專利名稱：水稻OsAT1蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術領域，具體涉及一種與水稻籽粒千粒重和直連淀粉含量相關的陰離子通道蛋白(水稻OsATl蛋白)及其編碼基因和應用。
背景技術：
水稻是我國最主要的糧食作物之一，其播種面積、總產(chǎn)和單產(chǎn)均居糧食作物首位，水稻的生產(chǎn)對我國的國民經(jīng)濟具有重要的作用。目前，隨著人民生活水平的提高，水稻生產(chǎn)不但要提高品種的產(chǎn)量，也要注重品質(zhì)的改良，而水稻的千粒重和直鏈淀粉含量對稻米的外觀、產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的影響。因此，選育不同千粒重和直鏈淀粉含量的水稻品種，發(fā)掘控制水稻千粒重和直鏈淀粉含量的主要基因?qū)μ岣叩竟犬a(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的意義。
谷粒重量一般以千粒重表示，是衡量水稻產(chǎn)量的因素之一，也是谷粒長度、寬度與厚度的綜合指標(楊聯(lián)松等，粳稻粒形遺傳初步研究.雜交水稻，2002, 17(6):46-48)。
人們一般認為粒重受多基因控制，基本呈正態(tài)分布(熊振民和孔繁林.水稻粒重的超親遺傳及其在育種中的應用.浙江農(nóng)業(yè)大學學報，1982，8 (I):17-25)，所以谷粒的粒長、粒寬、粒厚和粒重都屬于多基因控制的數(shù)量性狀(石春海和申宗坦.早秈粒形的遺傳和改良.中國水稻科學，1995，9 (I): 27-32)。
隨著各種分子標記的日趨完善，基因的定位與克隆效率得到很大的提高。到目前為止，已克隆到5個控制水稻粒重的基因，分別為GS3 (Fan et al, GS3, amajorQTL for grain length and weight and minor QTL for grain width andthicknessin rice,encodes a putative transmembrane protein.Theor ApplGenet，2006，112: 1164-1171)、GW2 (Song et al, A QTL for rice grain widthand weight encodes aprev iously unknown RING-type E3ubiquitin Iigase.Nat Genet，2007，39 (5):623-630)、GW5(Wang et al.1solation and initialcharacterization of GW5, a majorQTL associated with rice grain width andweight.Cell Res.2008, 18:1199-1209)/qSW5 (Shomura et al，Deletion in a geneassociated with grain sizeincreased yields during rice domestication.NatGenet，2008，40 (8): 1023-1028)、GIFl (Wang et al, Control of rice grain-fillingand yield by a gene with a potentialsignature of domestication.NatGenet，2008，44 (11):1370-1374)和 GW8(Wang et al,Control of grain size,shape andquality by 0sSPL16in rice.Nat Genet，2012，44(8):950-955)。
GS3是第一個克隆到的控制粒長和粒重的主效基因，它導致粒長變化是由于第二個外顯子上發(fā)生單堿基突變而使翻譯提前終止產(chǎn)生的(Fan et al，GS3，amajorQTL for grain length and weight and minor QTL for grain width andthicknessin rice,encodes a putative transmembrane protein.Theor ApplGenet，2006，112:1164-1171) ;Mao等對GS3蛋白功能進一步研究發(fā)現(xiàn)，GS3編碼蛋白的N端是一個植物特有的器官大小調(diào)節(jié)功能域OSR(organ size regulation), OSR對谷粒大小具有負調(diào)控的作用，能抑制粒形變長(Mao et al, Linking differential domainfunctionsof the GS3protein to natural variation of grain size in rice.Proc Natl AcadSciUSA, 2010，107(45):19579-19584)。2007年，Song等人成功地克隆并分析了控制水稻粒重的數(shù)量性狀基因(QTL)GW2(Song et al, A QTL for rice grain width and weight encodes a previouslyunknownRING-type E3ubiquitin ligase.Nat Genet, 2007，39 (5):623-630)，研究表明:GW2 作為一個新的E3泛素連接酶可能參與降解促進細胞分裂的蛋白，從而調(diào)控水稻穎殼大小和控制粒重；當GW2的功能缺失或降低時，該基因降解可能與細胞分裂相關蛋白的能力下降，從而加快細胞分裂，增加谷粒穎殼的細胞數(shù)目，從而增加水稻谷粒的寬度和粒重。qSW5和GW5實為同一基因，序列分析表明其編碼一種新的蛋白，與任何已知功能的蛋白不具有同源性，該基因突變導致粒寬增加，其主要原因在于外稃上表皮細胞數(shù)量增加而使外稃增大，從而導致粒寬和粒重的增加(Shomura et al, Deletion in a geneassociated with grain size increased yields during ricedomestication.NatGenet, 2008，40(8):1023-1028)；GIFl編碼598個氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物，其蛋白為一種細胞壁轉(zhuǎn)化酶，它能把鹿糖轉(zhuǎn)化為淀粉，過量表達該基因能促進籽粒灌衆(zhòng)，提高籽粒粒重(Wang etal, Controlof rice grain-filling and yield by a gene with a potential signatureofdomestication.Nat Genet, 2008，44(11):1370-1374)；GW8編碼一個促進細胞增殖的蛋白，該基因能促進細胞分裂和籽粒灌漿，從而增加粒寬和粒重(Wang et al, Control of grain size, shape and quality by0sSPL16in rice.Nat Genet, 2012，44(8):950-955)。稻米的主要成分是淀粉，包括直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種形式。淀粉的組成與結(jié)構(gòu)在相當程度上決定了稻米 品質(zhì)的優(yōu)劣，稻米的直連淀粉含量大多在16-30%之間，其主要由Wx基因編碼酶GBSSI合成(舒慶堯等.秈稻和粳稻中蠟質(zhì)基因座位上微衛(wèi)星標記的多態(tài)性及其與直鏈淀粉含量的關系.遺傳學報，1999,26(4):350-358)。研究表明，當植物體內(nèi)缺少GBSSI蛋白時，合成淀粉中缺乏直鏈淀粉；利用反義RNA技術特異抑制GBSSI基因的表達，貝U導致直鏈淀粉含量的下降(Denyer et al.The isolation andcharacterization of novel low-amylosemutants of Pisum sativum L.Plant CellEnviron.1995，18:1019-1026)，說明GBSSI主要負責水稻籽粒直連淀粉的含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于提供一種水稻OsATl蛋白。本發(fā)明的另一目的在于提供上述水稻OsATl蛋白的編碼基因，該基因與硅酸分泌通道基因Lsi2編碼的蛋白屬于同一基因家族(Ma et al, An effluxtransporter ofsilicon in rice.Nature, 2007, 448(12):209-213) 本發(fā)明的再一目的在于提供上述水稻OsATl蛋白的編碼基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn):水稻OsATl蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或該序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸后功能與SEQ ID N0:2所示序列相同的序列。
上述水稻OsATl蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；或在嚴格條件下可與SEQ ID N0:1雜交并且編碼上述水稻OsATl蛋白的DNA分子；或者與SEQ ID NO:1的序列有90%以上的同源性(優(yōu)選95%以上同源性)，并且編碼上述水稻OsATl蛋白的DNA分子；
上述水稻OsATl蛋白的編碼基因的啟動子，序列如SEQ ID N0:3所示；或嚴格條件下可與SEQ ID NO: 3所示的DNA分子雜交且具有啟動子功能的DNA分子；
所述的嚴格條件是:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗雜交膜一次。
一種表達載體，是由上述水稻OsATl蛋白的編碼基因插入到植物表達載體的多克隆位點構(gòu)建而成。
此外，使用上述水稻OsATl蛋白的編碼基因構(gòu)建植物表達載體時，還可以使用增強子，包括翻譯增強子或者轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或是鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)區(qū)域。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達可以產(chǎn)生顏色變化的酶或是發(fā)光化合物的基因(如GUS基因、熒光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除銹劑基因)等。
所述的植物表達載體優(yōu)選pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301 或 pBI121。
攜帶有上述的水稻OsATl蛋白的編碼基因的植物表達載體可以通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉(zhuǎn)化到植物細胞或是組織中。被轉(zhuǎn)化的宿主植物可以是水稻或其它作物。
上述的水稻OsATl蛋白或水稻OsATl蛋白的編碼基因，可用于改善水稻千粒重和降低籽粒直連淀粉含量的能力。如，水稻OsATl蛋白在制備改善植物千粒重和降低籽粒直連淀粉含量藥劑中的應用；或者，水稻OsATl蛋白的編碼基因在制備改善植物千粒重和降低籽粒直連淀粉含量的轉(zhuǎn)基因植物中的應用。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果:
實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)OsATl基因植株表現(xiàn)為水稻籽粒千粒重和直連淀粉含量下降，其蛋白質(zhì)和編碼基因?qū)φ{(diào)控水稻籽粒千粒重和直連淀粉含量的有重要的實際意義，在實際應用中可以將OsATl基因轉(zhuǎn)入不同的水稻品種中以培育更加理想的水稻栽培品種，或調(diào)節(jié)OsATl基因的表達獲得相應的水稻籽粒千粒重和直鏈淀粉含量的水稻品種。OsATl蛋白及其編碼基因在農(nóng)業(yè)領域具有廣闊的應用和市場前景。


圖1是本發(fā)明的水稻OsATl基因的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，泳道M為分子量標記DL2000plus (購自TAKARA);泳道1-2為目的基因。
圖2是定量PCR分析轉(zhuǎn)基因植株中OsATl的表達情況示意圖；其中，WT:野生型水稻植株中花11 ；pOX:Line3 =OsATl過量表達水稻轉(zhuǎn)基因植株。圖3是過量表達OsATl的轉(zhuǎn)基因水稻表型示意圖；其中，WT:野生型水稻中花11 ；p0X:Line3:OsATI過量表達水稻轉(zhuǎn)基因植株。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1水稻OsAT I基因的克隆根據(jù)NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)提供的關于 OsATl 基因的 cDNA 序列設計引物，引物序列如下:OsATl-Fl: ACGAAGCTTGTTCTTGATTGGCGGCAATG (下劃線部分為限制性內(nèi)切酶HindIII識別位點)
OsATl-Rl: ACTACGCGTTCAGTTGCTTCTGATGAGCAG (下劃線部分為限制性內(nèi)切酶 MluI識別位點)以粳稻品種中花112周的幼苗葉片cDNA為模板，在引物OsATl-Fl和OsATl-Rl的引導下，用常規(guī)方法擴增OsATl基因。反應結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳(結(jié)果如圖1所示)，回收并純化大約1600bp左右的DNA片段，將該片段克隆到pMD18-T載體(購自TAKARA公司)上，獲得pMD18-T-0sATl載體，送北京奧科生物技術有限公司測序，測序結(jié)果表明，該DNA片段的序列如SEQ ID NO:1所示；編碼如SEQ ID NO: 2所示序列的蛋白，在其DNA兩端引入了合適的酶切位點。實施例2遺傳轉(zhuǎn)化鑒定目的基因的功能將OsATl基因克隆入植物過量表達載體pCAMBIA1380 (購自澳大利亞CAMBIA公司)多克隆位點的HindIII和MluI酶切位點之間，得到含有OsATl基因的植物表達載體，然后利用農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)化粳稻品種中花11的成熟胚的愈傷組織，方法如下述文獻描述(Hiei et al, Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA.PlantJ, 1994，6 (2): 271-282)，經(jīng)過預分化、分化，得到16株轉(zhuǎn)化植株，經(jīng)過PCR鑒定，全部為陽性，PCR引物序列如下:引物1:5’ -CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC-3’ (SEQ ID N0:6)；引物2:5，-TAGCGCGTCTGCTGCTCCATACA-3’(SEQ ID NO:7);PCR 擴增條件為:94 °C 2min ；94 °C 30sec, 58 °C 30sec, 72 °C lmin, 35 個循環(huán)；72 °C 5min。經(jīng)過PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因植株，提取Tl代轉(zhuǎn)基因植株葉片基因組DNA進行Southern Blot檢測插入基因的拷貝數(shù)，選擇單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株分單株收取種子，然后取100粒以上種子發(fā)芽后利用潮霉素進行篩選，若沒有死亡則表明種子已經(jīng)純合；選擇已經(jīng)純合的轉(zhuǎn)基因種子和野生型水稻中花11種子萌發(fā)后，利用木村B營養(yǎng)液(調(diào)pH為4.8)培養(yǎng)水稻至4葉期，然后提取水稻RNA，檢測總RNA濃度和完整度后再合成cDNA第一鏈，以水稻Actin作為內(nèi)參基因，加入等量的cDNA模板，在熒光定量PCR儀擴增Actin和OsATl，從圖2可以看出，在轉(zhuǎn)基因植株葉片中OsATl的表達較野生型水稻提高了 11倍；所用PCR引物序列如下:Actin-F:5’-GCCACACTGTCCCCATCTATG-3’ (SEQ ID N0:8)；Actin-R:5，-AGGTCGAGACGAAGGATAGCAT-3’ (SEQ ID N0:9)；AT1-F:5，-CGTCACCTCCCACCGCTTCT-3’ (SEQ ID NO: 10)；AT1-R:5’-TGGTGACAGGGACGGGCTTC-3’ (SEQ ID NO: 11)；PCR擴增條件為:95°C IOmin ；95°C 15sec，60°C lmin，40 個循環(huán)；60_95°C分析溶解曲線。木村B 營養(yǎng)液具體配方為:(NH4) 2S04 (0.365mM)，KH2PO4 (0.182mM)，KNO3 (0.183mM)，K2SO4 (0.086mM)，Ca (NO3) 2 (0.366mM)，MgSO4 (0.548mM)，EDTA-Fem (0.020mM)，MnCl2.4H20 (0.091 X I(T3HiM)，ZnSO4.7H20 (0.77 X I(T3HiM)，CuSO4.5H20 (0.32 X I(T3HiM)，H3BO3 (0.0462mM)，(NH4)6Mo7024.4H20 (0.145 X I(T3HiM)。通過以上實驗，證實了過量表達OsATl的轉(zhuǎn)基因植株為陽性植株，轉(zhuǎn)基因植株在核酸表達水平較野生型提高了 11倍(圖2)，并且從圖3中可以看出，水稻成熟后，過量表達OsATl的轉(zhuǎn)基因植株的株高比野生型植株要低，其葉片向內(nèi)卷曲(圖3A);過量表達OsATl的轉(zhuǎn)基因植株的稻穗長度 和結(jié)實率與野生型植株差異不大，但谷粒粒形有較大差異，轉(zhuǎn)基因植株的粒長和粒寬明顯變小(圖3B和圖3C)。為了檢驗轉(zhuǎn)基因純合植株對水稻籽粒相關性狀和米質(zhì)的影響，進一步對轉(zhuǎn)基因純合植株收獲后進行考種和米質(zhì)分析，考種和米質(zhì)分析方法參照部頒標準《NY147-88米質(zhì)測定方法》，并采用FOSS Infratec 1241Grain Analyzer進行自動測定。具體如下:稻米收獲干燥后貯藏3個月，測定品質(zhì)性狀。糙米率、精米率、整精米率、長寬比的測定參照部頒標準《NY147-88米質(zhì)測定方法》。直連淀粉與蛋白質(zhì)含量的測定采用FOSS Infratec 1241GrainAnalyzer進行自動測定。結(jié)果如表I所示，過量表達OsATl的轉(zhuǎn)基因純合植株的千粒重只有野生型水稻中花11的57.3% ;并且直鏈淀粉含量也下降了 13%，統(tǒng)計分析表明，過量表達OsATl的轉(zhuǎn)基因植株和野生型水稻中花11的粒長、粒寬、千粒重和直鏈淀粉含量差異性顯著(表I)。表I (WT為野生型植株中花11 ；p0X:Line3:過量表達OsATl的水稻轉(zhuǎn)基因植株)
權(quán)利要求
1.水稻OsATl蛋白，特征在于:其序列如SEQID NO:2所示。
2.權(quán)利要求1所述的水稻OsATl蛋白的編碼基因，特征在于:其序列如SEQID NO:1所/Jn ο
3.—種表達載體，其特征在于:是由權(quán)利要求2所述的水稻OsATl蛋白的編碼基因插入到植物表達載體的多克隆位點構(gòu)建而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達載體，其特征在于:所述的植物表達載體為pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301 或 pBI121。
5.權(quán)利要求2所述的水稻OsATl蛋白的編碼基因在改善水稻千粒重和降低籽粒直連淀粉含量中的 應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻OsAT1蛋白及其編碼基因與應用。水稻OsAT1蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示，其編碼基因的序列如SEQ ID NO:1所示。水稻OsAT1蛋白及其編碼基因可以用于改善水稻千粒重和降低籽粒直連淀粉含量。本發(fā)明中，轉(zhuǎn)OsAT1基因植株表現(xiàn)為水稻籽粒千粒重和直連淀粉含量下降，其蛋白質(zhì)和編碼基因?qū)φ{(diào)控水稻籽粒千粒重和直連淀粉含量的有重要的實際意義，在實際應用中可以將OsAT1基因轉(zhuǎn)入不同的水稻品種中以培育更加理想的水稻栽培品種，或調(diào)節(jié)OsAT1基因的表達獲得相應的水稻籽粒千粒重和直鏈淀粉含量的水稻品種。
文檔編號C12N15/82GK103145818SQ20131007346
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者張建軍, 彭新湘, 田華, 劉娥娥, 陳燕, 周曉垂 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學