一種a亞群禽白血病病毒基因工程亞單位疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種A亞群禽白血病病毒基因工程亞單位疫苗，其中抗原的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1。本發(fā)明利用pET32a(+)表達(dá)性載體構(gòu)建了能表達(dá)A亞群禽白血病病毒(ALV-A)囊膜表面蛋白基因(gp85)的大腸桿菌Rosetta宿主菌。經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)出了53kDa重組融合目的蛋白。將融合蛋白純化并復(fù)性后制備成基因工程亞單位氫氧化鋁膠疫苗，免疫成年祖代雞，可以誘發(fā)維持42天以上的特異性抗ALV-Ab的抗體,并可抵抗ALV-A病毒的感染。對(duì)制備的A亞群禽白血病病毒基因工程亞單位疫苗的性狀改造，使該亞單位疫苗保存期內(nèi)的免疫效力由70％提高至85％。
【專利說(shuō)明】一種A亞群禽白血病病毒基因工程亞單位疫苗

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種A亞群禽白血病病毒基因工程 亞單位疫苗。

【背景技術(shù)】
[0002] 禽白血病病毒（Avian Leukosis Viruses, ALVs)是反轉(zhuǎn)錄病毒科α反轉(zhuǎn) 錄病毒屬的成員之一。20世紀(jì)60年代，在雞群中發(fā)現(xiàn)了 5個(gè)亞群的ALV，其中A、Β、 C和D亞群是外源性的。E亞群主要以前病毒的形式存在，是內(nèi)源性的。其中A、B亞 群是雞群中較常見的ALV，而C、D亞群較少見。由于采取了嚴(yán)格的切斷垂直傳播和將 未感染的后代隔離飼養(yǎng)的凈化措施，從1987年以后國(guó)際發(fā)達(dá)國(guó)家的大型種雞公司中 就已經(jīng)宣布將外源性雞白血病毒凈化了（Payne L N，F(xiàn)adly A M.Leukosis/Sarcoma group. Calnek BW, et al. Diseases of Poultry. Ames,USA:Iowa State University Press, 1997,414-416 ；Payne L N. HPRS-103:a retrovirus strikes back.The emergence of subgroup J avian leukosis virus.Avian Pathology, 1998, 27:S36-S45 ； Spencer J L，Crittenden L B，Burmester B R, Okazaki W,Witter R L. Lymphoid Leukosis: Interrelations among virus infections in hens, eggs, embryos and chickens. Avian Diseases, 1977, 21:331-345 ；Spencer J L. Progresstowards eradiction of lymphoid leucosis viruses-a review. Avian Pathology，1984, 13:599-619.)〇 但 美國(guó)不久前報(bào)道了從馬立克氏病疫苗中分離到了 ALV-A(Silva R F，F(xiàn)adly A M，TaylOT SP.Development of a polymerase chain reaction to differentiate avain leukosis virus (ALV)subgroup: detection of an ALV contaminant in commercial Marek' s disease vaccines. Avian Diseases, 2007, 51:663-667 ；Zavala G, Cheng S. Detection and characterization of avian leukosis virus in Marek' s disease vaccines. Avian Diseases, 2006, 50:209-215 ；Barbosa T, Zavala G, Cheng S.Molecualr characterization of three recombinant isolate of avian leukosis virus obtained from contaminated Marek's disease vaccines. Avian Diseases，2008, 52:245-252)。而我國(guó)長(zhǎng)期使用從國(guó)外 進(jìn)口袓代雞和進(jìn)口疫苗，并且從來(lái)沒有對(duì)ALV采取過(guò)凈化措施，因此，我國(guó)的雞群中可能已 經(jīng)存在A亞群禽白血病。近幾年對(duì)ALV感染的血清學(xué)調(diào)查證明了 ALV-A感染的普遍性，并且 從中國(guó)的雞群中分離到了 ALV-Α(朱美真等.山東地方品系雞中一株ALV-A的分離鑒定.中 國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2009, 17 (4) :31-35 ;喬彥華，等.A亞群禽白血病病毒QC6281株的分離 與 gp85 基因的序列分析.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009,44(12) :9-11 ;Qing-chan ZHANG，Dong-min ZHAO, Hui-jun GUO, Zhi-zhong Cui. Isolation and Identification of a Subgroup A Avian Leukosis Vrius from Imported Meat-type Grand-parent Chickens. Virologica Sinica，2010, 25 (2) : 130-136.)，證實(shí)了中國(guó)雞群中A亞群禽白血病的存在。
[0003] 感染有ALV的病雞和帶毒雞是重要的傳染源。有病毒血癥的母雞產(chǎn)出的雞蛋常帶 毒，并且孵出的雛雞也會(huì)帶毒。一般雛雞在2周以內(nèi)感染這種病毒，發(fā)病率和感染率很高， 殘存母雞產(chǎn)下的蛋帶毒率也很高。外源ALV有兩種傳播途徑，垂直傳播和水平傳播。垂直 傳播是主要的傳播方式，在流行病學(xué)上很重要，決定了感染的延續(xù)性、持續(xù)性。因此，只有通 過(guò)從我國(guó)以及進(jìn)口的祖代雞的源頭上進(jìn)行凈化，才能根除禽白血病的危害。但單純通過(guò)淘 汰帶毒祖代雞給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)的損失太大，到目前為止，世界上還沒有商品化地用于預(yù)防ALV 的疫苗，這一嚴(yán)峻現(xiàn)實(shí)對(duì)于抗ALV的疫苗提出了新要求，因此通過(guò)制備抵抗ALV-A的疫苗， 使其產(chǎn)生抗ALV-A的抗體，并通過(guò)垂直傳播的方式將產(chǎn)生的抗體以母源抗體的形式傳給下 一代雛雞，從而使其對(duì)早期易感染ALV的雛雞提供較強(qiáng)的保護(hù)力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種A亞群禽白血病病毒基因工程亞單位疫苗，即通過(guò)原 核表達(dá)載體構(gòu)建出能表達(dá)A亞群禽白血病病毒（ALV-A)囊膜表面蛋白gp85的大腸桿菌 Rosetta重組基因工程菌，以制備A亞群禽白血病病毒基因工程重組亞單位疫苗。
[0005] 申請(qǐng)人:通過(guò)pET32a(+)原核表達(dá)載體構(gòu)建出能表達(dá)A亞群禽白血病病毒（ALV-A) 囊膜表面蛋白gp85的大腸桿菌Rosetta重組基因工程菌，通過(guò)對(duì)工程菌的誘導(dǎo)、超聲破碎、 融合蛋白純化、定量、與佐劑配比等制備和生產(chǎn)方法制備出了A亞群禽白血病病毒基因工 程重組亞單位疫苗。
[0006] 本發(fā)明的A亞群禽白血病病毒基因工程亞單位疫苗，其中抗原的氨基酸序列為 SEQ ID N0:1 ；
[0007] 其中編碼抗原的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。
[0008] 本發(fā)明的A亞群禽白血病病毒基因工程亞單位疫苗，為氫氧化鋁膠苗；
[0009] 本發(fā)明所提供的亞單位疫苗中，抗原蛋白的含量?jī)?yōu)選不少于207. 5 μ g/ml ;
[0010] 本發(fā)明的A亞群禽白血病病毒基因工程亞單位疫苗，其制備方法包含如下的步 驟：
[0011] 1)將ALV-A接種于DF1細(xì)胞上，提取感染細(xì)胞的DNA作為模板；
[0012] 2)通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出ALV-A囊膜表面糖蛋白gp85基因，回收gp85目的片段；
[0013] 3)將gp85目的片段按正確閱讀框架插入表達(dá)載體pET32a(+)中，構(gòu)建成表達(dá)重組 質(zhì)粒；
[0014] 4)將構(gòu)建的表達(dá)重組質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)化Rosetta宿主菌，構(gòu)建了能表達(dá)ALV-A囊膜表 面糖蛋白gp85的大腸桿菌；用該重組基因工程菌表達(dá)出ALV-A囊膜表面糖蛋白gp85融合 蛋白；
[0015] 5)對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化、復(fù)性后，加入氫氧化鋁膠相制成疫苗。
[0016] 6)為了提高疫苗的免疫效力，對(duì)抗原進(jìn)行改造，改造后的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0:3。
[0017] 本發(fā)明利用pET32a (+)表達(dá)性載體構(gòu)建了能表達(dá)A亞群禽白血病病毒（ALV-A)囊 膜表面蛋白基因（gp85)的大腸桿菌Rosetta宿主菌。經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)出了 53kDa 重組融合目的蛋白。將融合蛋白純化并復(fù)性后制備成基因工程亞單位氫氧化鋁膠疫苗，免 疫成年祖代雞，可以誘發(fā)維持42天以上的特異性抗ALV-Ab的抗體，并可抵抗ALV-A病毒 的感染。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 實(shí)施例1表達(dá)ALV-A gp85基因的重組質(zhì)粒pET32a-ALV-A-gp85的構(gòu)建 [0019] 根據(jù)ALV-A YB株病毒基因組中g(shù)p85囊膜糖蛋白基因序列與表達(dá)性載體 PET32a(+)的多克隆酶切位點(diǎn)，利用DNAStar軟件設(shè)計(jì)ALV-A-gp85的特異性引物：gp85-F :5-TATGGATCCCACTTACTCGAGCAGCCA-3 加入了 BamH I 酶切位點(diǎn)；gp85-R:5-ATAGCGGCCGCCT AGACGCTTCGTTTATGTC-3加入了 Not I酶切位點(diǎn)。以禽白血病病毒基因組DNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，并用DNA純化回收試劑盒回收目的基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0:2,編碼的 蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。利用pET32a(+)質(zhì)粒獲得pET32a-ALV-A-gp85重組質(zhì) 粒，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)性大腸桿菌Rosetta宿主菌，挑取單個(gè)克隆，酶切法鑒定陽(yáng)性克 隆，搖菌，測(cè)序。
[0020] 實(shí)施例2.重組融合蛋白的表達(dá)、純化、復(fù)性及SDS-PAGE鑒定
[0021] 將測(cè)序結(jié)果正確的單個(gè)克隆重組質(zhì)粒pET32a-ALV-A_gp85轉(zhuǎn)化表達(dá)性Rosetta 宿主菌構(gòu)建出重組基因工程菌，命名為pET32a-ALV-A-gp85/Rosetta。將該重組基因工程 菌接種于5ml含有氨芐青霉素（100mg/L)的LB細(xì)菌培養(yǎng)基，37°C振搖（200r/min)培養(yǎng) 過(guò)夜，次日取出lml培養(yǎng)物接種于120ml的LB培養(yǎng)基中，37°C振搖（200r/min)培養(yǎng)2. 5h 后，菌液搖至半透明半渾濁狀態(tài)，吸光光度法測(cè)得0D600 = 0. 6?0. 8,在誘導(dǎo)前先取10ml 作為誘導(dǎo)前對(duì)照，并將振搖溫度變?yōu)?0°C加 α -乳糖（終濃度為1. 0mm〇l/L)誘導(dǎo)，分別 誘導(dǎo)lh、2h、3h、4h、5h、6h收集10ml菌液，以誘導(dǎo)未轉(zhuǎn)化pET32a(+)載體的菌液作為空白 對(duì)照，以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化pET32a(+)載體的菌液作為空載體對(duì)照。按照以下步驟進(jìn)行純化、復(fù)性： (1)將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液取出分裝至50ml離心管中，4000r/min離心10min，棄上清；（2)用 lml TE1 (Tris-cll0mM/L，EDTA 二鈉 lmM/L, PH = 8. 0)重懸沉淀并轉(zhuǎn)移至 1. 5ml 離心管中， 按照以下條件：超聲30s、間隔30s、工作20次、480V電壓下超聲波裂解破碎工程菌，7000r/ min4°C離心 20min，棄上清；（3)將沉淀中加入 lml TE2(Triton X-100/TE1 = 1/100 配置） 震蕩混勻，7000r/min4°C離心20min，棄上清；（4)在沉淀中加入lml TE3 (用TE1配置2M/L 尿素），7000r/min4°C離心20min，棄上清；（5)將沉淀收集加入150ml變性液（8M/L尿素、 10mM/L Tris_cl、10mM/L DTT)攪拌溶解，8000r/min4°C離心 30min，取上清；（6)將上清液 加入半透膜袋中，4°C透析復(fù)性48h。取半透膜袋中的蛋白液按1:1加2X上樣Buffer煮沸 10min，離心取上清，上清用12% SDS-PAGE電泳鑒定分析獲得53kDa目的蛋白。
[0022] 實(shí)施例3純化融合蛋白定量與A亞群禽白血病病毒基因工程亞單位疫苗制備
[0023] 將純化好的A亞群禽白血病gp85目的蛋白用分光光度法按照以下步驟進(jìn)行絕對(duì) 定量：（1)加測(cè)蛋白用的PBS0. 15ml和蛋白定量用考馬斯亮藍(lán)染液2. 85ml于比色皿中作為 對(duì)照，進(jìn)行調(diào)零；（2)加測(cè)蛋白用PBS0. 14ml、加待測(cè)蛋白溶液0. 01ml和蛋白定量用考馬斯 亮藍(lán)染液2. 85ml于比色皿中測(cè)出吸光度值y為0. 184,通過(guò)公式y(tǒng) = 0. 0142X+0. 0658得出 蛋白濃度X = 〇. 83mg/ml，即為830 μ g/ml，以上所用測(cè)蛋白用試劑購(gòu)自TIANGEN公司。將 此純化的融合蛋白溶液與氫氧化鋁膠佐劑按體積比=1 :3進(jìn)行配苗，制備成A亞群禽白血 病病毒基因工程亞單位疫苗，相當(dāng)于每毫升氫氧化鋁膠苗中含有融合蛋白207. 5 μ g/ml。
[0024] 實(shí)施例4 A亞群禽白血病病毒基因工程亞單位疫苗對(duì)成年祖代雞免疫反應(yīng)及抗體 水平檢測(cè)
[0025] 以0. 5ml/只的劑量用胸部肌肉注射的途徑免疫4月齡的成年祖代雞，14天后重 復(fù)免疫一次。成年祖代雞在帶過(guò)濾空氣裝置的隔離罩內(nèi)飼養(yǎng)，飼料及飲用水均高壓滅菌，維 生素及飼料添加劑亦經(jīng)過(guò)無(wú)菌檢測(cè)。在二免后14d、35d、42d、49d采集的血清用ELISA標(biāo)準(zhǔn) 試劑盒（ALV-Ab Antibody Test Kit，購(gòu)于IDEXX公司）進(jìn)行檢測(cè)。ELISA試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的 S/P值> 0. 4判為陽(yáng)性。
[0026] 檢測(cè)結(jié)果如下：成年祖代雞免疫接種試驗(yàn)表明（表1)，用制備的A亞群禽白血病 病毒基因工程亞單位疫苗第2次胸部肌肉注射后14d，ELISA ALV-Ab檢測(cè)試劑盒測(cè)得4只 雞（編號(hào)為3?6)血清的S/P值（[待檢樣品孔讀數(shù)-已知陰性對(duì)照孔讀數(shù)]/[標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性 對(duì)照孔讀數(shù)-已知陰性對(duì)照孔讀數(shù)])都大于〇. 4,呈強(qiáng)陽(yáng)性，并且其中3號(hào)雞的抗體水平 明顯高于其它雞只，S/P值竟高達(dá)1.735。其它幾只雞的抗體水平也明顯高于對(duì)照雞（編號(hào) 為1?2)血清。隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)體內(nèi)ALV-A的中和抗體滴度開始下降，在第2次 免疫注射后35d檢測(cè)時(shí)，雖然4只雞仍為強(qiáng)陽(yáng)性，但S/P值已經(jīng)下降。在二免后42d，雞血清 中ALV-A的中和抗體滴度最低值下降至陽(yáng)性臨界值。在二免后49d，4只雞血清的S/P值均 降至0. 4以下，但仍高于對(duì)照組雞。
[0027] 實(shí)施例5亞單位疫苗免疫祖代雞后種蛋孵出雛雞母源ALV-Ab抗體檢測(cè)及ALV-A 攻毒保護(hù)試驗(yàn)
[0028] 將制備的A亞群禽白血病病毒基因工程亞單位氫氧化鋁膠疫苗，以0. 5ml/只的劑 量免疫4月齡成年祖代雞。所有成年祖代雞在無(wú)菌隔離罩內(nèi)飼養(yǎng)，于二免后產(chǎn)蛋雞抗體水 平最高時(shí)收集種蛋（包括無(wú)抗體組）進(jìn)行孵化。孵出雛雞12只，其中無(wú)抗體組4只，有抗體 組8只，于1日齡用ALV-A病毒以10 6TCID5(I/只的劑量進(jìn)行腹腔攻毒，以后每隔10d無(wú)菌采 血,進(jìn)行血液病毒分離試驗(yàn)并采用間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA)進(jìn)行檢測(cè)，以確定血液中ALV-A 病毒是否存在。結(jié)果，攻毒后l〇d、20d和30d分別采血分離病毒，有抗體組8只雞IFA結(jié)果 全部為陰性，無(wú)抗體組4只雞IFA檢測(cè)結(jié)果全為陽(yáng)性。血清ELISA標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，其 有抗體組7只雞抗體水平并未升高。以上說(shuō)明ALV-A病毒并未在雞體內(nèi)增殖，從而證明成 年祖代雞在免疫該亞單位疫苗后，能產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力，以抵抗ALV-A病毒的侵襲。
[0029] 實(shí)施例6 A亞群禽白血病病毒基因工程亞單位疫苗的性狀改造
[0030] 本發(fā)明制備的A亞群禽白血病病毒基因工程亞單位疫苗在保存過(guò)程中，由于蛋白 的降解，會(huì)發(fā)生效價(jià)降低現(xiàn)象。為了延長(zhǎng)疫苗的保存期限，對(duì)囊膜表面蛋白gp85的氨基酸 序列進(jìn)行了改造，從而使改造后的疫苗在免疫效力不下降的基礎(chǔ)上，能夠在長(zhǎng)期保存過(guò)程 中效價(jià)下降速度變慢。
[0031] 具體的改造方法如下：
[0032] 設(shè)計(jì) PCR 引物 Xynll-Fla、Xynll-Rlb 如下：
[0033] Xynll-Fla ：GGCGAATTC TATGGATCCCACTTACTCGAGCAGCCA(下劃線為限制性內(nèi)切酶 EcoRI識(shí)別位點(diǎn)）
[0034] Xynll-Rlb ：ATAGCGGCCGC ATAGCGGCCGCCTAGACGCTTCGITTATGTC(下劃線為限制性 內(nèi)切酶NotI識(shí)別位點(diǎn)）
[0035] 以核苷酸序列為SEQ ID N0 :2的基因片段為模板，以上述引物用GeneMorph II隨 機(jī)突變PCR試劑盒（Stratagene)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收PCR產(chǎn)物，EcoRI、NotI進(jìn)行酶切處 理后與經(jīng)同樣酶切后的pET32a(+)載體連接，將該重組基因工程菌接種于5ml含有氨芐青 霉素（100mg/L)的LB細(xì)菌培養(yǎng)基，37°C振搖（200r/min)培養(yǎng)過(guò)夜，次日取出lml培養(yǎng)物接 種于120ml的LB培養(yǎng)基中，37°C振搖（200r/min)培養(yǎng)2. 5h后，菌液搖至半透明半渾濁狀 態(tài)，吸光光度法測(cè)得OD600 = 0. 6?0. 8,在誘導(dǎo)前先取10ml作為誘導(dǎo)前對(duì)照，并將振搖溫 度變?yōu)?0°C加 α -乳糖（終濃度為1. 〇mm〇l/L)誘導(dǎo)，分別誘導(dǎo)lh、2h、3h、4h、5h、6h收集 l〇ml菌液，以誘導(dǎo)未轉(zhuǎn)化pET32a(+)載體的菌液作為空白對(duì)照，以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化pET32a(+)載體 的菌液作為空載體對(duì)照。按照以下步驟進(jìn)行純化、復(fù)性：（1)將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液取出分裝至 50ml 離心管中，4000r/min 離心 lOmin，棄上清；（2)用 lml TEl(Tris-cllOmM/L，EDTA 二鈉 ImM/L，PH = 8. 0)重懸沉淀并轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管中，按照以下條件：超聲30s、間隔30s、工 作20次、480V電壓下超聲波裂解破碎工程菌，7000r/min4°C離心20min，棄上清；（3)將沉 淀中加入 lml TE2(Triton X-100/TE1 = 1/100 配置）震蕩混勻，7000r/min4°C 離心 20min， 棄上清；（4)在沉淀中加入lml TE3 (用TE1配置2M/L尿素），7000r/min4°C離心20min，棄 上清；（5)將沉淀收集加入150ml變性液（8M/L尿素、10mM/L Tris-clUOmM/L DTT)攪拌溶 解，8000r/min4°C離心30min，取上清；（6)將上清液加入半透膜袋中，4°C透析復(fù)性48h。取 半透膜袋中的蛋白液，即得到純化復(fù)性的gp85囊膜表面糖蛋白突變體。
[0036] 最終篩選出氨基酸序列為SEQ ID N0 :3的突變體，將突變體按照實(shí)施例3記載的 方法進(jìn)行定量配苗，制備的亞單位疫苗按照實(shí)施例4和實(shí)施例5記載的方法進(jìn)行疫苗免疫 效力評(píng)價(jià)。結(jié)果，獲得具有免疫效力且能夠抵抗ALV-A病毒侵染的突變體亞單位疫苗。然 后將具有免疫效力的gp85囊膜表面糖蛋白突變體制備的亞單位疫苗進(jìn)行保存期試驗(yàn)，其 在2?8°C保存4個(gè)月后還保有85%以上的免疫效力，而沒有進(jìn)行隨機(jī)突變的亞單位疫苗 免疫效力僅為70%。
[0001] 序列表 SEQUENCE LISTING <110>青島易邦生物工程有限公司 <120> -種A亞群禽白血病病毒基因工程亞單位疫苗 <160> 3 <170> Patent!n version 3.5 <210> 1 <211> 341 <212> PRT <213> wild amino acid sequence <400> 1 Asp Val His Leu Leu Glu Gin Pro Gly Asn Leu Trp lie ThrTrp Ala 1 5 10 15 Asn Arg Thr Gly Gin Thr Asp Phe Cys Leu Ser Thr Gin Ser Ala Thr 20 25 30 Ser Pro Phe Gin Thr Cys Leu lie Gly lie Pro Ser Pro lie Ser Glu 35 40 45 Gly Asp Phe Lys Gly Tyr Val Ser Asp Asn Cys Thr Thr Leu Gly Thr 50 55 60 Asp Arg Leu Val Ser Ser Ala Ser lie Thr Gly Gly Pro Asp Asn Ser 65 70 75 80 Thr Thr Leu Thr Tyr Arg Lys Val Ser Cys Leu Leu Leu Lys Leu Asn 85 90 95 Val Ser Met Trp Asn Glu Pro Pro Glu Leu Gin Leu Leu Gly Ser Gin 100 105 110
[0002] Ser Leu Pro Asn lie Thr Asp lie Thr Gin lie Ser Gly Val Ala Gly 115 120 125 Gly Cys Val Gly Phe Arg Pro Lys Gly Val Pro Trp Tyr Leu Gly Trp 130 135 140 Ser Gin Gly Giu Ala Thr Arg Phe Leu Leu Arg His Pro Ser Phe Ser 145 150 155 160 Asn Leu Thr Glu Pro Phe Thr Val Val Thr Ala Asp Arg His Asn Leu 165 170 175 Phe Met Gly Ser Glu Tyr Cys Gly Ala Tyr Gly Tyr Arg Phe Trp Glu 180 185 190 lie Tyr Asn Cys Ser His Arg Trp Gly Ser Ser Thr Ala Val Ala Met 195 200 205 His Ala Ala Pro Ala Arg Val lie Leu Lys Pro Ser Val Gin Gly Glu 210 215 220 Glu Ala Asn Gly Leu lie Asn His Gly Lys Leu Met Arg Gin Ser Arg 225 230 235 240 Ser Ala Leu Arg Arg Pro Val Gin Leu Val Leu Gly Asn Ala Ser Gly 245 250 255 Cys Cys Gly Lys Ala Gly Thr lie Leu Pro Gly lie Trp Val Asp Ser 260 265 270 Thr Gin Gly Asn Phe Thr Lys Pro Lys Ala Leu Pro Pro Ala lie Phe 275 280 285
[0003] Leu lie Cys Gly Asp Arg Ala Trp Gin Gly lie Pro Ser Arg Pro Val 290 295 300 Gly Gly Pro Cys Tyr Leu Gly Lys Leu Thr Met Leu Ala Pro Asn His 305 310 315 320 Thr Asp lie Leu Lys lie Leu Ala Asn Ser Ser Arg Thr Gly lie Arg 325 330 335 Arg Arg Arg Ser Val 340 <210> 2 <211> 1023 <212> DNA <213> wild gene sequence <400> 2 gatgtccact tactcgagca gccagggaat ctttggatta catgggccaa ccgtacaggc 60 caaacggatt tctgcctctc tacacagtca gccacttccc cttttcaaac atgtttgata 120 ggcatcccgt cccctatttc cgaaggtgat tttaagggat acgtctctga taattgcacc 180 accttgggaa ctgaccggtt agtctcgtca gccagcatta ctggcggccc tgacaacagc 240 accaccctca cttatcgaaa ggtttcatgc ttgctgttaa aactgaacgt ctctatgtgg 300 aatgagccac cggaactaca gctgctaggt tcccagtctc tccctaacat tactgatatt 360 actcagattt ctggtgtagc tgggggatgc gtaggcttca ggccgaaagg ggtcccctgg 420 tacctgggtt ggtctcaggg ggaggccaca cggttcctcc ttagacaccc ctctttctct 480 aatctcacgg aaccgttcac ggtggtaaca gcggatagac acaatctctt tatggggagt 540 gagtattgcg gtgcgtacgg atacagattt tgggaaatat acaactgctc acacaggtgg 600 ggcagcagta ccgctgtggc aatgcacgcc gcccccgccc gggtcatcct gaaacccagt 660
[0004] gtacaaggag aggaggcaaa tgggttaatc aatcacggaa aattaatgag acagagccgt 720 tcagctttac ggtaacctgt acagctagta ttgggcaatg ccagtggatg ttgcpgaaaa 780 gcaggcacga ttctcccggg aatctgggtc gacagcacac aaggtaattt caccaaacca 840 aaagcgctac cacccgcaat tttcctcatt tgcggggatc gcgcatggca gggaattcct 900 agtcgtccgg tagggggccc ctgctattta ggcaagctta ccatgttagc acccaaccat 960 acagatattc tcaaaattct tgctaattcg tcgcggacag gtataagacg tagacgaagc 1020 gtc 1023 <210> 3 <211> 341 PFTT <213> mutant amino acid sequence <400> 3 Asp Val His Leu Leu Glu Gin ProGlyAsn Leu Trp UeThrTrp Ala 1 5 10 15 Asn Arg Thr Gly Gin Thr Asp Phe Cys Leu Ser Thr Gin Ser Ala Thr 20 25 30 Ser Pro Phe Gin Thr Cys Leu lie Gly lie Pro Ser Pro lie Ser Glu 35 40 45 Gly Asp Phe Lys Gly Tyr Val Ser Asp Asn Cys Thr Thr Leu Gly Thr 50 55 60 Asp Arg Leu Val Ser Ser Ala Ser lie Thr Gly Gly Pro Asp Asn Ser 65 70 75 B0 Thr Thr Leu Thr Tyr Arg Lys Val Ser Cys Leu Leu Leu Lys Leu Asn
[0005] 85 90 95 Val Ser Met Trp Asn Glu Pro Pro Glu Leu Gin Leu Leu Gly Ser Gin 100 105 110 Ser Leu Pro Asn lie Thr Asp lleThr Gin lie Ser Gly Val Ala Gly 115 120 125 Gly Cys Val Gly Phe Arg Pro Lys Gly Val Pro Trp Tyr Leu Gly Trp 130 135 140 Ser Gin Gly Glu Ala Thr Arg Phe Leu Leu Arg His Pro Ser Phe Ser 145 150 155 160 Asn Leu Thr Glu Pro Phe Thr Val Val Thr Ala Asp Arg His Asn Leu 165 170 175 Phe Met Gly Ser Glu Tyr Cys Gly Ala Tyr Gly Tyr Arg Phe Trp Glu 180 185 190 lie Tyr Asn Cys Ser His Arg Gly Gin Gin Tyr Thr Ala Val Ala Met 195 200 205 His Ala Pro Arg Pro Gin Ser lie Leu Lys Pro Ser Thr Arg Gin Gin 210 215 220 Gly Ala Asn Gly Leu lie Asn His Giy Lys Leu Met Arg Gin Ser Arg 225 230 235 240 Ser Ala Leu Arg Arg Pro Val Gin Leu Val Leu Gly Asn Ala Ser Gly 245 250 255 Cys Cys Gly Lys Ala Gly Thr lie Leu Pro Gly lie Trp Val Asp Ser
[0006]
【權(quán)利要求】
1. 一種A亞群禽白血病病毒基因工程亞單位疫苗，其特征在于，所述的疫苗免疫祖代 雞可以誘發(fā)維持42天以上的特異性抗ALV-Ab的抗體，免疫祖代雞所產(chǎn)種蛋孵出雛雞可抵 抗ALV-A病毒的感染。
2. 如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于疫苗抗原的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1。
3. 如權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于所述的抗原編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
4. 如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的抗原的氨基酸序列為SEQ ID NO:3。
5. 如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的疫苗為氫氧化鋁膠苗。
6. 如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的抗原蛋白的含量為207. 5 μ g/ml。
7. 權(quán)利要求1所述的疫苗的制備方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步驟： 1) 將ALV-A接種于DF1細(xì)胞上，提取感染細(xì)胞的DNA作為模板； 2) 通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出ALV-A囊膜表面糖蛋白gp85基因，回收gp85目的片段； 3) 將gp85目的片段按正確閱讀框架插入表達(dá)載體pET32a(+)中，構(gòu)建成表達(dá)重組質(zhì) 粒； 4) 將構(gòu)建的表達(dá)重組質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)化Rosetta宿主菌，構(gòu)建了能表達(dá)ALV-A 囊膜表面糖蛋白gp85的大腸桿菌；用該重組基因工程菌表達(dá)出ALV-A囊膜表面糖蛋白 gp85融合蛋白； 5) 對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化、復(fù)性后，加入氫氧化鋁膠相制成疫苗。
8. 如權(quán)利要求1所述的疫苗，通過(guò)對(duì)其性狀進(jìn)行改造，使該亞單位疫苗保存期內(nèi)的免 疫效力由70 %提高至85%。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK104096241SQ201410347690
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月19日
【發(fā)明者】張恒, 范根成, 杜元釗 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司