專利名稱：與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物，同時還涉及該標志物的應用，屬于基因工程及腫瘤學領域。
背景技術：
食管癌(Esophageal carcinoma, EC)是常見的消化道惡性腫瘤，占消化系統(tǒng)各部位腫瘤死亡的第二位，全世界每年死于此病達30萬人，其中中國每年平均死亡約15萬人，是世界上食管癌發(fā)病率最高的國家。盡管近年來在食管癌的化療、放療以及同期放化療等方面取得了較大進展，但至今外科手術仍是食管癌最主要的治療手段。但治療效果不理想，5年生存率僅為30%左右，死亡的主要原因為術后復發(fā)和轉移，尤其是食管癌患者術后早期淋巴結轉移。目前國內外報道其術后早期復發(fā)和轉移率(術后I年內)可達約20-50%不等，這對患者及外科醫(yī)師的信心均是沉重打擊，部分患者甚至對外科手術療效產生疑問。食管癌患者的自然病程或者稱生存期約為6-12月，術后I年內出現(xiàn)早期復發(fā)和轉移，意味著手術的失敗，或者說對這些患者采取放化療更有益。
影響食管癌預后的因素很多，目前判斷食管癌預后的主要方法還是傳統(tǒng)的TumorNodemetastasis(TNM)分期方法。食管癌的臨床診治過程中，經典的1'匪病理分期系統(tǒng)對于不同病理分期預后判斷起著重要作用，但對于臨床工作中遇到的病理分期相同而預后差異明顯的情況無法解釋，而且缺乏對術后出現(xiàn)早期復發(fā)的判斷作用。目前，臨床工作者正在進一步完善期系統(tǒng)以評估預后。與此同時，基礎醫(yī)務工作者也從腫瘤異質性方面不同來考慮，尋找新的判斷預后的分子指標，作為TNM病理分期系統(tǒng)的有益補充。食管癌的發(fā)生、發(fā)展過程中涉及多個癌基因、抑癌基因的突變，產生各種酶學的改變，表現(xiàn)為多基因、多因素、多步驟的協(xié)同作用。對于食管癌診斷和預后有關的分子生物學標志物的研究已成為研究重點。
目前食管癌腫瘤分子標記物的研究和報告較多，除傳統(tǒng)意義的腫瘤標記物癌胚抗原(CEA)、鱗狀上皮細胞癌相關抗原(SCC)、細胞角化素蛋白片段19 (CYFRA21 -1)、p53蛋白抗體(p53-Ab)等以外，目前研究中熱點分子標記物EGFR (表皮生長因子受體)、CycIinDl(細胞周期蛋白Dl)、C0X-2 (環(huán)氧化酶2)、PCNA (增殖細胞核抗原)、VEGF (血管內皮細胞生長因子)等都對食管癌預后判斷有一定的臨床意義，但以上分子標記物主要集中于對不同腫瘤病理分期的研究，以及對淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度等單個因素的影響，缺乏對相同病理分期、同一術者、相同術式、相同術后治療方案而預后不同分子標記物的研究，缺乏對食管癌術后出現(xiàn)早期復發(fā)和轉移的研究，缺少特異性和靈敏性高的分子標記物來預測食管癌的發(fā)生、發(fā)展和預后，而且食管癌變和發(fā)展過程是多基因改變的結果，其分子生物學變化并不完全相同，聯(lián)合分子標記 物檢測有助于提高判斷預后的敏感性。
microRNAs (miRNAs)是一類長度為二十幾個核苷酸的內源性非編碼調控RNA，通過序列特異性翻譯抑制或mRNA裂解來調控基因表達，參與細胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物學進程。近期的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA具有癌基因和抑癌基因的作用，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。如能篩選出食管癌術后早期復發(fā)和預后特異或異常表達的miRNA作為生物標志物，并研制相應的疾病進展監(jiān)測、輔助診斷試劑盒，對我們食管癌的診治現(xiàn)狀必將是一次有力的推動，尤其對一些患者避免不必要的外科手術有著重要的意義。此外，這些異常表達的miRNA對于食管癌細胞遷移、轉移能力的影響等，還有助于發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物。為了實現(xiàn)以上 目的，本發(fā)明所采用的技術方案是提供與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物，所述miRNA標志物為has-miR-382。所述miRNA 標志物的引物如 SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6 所示。本發(fā)明的目的還在于提供一種與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物在制備食管癌術后早期復發(fā)和預后輔助診斷試劑盒方面的應用。本發(fā)明所采用的技術方案還在于提供一種與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物在制備食管癌術后早期復發(fā)和預后輔助診斷試劑盒方面的應用。所述試劑盒包括has-miR-382的引物、聚合酶鏈反應試劑、U6snRNA內參引物及熒光染料 SYBR-Greenl。本發(fā)明的目的還在于提供一種與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物的引物在制備食管癌術后早期復發(fā)和預后輔助診斷試劑盒方面的應用。本發(fā)明所采用的技術方案還在于提供一種與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物的引物在制備食管癌術后早期復發(fā)和預后輔助診斷試劑盒方面的應用。本發(fā)明的目的還在于提供一種與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物的引物的食管癌術后早期復發(fā)和預后輔助診斷試劑盒。本發(fā)明所采用的技術方案還在于提供一種與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物的引物的食管癌術后早期復發(fā)和預后輔助診斷試劑盒。利用本試劑盒中提供的試劑，結合常用的RNA提取試劑和通用的miRNA逆轉錄試齊U，可以特異地檢測組織中has-miR-382的表達量，有效地用于臨床食管癌的輔助診斷。本發(fā)明has-miR-382的篩選方法，包括以下步驟:1、選擇相同病理分期、同一術者、相同術式、相同術后治療方案卻有著截然不同預后結果的典型樣本，同時選取病理分期相同距離腫瘤組織邊緣8cm以外的正常食管粘膜作為對照品；2、提取樣本和對照品的RNA ；3、對總RNA通過逆轉錄得到cDNA ； 4、cDNA進行預擴增；5、將預擴增產物進行實時熒光RT-PCR擴增，篩選表達存在明顯差異的miRNA，進行miRNA的表達統(tǒng)計分析，篩選得到與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物。本發(fā)明選取食管癌術后復發(fā)時間和預后差異較大的腫瘤樣本及其正常食管組織作為對照，通過提取RNA，逆轉錄、實時熒光定量RT-PCR篩選表達存在明顯差異的miRNA，進RmiRNA的表達統(tǒng)計分析，篩選得到has-miR-382。本發(fā)明方法簡單、操作方便，篩選得到的has-miR-382可輔助判斷食管癌患者的預后或死亡風險，推動了食管癌診治方面的發(fā)展。
采用本發(fā)明制備的miRNA試劑盒，不僅穩(wěn)定，檢測方便，且定量準確，大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，將此試劑盒投入實踐，可以幫助診斷和更有效的個體化治療。


圖1為has-miR-382在病理分期相同而預后差異食管癌患者表達RT-PCR擴增曲線.
圖2為has-miR-382表達量與食管癌預后的危險度評分方法分析圖。
具體實施方式
實施例
1、樣本的選擇
選取新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2006-2007年收治的病理分期相同，預后生存明顯差異的2例石蠟標本，這2例標本均為原發(fā)病灶的首次手術切除腫瘤樣本制作的石蠟標本。同時分別選取距離此2例石蠟樣本腫 瘤組織邊緣8cm以外的正常食管粘膜作為對照。2例病例，術前經全身物理體格檢查及影像學診斷無遠處轉移，術前未接受放射治療或化學治療等，均采用食管癌切除+胸腹二野淋巴結清掃術，頸部手工吻合，術后化療2次，術后病理學檢查提示食管中段高分化鱗癌，潰瘍型，侵及外膜，無淋巴結轉移，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(瓜0:)2002年第六版分期標準，2例均為13_10，臨床分期為113期，但預后存在明顯差異，一例術后5年仍健在，一例術后4個月頸部淋巴結轉移，I年死亡。
2、提取 RNA
I)采用Trizol —步法提取石蠟包埋組織微切割腫瘤細胞中的總RNA，操作按照RNA提取試劑盒(Invitrogen, USA)說明進行。
2)回收總 RNA,操作按照 Recover All Total Nucleic Acid Isolation KitTRIZOL REAGENT (Ambion，USA)的說明書進行。
3)采用分管光度計分別測定波長230，260，280nm處的光吸收度值，確定總RNA的純度和濃度。
4)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA樣品中28s和18s的比例，鑒定其純度和完整性。
3、Megaplex 逆轉錄
a) Megaplex逆轉錄體系如表I所示。
表IMegaplex逆轉錄體系
權利要求
1.與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物，其特征在于，所述miRNA標志物為 has-miR-382。
2.根據(jù)權利要求1所述的與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物，其特征在于，所述miRNA標志物的引物如SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示。
3.—種如權利要求1所述的與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物在制備食管癌術后早期復發(fā)和預后輔助診斷試劑盒方面的應用。
4.根據(jù)權利要求3所述的與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物在制備食管癌術后早期復發(fā)和預后輔助診斷試劑盒方面的應用，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求2所述的引物、聚合酶鏈反應試劑、U6snRNA內參引物及熒光染料SYBR-Greenl。
5.一種如權利要求1所述的與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物的引物在制備食管癌術后早期復發(fā)和預后輔助診斷試劑盒方面的應用。
6.一種含權利要求1所述的與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物的引物的食管癌術后早期復發(fā)和預后輔助診斷試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物及其應用，其中，miRNA標志物為has-miR-382。該miRNA標志物在制備食管癌術后早期復發(fā)和預后輔助診斷試劑盒方面的應用。一種與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物的引物在制備食管癌術后早期復發(fā)和預后輔助診斷試劑盒方面的應用。一種與食管癌術后早期復發(fā)和預后相關的miRNA標志物的引物的食管癌術后早期復發(fā)和預后輔助診斷試劑盒。本發(fā)明方法簡單、操作方便，篩選得到的has-miR-382可輔助判斷食管癌患者的預后或死亡風險，推動了食管癌診治方面的發(fā)展。
文檔編號C12N15/113GK103173449SQ20131007275
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權日2013年3月7日
發(fā)明者趙寶生, 秦秀廣, 齊博, 劉尚國, 王天云, 李漢臣 申請人:新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院