專利名稱：Rala基因的小干擾rna在制備抗白血病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種RALA基因的小干擾RNA及其在制備抗白血病 藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
慢性粒細(xì)胞性白血病是一種起源于多能造血干細(xì)胞的惡性增殖性疾病，約占成年 人白血病的20% 30%，在我國(guó)白血病中發(fā)病率僅次于急粒和急淋而居第三位，成為威脅 人民健康的一種常見(jiàn)惡性腫瘤。目前CML尚缺乏特效的治療方案，以化療為主。近年來(lái)，對(duì) 白血病以及其他腫瘤的治療已由“全細(xì)胞毒殺”時(shí)代進(jìn)入到目前的“靶向治療”新紀(jì)元。尋 求腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵“靶標(biāo)”或與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的基因，開(kāi)發(fā)靶向藥物已經(jīng)成為腫瘤 基因治療研究的重要方向。RALA (v-ral simian leukemia viral oncogene homo log A)是一種癌基因，它番羽 譯的蛋白質(zhì)類似于RAS基因翻譯的連接于GTP上的連接蛋白，這種蛋白可以與細(xì)胞膜上的 受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。研究表明RALA與腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，尤其 在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起重要作用。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)現(xiàn)象自1998年發(fā)現(xiàn)以 來(lái)，作為一種反向遺傳學(xué)技術(shù)，已被成功應(yīng)用于線蟲(chóng)、果蠅、植物、真菌和哺乳動(dòng)物等生物的 多個(gè)研究領(lǐng)域中。小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)可特異性、高效率沉默靶基 因表達(dá)，能在低于反義核酸幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度下，使靶基因的表達(dá)降至極低水平。本實(shí)驗(yàn)設(shè) 計(jì)并合成RALA siRNA，將其導(dǎo)入慢性粒細(xì)胞性白血病(chronicmyeloid leukemia, CML)細(xì) 胞株k562細(xì)胞，檢測(cè)RALA siRNA的基因沉默功效。RNAi是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新型基因阻斷技術(shù)，其主要參與成分為siRNA， siRNA可特異性抑制靶目標(biāo)mRNA的表達(dá)。RNAi具有高度的序列專一性，可以特異性地使目 的基因沉默，利用此技術(shù)沉默腫瘤相關(guān)基因，通過(guò)觀察細(xì)胞表型的改變、分析基因表達(dá)和功 能的變化，不僅有助于了解腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，而且有助于辨認(rèn)和確定腫瘤基因治療的靶 點(diǎn)。目前，RNA干擾已廣泛應(yīng)用于腫瘤研究工作中，并取得了一些突破性進(jìn)展，在真核生物 體內(nèi)和體外模型都證明了 RNAi具有良好的基因沉默效應(yīng)。由于RNAi具有特異、高效、毒性 小的特點(diǎn)，因此可以用來(lái)對(duì)一些腫瘤進(jìn)行治療。

發(fā)明內(nèi)容
為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種RALA基因的 小干擾RNA。本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述RALA基因的小干擾RNA的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種RALA基因的小干擾 RNA(siRNA)，所述小干擾RNA的序列如下正義鏈為5'-CGUGGAAACAUCUGCUAAATT-3‘；反義鏈為5'-UUUAGCAGAUGUUUCCACGTA-3‘。
上述的一種RALA基因的小干擾RNA可用于制備抗白血病的藥物。本發(fā)明的作用原理是RALA是一種癌基因，它翻譯的蛋白質(zhì)類似于RAS基因翻譯的連接于GTP上的連接蛋白，這種蛋白可以與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的 轉(zhuǎn)運(yùn)。研究表明RALA與腫瘤發(fā)生、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，尤其在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起重 要作用。本發(fā)明RALA siRNA可以下調(diào)RALA的表達(dá)，從而有效抑制人白血病k562細(xì)胞的生 長(zhǎng)，具有分子靶向抗白血病的作用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明設(shè)計(jì)合成RALAsiRNA， 將其導(dǎo)入人白血病K562細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RALA siRNA明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)RALA mRNA的表 達(dá)水平降低，RALA siRNA轉(zhuǎn)染k562細(xì)胞48小時(shí)后細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，持續(xù)至72小時(shí) (P < 0. 05)；轉(zhuǎn)染終濃度25nmol/L的RALA siRNA即開(kāi)始表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性， 125nmol/L的RALAsiRNA表現(xiàn)出非特異性抑制作用(P < 0. 05) ；RALA siRNA轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞 48小時(shí)后，RALA mRNA的表達(dá)水平顯著降低；本發(fā)明RALA siRNA可以通過(guò)下調(diào)癌基因RALA 的表達(dá)抑制人白血病k562細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)腫瘤基因治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，有望將其應(yīng)用 于白血病的治療，并在此基礎(chǔ)之上，開(kāi)發(fā)抗白血病新藥，為臨床白血病的防治做出貢獻(xiàn)。


圖1是RALA siRNA抑制k562細(xì)胞生長(zhǎng)的量效關(guān)系圖，*表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖2是RALA siRNA抑制k562細(xì)胞生長(zhǎng)的時(shí)效關(guān)系圖，*表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖3是Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RALA mRNA的相對(duì)表達(dá)水平圖，*表示有統(tǒng)計(jì)
學(xué)意義。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)例與附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的敘述，但本發(fā)明的實(shí)施方法 靈活，不僅僅限于此例所述的具體操作方式。實(shí)施例中所需材料的準(zhǔn)備RALA siRNA 序列如下正義鏈5'-CGUGGAAACAUCUGCUAAATT-3‘；反義鏈5'-UUUAGCAGAUGUUUCCACGTA-3‘；以隨機(jī)序列的RNA雙鏈(scramble，SCR)作對(duì)照，隨機(jī)RNA雙鏈序列如下正義鏈5'-UUCUCCGAAC⑶⑶CAC⑶TT-3‘；反義鏈5'-AC⑶GACACGUUCGGAGAATT-3‘；RALA siRNA和隨機(jī)RNA雙鏈由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，-20°C保存。細(xì)胞培養(yǎng)將K562細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%的新生牛血清、無(wú)抗生素的DMEM/ F12培養(yǎng)基中，置于37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱，飽和濕度下培養(yǎng)。每2 3天換液 傳代。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、0. 2%臺(tái)盼藍(lán)拒染率> 95%的細(xì)胞。實(shí)施例1 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測(cè)RALA siRNA對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用的量效 效應(yīng)及抑制率本實(shí)施例分RALA siRNA組、隨機(jī)對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。RALAsiRNA組中RALA siRNA序列的核酸終濃度為25、50、75、100和125nmol/L，隨機(jī)對(duì)照組中隨 機(jī)序列的RNA雙鏈的核酸終濃度為25、50、75、100和125nmol/L。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì) 胞，各組細(xì)胞以1 X IOVmL的密度接種于96孔板，每孔50 μ L，轉(zhuǎn)染體積100 μ L (轉(zhuǎn)染方法 參照Invitrogen公司LipofectamineTM 2000說(shuō)明書(shū))，空白對(duì)照組加入50 μ L的無(wú)血清 Opti-MEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染6h后，加入100 μ L含20%血清DMEM/F12培養(yǎng)基，使終體積200 μ L。 48小時(shí)后每孔加入MTT液20 μ L，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后，1000rpm/min離心lOmin，棄上 清，每孔加入150yL 二甲基亞砜(DMSO)；震蕩使結(jié)晶充分溶解，在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定吸 光度A57tlIim,以A57tl間接反映存活細(xì)胞量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，計(jì)算增殖抑制率。增殖抑制率=
實(shí)驗(yàn)組Α對(duì)照組)]X100%。采用SPSS 13. O統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(i±S)表示，采用完全隨 機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析法(one-way AN0VA)分析各組數(shù)據(jù)間差異的顯著性。以P < 0. 05 為有顯著性差異。檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，轉(zhuǎn)染25nmol/L RALA siRNA即開(kāi)始表現(xiàn)出抑制細(xì)胞生長(zhǎng)活 性，終濃度lOOnmol/L RALA siRNA作用效果最佳，且細(xì)胞毒性小，隨著濃度的增大，抑制效 應(yīng)增強(qiáng)，但毒性增加，與隨機(jī)對(duì)照組和空白對(duì)照組相比有顯著差異(P < 0. 05)。實(shí)施例2 臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)RALA siRNA對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用的時(shí)間效應(yīng)
實(shí)驗(yàn)分組及轉(zhuǎn)染處理同實(shí)施例1，RALA siRNA組中RALA siRNA序列的核酸終濃度 為lOOnmol/L，隨機(jī)對(duì)照組中隨機(jī)序列的RNA雙鏈的核酸終濃度為lOOnmol/L。于24、48和 72小時(shí)將每組細(xì)胞充分混勻后用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)每組活細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次，取均值。采用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(〗±S)表示，采用完全隨 機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析法(one-way AN0VA)分析各組數(shù)據(jù)間差異的顯著性。以P < 0. 05 為有顯著性差異。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，終濃度lOOnmol/L的RALA siRNA作用于k562細(xì)胞后48小 時(shí)開(kāi)始表現(xiàn)出生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，持續(xù)至72小時(shí)，與隨機(jī)對(duì)照組和空白對(duì)照組相比有顯著差異 (P < 0. 05)。實(shí)施例3 :Real-time PCR檢測(cè)RALA siRNA對(duì)細(xì)胞內(nèi)RAlA mRNA的表達(dá)水平影響實(shí)驗(yàn)分組同實(shí)施例1，各組細(xì)胞以1.5X105/mL的密度接種于24孔板，每孔 400 μ L，轉(zhuǎn)染終體積500 μ L0 6小時(shí)后加入500 μ L體積分?jǐn)?shù)為20%的血清培養(yǎng)基置于培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)。RALA siRNA組中RALA siRNA序列的核酸終濃度為lOOnmol/L，隨機(jī)對(duì)照組 中隨機(jī)序列的RNA雙鏈的核酸終濃度為lOOnmol/L。于48小時(shí)后收集細(xì)胞，總RNA抽提按 Trizol試劑(Invitrogen公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取的總RNA用紫外分光光度儀(UVPupland， USA)測(cè)A260/A280進(jìn)行RNA純度及濃度計(jì)算，利用SYBR Green I Real-time PCR檢測(cè)白血 病K562細(xì)胞內(nèi)RALAmRNA的表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參。逆轉(zhuǎn)錄條件37°C持續(xù)lh，95°C持 續(xù) 5min。Real-time PCR 條件① 94°C持續(xù) 5min ；② 94°C持續(xù) 30s ；③ RALA 56°C, GAPDH 57. 5°C持續(xù)30s ；④72°C持續(xù)30s ；⑤讀板；⑥第二步至第五步共40循環(huán)；⑦融解曲線分析， 60°C至95°C，讀板ls/0. 3°C。PCR所用引物自行設(shè)計(jì)，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成RALA 上游引物5 ‘ -ATCGGAAGAAGGTAGTGC-3 ‘，下游引物5 ‘ -AAATCTGCTCCCTGAAGT-3 ‘；GAPDH 上游引物5 ‘ -CAACGGATTTGGTCGTATT-3 ‘，
下游引物5' -CACAGTCTTCTGGGTGGC-3 ‘。RALA和GAPDH的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為182bp和541bp。RALA mRNA的相對(duì)表達(dá)水 平用<formula>formula see original document page 6</formula>和<formula>formula see original document page 6</formula>"計(jì)算。采用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用完全隨 機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析法(one-way AN0VA)分析各組數(shù)據(jù)間差異的顯著性。以P < 0. 05 為有顯著性差異。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，終濃度lOOnmol/L的RALA siRNA作用于k562細(xì)胞后48 小時(shí)后，RALA mRNA的表達(dá)水平顯著降低，與隨機(jī)對(duì)照組和空白對(duì)照組相比有顯著差異(P < 0. 05)。實(shí)施例4取實(shí)施例1合成的RALA siRNA,配制成濃度為lOOnmol/L的抗白血病藥物，臨床上 可以通過(guò)靜脈注射或者直接將siRNA藥物直接注射到瘤體內(nèi)進(jìn)行治療。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種RALA基因的小干擾RNA，其特征在于所述小干擾RNA的序列如下正義鏈為5′-CGUGGAAACAUCUGCUAAATT-3′；反義鏈為5′-UUUAGCAGAUGUUUCCACGTA-3′。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種RALA基因的小干擾RNA用于制備抗白血病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種RALA基因的小干擾RNA及其在制備抗白血病藥物中的應(yīng)用。所述小干擾RNA的序列如下正義鏈為5′-CGUGGAAACAUCUGCUAAATT-3′；反義鏈為5′-UUUAGCAGAU GUUUCCACGTA-3′。所述RALA基因的小干擾RNA可用于制備抗白血病的藥物。本發(fā)明RALAsiRNA可以通過(guò)下調(diào)癌基因RALA的表達(dá)抑制人白血病k562細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)腫瘤基因治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，有望將其應(yīng)用于白血病的治療，并在此基礎(chǔ)之上，開(kāi)發(fā)抗白血病新藥，為臨床白血病的防治做出貢獻(xiàn)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101812452SQ201010157678
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2010年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月21日
發(fā)明者姚君琳, 朱雪姣, 李燦峰, 李育敏, 林春燕, 谷景義, 費(fèi)嘉, 黃康康 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)