專利名稱：增強型單體細菌熒光素酶基因luxAB及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術領域，尤其涉及的是一種增強型單體細菌熒光素酶基因IuxAB及其應用。
背景技術：
細菌發(fā)光基因操縱子IuxCDABE來源于Photorhabdus luminescens。因為檢測靈敏方便而被作為報告基因廣泛應用于基因表達分析、快速檢測、有毒有害物質分析等領域。其中IuxA和IuxB基因分別編碼細菌熒光素酶異二聚體的a (催化亞基，401^))和P (調節(jié)亞基，36kD)亞基，只有兩個亞基共存時才有活性，當將IuxA和IuxB基因融合表達后形成的單體蛋白仍然具有與野生型異二聚體蛋白相當?shù)陌l(fā)光活性，經(jīng)密碼子優(yōu)化后該融合蛋白在真核生物中也具有很高的活性。IuxCDE編碼脂肪酸還原酶和合成酶，用于合成細菌熒光素酶所作用的底物十四烷醛。為了克服真核生物來源熒光素酶報告系統(tǒng)需要外加底物的缺點，最近國外有研究人員通過將1uxC、1uxD和IuxE基因在哺乳動物細胞中共表達成功構建了產(chǎn)細菌熒光素酶底物的穩(wěn)定細胞系[30]，由于IuxA和IuxB基因融合型單體蛋白和非融合型二聚體蛋白均可在真核生物細胞系中功能表達，這一研究就此宣告了細菌熒光素酶真核活體實時自動化報告基因檢測系統(tǒng)的成功，也為基于細菌熒光素酶的自動化雙分子互補活體實時動態(tài)蛋白相互作用檢測系統(tǒng)今后在真核生物中的應用提供了擔保，奠定了基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足提供一種增強型單體細菌熒光素酶基因luxAB。本發(fā)明的技術方案如下:`增強型單體細菌熒光素酶基因luxAB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述的增強型單體細菌熒光素酶基因IuxAB作為生物發(fā)光報告基因的應用。本專利申請發(fā)明人將IuxA和IuxB基因融合表達后形成的單體蛋白經(jīng)過易錯PCR突變和化學隨機突變，克隆到pBluescriptll載體中，篩選得到9個熒光強度增強的突變體，然后經(jīng)過shuffling技術，得到一個增強型單體細菌熒光素酶基因luxAB。


圖1 為 pDM4_luxCDABE 基因及 MCS ;圖2 為 pBluescriptll 質粒圖譜；圖3為IuxA和IuxB基因融合單體克隆不意圖；圖4為易錯PCR突變IuxAB融合單體蛋白發(fā)光強度檢測；圖5為shuffling過程圖解；圖6為突變體經(jīng)過shuffling后篩選結果；圖7為不同濃度的底物(十四醛)對細菌熒光素酶IuxAB熒光強度的影響；
圖8為增強型單體細菌熒光素酶IuxAB基因在大腸桿菌E.coli DH5 a熒光強度檢測結果，PB-1uxABs為增強型單體細菌熒光素酶的熒光強度，pB-luxAB是陰性對照組；圖9為增強型單體細菌熒光素酶IuxAB基因在谷氨酸棒狀桿菌中熒光強度檢測結果，I組為增強型單體細菌熒光素酶的熒光強度，2組是陰性對照組；
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。一.材料與方法1.分子生物學試劑各種限制性內切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司，T4DNA連接酶為NewEngland Biolab公司產(chǎn)品，DNA分子量標準:MakerIII和DL5000+2000購自天根生物科技(北京)有限公司。研究中用到的抗生素濃度如下:氨芐青霉素IOOy g/mL，卡那霉素IOOy g/mL，氯霉素30 u g/mL,萘啶酸15 u g/mL。培養(yǎng)大腸桿菌一律采用LB培養(yǎng)基:10%蛋白胨，5%酵母膏，10%NaCl ;培養(yǎng)Yp采用YLB培養(yǎng)基:10%蛋白胨，5%酵母膏，5%NaCl。2.實驗材料:大腸桿菌E.coli DH5 a ；YPIII假結核耶爾森氏菌菌株由英國諾丁漢大學購買；pDM4-lux Box (含有IuxCDABE基因序列)由英國諾丁漢大學購買；質粒pBluescipt II購自大連寶生物公司(如圖2);質粒pKT25 ；pDM4均從天根生物公司購買。3.克隆構建本研究中所有克隆均采用此方法構建。首先以YpIII基因組為模板擴增目的基因。PCR 的反應體系為 50iiL:去離子水(ddH20) 33.5iiL，10XPCR buffer5u L,dNTPs (2mM each) 5 u L, MgS04 (25mM) 2 u L,正反向弓丨物(IOy M)各 1.5yL，模板DNA0.5 ii L，KOD-Plus-(lU/ii L) I ii L。PCR 程序為:94。C，2.5min ; (94 ° C，15s ;60。Cto50。C，30s,每個循環(huán)降低 0.5。C ；68 ° C，0.5min) X20 ; (94。C，15s ;50。C，30s ;68° C，0.5min) X 10。PCR產(chǎn)物用含0.5 y g/mL溴化乙錠(EB)的1%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，電泳條件為:I X TAE緩沖液，電壓5V/cm,電泳40min。在紫外燈下切下目的條帶,用上海生工凝膠回收試劑盒進行膠回收，回收操作方法見試劑盒說明書。擴增產(chǎn)物50 U L雙酶切反應體系包括:PCR產(chǎn)物20 U L，buffer5 U L，限制性內切酶各I y L ;載體50 ii L酶切體系:8 ii L載體質粒，buffer5 u L，限制性內切酶各I y L，最后用ddH20補足體積至50iiL。酶切后回收。連接反應:連接體系包括目的片段6.5 iiL，酶切后的載體2.5 ii L，
T4bufferl U L，T4DNA連接酶0.3 ii L，充分混勻后16°過夜連接。4.感受態(tài)的制備及轉化方法研究中所有E.coli感受態(tài)制備及轉化均采用Ca2+轉化方法進行。10 ii L連接產(chǎn)物加入到100 uL E.coli S17-1鈣轉感受態(tài)細胞并輕輕混勻，冰浴30min，42° C水浴熱激90s,再冰浴3min,加入ImL新鮮LB培養(yǎng)基,置恒溫搖床中37° C80rpm復蘇45min, 5000rpm離心3min，去除800 u L上清，用剩余的培養(yǎng)基重懸菌體后涂含有Cm的LB平板，37° C培養(yǎng)過夜。YpIII野生型及突變體感受態(tài)的制備及轉化轉化方法，在-80°冰箱中取出感受態(tài)冰上融化，同時電轉杯也放在冰上，電轉化電壓1800V，將產(chǎn)物與IOOii L感受態(tài)混合，放入電轉杯中，脈沖結束后盡快取出電轉杯將電轉產(chǎn)物加入到900 ii L LB培養(yǎng)基中，隨后30° C 復蘇 lh。二.1uxA和IuxB基因異二聚體的融合:細菌發(fā)光基因操縱子IuxCDABE來源于Photorhabdus luminescens,我們實驗室的IuxCDABE操縱子序列在pDM4質粒中(如圖1)，IuxA和IuxB基因分別編碼細菌熒光素酶異二聚體的a (催化亞基，401^))和P (調節(jié)亞基，36kD)亞基，Iux⑶E分別編碼脂肪酸轉移酶、還原酶和合成酶，用于合成細菌熒光素酶所作用的底物十四烷醛。LuxA和IuxB基因是兩個分開的亞基，即異二聚體，可以直接在原核中表達，作為報告基因。IuxA和IuxB基因融合型單體蛋白和非融合型二聚體蛋白均可在真核生物細胞系中功能表達，但是融合型的單體蛋白更容易表達，所以我們通過overlap PCR設計引物將IuxA亞基和IuxB亞基融合到一起，我們在IuxA和IuxB基因異二聚體間插入(GGGGS) 31 inker，以減少兩個亞基間的空間位阻。LuxA和IuxB的單體融合蛋白基因序列(突變后)序列特征見SEQ ID No:1的信肩、O我們根據(jù)SEQ ID N0.l的序列信息設計引物，其中IuxA基因的上游引物LuxA-F-Xbal含XbaI酶切位點和下游引物LuxA_R_L15含(GGGGS) 31inker。LuxB基因上游引物 luxB-F-L15 含(GGGGS) 31inker 和下游引物 LuxB-R-BglII 含有 BglII 酶切位點。IuxA和IuxB基因異二聚體 overlap PCR引物序列如下:LuxA-F-Xbal:5，-GCTCTAGAATGAAATTTGGAAACTTTTTGC-3’LuxA-R-LI5:5，-GCTACCTCCGCCACCACTTCCACCGCCTCCAGAACCTCCTCCACCATATAATAGCGAACGTTGTTTTTC-3’luxB-F-L15:5’ -GGTGGAGGAGGTTCTGGAGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGAGGTAGCATGAAATTTGGATTGTTCTTCC-3，LuxB-R-BglI1:5’ -GAAGATCTTTAGGTATATTCCATGTGGTACTTC-3’LuxA和IuxB基因異二聚體的第一次擴增:我們先用IuxA基因的上游引物LuxA-F-Xbal含XbaI酶切位點和下游引物LuxA_R_L15含(GGGGS) 31 inker兩對引物擴增IuxA基因片段。然后用LuxB基因上游引物luxB-F-L15含(GGGGS) 31 inker和下游引物LuxB-R-BglII含有BglII酶切位點擴增IuxB基因片段。兩個片段分別純化回收，然后用回收之后的片段作為模板，進行第二輪PCR的擴增，使用LuxA-F-Xbal和LuxB-R-BglII兩個正反向引物擴增，擴增體系為:第一輪PCR擴增得到的IuxA和IuxB基因共同作為模板各 IOuL, primers 正反向引物(lOuM) LuxA-F-Xbal 和 LuxB-R-Bgl II 各 5 u L, DNA 聚合酶 I ii L，DNA 聚合酶 10 X PCR buffer5 u L, dNTP5 u L,然后用 ddH20 補充至 50 y L。PCR 程序為:94。C,3min ； (94° C, 30s ；50° C, 30s, ；72° C，2.5min) X 30。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠純化回收之后得到IuxA和IuxB基因的融合單體基因序列，中間用引物中的序列(GGGGS) 31 inker做連接。純化所用到的試劑和方法參見一。三.pBluescriptll-Plac::1uxAB 質粒的構建:
我們將IuxA和IuxB基因融合的單體序列插入到pBluescriptll質粒中(如圖2酶切位點為XbaI和BamHI )，然后再XbaI和SacI位點插入Iac啟動子，得到構建的質粒pBluescriptll-Plac,以提高IuxAB融合單體蛋白的表達量(如圖3是pBluescriptI1-Plac-1uxAB 構建的不意圖)。四.隨機化學突變:取5ug的pBluescriptI1-Plac::1uxAB融合蛋白單體質粒DNA,放于IOOul的反應體系中，其中包括 0.5M 鹽酸羥胺；5mMTris-Hcl PH6.0; 0.5mM Na2EDTA;表IlOOul反應體系
權利要求
1.增強型單體細菌熒光素酶基因luxAB，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.根據(jù) 權利要求1所述的增強型單體細菌熒光素酶基因IuxAB作為生物發(fā)光報告基因的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了增強型單體細菌熒光素酶基因luxAB，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。以及所述的增強型單體細菌熒光素酶基因luxAB作為生物發(fā)光報告基因的應用。本發(fā)明將luxA和luxB基因融合表達后形成的單體蛋白經(jīng)過易錯PCR突變和化學隨機突變，克隆到pBluescriptII載體中，篩選得到9個熒光強度增強的突變體，然后經(jīng)過shuffling技術，得到一個增強型單體細菌熒光素酶基因luxAB。從實驗結果我們看出該增強型單體細菌熒光素酶不僅可以在革蘭氏陰性菌種表達出有活性的熒光蛋白而且還可以應用到革蘭氏陽性菌中，是很有前景的生物發(fā)光報告基因。
文檔編號C12Q1/68GK103160528SQ20131007340
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權日2013年3月7日
發(fā)明者王瑤, 崔博宇, 沈錫輝, 宋云洪, 劉應保 申請人:西北農林科技大學