專利名稱：白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測方法及診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及體外診斷檢測技術領域，具體涉及多種白血病融合基因的液相芯片聯(lián) 合并行檢測方法及其診斷試劑盒。
背景技術：
白白血病是由于造血干細胞分化異常和惡性增生而引起的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，是 我國最常見的惡性腫瘤之一。隨著白血病研究的不斷進展，發(fā)現(xiàn)許多白血病患者具有特異 性的染色體易位，導致新的融合基因產(chǎn)生，這些異?；蛞殉蔀椴煌愋桶籽〉姆肿由?物學特異性標志。2000年WHO關于白血病分型的標準中更是將一些常見異?；驓w納為白 血病基本診斷的標準。因此，在分子基因水平對白血病相關的融合基因進行檢測，不僅可以 為白血病診斷、分型、臨床治療選擇和預后判斷提供重要依據(jù)，同時也為白血病微小殘留病 變提供檢測基礎。白血病中常見的融合基因有慢性粒細胞白血病(CML)中的BCR-ABL (b2a2)、 BCR-ABL(b3a2)；急性淋巴細胞性白血病(ALL)中的 BCR-ABL(ela2)、E2A-PBX1、TEL-AML1、 MLL-AF4(elO/e4)；急性粒細胞白血病(AML)中的 CBFB-MYH11 (A type)、AML1-ET0 ；急性早 幼粒細胞白血病(APL)中的 PML-RARA (L form)、PML-RARA (S form)。目前，白血病主要是依靠細胞形態(tài)學、免疫學、細胞遺傳學、分子生物學等檢測方 法來進行診斷和檢測分型。細胞形態(tài)學受主觀因素影響，臨床診斷的一致率僅為70%左 右。核型分析和顯帶技術等細胞遺傳學方法是在全基因組水平篩查染色體易位，容易漏檢 許多染色體的微小異常。免疫學方法具有較高的假陽性率和假陰性率，并且無法做到早期 診斷。當前國內(nèi)外廣泛使用的分子生物學檢測白血病融合基因的方法中，熒光原位雜交技 術(FISH)只能進行定性檢測、操作復雜；熒光定量PCR存在著檢測通量的局限性，所以都還 不能真正滿足臨床診斷檢測的需要。傳統(tǒng)的固相生物芯片(Biochip)技術存在著可重復性 差、靈敏度不夠好以及操作繁瑣的突出弱點。因此臨床上需要有一種檢測方法，能夠迅速、 穩(wěn)定、準確地對白血病的多種融合基因進行聯(lián)合并行檢測，液相芯片技術(xMAP)正是這樣 一種新型檢測技術。液相芯片能夠對少量樣本進行定性、定量檢測，具有高通量、操作簡便、重復性好、 靈敏度高、線性范圍寬等突出優(yōu)點。該系統(tǒng)是由許多微球為主要基質構成的，在微球的制造 過程當中，摻入了兩種不同的紅色分類熒光，根據(jù)這兩種熒光的比例不同，把球形基質分為 100種，可以標記上100種不同的探針分子，能同時對一個樣品中多達100種不同的目標分 子進行檢測。根據(jù)檢測物的不同，微球表面可以共價結合各種各樣的核酸檢測探針，在雜交 反應進行時再加上熒光標記。在同一反應體系中可以同時加入不同的檢測微球，這樣就可 以利用少量的樣本進行快速、高通量的檢測。反應結束后，通過微流體技術將微球排成單列 快速流經(jīng)液相芯片檢測儀，每個微球可同時被兩束激光檢測到，紅色激光激發(fā)微球上的紅 色分類熒光，將各個不同的反應區(qū)分開來而定性；綠色激光則激發(fā)結合在待測樣本上的熒 光標記進行定量。當標記好的待測樣本與特定微球上的探針結合在一起時，兩束激光所激發(fā)的光均可被檢測到。最后，通過計算機的高速數(shù)字信號處理器，可以自動統(tǒng)計分析得出特 定微球上的平均熒光強度，從而確定檢測物的種類和數(shù)量。本發(fā)明基于液相芯片技術的高通量、操作簡便、重復性好、靈敏度高、線性范圍寬 等突出優(yōu)點，對白血病的多種融合基因進行聯(lián)合并行檢測，能夠在臨床檢測上得到更好的 應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術問題是提供一種白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測方法及診斷試劑盒。該方法及試劑盒包含對BCR-ABL (b2a2)、BCR-ABL (b3a2)、BCR-ABL (ela2)、 E2A-PBX1、TEL-AMLl、MLL-AF4 (el0/e4)、CBFB-MYH11 (A type)、AMLl-ETO, PML-RARA (L form)、PML-RARA(S form)，10種融合基因聯(lián)合并行檢測，可以對慢性粒細胞白血病(CML)、 急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性粒細胞白血病(AML)、急性早幼粒細胞白血病(APL)進 行臨床分型，同時對患者進行療效觀察、預后及微小殘留疾病進行動態(tài)監(jiān)測。本檢測方法及 診斷試劑盒具有高靈敏度、高特異性、高準確度、檢測迅速等優(yōu)點。為解決上述技術問題，本發(fā)明的白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測方法，包括以下 步驟(1)包含10種不同熒光編碼的羧基微球beads，編號分別為11、15、17、21、25、33、 37、45、50、56 ；每種微球上分別共價結合針對白血病中染色體易位形成的10種融合基因的 mRNA所設計的特異性核酸探針(DNA探針)；(2)針對不同白血病類型中染色體易位所形成的10種融合基因的mRNA，分別設計 上下游引物，對不同的融合基因mRNA，通過逆轉錄PCR擴增出相應的產(chǎn)物；(3)含有特異性核酸探針的微球與融合基因mRNA的逆轉錄擴增產(chǎn)物雜交后，加入 鏈霉親和素_藻紅蛋白(Sti^ptavidin-PE)，通過液相芯片法xMAP檢測熒光信號；(4)將檢測到的熒光信號與內(nèi)參基因的熒光信號進行比較，從而確定檢測樣品中 是否含有白血病相關的融合基因，和/或樣品中融合基因的表達狀況。以上檢測方法中所述的微球是平均直徑為5. 6 μ m，結合了不同熒光染料的聚苯烯 微球，即色彩編碼微球(color-coded beads)；白血病中染色體易位形成的融合基因是針 對以下10種可以自由組合的融合基因BCR-ABL(b2a2)、BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(ela2)、 E2A-PBX1、TEL-AMLl、MLL-AF4 (el0/e4)、CBFB-MYH11 (A type)、AMLl-ETO, PML-RARA (L form), PML-RARA(S form)。所述的共價結合于微球上的10條特異性核酸探針(DNA探針)，包括如下序列(其 中5’端含氨基修飾)BCR-ABL(b2a2) :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTCTTCCTTATT_3，，如 SEQID NO. 1 所示；BCR-ABL(b3a2) :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTTTGAACTCTG_3，，如 SEQID N0. 2 所示；BCR-ABL(ela2) :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTCTGCGTCTCC_3，，如 SEQID N0. 3 所示；E2A-PBX1 :5，-AminolinkerC12TACTCAAAACACTGTAGGAG_3，，如 SEQ ID N0. 4 所示；
TEL-AMLl :5，-AminolinkerC12TCCAAGTATGCATTCTGCTA-3‘,如 SEQ ID NO. 5 所示；MLL-AF4(elO/e4) :5，-AminolinkerC12AGTAGGTCTGCTTAAAGTCC_3，，如SEQID NO. 6 所示；CBFB-MYH11(A type) :5， -AminolinkerC12GCTCATGGACCTCCATTTCC_3，，如 SEQID NO. 7所示；AMLl-ETO :5，-AminolinkerC12TCAGTACGATTTCGAGGTTC_3，，如 SEQ ID NO. 8 所示；
PML-RARA(L form) :5， -AminolinkerC12GTCTCAATGGCTGCCTCCCC_3，，如 SEQID NO. 9所示；PML-RARA(S form) :5， -AminolinkerC12GTCTCAATGGCTTTCCCCTG_3，，如 SEQID NO. 10所示；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。所述的針對不同融合基因的mRNA所設計的上下游引物，包括如下序列(其中上游 引物5’端含生物素標簽)BCR-ABL(b2a2)上游引物 5，-biotin TGTGTGAAACTCCAGACTGTCC-3，，如 SEQID NO. 11 所示；下游引物 5’ -GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如 SEQ ID N0. 12 所示；BCR-ABL(b3a2)上游引物 5， -biotin GGTTTCTGAATGTCATCGTCC-3，，如 SEQID N0. 13 所示；下游引物 5’ -GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如 SEQ ID N0. 14 所示；BCR-ABL (ela2)上游引物 5，-biotin ACTGCCCGGTTGTCGTGT-3，，如 SEQ IDN0. 15 所示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如 SEQ ID N0. 16 所示；E2A-PBX1 上游引物 5，-biotin CACCAGCCTCATGCACAAC-3，，如 SEQ ID N0. 17 所 示；下游引物 5，-CACGCCTTCCGCTAACAG-3，，如 SEQ ID N0. 18 所示；TEL-AMLl 上游引物 5，_biotin ACCTCTCTCATCGGGAAGACC-3，，如 SEQ ID N0. 19 所 示；下游引物 5，-TGGCATCGTGGACGTCTCTAG-3，，如 SEQ ID N0. 20 所示；MLL-AF4(elO/e4)上游引物 5，_biotin CCACCTCCGGTCAATAAG-3，，如 SEQ IDN0. 21 所示；下游引物 5，-CTAGGCGTATGTATTGCTGTC-3，，如 SEQ ID N0. 22 所示；CBFB-MYH11 (A type)上游引物 5，-biotinAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-3，，如 SEQID N0. 23 所示；下游引物 5，-CTCTTCCAGCTGCGTCTTCATC-3，，如 SEQ ID N0. 24 所示；AML1-ET0 上游引物 5，_biotin CAAGTCGCCACCTACCACAGAG-3，，如 SEQ IDN0. 25 所 示；下游引物 5，-GTGGCATTGTTGGAGGAGTCAG-3，，如 SEQ ID N0. 26 所示；PML-RARA(L form)上游弓丨物 5， -biotinCCCGTCATAGGAAGTGAGGT-3，，如 SEQ IDN0. 27 所示；下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，，如 SEQ ID N0. 28 所示；PML-RARA(S form)上游弓丨物 5，-biotin CAGGACCTCAGCTCTTGCAT-3，，如 SEQ IDN0. 29 所示；下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，，如 SEQ ID N0. 30 所示；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補序列；
或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。所述的內(nèi)參基因Abelson基因的引物和探針序列如下上游引物5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 31 所示；下游引物5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 32 所示；探針5，-AminolinkerC12CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID NO. 33 所示；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。本發(fā)明另一個解決的問題是，提供一種檢測白血病多種融合基因的診斷試劑盒， 包含共價結合了白血病融合基因mRNA特異性探針的微球混合物、結合了 Abelson基因探針 的微球、白血病融合基因mRNA的上下游引物、Abelson基因的上下游引物、鏈霉親和素-藻 紅蛋白Str印tavidin-PE、質控品(陰性對照和陽性對照)。以上試劑盒中所述的質控品包含陽性對照和陰性對照，其中陽性對照為含有各種融合基因質粒的混合液(包括含Abelson基因的質粒)，陰性對照品為不含有融合基因及 Abelson基因的質粒；所述的微球混合物，根據(jù)不同檢測樣品的需要自由組合。本發(fā)明的一種檢測白血病多種融合基因的診斷試劑盒，可用于檢測體外樣品，對 白血病進行分型，早期診斷，療效觀察，預后與微小殘留疾病的動態(tài)監(jiān)測。由于本發(fā)明利用了液相芯片技術，使檢測方法及試劑盒具有高靈敏度、高特異性、 高通量、穩(wěn)定性好、檢測迅速、準確等突出優(yōu)點，能夠對白血病融合基因進行定性和定量檢 測，能在臨床檢測上得到更好的應用。
具體實施例方式下面結合具體實施例詳細說明本發(fā)明，但并不能理解為對本發(fā)明的限制。所述的 實施例只提供闡明核酸探針、試劑盒及其制作和應用方法而不為其所限制。期間各種變化 形式在本發(fā)明和所述的權項的范圍內(nèi)是可預期的。實驗材料引物和探針均由invitrogen公司合成；Trizol購自invitrogen公司；逆轉錄 cDNA合成試劑盒、PCR試劑購置于Fermentas公司；不同編號的微球(表面羧基修飾)、鏈 霉親和素_藻紅蛋白均購置于QIAGEN公司；1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二 亞胺鹽酸鹽(EDC)購置于Pierce公司；2-(N-嗎啉)-乙磺酸(MES)、N-月桂?；彼徕c (Sarkosyl)、四甲基氯化銨(TMAC)均購置于sigma公司。緩沖液和雜交液的配制偶聯(lián)緩沖液，ρΗ4·5 250mlMES4. 88g ；1.5 X TMAC 雜交溶液 250ml5M TMAC225ml20% Sarkosyl1.88mlIM Tris-HCl, ρΗ8. O 18.75ml
0. 5M EDTA, ρΗ8· 0 3. OmlH2O1. 37ml ；1.5 X TMAC 雜交溶液 250ml5M TMAC150ml20% Sarkosyl1.25mlIM Tris-HCl, pH8. 0 12.5ml0. 5M EDTA, pH8. 0 2. OmlH2O84. 25ml ；TE 緩沖液，pH8. 0500mlIM Tris-HCl, pH8. 0 5ml0. 5M EDTA, pH8. 0 ImlH2O444ml實例1 :4種白血病融合基因的液相芯片聯(lián)合并行檢測方法具體的檢測方法包括如下步驟一 .檢測 BCR-ABL (b2a2)、TEL-AMLl、CBFB-MYH11 (A type)、PML-RARA (L form)四 種融合基因的微球混合液的制備1.按照以下序列合成寡核苷酸探針BCR-ABL (b2a2) 5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTCTTCCTTATT_3，TEL-AML 15， -AminolinkerC12TCCAAGTATGCATTCTGCTA-3‘CBFB-MYH11(A type) 5，-AminolinkerC12GCTCATGGACCTCCATTTCC_3，PML-RARA (L form) 5，-AminoIinkerC 12GTCTCAATGGCTGCCTCCCC-3，Abelson 基因 5，-AminolinkerC12CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3'2.將含有氨基修飾的寡核苷酸探針分別與編號為11、25、37、50、64號的5種羧基 微球偶聯(lián)2. 1取出一小份_20°C保存的新鮮干粉狀EDC平衡到室溫；2. 2 用 dH20 分另Ij 溶解 BCR-ABL (b2a2)、TEL-AML 1、CBFB-MYH11 (A type)、 PML-RARA(Lform),Abelson 的寡核苷酸探針，濃度為 lmM(lnmol/y 1)；2. 3分別全速渦旋編號為11、25、37、50、64號的5種羧基微球儲存懸液至少3min， 產(chǎn)生均一的微球懸液；2. 4分別取2. 5 X IO6微球儲存懸液到五個離心管中；2. 510，OOOg,離心，l_2min ；2. 6移除上清液，用50 μ 1 0. IM MES, ρΗ4. 5的偶聯(lián)緩沖液，重懸微球，渦旋震蕩20 秒；2. 7將五種濃度為ImM寡核苷酸探針分別用dH20以1 10的比例稀釋，使其濃度為 0. Inmol/μ 1 ；2. 8每種探針各加入2 μ 1 (濃度為0. Inmol/μ 1)到混勻的相應的微球里，渦旋混 合；2. 9用dH20配制10mg/ml的新鮮EDC溶液(注意保持EDC粉末干燥，便于下一步 EDC的使用)；
2. 10加入2. 5 μ 1 10mg/ml EDC的的新鮮EDC溶液分別到五種微球中(25 μ g終濃 度約為0. 5 μ g/ μ 1)渦旋混勻；2. 11室溫避光孵育30min ；2. 12用dH20配制第二份10mg/ml的EDC新鮮溶液(注意EDC粉末如果潮解，則 應丟棄，建議每一步偶聯(lián)過程都使用新鮮的EDC粉末)；2. 13五種微球中各加入2. 5 μ 110mg/ml的EDC新鮮溶液，渦旋混勻；2. 14室溫避光孵育30min ；2. 15五種偶聯(lián)微球中各加入Iml 0. 02% Tween-20 ；2. 1610，OOOg，離心，l_2min ；2. 17移除上清，分別用Iml 0. 1 % SDS重懸五種偶聯(lián)微球，振蕩混勻；2. 1810，000g，離心，l-2min ；2. 19移除上清，分別加入100 μ 1 TE, ρΗ8· 0，渦旋混合20s,重懸微球；2. 20用細胞計數(shù)器計數(shù)五種偶聯(lián)了寡核苷酸探針的微球；a.用dH20將偶聯(lián)微球以1 100稀釋；b.渦旋震蕩充分混勻；c.取10 μ 1到細胞計數(shù)器上；d.數(shù)細胞計數(shù)器上4個角大格的微球總量；e.微球/ μ 1 = (4大格微球總量)X 2. 5 X 100 (稀釋倍數(shù))。3.微球混合液的配制將上述偶聯(lián)了寡核苷酸探針的微球，如下列分別為BCR_ABL(b2a2)探針微球11、 TEL-AMLl 探針微球 25、CBFB-MYH11(A type)探針微球 37、PML-RARA (L form)探針微球 50、 Abelson探針微球64，等比例混合，各種微球的終濃度為1500個/ μ 1，2_8°C避光保存。二.樣本的制備1-4號白血病患者的臨床樣本分別按照下面的步驟提取RNA 1.淋巴細胞提取取新鮮全血2ml加Iml 3%檸檬酸鈉，混勻后3000r/min離心， 10min，4°C，取血球層上淺黃色層即為淋巴細胞；2.取1個離心管(經(jīng)DEPC水處理)加入淋巴細胞液150 μ 1.然后加Iml TRIZ0L， 室溫放置5min，使其充分裂解；3. 12，OOOrpm 離心 5min，取上清；4.每Iml Trizol中加入200 μ 1氯仿，劇振蕩混勻后室溫放置15min ；5. 4°C 12，OOOg 離心 15min ；6.吸取上層水相，至另一離心管中；7.每Iml Trizol中加入500 μ 1異丙醇混勻，室溫放置5-lOmin ；8. 4"C 12，OOOg 離心 lOmin，棄上清，RNA 沉于管底；9.按每Iml Trizol中加入Iml 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；10. 4"C 8，OOOg 離心 5min，盡量棄上清；11.室溫晾干或真空干燥5-lOmin ；12.可用 50ul H2OjTE buffer 或 0. 5% SDS 溶解 RNA 樣品，55_60°C，5-lOmin (H20、 TE或0. 5% SDS均須用DEPC處理并高壓)；
13.測OD值定量RNA濃度。三.多重RT-PCR按照如下方法對上述的1-4號樣本的mRNA進行多重逆轉錄PCR擴增l.cDNA第一鏈的合成①取一經(jīng)DEPC處理過的微量離心管，置于冰上，建立下列反應體系；Total RNA5 10 μ g/3 μ 1
Oligo (dT) 18Primer (0. 5 μ g/ μ 1)1 μ 1EDPC-treated waterforword to12 μ 1輕輕混勻反應液，用冷凍離心機稍微離心收集管壁上的反應液到管底；②離心管于70°C溫育5分鐘，之后迅速取出置于冰中冷卻，用冷凍離心機稍微離 心收集管壁上的反應液到管底；③將離心管放置于冰上，按順序加入以下反應液；5Xreaction buffer4 μ 1RNase Inhibitor (20U/μ 1) 1 μ 1IOmMdNTPsMix2μ 1輕輕混勻反應液，用冷凍離心機稍微離心收集管壁上的反應液到管底；④離心管于37°C溫育5分鐘；⑤力口入 1 μ 1 RevertAidTM Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)，終體積為 20 μ 1 ；⑥離心管于42°C反應60分鐘；⑦離心管于70°C加熱10分鐘終止反應，之后迅速取出置于冰中冷卻；2.多重 PCR2. 1按照如下序列合成引物BCR-ABL(b2a2) 上游引物 5，-biotin TGTGTGAAACTCCAGACTGTCC-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，TEL-AMLl上游引物 5，-biotin ACCTCTCTCATCGGGAAGACC-3，下游引物 5，-TGGCATCGTGGACGTCTCTAG-3，CBFB-MYHlKA type)上游引物 5，-biotinAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-3，下游引物 5，-CTCTTCCAGCTGCGTCTTCATC-3，PML-RARA(L form)上游引物 5，-biotinCCCGTCATAGGAAGTGAGGT-3，下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，Abelson 基因上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，2. 2PCR反應體系如下cDNA10 μ 110XPCR Buffer10 μ 1MgCl2 (25mmol/L)4μ 1dNTPs (IOmM)0. 5 μ 1Taq Polymerase (5u/μ 1) 0. 5 μ 1Primer mix5 μ 1
dd H2O20 μ 1終體積為50 μ 1PCR 擴增程序:95 V IOmin ；95 V 30s, 64-50°C lmin，72°C 30min ；前 14 個循環(huán)，每
循環(huán)一次，退火溫度降低l°c，后21個循環(huán)，退火溫度保持在50°C中進行；72°C 7min ；4°C保溫。四.寡核苷酸探針和PCR產(chǎn)物的雜交1.選取步驟一中配制的寡核苷酸探針微球混合物；2.渦旋震蕩20s，混勻微球；3.制備微球工作液，用1. 5 X TMAC雜交溶液稀釋偶聯(lián)微球至濃度為150個微球/ μ 1。(注每個反應需要33 μ 1的微球工作液)；4.渦旋震蕩20s，混勻微球工作液；5.向樣本孔、陽性對照孔、陰性對照孔內(nèi)分別加入33μ 1微球工作液；6.向每個樣品孔內(nèi)分別加入1-4號患者樣本的PCR擴增產(chǎn)物和TE溶液(ρΗ為 8. 0)，總體積為17 μ 1 ；7.用排槍上下吸打，溫柔混勻反應液；8.蓋上反應蓋避免蒸發(fā)，在95-100°C下孵育l_3min，使樣品中的寡核苷酸去掉二 級結構；9.在雜交溫度下孵育反應板15min ；10.制備新鮮的檢測混合液，用IXTMAC雜交溶液稀釋鏈霉親和素藻紅蛋白溶液 至10 μ g/ml (每個反應需要25 μ 1的檢測混合液)；11.向每孔加入25 μ 1的檢測混合液，用排槍上下吸打，溫柔混勻；12.在雜交溫度下孵育5min ；上述步驟可以通過PCR儀按以下方案編程將其合并95°C，l_3min;雜交溫度，forever；13.在液相芯片儀(LiquiChip 200，QIAGEN公司)上，保持雜交溫度，對各反應孔 進行檢測分析，測定熒光MFI值(平均熒光強度)。五.檢測結果及分析檢測結果(熒光MFI值)如下 結果分析 1號患者類型為白血病融合基因TEL-AMLl陽性，2號患者類型為白血病融合基因 BCR-ABL (b2a2)陽性，3號患者類型為白血病融合基因CBFB-MYH11 (A type)陽性，4號患者 類型為白血病融合基因PML-RARA(L form)陽性；同時，將患者呈現(xiàn)陽性的融合基因的熒光 MFI值與內(nèi)參Abelson基因的熒光MFI值相比，可得出融合基因的表達狀況。實例2 10種白血病融合基因的液相芯片聯(lián)合并行檢測方法具體的檢測方法包括如下步驟一 .檢測 BCR-ABL (b2a2)、BCR-ABL (b3a2)、BCR-ABL (ela2)、E2A-PBX1、TEL-AMLl、 MLL-AF4(elO/e4)、CBFB-MYH11 (A type)、AMLl-ETO, PML-RARA (L form)、PML-RARA (Sform) 十種融合基因的微球混合液的制備1.按照以下序列合成寡核苷酸探針BCR-ABL(b2a2) 5 ‘ -Amino1inkerCl2TGAAGGGCTTCTTCCTTATT-3‘BCR-ABL(b3a2) 5， -AminolinkerC12TGAAGGGCTTTTGAACTCTG_3，BCR-ABL(ela2) 5' -Amino1inkerCl2TGAAGGGCTTCTGCGTCTCC-3‘E2A-PBX 15， -AminolinkerC12TACTCAAAACACTGTAGGAG-3‘TEL-AML 15’ -AminolinkerCl2TCCAAGTATGCATTCTGCTA-3‘MLL-AF4(elO/e4) 5‘ -AminolinkerCl2AGTAGGTCTGCTTAAAGTCC-3‘CBFB-MYH11(A type) 5，-AminolinkerC12GCTCATGGACCTCCATTTCC_3，AML1-ET05’ -AminolinkerCl2TCAGTACGATTTCGAGGTTC-3‘PML-RARA(L form) 5' -Amino1inkerCl2GTCTCAATGGCTGCCTCCCC-3‘PML-RARA(S form) 5' -Amino1inkerCl2GTCTCAATGGCTTTCCCCTG-3‘Abelson 基因5，-AminolinkerC12CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT_3，2.將以上含有氨基修飾的寡核苷酸探針分別與編號為11、15、17、21、25、33、37、 45、50、56、64號的11種羧基微球偶聯(lián)2. 1取出-小份_20°C保存的新鮮干粉狀EDC平衡到室溫；2. 2 用 dH20 分別溶解 BCR-ABL (b2a2)、BCR-ABL (b3a2) ,BCR-ABL (ela2)、E2A_PBX1、 TEL-AMLl、MLL-AF4(elO/e4)、CBFB-MYH11 (A type)、AMLl-ETO, PML-RARA (L form)、 PML-RARA(S form)、Abelson 的寡核苷酸探針，濃度為 lmM(lnmol/y 1)；2. 3分別全速渦旋編號為11、15、17、21、25、33、37、45、50、56、64號的11種羧基微 球儲存懸液至少3min，產(chǎn)生均一的微球懸液；2. 4分別取2. 5 X IO6微球儲存懸液到11個離心管中；2. 510，OOOg，離心，l_2min ；2. 6移除上清液，用50 μ 1 0. IM MES, ρΗ4. 5的偶聯(lián)緩沖液，重懸微球，渦旋震蕩20秒；
2. 7將11種濃度為ImM寡核苷酸探針分別用dH20以1 10的比例稀釋，使其濃 度為 0. Inmol/μ 1 ；2. 8每種探針各加入2 μ 1 (濃度為0. Inmol/μ 1)到混勻的相應的微球里，渦旋混 合；2. 9用dH20配制10mg/ml的新鮮EDC溶液(注意保持EDC粉末干燥，便于下一步EDC 的使用)；2. 10加入2. 5 μ 1 10mg/ml EDC的的新鮮EDC溶液分別到11種微球中(25 μ g終 濃度約為0. 5 μ g/ μ 1)渦旋混勻；2.11室溫避光孵育30min ；2. 12用dH20配制第二份10mg/ml的EDC新鮮溶液(注意EDC粉末如果潮解，則 應丟棄，建議每一步偶聯(lián)過程都使用新鮮的EDC粉末)；2. 1311種微球中各加入2. 5μ 1 10mg/ml的EDC新鮮溶液，渦旋混勻；2. 14室溫避光孵育30min ；2. 1511 種偶聯(lián)微球中各加入 Iml 0. 02% Tween-20 ；2. 1610，OOOg,離心，l_2min ；2. 17移除上清，分別用Iml 0. 1 % SDS重懸11種偶聯(lián)微球，振蕩混勻；2. 1810，OOOg,離心，l_2min ；2. 19移除上清，分別加入100 μ 1 TE, ρΗ8· 0，渦旋混合20s,重懸微球；2. 20用細胞計數(shù)器計數(shù)11種偶聯(lián)了寡核苷酸探針的微球；a.用dH20將偶聯(lián)微球以1 100稀釋；b.渦旋震蕩充分混勻；c.取10 μ 1到細胞計數(shù)器上；d.數(shù)細胞計數(shù)器上4個角大格的微球總量；e.微球/ μ 1 = (4大格微球總量)X 2. 5 X 100 (稀釋倍數(shù))。3.微球混合液的配制將上述偶聯(lián)了寡核苷酸探針的微球，如下列BCR-ABL(b2a2)探針微球11、 BCR-ABL (b3a2)探針微球 15、BCR_ABL (ela2)探針微球 17、E2A_PBX1 探針微球 21、TEL_AML1 探針微球 25、MLL-AF4(elO/e4)探針微球 33、CBFB-MYH11 (A type)探針微球 37、AML1-ET0 探針微球 45、PML-RARA (L form)探針微球 50、PML-RARA (S form)探針微球 56、Abelson 探 針微球64，等比例混合，各種微球的終濃度為1500個/μ 1，2-8°C避光保存。二 .樣本的制備1-10號白血病患者的臨床樣本分別按照下面的步驟提取RNA 1.淋巴細胞提取取新鮮全血2ml加Iml 3%檸檬酸鈉，混勻后3000r/min離心， 10min，4°C，取血球層上淺黃色層即為淋巴細胞；2.取1個離心管(經(jīng)DEPC水處理)加入淋巴細胞液150 μ 1，然后加Iml TRIZ0L， 室溫放置5min，使其充分裂解；3. 12，OOOrpm 離心 5min，取上清；4.每Iml Trizol中加入200 μ 1氯仿，劇振蕩混勻后室溫放置15min ；5. 4"C 12，OOOg 離心 15min ；
6.吸取上層水相，至另一離心管中；7.每Iml Trizol中加入500 μ 1異丙醇混勻，室溫放置5-lOmin ；8. 40C 12，OOOg 離心 lOmin，棄上清，RNA 沉于管底；9.按每Iml Trizol中加入Iml 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；10. 4"C 8，OOOg 離心 5min，盡量棄上清；11.室溫晾干或真空干燥5-10min ；12.可用 50ul H2O, TE buffer 或 0. 5% SDS 溶解 RNA 樣品，55_60°C，5-lOmin (H20、 TE或0.5% SDS均須用DEPC處理并高壓)；13.測OD值定量RNA濃度。三.多重RT-PCR按照如下方法對上述的1-10號樣本的mRNA進行多重逆轉錄PCR擴增1. cDNA第一鏈的合成①取一經(jīng)DEPC處理過的微量離心管，置于冰上，建立下列反應體系；Total RNA5 10 μ g/3 μ 1Oligo (dT) 18Primer (0. 5 μ g/ μ 1) 1 μ 1EDPC-treated water forword to 12 μ 1輕輕混勻反應液，用冷凍離心機稍微離心收集管壁上的反應液到管底；②離心管于70°C溫育5分鐘，之后迅速取出置于冰中冷卻，用冷凍離心機稍微離心收集管壁上的反應液到管底；③將離心管放置于冰上，按順序加入以下反應液；5Xreaction buffer4μ 1RNase Inhibitor (20U/μ 1) 1 μ 1IOmM dNTPs Mix2 μ 1輕輕混勻反應液，用冷凍離心機稍微離心收集管壁上的反應液到管底；④離心管于37°C溫育5分鐘；⑤力口入 1 μ 1 RevertAidTM Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)，終體積為 20 μ 1 ；⑥離心管于42°C反應60分鐘；⑦離心管于70°C加熱10分鐘終止反應，之后迅速取出置于冰中冷卻；2.多重 PCR2. 1按照如下序列合成引物BCR-ABL(b2a2)上游引物 5，-biotin TGTGTGAAACTCCAGACTGTCC-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，BCR-ABL(b3a2)上游引物 5，-biotin GGTTTCTGAATGTCATCGTCC-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，BCR-ABL(ela2)上游引物 5，-biotin ACTGCCCGGTTGTCGTGT-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，E2A-PBX1上游引物 5，-biotin CACCAGCCTCATGCACAAC-3，下游引物 5，-CACGCCTTCCGCTAACAG-3，TEL-AMLl上游引物 5，-biotin ACCTCTCTCATCGGGAAGACC-3，
下游引物 5，-TGGCATCGTGGACGTCTCTAG-3，MLL-AF4(elO/e4) 上游引物 5，-biotin CCACCTCCGGTCAATAAG-3，下游引物 5，-CTAGGCGTATGTATTGCTGTC-3，CBFB-MYHlKA type)上游引物 5，-biotinAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-3，下游引物 5，-CTCTTCCAGCTGCGTCTTCATC-3，AMLl-ETO上游引物 5，-biotinCAAGTCGCCACCTACCACAGAG-3，下游引物 5，-GTGGCATTGTTGGAGGAGTCAG-3，PML-RARA(L form) 上游引物 5，-biotinCCCGTCATAGGAAGTGAGGT-3，下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，PML-RARA(S form) 上游引物 5，-biotin CAGGACCTCAGCTCTTGCAT-3，下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，Abelson 基因上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，2. 2PCR反應體系如下cDNA10 μ 110XPCR Buffer10 μ 1MgCl2 (25mmol/L)4μ 1dNTPs (IOmM)0. 5 μ 1Taq Polymerase (5u/μ 1) 0. 5 μ 1Primer mix 11 μ 1dd H2O14 μ 1終體積為50 μ 1PCR 擴增程序:95 V IOmin ；95 V 30s, 64-50°C lmin，72°C 30min ；前 14 個循環(huán)，每
循環(huán)一次，退火溫度降低l°c，后21個循環(huán)，退火溫度保持在50°C中進行；72°C 7min ；4°C保
ilm ο四.寡核苷酸探針和PCR產(chǎn)物的雜交1.選取步驟一中配制的寡核苷酸探針微球混合物；2.渦旋震蕩20s，混勻微球；3.制備微球工作液，用1. 5 X TMAC雜交溶液稀釋偶聯(lián)微球至濃度為150個微球/ μ 1。(注每個反應需要33 μ 1的微球工作液)；4.渦旋震蕩20s，混勻微球工作液；5.向樣本孔、陽性對照孔、陰性對照孔內(nèi)分別加入33μ 1微球工作液；6.向每個樣品孔內(nèi)分別加入1-10號患者樣本的PCR擴增產(chǎn)物和TE溶液(ρΗ為 8. 0)，總體積為17 μ 1 ；7.用排槍上下吸打，溫柔混勻反應液；8.蓋上反應蓋避免蒸發(fā)，在95-100°C下孵育l_3min，使樣品中的寡核苷酸去掉二 級結構；9.在雜交溫度下孵育反應板15min ；10.制備新鮮的檢測混合液，用IXTMAC雜交溶液稀釋鏈霉親和素藻紅蛋白溶液至10 μg/ml (每個反應需要25 μ 1的檢測混合液)；11.向每孔加入25μ 1的檢測混合液，用排槍上下吸打，溫柔混勻；12.在雜交溫度下孵育5min ；上述步驟可以通過PCR儀按以下方案編程將其合并95°C，l_3min;雜交溫度，forever；13.在液相芯片儀(LiquiChip 200，QIAGEN公司)上，保持雜交溫度，對各反應孔 進行檢測分析，測定熒光MFI值。五.檢測結果及分析檢測結果(熒光MFI值)如下 結果分析 同時，將患者陽性融合基因的熒光MFI值與內(nèi)參Abelson基因的熒光MFI值相比， 可得出融合基因的表達狀況。在閱讀了以上關于本發(fā)明的陳述內(nèi)容之后，本領域的技術人員可以對本發(fā)明作各 種修改或變化，這些等價形式同樣歸屬于本申請所附權利要求書中所限定的范圍。序列表<110>江蘇邁迪基因生物科技有限公司<120>白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測方法及診斷試劑盒<130>NP-09-12968<160>33<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>1tgaagggctt cttccttatt20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>2tgaagggctt ttgaactctg20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>3tgaagggctt ctgcgtctcc20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>4tactcaaaac actgtaggag20<210>5<211>20<212>DNA<213> 人工序列<220><221>misc_feature
<223>(1). . . (20)<400>5tccaagtatg cattctgcta20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>6agtaggtctg cttaaagtcc20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>7gctcatggac ctccatttcc20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>8tcagtacgat ttcgaggttc20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>9gtctcaatgg ctgcctcccc 20
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<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>23aagaggctcg gagaaggaca c21<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>24ctcttccagc tgcgtcttca tc22<210>25<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>25caagtcgcca cctaccacag ag22<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>26gtggcattgt tggaggagtc ag22<210>27<211>20<212>DNA
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<223> 引物<400>31gcgcaaaatg ttggagatc19<210>32<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>32ggagcttttc acctttagtt atgc24<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>33ctgaagggct tcttccagat 20
權利要求
一種白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測方法，包括以下步驟(1)包含10種不同熒光編碼的羧基微球Beads，每種微球上分別共價結合針對白血病中染色體易位形成的10種融合基因的mRNA所設計的特異性核酸探針；(2)針對不同白血病類型中染色體易位所形成的10種融合基因的mRNA，分別設計上下游引物，對不同的融合基因mRNA，通過逆轉錄PCR擴增出相應的產(chǎn)物；(3)含有特異性核酸探針的微球與融合基因mRNA的逆轉錄擴增產(chǎn)物混合雜交，加入鏈霉親和素-藻紅蛋白Streptavidin-PE后，通過液相芯片法xMAP檢測熒光信號；(4)將檢測到的熒光信號與內(nèi)參基因的熒光信號進行比較，從而確定檢測樣品中是否存在白血病融合基因，以及樣品中融合基因的表達狀況。
2.如權利要求1所述的白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測方法，其特征在于，所述的微 球是色彩編碼微球Color-coded beads，其平均直徑為5. 6 μ m，是結合了不同熒光染料的聚 苯烯微球。
3.如權利要求1所述的白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測方法，其特征在于，所述的白 血病中染色體易位形成的融合基因是針對以下10種可以自由組合的融合基因BCR-ABL b2a2、BCR-ABL b3a2、BCR-ABL ela2、E2A-PBX1、TEL-AMLU MLL_AF4elO/e4、 CBFB-MYH11 A type、AML1-ET0、PML-RARA L form,PML-RARA S form。
4.如權利要求1所述的白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測方法，其特征在于，所述的共 價結合于微球上的10條特異性核酸探針，包括如下序列，其中5’端含氨基修飾BCR-ABL b2a2 :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTCTTCCTTATT_3，，如 SEQ IDN0. 1 所示； BCR-ABL b3a2 :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTTTGAACTCTG_3，，如 SEQ ID NO. 2 所示； BCR-ABL ela2 :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTCTGCGTCTCC_3，，如 SEQ ID NO. 3 所示； E2A-PBX1 :5，-AminolinkerC12TACTCAAAACACTGTAGGAG-3，，如 SEQ ID NO. 4 所示； TEL-AMLl :5，-AminolinkerC12TCCAAGTATGCATTCTGCTA_3，，如 SEQ ID NO. 5 所示； MLL-AF4elO/e4 :5，-AminolinkerC12AGTAGGTCTGCTTAAAGTCC_3，，如 SEQ IDN0. 6 所示； CBFB-MYH11A type :5，-AminolinkerC12GCTCATGGACCTCCATTTCC_3，，如 SEQID N0. 7 所示；AML1-ET0 :5，-AminolinkerC12TCAGTACGATTTCGAGGTTC-3，，如 SEQ ID N0. 8 所示； PML-RARA L form :5’ -AminolinkerC12GTCTCAATGGCTGCCTCCCC_3，，如 SEQ IDN0. 9 所示；PML-RARA S form :5，-AminolinkerC12GTCTCAATGGCTTTCCCCTG_3，，如 SEQ IDN0. 10 所示；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列； 或者與上述序列同源性大于85%的序列； 或者與上述序列的堿基互補序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
5.如權利要求1所述的白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測方法，其特征在于，所述的針 對不同融合基因的mRNA所設計的上下游引物，包括如下序列，其中上游引物5’端含生物素 標簽BCR-ABL b2a2 上游引物 5，-biotin TGTGTGAAACTCCAGACTGTCC-3，，如 SEQ IDN0. 11 所示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 12 所示；BCR-ABL b3a2 上游引物 5，-biotin GGTTTCTGAATGTCATCGTCC-3，，如 SEQ IDN0. 13 所 示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 14 所示； BCR-ABL ela2 上游引物 5，_biotin ACTGCCCGGTTGTCGTGT-3，，如 SEQ ID NO. 15 所示； 下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 16 所示；E2A-PBX1 上游引物 5，-biotin CACCAGCCTCATGCACAAC-3，，如 SEQ ID NO. 17 所示；下 游引物 5，-CACGCCTTCCGCTAACAG-3，，如 SEQ ID NO. 18 所示；TEL-AMLl 上游引物 5，-biotin ACCTCTCTCATCGGGAAGACC-3，，如 SEQ ID NO. 19 所示； 下游引物 5，-TGGCATCGTGGACGTCTCTAG-3，，如 SEQ ID NO. 20 所示；MLL-AF4elO/e4 上游引物 5，_biotin CCACCTCCGGTCAATAAG-3，，如 SEQ IDN0. 21 所示； 下游引物 5，-CTAGGCGTATGTATTGCTGTC-3，，如 SEQ ID NO. 22 所示；CBFB-MYHllAtype 上游引物 5，-biotinAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-3，，如 SEQID NO. 23 所示；下游引物 5，-CTCTTCCAGCTGCGTCTTCATC-3，，如 SEQ ID NO. 24 所示；AMLl-ETO 上游引物 5，-biotin CAAGTCGCCACCTACCACAGAG-3，，如 SEQ ID NO. 25 所示； 下游引物 5，-GTGGCATTGTTGGAGGAGTCAG-3，，如 SEQ ID NO. 26 所示；PML-RARA L form 上游引物 5，-biotinCCCGTCATAGGAAGTGAGGT_3，，如 SEQ IDN0. 27 所 示；下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，，如 SEQ ID NO. 28 所示；PML-RARA S form 上游引物 5，-biotin CAGGACCTCAGCTCTTGCAT-3，，如 SEQ IDN0. 29 所示；下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，，如 SEQ ID NO. 30 所示； 或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列； 或者與上述序列同源性大于85%的序列； 或者與上述序列的堿基互補序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
6.如權利要求1所述的白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測方法，其特征在于，所述的內(nèi) 參基因為Abelson基因，其引物和探針序列如下上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 31 所示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 32 所示；探針 5，-AminolinkerC12CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID NO. 33 所示；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
7.—種檢測白血病融合基因的診斷試劑盒，其特征在于，包含了權利要求1中所述的 共價結合了白血病融合基因特異性探針的微球混合物及結合了 Abelson基因探針的微球、 權利要求1中所述的白血病融合基因mRNA的上下游引物及Abelson基因的上下游引物、鏈 霉親和素-藻紅蛋白、質控品。
8.如權利要求7中所述的檢測白血病融合基因的診斷試劑盒，其特征在于，所述的微 球混合物，根據(jù)不同檢測樣品的需要自由組合。
9.如權利要求7中所述的檢測白血病融合基因的診斷試劑盒，其特征在于，所述的質控品包含陽性對照和陰性對照，其中陽性對照為含有各種融合基因質粒的混合液，包括含 Abelson基因的質粒；陰性對照品為不含有融合基因及Abelson基因的質粒溶液。
10. 一種如權利要求7所述的檢測白血病融合基因的診斷試劑盒在檢測體外樣品，對 白血病進行分型、早期診斷、療效觀察、預后與微小殘留疾病的動態(tài)監(jiān)測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測方法及診斷試劑盒，聯(lián)合并行檢測方法的特征是能夠一次性檢測白血病相關的多種融合基因。通過對白血病融合基因mRNA設計引物和探針，將探針與微球共價結合形成的探針微球混合物，與逆轉錄PCR擴增產(chǎn)物雜交，加入鏈霉親和素藻紅蛋白后，可檢測出不同微球的熒光信號，從而確定待檢測樣品中是否含有白血病融合基因及融合基因的表達狀況。本發(fā)明所述的方法及試劑盒具有高靈敏度、高通量性、檢測快速、準確等優(yōu)點，能夠對多種白血病融合基因同時進行定性和定量檢測。
文檔編號C12Q1/68GK101838682SQ20091005697
公開日2010年9月22日 申請日期2009年3月20日 優(yōu)先權日2009年3月20日
發(fā)明者孫黎, 徐春雷, 邵棠 申請人:江蘇邁迪基因生物科技有限公司