一種對胎糞alv病毒p27蛋白快速反應(yīng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種對胎糞ALV病毒P27蛋白快速反應(yīng) 的方法，
【背景技術(shù)】
[0002] 禽白血病（avian leukemia，AL)是由禽白血病病毒（avian leukemia virus，ALV) 引起的家禽腫瘤性疾病。ALV在各類雞群都廣泛性感染，包括白雞、蛋雞和地方黃雞。對ALV 的防控措施，只有通過疾病凈化，沒有其它更好的捷徑。ALV既可以水平傳播，也可以垂直傳 播。對育種企業(yè)而言，垂直傳播的危害性更大。在禽白血病的垂直傳播環(huán)節(jié)中，以1日齡胎 糞的載毒量最高，橫向傳染性最強，所以胎糞ALV病毒的檢測和陽性雛雞的淘汰是AL凈化 流程中最重要的核心環(huán)節(jié)。
[0003] 目前國內(nèi)外的家禽育種企業(yè)在大批量鑒定胎糞ALV的免疫學(xué)方法主要以EL ISA (酶聯(lián)免疫吸附實驗）為主，以間接免疫熒光（IFA)、PCR為輔。以上各種方法雖然可能 在臨床上提供一定的幫助，但因操作過程較為繁瑣，效率較低。以2000羽雛雞的規(guī)模計算， 該環(huán)節(jié)傳統(tǒng)的ELISA檢測與淘汰方法大致需要20小時，整個胎糞ALV檢測/淘汰環(huán)節(jié)時間 冗長，導(dǎo)致初生苗雞在長時間等待檢測結(jié)果、高密度集中存放狀態(tài)下容易出現(xiàn)脫水，同時導(dǎo) 致其它病原（特別是垂直傳播的病原和1日齡橫向傳播的病原）在雛雞之間交叉感染幾率 增大，同時生產(chǎn)技術(shù)人員疲憊，效率較低。因此有必要建立一種快速高效的現(xiàn)場診斷雞群胎 糞ALV的方法，對臨床的操作具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明主要提供了一種對胎糞ALV病毒P27蛋白快速反應(yīng)的方法，該檢測方法能 夠快速、高效的檢測禽白血病，且節(jié)約成本。具體技術(shù)方案如下：一種對胎糞ALV病毒P27 蛋白快速反應(yīng)的方法，包括以下步驟：
[0005] (1)以同一母性家禽所孵化出的幼禽為單位，一窩即為一個家系，對每一家系單獨 編號，每一窩中的2只幼禽的胎糞合并作為一個檢測樣本，將檢測樣本加入含有緩沖液的 樣品采集管中；
[0006] (2)將樣品采集管放入保溫盒中，向保溫盒中加入液氮，待檢測樣本完全冰凍后取 出；
[0007] (3)將步驟（2)冰凍的檢測樣本放入水浴鍋中恒溫融化，并混勻；
[0008] (4)重復(fù)步驟（2)-(3) -次；
[0009] (5)室溫下，將步驟（4)處理完成的檢測樣本的上清液分別加入到預(yù)先包被了針 對ALV病毒P27蛋白的一組特異性單克隆抗體的檢測試紙條的加樣端進行特異性反應(yīng)； [0010] (6)反應(yīng)完全后，采取家系淘汰制，即同一只家禽的種蛋孵出的幼禽，若有一只出 現(xiàn)胎糞檢測ALV陽性，則該窩幼禽全部淘汰。
[0011] 優(yōu)選的，步驟（2)中冰凍時間為2-4min。
[0012] 優(yōu)選的，步驟（3)中恒溫融化時間為2-4min。
[0013] 優(yōu)選的，步驟（6)中反應(yīng)完全的時間為5-10min。
[0014] 優(yōu)選的，所述家禽為雞、鴨、鵝。
[0015] 采用上述對胎糞ALV病毒P27蛋白快速反應(yīng)的方法，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0016] (1)本發(fā)明的反應(yīng)方法中，將幼禽逐只采集胎糞檢測提升為兩只幼禽的胎糞合并 檢測，檢測靈敏度高，節(jié)省大量的人力和物力；
[0017] (2)本發(fā)明的反應(yīng)方法采取家系淘汰制，即一只母性家禽的種蛋孵出的幼禽為一 窩，只要有一只出現(xiàn)ALV陽性，即淘汰該窩所有幼禽，減少垂直傳播的危害性，這只需對同 一家系進行同一編號即可，避免了對所有幼禽進行逐一編號的弊端，極大的縮減了采樣編 號時長，同時避免了現(xiàn)有的穿刺編號對幼禽的刺激，減少編號費用的投入，節(jié)省人力物力；
[0018] (3)本發(fā)明的反應(yīng)方法中采用快速凍融的方法，傳統(tǒng)的凍融方法耗時需4小時之 久，導(dǎo)致初生苗雞長時間脫水、高密度雛苗等待檢測結(jié)果時集中存放導(dǎo)致其它病原容易相 互傳染，而本發(fā)明中凍融一次只需6min左右，極大地縮減檢測時長，同時避免操作時間過 長對試驗的影響，能夠快速、高效的檢測胎糞中禽白血病病毒抗原。
【具體實施方式】
[0019] 一、具體實施例 [0020] 實施例1
[0021] 以檢測黃羽肉雞的ALV病毒為例，下述的檢測方法同樣適用于其它的禽類ALV病 毒檢測。
[0022] 1.胎糞采集及凍融
[0023] (1)物品的準備：樣品采集專用的耐凍融樣品盒（含底帶蓋），裝滿液氮的液氮罐 2個，帶蓋保溫盒3個，水浴鍋，專用的樣品稀釋裂解液；
[0024] (2)樣品采集：以窩（同一母雞所孵化出的雛雞）為單位，每一個家系單獨編號。 同時根據(jù)本研究的定量研究結(jié)果，每2只雛雞的胎糞合并到一個含專用采樣緩沖液的樣品 采集管內(nèi)，這比傳統(tǒng)方法（逐只單樣品收集）節(jié)省一半的檢測費用和的大量后續(xù)的人力物 力；（3)快速凍融樣品：收到樣品后將盒子的底部殼子去掉，只將蓋子和樣品部分放入特定 保溫盒中，使用容器往泡沫盒中添加液氮，迅速用保溫盒的蓋子蓋住。待樣品全部冰凍后取 出，冷凍過程大約需要2-4min ;
[0025] (4)迅速融化樣品：預(yù)先調(diào)整水浴鍋溫度到37°C，將上述冷凍的樣品原樣（樣 品部分及蓋子）放入水浴鍋中，并顛倒混勻，待樣品全部融化后取出，融化過程大約需要 2_4min ;
[0026] (5)重復(fù)凍融：上述（3)-⑷步驟；
[0027] 以凍融一盒樣本為例，整個凍融環(huán)節(jié)總共需要15min，比零下70°C冰箱凍融的傳 統(tǒng)方法（約4h)，節(jié)約時間三個多小時。
[0028] 2.胎糞ALV的快速檢測
[0029] (1)物品準備：凍融過兩次的胎糞樣品，小型一次性塑料吸管，檢測試劑和平板 (擺放試紙條）。
[0030] (2)將預(yù)先包被了針對ALV病毒P27蛋白的一組特異性單克隆抗體的檢測試紙條 并行排列在檢測平板。使用一次性小塑料吸管，按樣品擺放順序滴加200微升（4滴）樣品 (上清）到檢測條的加樣端，一般在室溫（20-25度）下反應(yīng)5-10分鐘判斷結(jié)果。如果操 作時間過長（> 10~20min)，會引起非特異反應(yīng)。熟練操作人員加樣50個，需時間大約 5-6min〇
[0031] (3)安排技術(shù)員進行結(jié)果判斷：每50個樣本在加樣結(jié)束后即可判定（加樣約 5min)，同時在記錄紙上記錄此時間點的結(jié)果，剩余樣本需放置2~5min再判定（加樣結(jié)束 后 5min)〇
[0032] (4)淘汰環(huán)節(jié)：采取家系淘汰，即同一只母雞的種蛋孵出的苗雞，只要有一只出現(xiàn) 胎糞檢測ALV陽性，即該母雞的所產(chǎn)的其他苗雞全部淘汰。
[0033] 3.操作注意點
[0034] (1)為保障整個檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定，避免一些非特異因素的干擾，對每批檢測試劑， 用病毒衣殼蛋白P27基因表達產(chǎn)物作為陽性對照、將新鮮配制的采樣緩沖液和純水（5份） 作為陰性對照進行驗證，正常情況在5-10min內(nèi)P27蛋白為陽性、采樣緩沖液和純水均為陰 性。檢測試劑的保存，室溫（25°C左右），時間不要超過2個月。
[0035] (2)加樣時注意不要吸取有雜質(zhì)的部分，防止太黏導(dǎo)致樣品蛋白在檢測試紙條上 不能迀移。
[0036] (3)不同家系雞群，注意吸管的更換，避免交叉污染。
[0037] (4)樣本加完后放回原處，等結(jié)果判定無誤后再棄掉。
[0038] (5)判定時光照要強，太弱會影響結(jié)果判定。
[0039] (6)陽性雞群標記與處理：每個家系的雞群中，有一個以上出現(xiàn)陽性，用紅筆標 記，必須淘汰。
[0040] 二、檢測效果的評估
[0041] 由于慢速型中國地方黃羽肉雞ALV病毒排毒時間點的不確定性，很少做胎糞檢測 和淘汰效果的系統(tǒng)評估。本技術(shù)體系則根據(jù)前期研究結(jié)果，建立了胎糞檢測淘汰效果的評 估技術(shù)。
[0042] 具體技術(shù)細節(jié)如下：
[0043] (1)選取慢速黃羽肉雞種雞群的未檢測胎糞組和檢測胎糞組，分別跟蹤4周齡、6 周齡、8周齡，采樣用于檢測腸粘膜排毒（腸毒）和血淋巴細胞病毒（血毒）陽性率；
[0044] (2)血毒和腸毒檢測：血毒檢測法是，將血淋巴細胞直接接種雞胚成纖維細胞系 DF1細胞，感染1小時后，棄去上清，連續(xù)培養(yǎng)8天，凍融DF1細胞，然后采用ELISA方法檢測 ALV病毒P27蛋白；腸毒檢測法是，直接將腸粘膜棉拭子收集到特定的樣品緩沖液，反復(fù)凍 融2次后，直接用ELISA法檢測病毒P27抗原。S/P大于0. 2的樣品判定為病毒感染陽性。 [0(Μ5] 表1檢測結(jié)果
[0046]
[0047] 現(xiàn)場技術(shù)評估典型結(jié)果如下：
[0048] 從各個時間段的腸毒和血毒陽性結(jié)果來看，"檢測胎糞組"比"未檢測胎糞組"陽性 率有明顯的降低。證明整個胎糞檢測和淘汰技術(shù)體系的準確性和實效性高。而未檢測胎糞 組，隨著雛雞的長大，其感染率也逐漸增大，最終對雛雞或成雞的淘汰率也增高，浪費了更 多的成本。
[0049] 對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種 相應(yīng)的改變以及形變，而所有的這些改變以及形變都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍 之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種對胎糞ALV病毒P27蛋白快速反應(yīng)的方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 以同一母性家禽所孵化出的幼禽為單位，一窩即為一個家系，對每一家系單獨編 號，每一窩中的2只幼禽的胎糞合并作為一個檢測樣本，將檢測樣本加入含有緩沖液的樣 品采集管中； (2) 將樣品采集管放入保溫盒中，向保溫盒中加入液氮，待檢測樣本完全冰凍后取出； (3) 將步驟（2)冰凍的檢測樣本放入水浴鍋中恒溫融化，并混勻； (4) 重復(fù)步驟（2)-(3) -次； (5) 室溫下，將步驟⑷處理完成的檢測樣本的上清液分別加入到預(yù)先包被了針對ALV 病毒P27蛋白的一組特異性單克隆抗體的檢測試紙條的加樣端進行特異性反應(yīng)； (6) 反應(yīng)完全后，采取家系淘汰制，即同一只家禽的種蛋孵出的幼禽，若有一只出現(xiàn)胎 糞檢測ALV陽性，則該窩幼禽全部淘汰。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種對胎糞ALV病毒P27蛋白快速反應(yīng)的方法，其特征在于： 步驟（2)中冰凍時間為2-4min。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種對胎糞ALV病毒P27蛋白快速反應(yīng)的方法，其特征在于： 步驟（3)中恒溫融化時間為2-4min。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種對胎糞ALV病毒P27蛋白快速反應(yīng)的方法，其特征在于： 步驟（6)中反應(yīng)完全的時間為5-10min。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的一種對胎糞ALV病毒P27蛋白快速反應(yīng)的方法，其 特征在于：所述家禽為雞、鴨、鵝。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種對胎糞ALV病毒P27蛋白快速反應(yīng)的方法，其包括以下步驟：(1)以同一母性家禽所孵化的幼禽為單位，對每一家系編號，每窩中的2只幼禽的胎糞合并作為一個檢測樣本，將檢測樣本加入含緩沖液的樣品采集管中；(2)將樣品采集管放入保溫盒中并加入液氮，完全冰凍后取出；(3)水浴恒溫融化，并混勻；(4)重復(fù)(2)-(3)一次；(5)室溫下，將步驟(4)處理完成的檢測樣本的上清液分別加入到預(yù)先包被了針對ALV病毒P27蛋白的一組特異性單克隆抗體的檢測試紙條的加樣端進行特異性反應(yīng)；(6)采取家系淘汰制淘汰。本發(fā)明的方法能夠快速、高效的檢測胎糞中禽白血病病毒抗原，且節(jié)約成本。
【IPC分類】G01N33/569
【公開號】CN105353124
【申請?zhí)枴緾N201510886247
【發(fā)明人】劉岳龍, 秦愛建, 尹麗萍, 繆偉, 莊新娟, 朱江寧, 程立力, 錢琨, 邵紅霞, 梁有志, 楊銅, 戎雙琳, 辜新貴
【申請人】江蘇立華牧業(yè)股份有限公司
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年12月4日