一種檢測白血病融合基因的多重pcr試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測白血病融合基因的多重PCR試劑盒，包括：常規(guī)多重PCR組件、針對常見白血病融合基因的嵌合引物和公共引物對。嵌合引物為在針對BCR/ABL、PML/RARα、AML1/ETO、E2A/PBX1常見白血病融合基因7個(gè)剪切異構(gòu)體的特異引物5’端加上公共引物的序列。利用本發(fā)明公開的檢測白血病融合基因的多重PCR試劑盒可同時(shí)檢測包括AML1/ETO、BCR/ABLe1a2、BCR/ABLe13a2、BCR/ABLe14a2、PML/RARαL型、PML/RARαS型和E2A/PBX1I型7種發(fā)病率高的白血病融合基因，不僅可節(jié)約試劑使用量和降低檢測成本，同時(shí)提高了檢測效率。此外，本發(fā)明的檢測敏感性最高可達(dá)10拷貝/25μL，并且操作簡單，臨床檢出率高，具有臨床推廣應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】—種檢測白血病融合基因的多重PCR試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測四種常見白血病融合基因的多重PCR試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]多重PCR工作原理是在同一 PCR反應(yīng)體系里加入多對引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段的PCR反應(yīng)，作為PCR重要衍生技術(shù)之一，該方法具有高效性、經(jīng)濟(jì)簡便性，可大大節(jié)約時(shí)間和試劑成本等諸多優(yōu)勢。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)、檢疫和醫(yī)學(xué)檢測等領(lǐng)域。
[0003]多重PCR反應(yīng)中，一般包括以下試劑:兩對以上引物對、dNTP、MgCl2、PCR緩沖液、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及其他佐劑(DMS0、甘油、BSA)，通常為了獲得比較好的擴(kuò)增結(jié)果，會(huì)對試劑的使用量、PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件，例如延伸溫度、延伸時(shí)間、退火時(shí)間、退火溫度、PCR循環(huán)數(shù)等，進(jìn)行優(yōu)化。
[0004]白血病患者的遺傳學(xué)特征異常復(fù)雜多變，包括染色體的易位、缺失、突變和倒位等，這些染色體易位畸變時(shí)大部分情況下會(huì)產(chǎn)生新的融合基因，這些融合基因可作為診斷不同類型白血病的分子標(biāo)志，此外，不同類型的白血病化療和放療的治療方案亦不同。因此，融合基因的檢測對白血病的診斷、預(yù)后、監(jiān)測微小殘留病和指導(dǎo)用藥等具有重要的指導(dǎo)價(jià)值，已成為白血病診 斷標(biāo)準(zhǔn)最重要的指標(biāo)之一。
[0005]BCR/ABL、PML/RAR a、AMLI/ETO, Ε2Α/ΡΒΧ1是四種最常見的白血病融合基因。其中，約95%的慢性粒細(xì)胞白血病患者能檢測到BCR/ABL融合基因；85%以上的急性早幼粒細(xì)胞白血病涉及PML/RARa融合基因；而AML1/ET0融合基因是最常見的核型異常之一，在M2亞型急性髓系白血病中約占30%-50% ；E2A/PBX1融合基因見于約3_5%的兒童和3%的成人B細(xì)胞型急性淋巴白血病，是兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診斷和治療中的重要檢測指標(biāo)?；谝陨显?，選取了這四種發(fā)病率高的白血病融合基因作為本研究的檢測靶標(biāo)。
[0006]作為PCR重要衍生技術(shù)之一，多重PCR有著諸多優(yōu)勢:(I)高效性，減少操作流程，可同時(shí)檢測多個(gè)基因或片段；(2)經(jīng)濟(jì)簡便性，可大大節(jié)約時(shí)間和試劑成本。其可在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測多種常見白血病融合基因，有力地彌補(bǔ)了染色體核型分析的不足，提高了隱匿性易位染色體的檢出率。目前，臨床常用白血病分子診斷方法主要以Poul Jorgensen為代表的逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測方法，此類方法一般將反應(yīng)體系分成八管，每管檢測不同類型的融合基因且產(chǎn)物片段大小存在明顯差異，依據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物所在反應(yīng)管位置及片段大小判斷融合基因類型。由于在同一反應(yīng)體系中多對引物易發(fā)生相互作用，如形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)、二聚體結(jié)構(gòu)等，從而影響擴(kuò)增效率，這是分為八管進(jìn)行檢測的主要原因，但這亦同時(shí)導(dǎo)致了該類檢測方法復(fù)雜、繁瑣，對操作人員相關(guān)專業(yè)要求較高，難以推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種常見四種白血病融合基因的逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測試劑盒，利用其可檢測出BCR-ABL、PML/RARa、AML1/ET0、E2A/PBX1這四種常見白血病融合基因的 7 個(gè)剪切異構(gòu)體，具體包括:BCR/ABL eIa2、BCR/ABL e13a2、BCR/ABL el4a2、PML/RARa L 型、PML/RAR a S 型、E2A/PBXI I 型和 AMLI/ETO。
[0008]為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種檢測白血病融合基因的多重PCR試劑盒，所述多重PCR試劑盒包括:常規(guī)多重PCR組件，還包括針對常見白血病融合基因的嵌合引物以及公共引物對，所述公共引物對包括以下核苷酸序列:
SEQ ID N0.1:公共引物對中的正義引物 5’- AGACATCGTAGGTAGTGACA -3，；SEQ IDN0.2:公共引物對中的反義引物5’ - GAACGGACGACAATACAGTG -3’ ；
所述針對常見白血病融合基因的嵌合引物為針對常見白血病融合基因BCR/ABL、PML/RARa、AML1/ET0、E2A/PBX1的多條嵌合引物對，具體如以下核苷酸序列所示:
【權(quán)利要求】
1.一種檢測白血病融合基因的多重PCR試劑盒，所述多重PCR試劑盒包括:常規(guī)多重PCR組件，其特征在于，還包括針對常見白血病融合基因的嵌合引物以及公共引物對，所述公共引物對包括以下核苷酸序列: SEQ ID N0.1:公共引物對中的正義引物5’- AGACATCGTAGGTAGTGACA _3’;SEQ IDN0.2:公共引物對中的反義引物5 ’ - GAACGGACGACAATACAGTG -3，； 所述針對常見白血病融合基因的嵌合引物為分別針對常規(guī)白血病融合基因BCR/ABL、PML/RAR a、AML1/ET0、Ε2Α/ΡΒΧ1的多條嵌合引物對，具體如以下核苷酸序列所示:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測白血病融合基因的多重PCR試劑盒，其特征在于，所述常規(guī)多重PCR組件包括:陽性對照引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2, PCR緩沖液、去離子水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測白血病融合基因的多重PCR試劑盒，其特征在于，進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)每條針對常見白血病融合基因的嵌合引物的濃度為I μΜ。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測白血病融合基因的多重PCR試劑盒，其特征在于，進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)公共引物的濃 度為10 μ Μ。
【文檔編號】C12Q1/68GK103937891SQ201410153342
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】孫萬平, 胡穎熹, 張舒羽, 張國興, 姚利, 李凱, 陳子興 申請人:蘇州大學(xué)