包含最優(yōu)化的貓白血病病毒包膜基因的重組貓白血病病毒疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供包含以及體內(nèi)或體外表達引發(fā)動物或人的抗FeLV的免疫應(yīng)答的FeLV抗原的載體，包含所述載體和/或FeLV多肽的組合物，抗FeLV免疫接種的方法和用于與這樣的方法和組合物一起使用的試劑盒。
【專利說明】包含最優(yōu)化的貓白血病病毒包膜基因的重組貓白血病病毒疫苗
[0001]與相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2011年7月20日遞交的美國臨時申請61/509，912的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及用于抵御動物中貓白血病病毒感染的組合物或疫苗。具體地，本發(fā)明提供了包含和體內(nèi)或體外表達引發(fā)動物的抗貓白血病病毒的免疫應(yīng)答的最優(yōu)化的貓白血病病毒包膜抗原的載體，包括包含所述載體的組合物，抗貓白血病病毒的免疫接種方法以及用于與這樣的方法和組合物一起使用的試劑盒。
[0004]發(fā)明背景
[0005]貓白血病病毒(FeLV)是全世界家貓感染的常見原因以及顯著的發(fā)病率和死亡率的原因。抗原血癥的流行可從健康貓中的I至5%變化至病貓中的 15 至 30%(Hosie Μ.J.等人，Veterinary Records, 1989, 128, 293-297; BraleyJ.，F(xiàn)eline Practice,1994，22，25-29;Malik R.等人，Australian VeterinaryJournal, 1997, 75, 323-327;Arjona A.等人,Journal of ClinicalMicrobiology, 2000, 38，3448-3449)。病毒可建立特征在于持續(xù)的病毒血癥和致命性結(jié)果的終生感染。大多數(shù)FeLV相關(guān)疾病在被感染的動物中持續(xù)發(fā)生，它們總是嚴(yán)重的并且最有可能是致命的。最常被診斷的病況有淋巴瘤、骨髓性白血病、免疫缺陷和非再生性貧血。感染可通過鑒定和隔離作為傳染源的持續(xù)性病毒血癥的貓來進行控制。疫苗還幫助阻止病毒播散。幾種FeLV疫苗是可獲得的。它們中的大部分包含滅活的病毒或重組亞單位。它們的效力是有爭議的(Sparkes A.H., Journal of Small Animal Practice, 1997, 38, 187-194)。已觀察到了疫苗分解(breakdown)。
[0006]備選的方法將是使用重組病毒載體。已就FeLV基因表達測試了金絲雀痘病毒載體，特別是 ALVAC 載體(Tartaglia J.等人，Journal of Virology, 1993, 67, 2370-2375;Poulet H.等人，Veterinary Record, 2003, 153, 141-145)。商業(yè)重組 FeLV 疫苗也是可獲得的(EUR1FEL? FeLV, Merial) ο
[0007]FeLV基因組編碼3個基因:編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)組分的GAG基因、編碼包膜糖蛋白的ENV基因和編碼聚合酶蛋白的POL基因(Thomsen D.R.,等人，Journal of GeneralVirology，73，1819-1824，1992)。FeLV包膜(ENV)基因編碼被細胞酶蛋白水解加工以產(chǎn)生主要包膜糖蛋白gp70和相關(guān)跨膜蛋白pl5E的gp85前體蛋白(DeNoronha, F.，等人，1978，Virology85:617-621; Nunberg, J.H.,等人，1983，PNAS81:3675-3679)?？缒さ鞍?pl5E 包含在Y反轉(zhuǎn)錄病毒間保守的具有免疫抑制性質(zhì)的序列(Mathes, L.E.等人，1978，Nature)。FeLV包膜糖蛋白是主要免疫原之一并且是FeLV特異性細胞毒性T細胞反應(yīng)以及中和抗體的靶標(biāo)(Flynn, J.N.，等人，2002，J.Virol.)。美國專利申請US2008/0008683討論了能夠調(diào)節(jié)病毒蛋白針對表達其的宿主的免疫抑制性質(zhì)。FeLV GAG基因編碼被蛋白酶(FeLV PRO基因)切割以產(chǎn)生衣殼蛋白的前體多聚蛋白。衣殼蛋白也是主要的免疫原，其誘導(dǎo)FeLV特異性細胞毒性T細胞反應(yīng)以及中和抗體(Flynn，J.N.，等人，2002, J.Virol.)。POL基因編碼3種蛋白質(zhì):蛋白酶(PRO)、反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。通過基因的蛋白酶部分進行的自加工產(chǎn)生POL區(qū)域的所有3種蛋白質(zhì)(Thomsen D.R.，等人，1992)。
[0008]存在對FeLV疫苗的效力和安全性的改善以及在現(xiàn)場條件下的更有效保護的一般需要。
[0009]發(fā)明概述
[0010]本發(fā)明的目的可以是下述的任一或所有:提供重組載體或病毒以及用于產(chǎn)生這樣的病毒的方法，和提供用于治療和預(yù)防FeLV感染的組合物和/或疫苗以及方法。
[0011]本發(fā)明提供了重組載體例如重組病毒，例如重組痘病毒，其包含和表達至少一個外源核酸分子，并且所述至少一個外源核酸分子可包含編碼來自FeLV蛋白的目標(biāo)免疫原或表位(例如FeLV ENV和/或FeLV GAG/PR0)的核酸分子。
[0012]具體地，本發(fā)明提供了重組載體，例如重組病毒，例如重組痘病毒，其包含和表達至少一個外源核酸分子，并且所述至少一個外源核酸分子可包含F(xiàn)eLV多肽和/或其變體或片段。
[0013]本發(fā)明還提供了包含這樣的表達載體或這樣的表達載體的表達產(chǎn)物的組合物或疫苗。
[0014]本發(fā)明還提供了用于誘導(dǎo)抗FeLV的免疫(或免疫原性)或保護性反應(yīng)的方法，以及用于防止FeLV或由FeLV引起的疾病狀態(tài)的方法，所述方法包括施用表達載體或所述表達載體的表達產(chǎn)物，或包含表達載體的組合物，或包含表達載體的表達產(chǎn)物的組合物。
[0015]本發(fā)明還涉及來自病毒的表達產(chǎn)物以及由所述表達產(chǎn)物或其體內(nèi)表達產(chǎn)生的抗體以及這樣的產(chǎn)物和抗體例如在診斷應(yīng)用中的用途。
[0016]這些和其它實施方案被公開，或根據(jù)下列詳細說明為顯然的并且被包含在下列詳細說明中。
[0017]附圖簡述
[0018]通過實例的方式給出的并且無意將本發(fā)明限定于所描述的特定實施方案的下列詳細說明可結(jié)合通過引用并入本文的附圖來進行理解，其中:
[0019]圖1提供了標(biāo)識指定給多核昔酸和蛋白質(zhì)序列的SEQ ID NO的表。
[0020]圖2描述了 pH6C5env(208.2)的質(zhì)粒圖譜。
[0021]圖3提供了包含F(xiàn)eLV ENV DNA和左右臂(SEQ ID NO: 36)以及來自質(zhì)粒pHCMV-ENVFeLV 的 FeLV ENV 蛋白(SEQ ID NO: 7)的質(zhì)粒 pCXL208.2 (pH6C5env)片段的序列。
[0022]圖4提供了質(zhì)粒pPB713的限制性圖譜。
[0023]圖5提供了 FeLV ENV DNA和蛋白質(zhì)的序列比對。
[0024]圖6提供了質(zhì)粒pPB712限制性圖譜。
[0025]圖7 顯示野生型GAG/PRO DNA(SEQ ID NO: 11)與密碼子最優(yōu)化的GAG/PRO DNA (SEQID NO: 10)之間的DA序列比對。
[0026]圖8提供了克隆方案。[0027]圖9提供了質(zhì)粒PJY1874.1的限制性圖譜。
[0028]圖10提供了 FeLV GAG-PRO蛋白序列。
[0029]圖11顯示了包含臂和插入物的pJY1874.1DNA片段的核苷酸序列(SEQ IDNO:38)。
[0030]圖12提供了用于產(chǎn)生VCP2294質(zhì)粒的克隆方案。
[0031]圖13顯示具有引物位置的VCP2294質(zhì)粒C3區(qū)域圖譜。
[0032]圖14描述了 VCP2294質(zhì)粒序列(注釋的)。
[0033]圖15提供了用于產(chǎn)生VCP2296質(zhì)粒的克隆方案。
[0034]圖16顯示具有引物位置的VCP2296質(zhì)粒C5區(qū)域圖譜。
[0035]圖17提供了用于產(chǎn)生VCP2295質(zhì)粒的克隆方案。
[0036]圖18描述了 VCP2295質(zhì)粒序列。
[0037]圖19是顯示攻擊后每組平均proviremia的演化的圖。
[0038]圖20是顯示攻擊后每組平均proviremia的演化和p27狀態(tài)的圖。
[0039]圖21是顯示與p27狀態(tài)相關(guān)的骨髓中的proviremia的圖。
[0040]圖22顯示在D35上的FeLV特異性-1FN Y應(yīng)答。
[0041 ] 圖23顯示在D35上的FeLV特異性(ENV肽混合物I號)IFN Y應(yīng)答。
[0042]圖24顯示在D35上的FeLV特異性(ENV肽混合物)IL-10應(yīng)答。
[0043]圖25顯示在D35上的FeLV特異性(GAG/PR0肽混合物)-1L-20應(yīng)答。
[0044]圖26a_b顯示在D35上的FeLV特異性(ENV刺激)-1FN Y /IL-10比率。
[0045]圖27顯示在D126上的FeLV特異性(GAG/PR0刺激)-1FN Y應(yīng)答。
[0046] 圖28a顯示在D126上的FeLV特異性(ENV刺激)-1L-10應(yīng)答。
[0047]圖28b顯示在D126上的FeLV特異性(GAG/PR0刺激)-1L-10應(yīng)答。
[0048]圖29顯示在D35上的FeLV特異性IFN y /IL-10比率FeLV ENV和GAG/PR0肽混合物。
[0049]發(fā)明詳述
[0050]應(yīng)注意，在本公開、尤其是權(quán)利要求中，術(shù)語例如“包含”、“包含有”、“包含(comprising)”等可具有美國專利法中歸于其的含義；例如，它們可意指“包括”、“包括有”、“包括(including)”等；并且術(shù)語例如“基本上由……組成的”和“基本上由……組成”具有美國專利法中歸于它們的含義，例如，它們允許未被明確地引述的元素，但不包括在現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的或影響本發(fā)明的基本或新穎特征的元素。
[0051]除非另有所指，否則技術(shù)術(shù)語按照常規(guī)用法來使用。分子生物學(xué)中常見術(shù)語的定義可見于Benjamin Lewin, Genes V.,由 Oxford University Press 出版，1994 (ISBNO-19-854287-9) ; Kendrew 等人(eds.)，The Encyclopedia of Molecular Biology,由 BlackwellScience Ltd.出版的，1994 (ISBN0-632-02182-9);和 Robert A.Meyers (ed.), MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers, Inc.出版的，1995 (ISBN1-56081-569-8)。
[0052]除非上下文清楚地另有所指，否則單數(shù)術(shù)語“一個/ 一種(a) ”、“一個/ 一種(an) ”和“所指物(the)”包括復(fù)數(shù)所指物。類似地，除非上下文明確地另有所指，否則單詞“或”意欲包括“和”。單詞“或”意指特定列表的任一個成員并且還包括所述列表的成員的任意組合。
[0053]術(shù)語“FeLV ENV多肽或DNA”是指任何天然或最優(yōu)化的/突變的FeLV ENV多肽或DNA，以及它們的衍生物和變體。例如，最優(yōu)化的/突變的FeLV ENV DNA可以是密碼子最優(yōu)化的FeLV DNA, FeLV ENV DNA可被最優(yōu)化來在FeLV多肽中產(chǎn)生單個氨基酸突變。最優(yōu)化的/突變的FeLV ENV多肽可包含單個氨基酸突變或雙氨基酸突變或多個氨基酸突變。
[0054]術(shù)語“動物”在本文中用于包括所有哺乳動物、鳥類和魚。如本文中所使用的動物可選自馬科(例如，馬)、犬科(例如，狗、狼、狐貍、郊狼、豺)、貓科(例如，獅子、老虎、家貓、野貓、其它大型貓和其它貓科動物包括獵豹和山貓)、?？?例如，牛)、豬科(例如，豬)、羊類(例如，綿羊、山羊、騎羊、野牛)、禽類(例如，X1、鴨、鵝、火雞、鶴鵓、雉雞、鶴踏、雀、鷹、烏鴉、駝鳥、鴯鹋和鶴鴕)、靈長類(例如，狐猴、跗猴、猴、長臂猿、人猿)、人和魚。術(shù)語“動物”還包括所有發(fā)育階段(包括胚胎期和胎兒期)的個體動物。
[0055]術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換地使用，以指連續(xù)氨基酸殘基的聚合物。
[0056]術(shù)語“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”是指RNA或DNA及其衍生物，例如包含經(jīng)修飾的主鏈的那些。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明提供了包含與本文中描述的那些序列互補的序列的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸可以以不同的方式(例如通過化學(xué)合成，通過基因克隆等)被制備，并且可采取各種形式(例如線性或分支的，單鏈或雙鏈的，或其雜交體，引物，探針等）。[0057]術(shù)語“基因”被廣義地用于指與生物功能相關(guān)的多核苷酸的任意區(qū)段。因此，基因或多核苷酸包括內(nèi)含子和外顯子(如在基因組序列中)，或僅編碼序列(如在cDNA中)，例如開放閱讀框架(ORF)，始于起始密碼子(甲硫氨酸密碼子)并終于終止信號(終止密碼子)?；蚝投嗪塑账徇€可包括調(diào)節(jié)它們的表達例如轉(zhuǎn)錄起始、翻譯和轉(zhuǎn)錄終止的區(qū)域。因此，還包括的是啟動子和核糖體結(jié)合區(qū)域(一般而言，這些調(diào)控元件位于編碼序列或基因的起始密碼子上游約60至250個核苷酸；Doree S M等人；Pandher K等人；Chung J Y等人)、轉(zhuǎn)錄終止子(一般而言，終止子位于編碼序列或基因的終止密碼子下游約50個核苷酸內(nèi)；Ward C K等人)?；蚧蚨嗪塑账徇€指表達mRNA或功能性RNA，或編碼特定蛋白質(zhì)的核酸片段，并且其包括調(diào)控序列。
[0058]如本文中所用，術(shù)語“免疫原性多肽”或“免疫原性片段”是指這樣的多肽或多肽的片段:其包含等位基因特異性基序、表位或其它序列從而所述多肽或片段將結(jié)合MHC分子并且誘導(dǎo)抗所述免疫原性多肽或免疫原性片段所源自的抗原的細胞毒性T淋巴細胞(“CTL”)應(yīng)答，和/或B細胞應(yīng)答(例如，抗體產(chǎn)生)，和/或T輔助淋巴細胞應(yīng)答，和/或延遲型超敏(DTH)應(yīng)答。DTH應(yīng)答是其中T細胞依賴性巨噬細胞活化和炎癥引起組織損傷的免疫反應(yīng)。對抗原的皮下注射的DTH反應(yīng)常被用作用于細胞介導(dǎo)的免疫的測定。
[0059]按照定義，表位是抗原決定簇，其在一旦被施用給宿主，其能夠引發(fā)體液(B細胞)和/或細胞類型(T細胞)的免疫應(yīng)答的意義上為免疫活性的。這些是分子上為抗原性的特定化學(xué)基團或肽序列?？贵w特異性地結(jié)合多肽上的特定抗原性表位。表位的具體的、非限制性實例包括多肽中的四至五肽，多糖中的三至五糖苷序列。在動物中，大多數(shù)抗原將同時呈遞幾個或甚至許多抗原性決定簇。這樣的多肽還可適格作為免疫原性多肽并且表位可如進一步描述的被鑒定。
[0060]“分離的”生物學(xué)組分(例如核酸或蛋白質(zhì)或細胞器)是指與所述組分天然存在于其中的生物體細胞中的其它生物學(xué)組分實質(zhì)上分離或純化的組分，例如，其它染色體和染色體外DNA和RNA、蛋白質(zhì)和細胞器。已被“分離”的核酸和蛋白質(zhì)包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。此術(shù)語還包括通過重組技術(shù)以及化學(xué)合成制備的核酸和蛋白質(zhì)。[0061]如本文中所使用的，術(shù)語“純化的”不需要絕對純度；相反地，其意在作為相對的術(shù)語。因此，例如，純化的多肽制備物是其中多肽比在其天然環(huán)境中的所述多肽更加富集的多肽制備物。多肽制備物是基本上純化的從而多肽代表幾個為制備物的總多肽含量的至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的實施方案。這同樣適用于多核苷酸。本文中公開的多肽可通過本領(lǐng)域已知的任何方式來純化。
[0062]重組多核苷酸是具有非天然存在的序列或具有通過兩個否則分開的序列區(qū)段的人工重組產(chǎn)生的序列的多核苷酸。該人工重組通常通過化學(xué)合成或更常見地，通過分離的核酸區(qū)段的人工操作(例如，通過遺傳工程技術(shù))來實現(xiàn)。在一個實施方案中，重組多核苷酸編碼融合蛋白。
[0063]在一個方面，本發(fā)明提供了來自FeLV的最優(yōu)化的或突變的多肽。在另一個方面，本發(fā)明提供了最優(yōu)化的或突變的FeLV ENV多肽。在另一個方面，本發(fā)明提供了最優(yōu)化的FeLV ENV蛋白，其中突變存在于，但不限于SEQ ID NO:2、4、6、27、28、29、30、31、32、33、34或43的氨基酸位置527處，或SEQ ID NO: 7的氨基酸位置533處。在另一個方面，突變是精氨酸(R)、天冬氨酸( D)或甲硫氨酸(M)對 SEQ ID NO:2、4、6、27、28、29、30、31、32、33、34 或43的氨基酸位置527或者SEQ ID NO: 7的氨基酸位置533處的谷氨酸(E)的置換。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，基于序列比對，所描述的突變包括未列于本申請中的其它FeLV ENV多肽中相應(yīng)氨基酸位置處的突變，其中相應(yīng)的氨基酸位置等同于SEQ ID N0:2、4、6、27、28、29、30、
31、32、33、34或43的氨基酸位置527或SEQ ID NO: 7的氨基酸位置533。某些FeLV ENV多肽的蛋白質(zhì)序列比對示例于圖1d中。在一個實施方案中，最優(yōu)化的或突變的FeLV ENV多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸位置527處或FeLV ENV蛋白的相應(yīng)氨基酸位置處的氨基酸突變。在另一個實施方案中，最優(yōu)化的或突變的FeLV ENV多肽包括R、D或M對SEQ IDNO:6的氨基酸位置527或FeLV ENV多肽的相應(yīng)氨基酸位置處的E的氨基酸置換。在另一個實施方案中，最優(yōu)化的或突變的FeLV ENV多肽包括R對SEQ ID NO:6的氨基酸位置527或FeLV ENV多肽的相應(yīng)氨基酸位置處的E的氨基酸置換。在另一個實施方案中，突變的FELV ENV多肽具有SEQ ID NO: 2，4，7或43中所示的序列。
[0064]此外，來自FeLV的多肽的同源物意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文中所用的，術(shù)語“同源物”包括直系同源物、類似物和旁系同源物。術(shù)語“類似物”是指具有相同或相似功能，但在不相關(guān)的生物體中分別進化的兩個多核苷酸或多肽。術(shù)語“直系同源物”是指來自不同物種，但已通過物種形成從共同的祖先基因進化而來的兩個多核苷酸或多肽。通常，直系同源物編碼具有相同或相似功能的多肽。術(shù)語“旁系同源物”是指通過基因組內(nèi)的復(fù)制而相關(guān)的兩個多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同的功能，但這些功能可以是相關(guān)的。野生型FeLV多肽的類似物、直系同源物和旁系同源物可通過翻譯后修飾、氨基酸序列差異或二者而與野生型FeLV多肽相異。特別地，本發(fā)明的同源物將通常顯示與野生型FeLV多肽或多核苷酸序列的全部或部分至少80-85%、85-90%、90-95%或95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性,并且將顯示相似的功能。
[0065]在另一個方面，本發(fā)明提供了與具有SEQID NO:2，4，6，27，28，29，30，31，32，33或34所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%,98%或99%的序列同一性的最優(yōu)化或突變的FeLV ENV多肽。
[0066]在另一個方面，本發(fā)明提供了上文中鑒定的最優(yōu)化的或突變的FeLV ENV多肽的片段和變體，其可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用公知的分子生物學(xué)技術(shù)來容易地制備。
[0067]變體是具有與SEQ ID NO: 2、4、6、27、28、29、30、31、32、33或34所示的氨基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的氨基酸序列的同源多肽。
[0068]變體包括等位基因變體。術(shù)語“等位基因變體”是指包含導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氨基酸序列的變化和存在于天然群體(例如，病毒種類或品種)中的多態(tài)性的多核苷酸或多肽。這樣的天然等位基因變異通常可引起多核苷酸或多肽中1-5%的變異。等位基因變體可通過對許多不同種類中的目標(biāo)核酸序列進行測序來鑒定，這可通過使用雜交探針來鑒定那些種類中相同基因的基因座來容易地進行。作為天然等位基因變異的結(jié)果和不改變目標(biāo)基因的功能活性的任何和全部此類核酸變異和所產(chǎn)生的氨基酸多態(tài)性或變異均意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0069]如本文中所用的，術(shù)語“衍生物”或“變體”是指下述多肽或編碼多肽的核酸:其具有一個或多個保守性氨基酸變異或其它小的修飾，從而(I)當(dāng)與野生型多肽相比較時相應(yīng)的多肽具有基本上等同的功能或(2)針對多肽產(chǎn)生的抗體與野生型多肽免疫反應(yīng)。這些變體或衍生物包括具有最優(yōu)化的或突變的FeLV ENV多肽一級氨基酸序列的少數(shù)修飾的多肽，所述修飾可產(chǎn)生相較于未修飾的對應(yīng)多肽具有基本上等同的活性的肽。這樣的修飾可以是有意而為的，如通過定點誘變，或可以是自發(fā)的。術(shù)語“變體”還包括對序列的缺失、添加和置換，只要所述多肽起作用而產(chǎn)生如本文中定義的免疫應(yīng)答。修飾可以是在不同于SEQ IDN0:2、4、6、27、28、29、30、31、32、33、34 或 43 的位置 527 或 SEQ ID NO: 7 的氨基酸位置 533的氨基酸位置處的任何氨基酸變化。
[0070]術(shù)語“保守性變異”是指氨基酸殘基被另一個生物學(xué)上相似的殘基替換，或核酸序列的核苷酸的替換，從而所編碼的氨基酸殘基不改變或為另一個生物學(xué)上相似的殘基。在這方面，特別優(yōu)選的置換將通常在性質(zhì)上是保守的，即在氨基酸的家族內(nèi)發(fā)生的那些置換。例如，氨基酸通常被分成4個家族:(I)酸性的一天冬氨酸或谷氨酸；(2)堿性的一賴氨酸、精氨酸，組氨酸；(3)非極性的一丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和(4)不帶電荷的極性的一甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有時被分類為芳香族氨基酸。保守性變異的實例包括將一個疏水殘基例如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸置換為另一種疏水殘基，或?qū)⒁粋€極性殘基置換為另一個極性殘基，例如賴氨酸對精氨酸、谷氨酸對天冬氨酸或谷氨酰胺對天冬酰胺的置換等；或?qū)τ谏飳W(xué)活性將沒有主要影響的、結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸對氨基酸的類似保守替換。具有與參照分子基本上相同的氨基酸序列但具有少量不實質(zhì)上影響蛋白質(zhì)的免疫原性的氨基酸置換的蛋白質(zhì)因而在參照多肽的定義內(nèi)。所有由這些修飾產(chǎn)生的多肽均被包括在本文中。術(shù)語“保守性變異”還包括使用經(jīng)置換的氨基酸來替代未經(jīng)置換的親本氨基酸，條件是針對經(jīng)置換的多肽產(chǎn)生的抗體也與未經(jīng)置換的多肽免疫反應(yīng)。
[0071]FeLV ENV 多肽的免疫原性片段包括具有 SEQ ID NO:2、4、6、7、27、28、29、30、31、
32、33、34或43所示的序列的FeLV ENV多肽或其變體的至少8、10、15或20個連續(xù)氨基酸、至少21個氨基酸、至少23個氨基酸、至少25個氨基酸或至少30個氨基酸。在另一個實施方案中，F(xiàn)eLV ENV多肽的片段包括在全長FeLV ENV多肽上發(fā)現(xiàn)的特定抗原性表位。
[0072]確定多肽的片段和表位的程序，例如產(chǎn)生重疊肽文庫(Hemmer B.等人)、肽掃描(Pepscan) (Geysen H.Μ.等人，1984 ;Geysen H.Μ.等人，1985 ;Van der Zee R.等人；Geysen Η.Μ.)和算法(De Groot Α.等人；Hoop T.等人；Parker K.等人)可用于本發(fā)明的實踐，而無需過度實驗。一般而言，抗體特異性結(jié)合特定抗原表位。具體地，表位的非限制性實例包括多肽中的四至五肽序列，多糖中的三至五糖苷序列。在動物中，大多數(shù)抗原將同時呈遞幾個或甚至許多抗原決定簇。優(yōu)選地，其中表位是更大分子的蛋白質(zhì)片段，其將具有與總蛋白質(zhì)基本上相同的免疫活性。
[0073]在一個方面，本發(fā)明提供了編碼FeLV ENV多肽的多核苷酸。在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼最優(yōu)化的或突變的FeLV ENV多肽的FeLV ENV多核苷酸，其中突變在SEQ IDΝ0:2、4、6、27、28、29、30、31、32、33、34 或 43 的氨基酸位置 527 或 SEQ ID NO: 7 的氨基酸位置533處發(fā)生。在另一個方面，F(xiàn)eLV ENV多核苷酸編碼最優(yōu)化的或突變的FeLV ENV多肽，其中突變是精氨酸(R)、天冬氨酸(D)或甲硫氨酸(M)對SEQ ID NO:2、4、6、7、28、29、30、31、 32、33、34或43的氨基酸位置527或SEQ ID NO:7的氨基酸位置533處的谷氨酸(E)的置換。在另一個方面，F(xiàn)eLV ENV多肽編碼在SEQ ID NO:6的氨基酸位置527處或FeLV ENV蛋白的相應(yīng)氨基酸位置處具有氨基酸突變的最優(yōu)化的或突變的FeLV ENV多肽。在另一個方面，F(xiàn)eLV ENV多核苷酸編碼在SEQ ID NO:6的氨基酸位置527處或在FeLV ENV多肽的相應(yīng)氨基酸位置處具有E至R、D或M的氨基酸改變的最優(yōu)化的或突變的FeLV ENV多肽。在另一個方面，F(xiàn)eLV ENV多核苷酸編碼在SEQ ID NO:6的氨基酸位置527處或在FeLV ENV多肽的相應(yīng)氨基酸位置處具有E至R的氨基酸改變的最優(yōu)化的或突變的FeLV ENV多肽。在另一個實施方案中，F(xiàn)eLV ENV多核苷酸編碼具有SEQ ID NO:2、4、7或43所示的序列的FeLV ENV多肽。在另一個實施方案中，F(xiàn)eLV ENV多核苷酸編碼與具有SEQ ID Ν0:2、4、6、
7、27、28、29、30、31、32、33、34或43所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的FeLV ENV多肽、或保守變體、等位基因變體、同源物或包含這些多肽之一的至少8個或至少10個連續(xù)氨基酸的免疫原性片段，或這些多肽的組合。
[0074]在另一個方面，本發(fā)明提供了與具有SEQ ID NO: 12所示序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的FeLVGAG-PRO 多肽。
[0075]在另一個方面，本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO: 1、3或5所示的核苷酸序列的FeLVENV多核苷酸或其變體。在另一個方面，本發(fā)明提供了與具有SEQ ID N0:l、3或5所示序列的多核苷酸具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少95%、96%、97%,98%或99%的序列同一性的FeLV ENV多核苷酸，或其變體。
[0076]在另一個方面，本發(fā)明提供了與具有SEQ ID NO: 10或11所示的序列的多核苷酸具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的FeLV GAG-PRO多核苷酸或其變體。
[0077]這些多核苷酸可包括編碼FeLV ENV或GAG-PRO多肽的DNA、cDNA和RNA序列。應(yīng)理解，所有編碼FeLV ENV或GAG-PRO多肽的多核苷酸也包括在本文中，只要它們編碼具有所認可的活性的多肽，所述活性例如為對識別所述多肽的抗體的結(jié)合、誘導(dǎo)對所述多肽的免疫應(yīng)答或當(dāng)給暴露于寄生蟲或經(jīng)受FeLV感染的跡象或癥狀減輕的受試者施用時對白血病的存活的作用。[0078] 本公開的多核苷酸包括作為遺傳密碼的結(jié)果的簡并的序列，例如對于特定宿主的最優(yōu)化的密碼子使用。如本文中所用的，“最優(yōu)化的”是指經(jīng)遺傳工程化以增加其在給定的物種中的表達的多核苷酸。為了提供編碼FeLV ENV或GAG-PRO多肽的最優(yōu)化的多核苷酸，可修飾FeLV ENV或GAG-PRO基因的DNA序列以I)包含在特定物種中高度表達的基因所優(yōu)選的密碼子；2)在核苷酸堿基組成上包含基本上為在所述物種中發(fā)現(xiàn)的A+T或G+C含量；3)形成所述物種的起始序列；或4)消除引起RNA的去穩(wěn)定化、不適當(dāng)?shù)亩嘞佘账峄?、降解和終止，或形成二級結(jié)構(gòu)發(fā)夾或RNA剪接位點的序列。FeLV蛋白在所述物種中的增加的表達可通過利用密碼子使用在真核生物和原核生物，或在特定物種中的分布頻率來實現(xiàn)。術(shù)語“優(yōu)選密碼子使用的頻率”是指特定宿主細胞在使用核苷酸密碼子來指定給定的氨基酸方面所顯示出的偏好。存在20種天然氨基酸，其中大部分由多于一種密碼子指定。因此，所有簡并的核苷酸序列被包括在本公開中，只要由核苷酸序列編碼的FeLV多肽的氨基酸序列在功能上未被改變。
[0079]兩個氨基酸序列之間的序列同一性可使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，通過NCBI (國家生物技術(shù)信息中心)配對blast和blosum62矩陣來確立(參見，例如，可在“國家生物技術(shù)信息中心”(NCBI，Bethesda，Md.，USA)服務(wù)器上以及在Altschul等人中可獲得的BLAST或BLASTX算法；從而，該文獻通過術(shù)語“blasts”提及使用算法或BLAST或BLASTX和BL0SUM62矩陣)。
[0080]兩個核苷酸序列之間的序列同一性還可使用Myers和Miller ( “OptimalAlignments in Linear Space”，CAB10S4, 11-17，1988)的、且可在 NCBI 獲得的“Align”程序確定，以及可通過英特網(wǎng)在其網(wǎng)站例如NCBI網(wǎng)站上獲得的相同或其它的程序來確定。
[0081]備選地或此外，術(shù)語“同一性”(例如關(guān)于核苷酸或氨基酸序列時)，可表示兩個序列之間的同源性的定量量度。百分比序列同源性可被計算為:
[0082](Nref-Ndif)*100/Nref,其中Ndif是當(dāng)比對時兩個序列中不相同的殘基的總數(shù)并且其中Nref是序列之一中的殘基的數(shù)目。因此，DNA序列AGTCAGTC將與序列AATCAATC (Nref=8 ；Ndif=2)具有75%的序列同一性。
[0083]備選地或此外，關(guān)于序列的“同一性”可指具有相同的核苷酸或氨基酸的位置的數(shù)目除以兩個序列中較短序列的核苷酸或氨基酸數(shù)目，其中兩個序列的比對可按照Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman)確定(例如使用20個核苷酸的窗口大小、4個核苷酸的字長和為4的缺口罰分)，并且包括比對的序列數(shù)據(jù)的計算機輔助分析和解釋可使用商購可得的程序(例如，Intelligenetics?Suite, Intelligenetics Inc.CA)來方便地進行。當(dāng)RNA序列被認為是相似的，或與DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性時，DNA序列中的胸苷(T)被認為等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，RNA序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且可通過將DNA序列中的胸苷(T)認為等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)而衍生自DNA序列。
[0084]兩個氨基酸序列的序列同一性或序列相似性或兩個核苷酸序列之間的序列同一性可使用 Vector NTI 軟件包(Invitrogen, 1600Faraday Ave., Carlsbad, CA)來確定。
[0085]FeLV ENV或GAG-PRO多核苷酸可包括被整合到載體、自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《尽⒒蛘咴嘶蛘婧松锏幕蚪MDNA中的重組DNA，或作為獨立于其它序列的單獨的分子(例如，cDAN)存在的重組DNA。
[0086]本文中公開的重組載體可包括編碼多肽、其變體或其片段的多核苷酸。重組載體可包括質(zhì)粒和病毒載體并且可用于體外或體內(nèi)表達。重組載體還可包括信號肽。信號肽是指導(dǎo)蛋白質(zhì)(其在細胞溶質(zhì)中被合成)至某些細胞器(例如細胞核、線粒體基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體、非原質(zhì)體和過氧化物酶體)的翻譯后運輸?shù)亩屉逆?3-60個氨基酸長)。通常地，天然存在的FeLV ENV蛋白可被翻譯為前體，其具有N末端信號肽序列和“成熟的”蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。信號肽可在翻譯后被快速切掉。信號序列可以是來自FeLV ENV蛋白的天然序列或來自經(jīng)分泌的蛋白的肽信號，例如來自組織纖溶酶原激活蛋白(tPA)、特別是人tPA(S.Friezner Degen等人；R.Rickles等人；D.Berg.等人)的信號肽，或來自胰島素樣生長因子I (IGFl)、特別是馬IGFl (K.0tte等人)、犬IGFl (P.Delafontaine等人)、貓科IGFl (W003/022886)、牛 IGFl (S.Lien 等人)、豬 IGFl (M.Muller 等人)、雞 IGFl (Y.Kajimoto等人)、火雞IGFl (GenBank登錄號AF074980)的信號肽。來自IGFl的信號肽可以是天然的或是最優(yōu)化的，這可通過除去隱蔽剪接位點和/或通過改變密碼使用來實現(xiàn)。翻譯后，可在切割位點切割未加工的多肽以產(chǎn)生成熟的多肽。切割位點可使用Von Heijne的方法(1986)來預(yù)測。
[0087]質(zhì)粒可包括DNA轉(zhuǎn)錄單元，例如允許其在宿主細胞中復(fù)制的核酸序列，例如復(fù)制起點(原核生物或真核生物的)。質(zhì)粒還可包括一個或多個可選擇的標(biāo)記物基因和本領(lǐng)域已知的其它遺傳元件。質(zhì)粒的環(huán)狀和線性形式被包括在本公開中。
[0088]在其它方面，本發(fā)明涉及包含多核苷酸序列的體內(nèi)表達載體，其包含并在宿主體內(nèi)表達最優(yōu)化的或突變的FeLV ENV多肽和/或其變體或片段。表達載體還可包含編碼FeLVGAG-PRO多肽和/或其變體或片段的多核苷酸。
[0089]體內(nèi)表達載體可包括含有目標(biāo)多核苷酸或基因以及用于其體內(nèi)表達的那些必需元件的任何轉(zhuǎn)錄單元。這些表達載體可以是質(zhì)粒或重組病毒載體。對于體內(nèi)表達，啟動子可以是病毒或細胞來源的。在一個實施方案中，啟動子可以是巨細胞病毒(CMV)早期啟動子(CMV-1E啟動子)、SV40病毒早期或晚期啟動子或勞斯肉瘤病毒LTR啟動子、細胞骨架基因的啟動子例如肌間線蛋白啟動子(Kwissa M.等人)，或肌動蛋白啟動子(Miyazaki J.等人)。當(dāng)幾個基因存在于同一質(zhì)粒中時，可在相同的轉(zhuǎn)錄單元或在不同的單元中提供它們。
[0090]如本文中所用的，術(shù)語“質(zhì)?！笨砂ê懈鶕?jù)本發(fā)明的多核苷酸和其在所需宿主或革G標(biāo)的細胞中體內(nèi)表達所必需的元件的任何DNA轉(zhuǎn)錄單元；并且在這方面,應(yīng)注意超螺旋或非超螺旋的環(huán)狀質(zhì)粒以及線性形式意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)。質(zhì)粒還可包括其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件例如內(nèi)含子類型的穩(wěn)定化序列。在幾個實施方案中，質(zhì)?？砂–MV-1E的第一內(nèi)含子(W089/01036)、兔β珠蛋白基因的內(nèi)含子II (van Ooyen等人)、由組織纖溶酶原激活物編碼的蛋白質(zhì)的信號序列(tPA !Montgomery等人)和/或多腺苷酸化信號(polyA),特別是牛生長激素(bGH)基因的polyA (US5，122,458)或兔β -珠蛋白基因或SV40病毒的polyA。
[0091]在其它方面，本發(fā)明涉及組合物，其包含:a)體內(nèi)表達載體，其中所述載體包含編碼一個或多個選自FeLV ENV多肽、FeLV ENV多肽的變體或片段以及其混合物的多肽；和b)藥學(xué)上或獸醫(yī)上可接受的媒介物、稀釋劑或賦形劑。
[0092] 在另一個方面，本發(fā)明涉及組合物，所述組合物包含:a)體內(nèi)表達載體，其中所述載體包含編碼一種或多種選自FeLV ENV多肽、FeLV GAG/PR0多肽、FeLV ENV多肽的變體或片段以及其混合物的多肽的多核苷酸；和《藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)可接受的媒介物、稀釋劑或賦形劑。[0093]在另一個方面，本發(fā)明涉及組合物，其包含:a)體內(nèi)表達載體，其中所述載體包含編碼FeLV ENV多肽、FeLV GAG/PR0多肽的多核苷酸；和b)藥學(xué)上或獸醫(yī)上可接受的媒介物、稀釋劑或賦形劑。
[0094]FeLV ENV和FeLV GAG/PR0多肽描述于上文中。
[0095]在一個實施方案中，本發(fā)明涉及組合物，其包含:a)體內(nèi)表達載體，其中所述載體包含編碼在SEQ ID NO:6的氨基酸位置527處或FeLV多肽的相應(yīng)氨基酸位置處具有R、D或M對E的氨基酸置換的最優(yōu)化的或突變的FeLV ENV的多核苷酸，和編碼與具有SEQ IDNO: 12所示的序列的多核苷酸具有至少90%的同一性的FeLV GAG/PR0多肽的多核苷酸；和
b)藥學(xué)上或獸醫(yī)上可接受的媒介物、稀釋劑或賦形劑。在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物包含:a)表達載體，其包含編碼具有SEQ ID N0:2或4所示的氨基酸序列的FeLV ENV多肽的第一多核苷酸和編碼具有SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列的FeLV GAG/PR0多肽的第二多核苷酸；和b)藥學(xué)上或獸醫(yī)上可接受的媒介物、稀釋劑或賦形劑。
[0096]術(shù)語“組合物”包含任何疫苗或免疫組合物，其一旦被注射入宿主(包括犬科、貓科和人)，就誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答和/或保護宿主免患白血病，和/或其可防止寄生蟲的植入，和/或其可防止被感染的受試者中的疾病進展，和/或其可限制逃離的寄生物至內(nèi)部器官的擴散。這可在根據(jù)本發(fā)明的疫苗接種后，通過誘導(dǎo)細胞因子分泌(特別是IFN-Y分泌)(作為測量IFN-Y分泌的方法的實例，可使用來自R&D Systems Inc.的Quantikine?免疫測定(目錄號#CAIF00) (Djoba Siawaya JF等人))來實現(xiàn)。
[0097]使用的藥學(xué)上可接受的媒介物或賦形劑是常規(guī)的。Remington’s PharmaceuticalSciences, by E.ff.Martin, Mack Publishing C0., Easton, PA,第 15 版(1975)描述了適用于本文中公開的多肽、質(zhì)粒、病毒載體的藥物遞送的組合物和制劑。一般而言，媒介物或賦形劑的性質(zhì)將取決于所采用的特定施用模式。例如，親代制劑通常包含可注射的液體，其包括藥學(xué)和生理上可接受的液體例如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、含水葡萄糖、甘油等作為媒介物。對于固體組合物(例如，冷凍干燥的錠劑、粉劑、丸劑、片劑或膠囊形式)，常規(guī)非毒性固體媒介物或賦形劑可包括例如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸鎂。除了生物學(xué)上中性的媒介物或賦形劑外，待施用的免疫原性組合物可包含少量非毒性輔助物質(zhì)例如濕潤劑或乳化劑、防腐劑和PH緩沖劑等，例如醋酸鈉或脫水山梨糖醇單月桂酸酯。
[0098]根據(jù)本發(fā)明的組合物或疫苗可包括編碼上述根據(jù)本發(fā)明的任何多核苷酸的載體。
[0099]可使用不同的插入位點或使用相同的插入位點在同一載體中進行多個插入。當(dāng)使用同一插入位點時，可將可以是前述本發(fā)明的任何多核苷酸的每一個多核苷酸插入物插入在相同和/或不同啟動子的控制之下。可尾對尾、頭對頭、尾對頭或頭對尾地進行插入。還可將IRES元件(內(nèi)部核糖體進入位點，參見EP0803573)用于分隔和表達可操作地連接至相同和/或不同啟動子的多個插入物。
[0100]在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含前述多核苷酸的表達載體。所述表達載體可以是體內(nèi)表達載體或體外表達載體。
[0101]更常見地，本發(fā)明包括體內(nèi)表達載體，其包括含有且在宿主中體內(nèi)表達FeLV ENV多肽、其變體或其片段的多核苷酸或基因以及其在體內(nèi)表達所必需的元件的任何質(zhì)粒(EP-A2-1001025 ；Chaudhuri P.)。
[0102]在具體的非限制性實例中，pVR1020或pVR1012質(zhì)粒(VICAL Inc.；Luke C.等人；Hartikka J.等人)、pVR2001-T0PA(或 pVR2001-T0P0) (Oliveira F.等人)或pAB110(US6,852, 705)可被用作用于插入多核苷酸序列的載體。pVR1020質(zhì)粒來源于PVR1012并且包含人tPA信號序列。pVR1020是可從Vical，Inc.，(San Diego, CA)獲得的先前已被使用的質(zhì)粒主鏈，參見，例如，美國專利號6，451，769和7，078，507。如Oliveira等人中所述，質(zhì)粒PVR2001-T0P0 (或pVR2001-T0PA)是經(jīng)如下修飾的pVR1020:添加側(cè)翼于克隆位點的拓撲異構(gòu)酶，并且包括編碼和表達信號分泌肽例如組織纖溶酶原激活物信號肽(tPA),這增加產(chǎn)生分泌的蛋白的可能性(參見Oliveira F.等人中的圖1)。
[0103]每一個質(zhì)?？砂ɑ虬刹僮鞯剡B接至啟動子或處于啟動子的控制之下或依賴于啟動子的根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或基本上由所述多核苷酸組成，其中啟動子可以有利地與所期望表達的多核苷酸鄰近。一般而言，采用在真核細胞中起作用的強啟動子是有利的。有用的啟動子的一個實例可以是人或鼠來源的立即早期巨細胞病毒啟動子(CMV-1E)，或其可任選地具有另一個來源例如來自大鼠或豚鼠。CMV-1E啟動子可包含實際的啟動子部分，其可以與或可以不與增強子部分結(jié)合?？蓞⒖糆P260148，EP323597，US5，168,062, 5，385，839和4，968，615以及參考W087/03905。CMV-1E啟動子可以有利地是人CMV-1E (BoshartM.等人)或鼠CMV-1E。在更一般的術(shù)語中，啟動子可具有病毒或細胞來源。除CMV-1E外可有用地用于實施本發(fā)明的強病毒啟動子是SV40病毒的早期/晚期或啟動子或勞斯肉瘤病毒的LTR啟動子。可 有用地用于實施本發(fā)明的強細胞啟動子是細胞骨架的基因的啟動子例如肌間線蛋白啟動子(Kwissa M.等人)或肌動蛋白啟動子(Miyazaki J.等人)。這些啟動子的功能性亞片段，即這些啟動子的維持足夠的啟動子活性的部分，被包括在本發(fā)明中，例如根據(jù)W098/00166或US6，156，567的截短的CMV-1E啟動子，并且可用于實施本發(fā)明。在實施本發(fā)明中有用的啟動子因而可包括全長啟動子的衍生物和/或亞片段，所述衍生物和/或亞片段可維持足夠的啟動子活性，并因而作為啟動子起作用，并且其可有利地具有與所述衍生物或亞片段所源自的實際或全長啟動子的活性實質(zhì)上相似的啟動子活性，例如類似于US6，156，567的截短的CMV-1E啟動子的活性相較于全長CMV-1E啟動子的活性。因此，用于實施本發(fā)明的CMV-1E啟動子可包含全長啟動子的啟動子部分和/或全長啟動子的增強子部分以及其衍生物和/或亞片段，或基本上由它們組成，或由它們組成。
[0104]有利地,質(zhì)粒包含其它表達控制元件或基本上由所述元件組成。特別有利地是整合穩(wěn)定化序列，例如內(nèi)含子序列，例如hCMV-1E的第一內(nèi)含子(W089/01036)、兔β -珠蛋白基因的內(nèi)含子II (van Ooyen等人)。關(guān)于質(zhì)粒和痘病毒以外的病毒載體的多腺苷酸化信號(polyA)，可使用牛生長激素(bGH)基因的poly (A)信號(參見US5，122，458)或兔β -珠蛋白基因的Poly(A)信號或SV40病毒的poly (A)信號。
[0105]更一般地，本發(fā)明包括體內(nèi)表達載體，包括含有編碼一個或多個FeLV ENV和/或其變體或片段的多核苷酸或基因(包括其體內(nèi)表達所必需的任何元件)的任何重組病毒載體。
[0106]所述重組病毒載體可選自例如痘病毒，特別是禽痘病毒例如鳥痘(fowlpox)病毒或金絲雀痘病毒。在一個實施方案中，鳥痘病毒是TROVAC (參見W096/40241)。在另一個實施方案中，金絲雀痘載體是ALVAC。這些重組病毒載體的使用以及目標(biāo)多核苷酸或基因的插入在 US5, 174，993 ；US5, 505，941 和 US5, 766，599 (對于鳥痘病毒)中和 US5, 756，103 (對于金絲雀痘)中被充分描述。病毒基因組內(nèi)超過一個插入位點可被用于多個目標(biāo)基因的插入。
[0107]在一個實施方案中，病毒載體是腺病毒，例如人腺病毒(HAV)或犬科腺病毒(CAV) ο
[0108]在另一個實施方案中，病毒載體是人腺病毒，特別是血清型5腺病毒，其通過病毒基因組的El區(qū)域中的缺失而使得不能復(fù)制，特別是參照在登錄號M73260下于Genbank中和引用的出版物Chroboczek等人，1992中公開的hAd5的序列的約核苷酸459至約核苷酸3510。在表達El的293 (Graham等人，1977)或PER細胞，特別是PER.C6 (Falloux等人，1998)中繁殖經(jīng)缺失的腺病毒。人腺病毒可另外地或備選地在E3區(qū)域中有缺失，特別是從約核苷酸28592至約核苷酸30470。可將El區(qū)域中的缺失與E3區(qū)域中的缺失組合進行(參見，例如，Shriver等人；Graham等人；Ilan等人；美國專利號6, 133, 028和6, 692, 956 ；Tripathy 等人；Tapnell ；Danthinne 等人；Berkner ；Berkner 等人；Chavier 等人)。在 El和/或E3區(qū)域的部分或完全缺失后，插入位點最終可以是El和/或E3基因座(區(qū)域)。有利地，當(dāng)表達載體是腺病毒時，將待表達的多核苷酸插入在于真核生物細胞中具有功能的啟動子的控制之下，所述啟動子例如為強啟動子，有利地為巨細胞病毒立即-早期基因啟動子(CMV-1E啟動子) ，特別是Boshart等人中的約核苷酸_ 734至約核苷酸+7的增強子/啟動子區(qū)域，或來自Promega Corp的pCI載體的增強子/啟動子區(qū)域。CMV-1E啟動子有利地為鼠或人來源的。也可使用延伸因子Ia的啟動子。還可使用肌肉特異性啟動子(Li等人)。在本申請中還關(guān)于質(zhì)粒載體討論了強啟動子。在一個實施方案中，剪接序列可位于增強子/啟動子區(qū)域的下游。例如，從CMV-1E基因分離的內(nèi)含子I (Stenberg等人)，從兔或人β_珠蛋白基因分離的內(nèi)含子，特別是來自β_珠蛋白基因的內(nèi)含子2，從免疫球蛋白基因分離的內(nèi)含子，來自SV40早期基因的剪接序列或從來自Promege Corp的pCI載體分離的嵌合內(nèi)含子序列。可將Poly(A)序列和終止子序列插入在待表達的多核苷酸下游，所述待表達的多核苷酸例如為牛生長激素基因，特別是具有GenBank登錄號B0VGHRH的序列的約核苷酸2339至約核苷酸2550，兔β -珠蛋白基因或SV40晚期基因多腺苷酸化信號。
[0109]在另一個實施方案中，病毒載體是犬腺病毒，特別是CAV-2 (參見，例如Fischer等人；美國專利號5，529，780和5，688，920 ;W095/14102)。對于CAV，插入位點可在E3區(qū)域中和/或在位于E4區(qū)域與右ITR區(qū)域之間的區(qū)域中(參見美國專利號6，090, 393和6，156，567)。在一個實施方案中，插入物處于啟動子例如巨細胞病毒立即早期基因啟動子(CMV-1E啟動子)或已對于人腺病毒載體進行了描述的啟動子的控制之下。可將poly (A)序列和終止子序列插入到待表達的多核苷酸例如牛生長激素基因或兔β_珠蛋白基因多腺苷酸化信號的下游。
[0110]在另一個實施方案中，病毒載體是皰疫病毒例如貓皰疫病毒(FHV)。在一個實施方案中，將待表達的多核苷酸插入到于真核細胞中具有功能的啟動子(有利地為CMV-1E啟動子(鼠或人))的控制之下?？蓪oly (A)序列和終止子序列插入到待表達的多核苷酸(例如牛生長激素或兔β_珠蛋白基因多腺苷酸化信號)的下游。
[0111]對于基于痘病毒載體的重組載體，可使用痘苗病毒或減毒的牛痘病毒(例如，MVA,為在雞胚成纖維細胞上進行超過570次安卡拉疫苗株(Ankara vaccine strain)傳代后獲得的改良安卡拉株；參見Stickl&Hochstein-Mintzel ；Sutter等人；可作為ATCCVR-1508獲得獲得的；或NYVAC，參見US5，494，807和美國專利號5，494，807，所述專利討論了 NYVAC的構(gòu)建，以及具有從Copenhagen株牛痘病毒基因組缺失的額外ORF的NYVAC的變異，以及異源編碼核酸分子至該重組體的位點的插入，以及使用匹配的啟動子；也參見TO96/40241)、禽痘病毒或減毒的禽痘病毒(例如，金絲雀痘、鳥痘、dov印ox、鴿痘、鵪鶉痘、ALVAC或TROVAC ;參見，例如，美國專利號5，505，941，5，494，807)。減毒金絲雀痘病毒被描述于US5, 756，103 (ALVAC)和W001/05934中。也參考US5, 766，599，其涉及減毒的鳥痘株TR0VAC。參考可在登錄號VR-1ll下從ATCC獲得的金絲雀痘。許多鳥痘病毒疫苗接種株也是可獲得的，例如由MERIAL市售的DIFTOSEC CT和由INTERVET市售的NOBILISVAR10LE疫苗。關(guān)于用于產(chǎn)生其重組體和如何施用其重組體的方法的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考本文中引用的文獻和W090/12882，例如關(guān)于牛痘病毒，特別地，參考美國專利號4，769，330,4, 722, 848,4, 603，112,5, 110，587,5, 494, 807 和 5，762,938 ;關(guān)于鳥痘，特別地，參考美國專利號5，174，993,5, 505，941和5，766，599 ;關(guān)于金絲雀痘，特別地，參考美國專利號5，756，103。當(dāng)表達載體是牛痘病毒時，待表達的多核苷酸的插入位點有利地在胸苷激酶(TK)基因或插入位點處，血凝素(HA)基因或插入位點處，編碼A型包涵體(ATI)的區(qū)域；也參見本文中引用的文獻，特別是與牛痘病毒相關(guān)的那些文獻。在金絲雀痘的情形中，有利地插入位點是ORF C3、C5和/或C6 ;也參見本文中引用的文獻，特別是涉及金絲雀痘病毒的那些文獻。在鳥痘的情形中，有利地是插入位點是ORF F7和/或F8 ;也參見本文中引用的文獻，特別是涉及鳥痘病毒的那些文獻。MVA病毒的插入位點有利地是如各種出版物中的，所述出版物包括Carroll M.W.等人；Stittelaar K.J.等人；Sutter G.等人；并且，在這方面，還注意到，完全MVA基因組被描述于Antoine G.，Virology中，其使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用其它插入位點或其它啟動子。有利地，將待表達的多核苷酸插入在特定痘病毒啟動子(例如，特別是，牛痘啟動子7.5kDa (Cochran等人)、牛痘啟動子I3L (Riviere等人)、牛痘啟動子HA(Shida)、牛痘啟動子ATI (Funahashi等人)、牛痘啟動子H6 (TaylorJ.等人；Guo P.等人J.;Perkus Μ.等人))的控制之下。
[0112] 此處公開的多核苷酸的任一個可通過將DNA或表達載體轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷毎衼眢w外表達。宿主細胞可以是原核或真核的。術(shù)語“宿主”還包括主題宿主細胞的任何后代。穩(wěn)定轉(zhuǎn)移(意指外源多核苷酸被持續(xù)地維持在宿主細胞中)的方法是本領(lǐng)域中已知的。宿主細胞可包括細菌(例如，大腸桿菌(Escherichia coli))、酵母、昆蟲細胞和脊椎動物細胞。在真核細胞中表達DNA序列的方法是本領(lǐng)域中熟知的。作為用于體外表達的方法，可將重組桿狀病毒載體(例如，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV))與本文中公開的核酸一起使用。例如，可將多角體蛋白啟動子與昆蟲細胞(例如，草地貪夜蛾細胞，如可在登錄號CRL1711下于ATCC獲得的Sf9細胞，或Sf21細胞)一起使用(參見例如，Smith 等人；Pennock 等人；Vialard 等人；Verne A.;0，Reilly 等人；Kidd 1.M.&EmeryV.C.；EP0370573 ；EP0265785 ；US4, 745，051)。關(guān)于表達，可使用來自 Pharmingen(BectonDickinson)的 BaculoGold Starter Package (Cat#21001K)。作為用于體外表達的方法，可將重組大腸桿菌與載體一起使用。例如，當(dāng)在細菌系統(tǒng)中克隆時，可使用可誘導(dǎo)的啟動子例如阿拉伯糖啟動子、卩遼菌體λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜合啟動子)等?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)來用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞。當(dāng)宿主是原核生物例如大腸桿菌時，可從在指數(shù)生長期后收獲、隨后使用本領(lǐng)域公知的方法通過CaC12法處理的細胞制備能夠攝取DNA的感受態(tài)細胞。備選地，可使用MgC12或RbCl。還可通過電穿孔進行轉(zhuǎn)化。當(dāng)宿主是真核生物時，可使用DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)(如磷酸鈣沉淀)、常規(guī)機械程序(例如顯微注射)、電穿孔、封裝在脂質(zhì)體中的質(zhì)粒的插入或病毒載體的方法。真核細胞還可用L.1ongipalpis多核苷酸序列和編碼可選擇表型的第二外來DNA分子(例如單純皰疹-胸腺激酶基因)來共轉(zhuǎn)化。另一種方法是使用真核生物病毒載體(參見上文)例如皰疹病毒或腺病毒(例如，犬腺病毒2)來瞬時轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細胞和表達蛋白質(zhì)(Gluzman EA)。此外，可使用轉(zhuǎn)染劑例如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
[0113]可通過常規(guī)方式來進行重組表達的多肽的分離和純化，所述常規(guī)方法包括制備層析法(例如，尺寸排阻、離子交換、親和)、選擇性沉淀和超濾?？墒褂玫幌抻诘默F(xiàn)有技術(shù)的實例可見于“Protein Purification Applications”，第二版，由 Simon Roe 編著，并且可在Oxford University Press獲得。此種重組表達的多肽是本公開的一部分分。還包括了用于產(chǎn)生上文中描述的根據(jù)本發(fā)明的任何多肽的方法，特別是包含根據(jù)本公開的多核苷酸的重組表達載體和宿主細胞的使用。 [0114]可冷凍干燥(有利地利用穩(wěn)定劑)包含根據(jù)本發(fā)明的重組病毒載體的疫苗?？砂凑展臉?biāo)準(zhǔn)凍干方法進行冷凍干燥。藥學(xué)上或獸醫(yī)上可接受的穩(wěn)定劑可以是糖類(例如山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、海藻糖)、谷氨酸鈉(Tsvetkov T等人；IsraeliE等人)、蛋白質(zhì)例如蛋白胨、白蛋白、乳清蛋白或酪蛋白、含蛋白質(zhì)試劑例如脫脂奶(MillsC K等人;Wolff E等人)和緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖劑、堿金屬磷酸鹽緩沖劑)?？墒褂米魟﹣硎沟脙龈傻闹苽湮锟扇堋?br> [0115]根據(jù)本發(fā)明的任何疫苗組合物還可有利地包含一種或多種佐劑。
[0116]基于質(zhì)粒的疫苗可用陽離子脂質(zhì)，有利地用DMRIE (N- (2_羥乙基)-N，N- 二甲基-2，3-雙(十四烷氧基)-1_丙銨；W096/34109)來配制，并且有利地與中性脂質(zhì)例如DOPE (二油酰磷脂酰乙醇胺；Behr J.P.)結(jié)合，從而形成DMRIE-D0PE。在一個實施方案中，混合物被臨時制成，在其施用前，有利地等待約IOmin至約60min (例如約30min)用于適當(dāng)?shù)幕旌?。?dāng)使用DOPE時，DMRIE/D0PE的摩爾比可以為95/5至5/95，并且有利地為1/1。質(zhì)粒/DMRIE或DMRIE-D0PE佐劑的重量比是例如50/1至1/10，10/1至1/5或1/1至1/2。
[0117]任選地，可將細胞因子添加至組合物，特別是誘導(dǎo)Thl的GM-CSF或細胞因子(例如IL12)?？蓪⑦@些細胞因子添加至組合物作為編碼細胞因子蛋白的質(zhì)粒。在一個實施方案中，細胞因子來自犬來源，例如基因序列已放置在GenBank數(shù)據(jù)庫(登錄號S49738)中的犬GM-CSF。該序列可用于以與在W000/77210中所進行的方式相似的方式產(chǎn)生所述質(zhì)粒。
[0118]可將基于重組病毒載體的疫苗與fMLP(N_甲?；?甲硫氨?；?亮氨酰-苯丙氨酸；US6, 017，537)和/或卡波姆佐劑(Phameuropa第8卷，N0.2，Junel996)組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可參考US2，909，462，其描述了利用多羥基化合物交聯(lián)的此種丙烯酸類聚合物，所述多羥基化合物具有至少3個羥基(有利地不超過8個)，至少3個羥基的氫原子被具有至少2個碳原子的不飽和脂肪族原子團取代。例如，所述原子團是包含2至4個碳原子的那些，例如乙烯基，烯丙基和其它烯屬不飽和基團。不飽和原子團本身可包含其它取代基例如甲基。在名稱CARBOPOL? (BF Goodrich, Ohio, USA)下銷售的產(chǎn)品是適當(dāng)?shù)摹?br> 所述產(chǎn)品用烯丙基蔗糖或用烯丙基季戊四醇交聯(lián)。其中，可有利地提及CARBOPOL?974P、934P 和 971P。[0119]在馬來酸酐與烯基衍生物的共聚物當(dāng)中，為馬來酸酐與乙烯的共聚物(線性的或交聯(lián)的，例如用二乙烯醚交聯(lián)的)的共聚物EMA? (Monsanto)是有利的?？蓞⒖糐.Fields 等人。
[0120]所述丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物和共聚物EMA?由例如下式
[0121]
【權(quán)利要求】
1.一種組合物，其包含: a)包含編碼最優(yōu)化的貓白血病病毒(FeLV)包膜(ENV)多肽的第一多核苷酸和編碼FeLV GAG/PRO多肽的第二多核苷酸的表達載體；和 b)藥學(xué)上或獸醫(yī)上可接受的媒介物、稀釋劑或賦形劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述最優(yōu)化的FeLVENV多肽在FeLV ENV蛋白的氨基酸位置527或等同的相應(yīng)氨基酸位置處包含突變。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述突變包括精氨酸(R)、天冬氨酸(D)或甲硫氨酸(M)對谷氨酸(E)的置換。
4.權(quán)利要求1-3的任一項的組合物，其中所述多核苷酸編碼與SEQID N0:2、4、6、27、28、29、30、31、32、33或34所示的序列具有至少80%的序列同一性的FeLVENV多肽，并且其中所述多肽在FeLV ENV蛋白的氨基酸位置527或等同的相應(yīng)氨基酸位置處包含突變。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述突變包括精氨酸(R)、天冬氨酸(D)或甲硫氨酸(M)對谷氨酸(E)的置換。
6.權(quán)利要求5的 組合物，其中所述突變包括精氨酸(R)對谷氨酸(E)的置換。
7.權(quán)利要求1-6的任一項的組合物，其中所述多核苷酸與SEQID NO: 1、3或5所示的序列具有至少70%的序列同一性。
8.權(quán)利要求1-7的任一項的組合物，其中所述載體包含編碼FeLVENV多肽的第一多核苷酸和編碼FeLV GAG/PRO多肽的第二多核苷酸。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中第一多核苷酸編碼與SEQID N0:2、4、6、27、28、29、.30、.31、32、33或34所示的序列具有至少80%序列同一性的FeLV ENV多肽，其中所述多肽在FeLV ENV蛋白的氨基酸位置527或等同的相應(yīng)氨基酸位置處包含突變，并且其中所述第二多核苷酸編碼與SEQ ID NO: 12所示的序列具有至少80%的序列同一性的FeLV GAG/PRO多肽。
10.權(quán)利要求8或9的組合物，其中所述第一多核苷酸編碼具有SEQID NO:2或4所示的氨基酸序列的FeLV ENV多肽，并且其中所述第二多核苷酸編碼具有SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列的FeLV GAG/PRO多肽。
11.權(quán)利要求8或9的組合物，其中編碼FeLVENV多肽的多核苷酸與SEQ ID NO: 1、.3或5所示的序列具有至少70%的序列同一性，并且編碼FeLV GAG/PRO多肽的多核苷酸與SEQ ID NO: 10或11所示的序列具有至少70%的序列同一丨生。
12.權(quán)利要求1-11的任一項的組合物，其中所述表達載體是禽痘載體。
13.權(quán)利要求1-12的任一項的組合物,其中所述組合物以約105pfu至約109pfu的劑量范圍被施用給動物。
14.一種表達載體，其包含編碼最優(yōu)化的FeLV ENV多肽的第一多核苷酸和編碼FeLVGAG/PRO多肽的第二多核苷酸。
15.權(quán)利要求14的表達載體，其中所述第一多核苷酸編碼與SEQID NO:4、.6、.27、 .28、.29、30、31、32、33或34所示的序列具有至少80%的序列同一性的FeLVENV多肽，其中所述多肽在FeLV ENV蛋白的氨基酸位置527或等同的相應(yīng)氨基酸位置處包含突變，并且其中所述第二多核苷酸編碼與SEQ ID NO: 12所示的序列具有至少80%的序列同一性的FeLV GAG/PRO多肽。
16.權(quán)利要求14或15的表達載體，其中所述第一多核苷酸編碼具有SEQID N0:2或4所示的氨基酸序列的FeLV ENV多肽，并且其中所述第二多核苷酸編碼具有SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列的FeLV GAG/PRO多肽。
17.權(quán)利要求14或15的表達載體，其中編碼FeLVENV多肽的多核苷酸與SEQ ID NO: K3或5所示的序列具有至少70%的序列同一性，并且編碼FeLV GAG/PRO多肽的多核苷酸與SEQ ID NO: 10或11所示的序列具有至少70%的序列同一丨生。
18.權(quán)利要求14-17的任一項的表達載體,其中所述表達載體是禽痘載體。
19.一種免疫接種動物的方法，包括至少一次施用權(quán)利要求1-18的任一項的組合物或表達載體。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述方法包括初免-加強施用方案。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其中所述組合物以約IO5Pfu至約IO9Pfu的劑量范圍被施用。
22.—種組合物，其包含: a)表達載體，其中所述載體包含一種或多種多核苷酸，所述多核苷酸編碼一種或多種選自最優(yōu)化的FeLV多肽、最優(yōu)化的FeLV多肽的變體或片段、及其混合物的多肽；和 b)藥學(xué)上或獸醫(yī)上可接受的媒介物、稀釋劑或賦形劑。
23.—種表達載體,其包含一種或多種多核苷酸,所述多核苷酸編碼一種或多種選自最優(yōu)化的FeLV多肽、最優(yōu)化的FeLV多肽的變體或片段及其混合物的多肽。
24.一種用于初免-加強免疫接種的試劑盒，其包括至少兩個小瓶:含有用于初免-接種的權(quán)利要求1-18的任一項的組合物或表達載體的第一小瓶，和含有用于加強-接種的權(quán)利要求1-18的任一項的組合物或表達載體或者亞單位FeLV疫苗或者質(zhì)粒FeLV疫苗的第二小瓶。
25.權(quán)利要求24的試劑盒，其中所述第一小瓶含有權(quán)利要求10的組合物并且第二小瓶含有權(quán)利要求10的組合物，并且其中所述組合物以約IO5Pfu至約IO9Pfu的劑量范圍被施用。
【文檔編號】C12N15/86GK103957932SQ201280041551
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年2月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月20日
【發(fā)明者】H·普萊, T·埃德曼 申請人:梅里亞有限公司, 國家科研中心, 古斯達威羅斯研究所, 巴黎第十大學(xué)