專利名稱：一種與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物，同時還涉及該標(biāo)志物的應(yīng)用，屬于基因工程及腫瘤學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
食管癌(Esophageal carcinoma, EC)是常見的消化道惡性腫瘤，占消化系統(tǒng)各部位腫瘤死亡的第二位，全世界毎年死于此病達30萬人，其中中國毎年平均死亡約15萬人，是世界上食管癌發(fā)病率最高的國家。盡管近年來在食管癌的化療、放療以及同期放化療等方面取得了較大進展，但至今外科手術(shù)仍是食管癌最主要的治療手段。但治療效果不理想，5年生存率僅為30%左右，死亡的主要原因為術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，尤其是食管癌患者術(shù)后早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。目前國內(nèi)外報道其術(shù)后早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率(術(shù)后I年內(nèi))可達約20-50%不等，這對患者及外科醫(yī)師的信心均是沉重打擊，部分患者甚至對外科手術(shù)療效產(chǎn)生疑問。食管癌患者的自然病程或者稱生存期約為6-12月，術(shù)后I年內(nèi)出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，意味著手術(shù)的失敗，或者說對這些患者采取放化療更有益。影響食管癌預(yù)后的因素很多，目前判斷食管癌預(yù)后的主要方法還是傳統(tǒng)的TumorNodemetastasis(TNM)分期方法。食管癌的臨床診治過程中，經(jīng)典的 !病理分期系統(tǒng)對于不同病理分期預(yù)后判斷起著重要作用，但對于臨床工作中遇到的病理分期相同而預(yù)后差異明顯的情況無法解釋，而且缺乏對術(shù)后出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)的判斷作用。目前，臨床工作者正在進ー步完善 M分期系統(tǒng)以評估預(yù)后。與此同時，基礎(chǔ)醫(yī)務(wù)工作者也從腫瘤異質(zhì)性方面不同來考慮，尋找新的判斷預(yù)后的分子指標(biāo)，作為TNM病理分期系統(tǒng)的有益補充。食管癌的發(fā)生、發(fā)展過程中涉及多個癌基因、抑癌基因的突變，產(chǎn)生各種酶學(xué)的改變，表現(xiàn)為多基因、多因素、多步驟的協(xié)同作用。對于食管癌診斷和預(yù)后有關(guān)的分子生物學(xué)標(biāo)志物的研究已成為研究重點。 目前食管癌腫瘤分子標(biāo)記物的研究和報告較多，除傳統(tǒng)意義的腫瘤標(biāo)記物癌胚抗原(CEA)、鱗狀上皮細(xì)胞癌相關(guān)抗原(SCC)、細(xì)胞角化素蛋白片段19 (CYFRA21 -1)、p53蛋白抗體(p53-Ab)等以外，目前研究中熱點分子標(biāo)記物EGFR (表皮生長因子受體)、CycIinDl(細(xì)胞周期蛋白Dl)、C0X-2 (環(huán)氧化酶2)、PCNA (增殖細(xì)胞核抗原)、VEGF (血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子)等都對食管癌預(yù)后判斷有一定的臨床意義，但以上分子標(biāo)記物主要集中于對不同腫瘤病理分期的研究，以及對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度等單個因素的影響，缺乏對相同病理分期、同一術(shù)者、相同術(shù)式、相同術(shù)后治療方案而預(yù)后不同分子標(biāo)記物的研究，缺乏對食管癌術(shù)后出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的研究，缺少特異性和靈敏性高的分子標(biāo)記物來預(yù)測食管癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后，而且食管癌變和發(fā)展過程是多基因改變的結(jié)果，其分子生物學(xué)變化并不完全相同，聯(lián)合分子標(biāo)記物檢測有助于提高判斷預(yù)后的敏感性。microRNAs (miRNAs)是ー類長度為二十幾個核苷酸的內(nèi)源性非編碼調(diào)控RNA，通過序列特異性翻譯抑制或mRNA裂解來調(diào)控基因表達，參與細(xì)胞發(fā)育、増殖、分化、凋亡等一系列重要生物學(xué)進程。近期的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA具有癌基因和抑癌基因的作用，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。如能篩選出食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后特異或異常表達的miRNA作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的疾病進展監(jiān)測、輔助診斷試劑盒，對我們食管癌的診治現(xiàn)狀必將是一次有力的推動，尤其對ー些患者避免不必要的外科手術(shù)有著重要的意義。此外，這些異常表達的miRNA對于食管癌細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)移能力的影響等，還有助于發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物。為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物，所述miRNA標(biāo)志物為has-miR-197。所述miRNA 標(biāo)志物的引物如 SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6 所示。本發(fā)明的目的還在于提供一種與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物在制備食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后輔助診斷試劑盒方面的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物在制備食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后輔助診斷試劑盒方面的應(yīng)用。所述試劑盒包括has-miR-197的引物、聚合酶鏈反應(yīng)試劑、U6snRNA內(nèi)參引物及熒光染料 SYBR-Greenl。 本發(fā)明的目的還在于提供一種與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物的引物在制備食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后輔助診斷試劑盒方面的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物的引物在制備食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后輔助診斷試劑盒方面的應(yīng)用。本發(fā)明的目的還在于提供一種與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物的引物的食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后輔助診斷試劑盒。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物的引物的食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后輔助診斷試劑盒。利用本試劑盒中提供的試劑，結(jié)合常用的RNA提取試劑和通用的miRNA逆轉(zhuǎn)錄試齊U，可以特異地檢測組織中has-miR-197的表達量，有效地用于臨床食管癌的輔助診斷。本發(fā)明has-miR-197的篩選方法，包括以下步驟:1、選擇相同病理分期、同一術(shù)者、相同術(shù)式、相同術(shù)后治療方案卻有著截然不同預(yù)后結(jié)果的典型樣本，同時選取病理分期相同距離腫瘤組織邊緣8cm以外的正常食管粘膜作為對照品；2、提取樣本和對照品的RNA ；3、對總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA ； 4、cDNA進行預(yù)擴增；5、將預(yù)擴增產(chǎn)物進行實時熒光RT-PCR擴增，篩選表達存在明顯差異的miRNA，進行miRNA的表達統(tǒng)計分析，篩選得到與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物。本發(fā)明選取食管癌術(shù)后復(fù)發(fā)時間及預(yù)后差異較大的腫瘤樣本及其正常食管組織作為對照，通過提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量RT-PCR篩選表達存在明顯差異的miRNA，進行miRNA的表達統(tǒng)計分析，篩選得到has-miR-197。本發(fā)明方法簡單、操作方便，篩選得到的has-miR-197可輔助判斷食管癌患者的預(yù)后或死亡風(fēng)險，推動了食管癌診治方面的發(fā)展。采用本發(fā)明制備的miRNA試劑盒，不僅穩(wěn)定，檢測方便，且定量準(zhǔn)確，大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，將此試劑盒投入實踐，可以幫助診斷和更有效的個體化治療。


圖1為has-miR-197在病理分期相同而預(yù)后差異食管癌患者表達RT-PCR擴增曲線；圖2為has-miR-197表達量與食管癌預(yù)后的危險度評分方法分析圖。
具體實施例方式實施例1、樣本的選擇選取新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2006-2007年收治的病理分期相同，預(yù)后生存明顯差異的2例石蠟標(biāo)本，這2例標(biāo)本均為原發(fā)病灶的首次手術(shù)切除腫瘤樣本制作的石蠟標(biāo)本。同時分別選取距離此2例石蠟樣本腫瘤組織邊緣8cm以外的正常食管粘膜作為對照。2例病例，術(shù)前經(jīng)全身物理體格檢查及影像學(xué)診斷無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，術(shù)前未接受放射治療或化學(xué)治療等，均采用食管癌切除+胸腹ニ野淋巴結(jié)清掃木，頸部手工吻合，術(shù)后化療2次，術(shù)后病理學(xué)檢查提示食管中段高分化鱗癌，潰瘍型，侵及外膜，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(瓜0:)2002年第六版分期標(biāo)準(zhǔn)，2例均為13_110，臨床分期為113期，但預(yù)后存在明顯差異，一例術(shù)后5年仍健在，一例術(shù)后4個月頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，I年死亡。2、提取 RNAI)采用Trizol —步法提取石蠟包埋組織微切割腫瘤細(xì)胞中的總RNA，操作按照RNA提取試劑盒(Invitrogen, USA)說明進行。2)回收總 RNA,操作按照 Recover All Total Nucleic Acid Isolation KitTRIZOL REAGENT (Ambion，USA)的說明書進行。3)采用分管光度計分別測定波長230，260，280nm處的光吸收度值，確定總RNA的純度和濃度。4)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA樣品中28s和18s的比例，鑒定其純度和完整性。3、Megaplex 逆轉(zhuǎn)錄a) Megaplex逆轉(zhuǎn)錄體系如表I所示。表IMegaplex逆轉(zhuǎn)錄體系
權(quán)利要求
1.一種與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物，其特征在于，所述miRNA標(biāo)志物為 has-miR-197。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物，其特征在于,所述miRNA標(biāo)志物的引物如SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示。
3.—種如權(quán)利要求1所述的與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物在制備食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后輔助診斷試劑盒方面的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物在制備食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后輔助診斷試劑盒方面的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求2所述的引物、聚合酶鏈反應(yīng)試劑、U6snRNA內(nèi)參引物及熒光染料SYBR-Greenl。
5.一種如權(quán)利要求1所述的與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物的引物在制備食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后輔助診斷試劑盒方面的應(yīng)用。
6.一種含權(quán)利要求1所述的與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物的引物的食管癌術(shù)后早期復(fù) 發(fā)及預(yù)后輔助診斷試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用，其中，miRNA標(biāo)志物為has-miR-197。該miRNA標(biāo)志物在制備食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后輔助診斷試劑盒方面的應(yīng)用。一種與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物的引物在制備食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后輔助診斷試劑盒方面的應(yīng)用。一種與食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的miRNA標(biāo)志物的引物的食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后輔助診斷試劑盒。本發(fā)明方法簡單、操作方便，篩選得到的has-miR-197可輔助判斷食管癌患者的預(yù)后或死亡風(fēng)險，推動了食管癌診治方面的發(fā)展。
文檔編號C12Q1/68GK103114092SQ20131007292
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者王天云, 趙寶生, 劉尚國, 楊曉煜, 秦秀廣, 李漢臣 申請人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院