指示阿爾茨海默氏病的微rna生物標志物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了通過測定源自受試者的樣品中的至少一種miRNA的水平來診斷受試者中的阿爾茨海默氏病的方法，其中所述至少一種miRNA的水平相對于合適對照的變化指示受試者中的阿爾茨海默氏病。還提供了監(jiān)測阿爾茨海默氏病的進程的方法，治療患有阿爾茨海默氏病的受試者的方法，和用于診斷阿爾茨海默氏病的試劑盒。
【專利說明】指TF阿爾茨海默氏病的微RNA生物標志物
[0001]相關申請
[0002]本申請要求2011年6月27日提交的美國臨時申請?zhí)?1/501，720的優(yōu)先權，其整個內(nèi)容通過引用并入本文。
【背景技術】
[0003]阿爾茨海默氏病是人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種進行性疾病。它表現(xiàn)為癡呆(通常在老年人中)，且征狀包括定向障礙，記憶缺失，語言、計算或視覺-空間技能的困難，以及精神病學表現(xiàn)。阿爾茨海默氏病與腦的幾個區(qū)域中的變性神經(jīng)元有關。阿爾茨海默氏病的神經(jīng)病理學的特征在于，存在淀粉樣蛋白斑塊、神經(jīng)原纖維纏結、突觸損失和選擇性的神經(jīng)元細胞死亡。淀粉樣蛋白斑塊源自異常的細胞外淀粉樣蛋白P肽水平，而神經(jīng)原纖維纏結與細胞內(nèi)的過度磷酸化的tau蛋白的存在有關。征狀通常首先在臨床上表現(xiàn)出記憶減退和隨后的其它認知功能的衰退以及異常行為。全世界大約2400萬人患有癡呆，其中大多數(shù)(~60%)是由于阿爾茨海默氏病(Ferri C.P.等人(2005) Lancet366 (9503): 2112-2117)。據(jù)估計，超過500萬美國人患有阿爾茨海默氏病，并且預計在本世紀中葉之前該數(shù)目將會增加至1430萬，這代表從2000年開始350%的增加。在發(fā)達國家中日益增加的癡呆患者的數(shù)目將對社會和健康護理體系造成巨大負擔。
[0004]早期診斷是治療阿爾茨海默氏病的一個基本步驟，因為早期診斷允許受試者接受可能減慢疾病進展的藥物。目前使用臨床標準的組合來診斷阿爾茨海默氏病，所述標準可能包括神經(jīng)學檢查、精神狀態(tài)試驗和腦成像。經(jīng)常通過消除其它癡呆來診斷阿爾茨海默氏病。基于這些標準，準確診斷可以是困難的，特別對于患有輕度或早期阿爾茨海默氏病的患者而言。通過檢查腦組織的 病理學可以做出明確診斷，但是這僅僅在死后才可行。因此，需要可以用于診斷應用中的指示阿爾茨海默氏病的標志物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了新穎的miRNA生物標志物，其指示阿爾茨海默氏病，且其可以用于準確地診斷受試者中的阿爾茨海默氏病。這些生物標志物包括miR-191、miR-15b、miR-142-3p、Let-7g、Let_7d、miR_301a和miR-545。在某些實施方案中，所述方法需要檢測在合適的樣品(優(yōu)選血液、血漿、血清、尿或唾液)中的細胞外循環(huán)miRNA。
[0006]因此，在第一個方面，本發(fā)明提供了一種通過測定含有源自受試者的循環(huán)miRNA的樣品中的至少一種miRNA的水平來診斷受試者中的阿爾茨海默氏病的方法，其中所述至少一種 miRNA 是 miR-191、miR-15b、miR-142-3p、Let-7g、Let-7d 或它們的組合，且其中所述至少一種miRNA的水平相對于正常受試者的水平的差異(如相對于合適對照所確定的)指示受試者中的阿爾茨海默氏病。例如，在一個實施方案中，所述方法包括:測定含有源自受試者的循環(huán)miRNA的樣品中的至少一種miRNA的水平,其中所述至少一種miRNA是miR-191、miR-15b、miR-142-3p、Let_7g、Let_7d或它們的組合，且其中所述至少一種miRNA的水平相對于對照的降低指示受試者中的阿爾茨海默氏病。任選地，所述方法可以進一步包括:基于樣品中的至少一種miRNA的水平，提供所述受試者患有或不患有阿爾茨海默氏病的診斷。在一個實施方案中，所述方法可以進一步包括:將至少一種miRNA的水平相對于合適對照的差異與所述受試者中的阿爾茨海默氏病的診斷相關聯(lián)。
[0007]在一個實施方案中，所述方法包括:測定所述樣品中的一種miRNA(例如，miR-191、miR-15b、miR-142-3p、Let_7g或Let_7d)的水平，其中miRNA的水平相對于正常受試者的水平的差異是降低。
[0008]在另一個實施方案中，所述方法包括:測定所述樣品中的2種或更多種miRNA的水平。在該實施方案中，所述方法可以進一步包括:測定所述樣品中的miR-301a、miR-545或miR-301a和miR-545的水平。例如，至少一種miRNA可以選自miR-191、miR_15b、miR-142_3p、Let_7g、Let_7d或它們的組合,且任選地,至少一種mRNA可以選自miR_301a、miR-545或miR-301a和miR-545。在一個實施方案中，所述方法包括，測定下述miRNA組合中的一種的水平:miR-545、let7g 和 miR_15b ；miR-15b 和 miR-545 ;miR_301a、miR-545、let-7g 和 miR-15b ；miR-191 和 miR_15b ;Let_7g 和 miR_15b ;miR_191、miR_301a 和miR-545 ;miR_301a、let_7g 和 miR_15b ;和 miR-191、miR_301a、miR-545 和 miR_15b。
[0009]在一個特定實施方案中，所述方法可以包括:測定得自受試者的含有循環(huán)miRNA的樣品中的2種或更多種miRNA的水平，將所述樣品中的2種或更多種miRNA的水平與一組數(shù)據(jù)進行對比，所述數(shù)據(jù)代表存在于正常受試者和患有阿爾茨海默氏病的受試者中的相同miRNA的水平，和基于所述對比，將所述受試者診斷為患有或不患有阿爾茨海默氏病。在某些實施方案中，所述2種或更多種miRNA可以包括以下組合:miR-545、let7g和miR-15b ；miR-15b 和 miR-545 ;miR_301a、miR-545、let_7g 和 miR_15b ；miR-191 和 miR_15b ;Let_7g和 miR-15b ;miR_191、miR_301a 和 miR-545 ;miR_301a、let_7g 和 miR_15b ；和 miR-191、miR-301a、miR-545 和 miR_15b。
[0010]所述方法可以任選地包括:執(zhí)行至少一個另外的試驗，以促進阿爾茨海默氏病的診斷。在某些實施方案中，所述另外的試驗可以是以下的一種或多種:弱智狀態(tài)檢查(MMSE)、min1-cog試驗、ADAS-cog試驗和畫鐘試驗。任選地或另外，另外的試驗可以包括:檢測或評估阿爾茨海默氏病的至少一種另外的生物標志物。
[0011]所述方法可以任選地包括:給所述受試者施用治療有效量的至少一種阿爾茨海默氏病治療劑。在某些實施方案中，所述阿爾茨海默氏病治療劑可以是Razadyne? (加蘭
他敏)、Exelon? (利凡斯的明)或Aricept?i (多奈哌齊)。在一個特定實施方案中，所
述阿爾茨海默氏病治療劑是多奈哌齊或其藥學上可接受的鹽或酯(例如，鹽酸多奈哌齊)。
[0012]通過任意合適的方法,可以檢測miRNA的水平。例如,使用與miRNA特異性地雜交的試劑，可以檢測miRNA。在某些實施方案中，使用擴增方法、雜交方法和/或測序方法，可以檢測miRNA的水平。在一個實施方案中，使用定量PCR，檢測miRNA的水平。
[0013]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種診斷受試者中的阿爾茨海默氏病的方法，所述方法包括:測量得自受試者的血液衍生的樣品中的至少一種miRNA的水平，其中所述至少一種 miRNA 是 miR-191、miR_15b、miR-142_3p、Let_7g、Let_7d 或它們的組合，和將所述受試者中的水平相對于合適對照的差異與所述受試者中的阿爾茨海默氏病的診斷相關聯(lián)。在一個實施方案中，所述方法可以進一步包括:測量所述樣品中的miR-301a、miR-545或miR-301a 和 miR-545 的水平。
[0014]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種監(jiān)測受試者中的阿爾茨海默氏病的進程的方法，所述方法包括:測定得自受試者的含有循環(huán)miRNA的第一樣品中的至少一種miRNA的水平，測定得自所述受試者的含有循環(huán)miRNA的第二樣品中的所述至少一種miRNA的水平，其中所述第二樣品是在所述第一樣品之后得到，并將在所述第一樣品中測定的水平與在所述第二樣品中測定的水平進行對比，其中所述水平指示阿爾茨海默氏病進展，且其中所述至少一種 miRNA 是 miR-191、miR-15b、miR-142-3p、Let-7g、Let-7d 或它們的組合。在一個實施方案中，所述方法可以進一步包括:測量所述樣品中的miR-301a、miR-545或miR-301a和miR-545的水平。
[0015]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種治療受試者中的阿爾茨海默氏病的方法，所述方法包括:測定得自所述受試者的含有循環(huán)miRNA的樣品中的至少一種miRNA的水平，其中所述至少一種miRNA的水平相對于正常受試者的水平的差異(如相對于合適對照所確定的)指示受試者中的阿爾茨海默氏??；和，如果檢測到至少一種miRNA的水平的差異，給所述受試者施用治療有效量的包含阿爾茨海默氏病治療劑的組合物。在一個實施方案中，所述至少一種 miRNA 是 miR-191、miR-15b、miR-142-3p、Let-7g、Let-7d 或它們的組合。所述方法可以任選地進一步包括:測定所述樣品中的miR-301a、miR-545或miR-301a和miR-545的水平。
[0016]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種治療患有阿爾茨海默氏病的受試者的方法，所述方法包括:鑒別患有阿爾茨海默氏病的受試者，其中得自受試者的含有循環(huán)miRNA的樣品中的至少一種miRNA的水平相對于合適對照而言是不同的(例如，降低)，和給所述受試者施用治療有效量的阿爾茨海默氏病治療劑。在一個實施方案中，所述至少一種miRNA是miR-191、miR-15b、miR-142-3p、Let-7g、Let-7d或它們的組合。所述方法可以任選地包括:鑒別受試者，其中在 所述樣品中的miR-301a、miR-545或miR_301a和miR-545的水平相對于合適對照而言也是不同的(例如，降低)。在這些方面，所述阿爾茨海默氏病治療劑可以
是Razadyne? (加蘭他敏)、Exelon?!(利凡斯的明)或Aricepfis (多奈哌齊)。在
一個示例性實施方案中，所述阿爾茨海默氏病治療劑是多奈哌齊或其藥學上可接受的鹽或酯(例如，鹽酸多奈哌齊)。
[0017]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于診斷受試者中的阿爾茨海默氏病的試劑盒，所述試劑盒含有試劑和說明書，所述試劑選擇性地檢測至少一種miRNA在得自受試者的含有循環(huán)miRNA的樣品中的存在，其中所述至少一種miRNA是miR-191、miR_15b、miR-142-3p、Let-7g、Let-7d或它們的組合,所述說明書是關于測定所述至少一種miRNA的水平，其中所述至少一種miRNA的水平相對于正常受試者的水平的差異(如相對于合適對照所確定的)指示受試者中的阿爾茨海默氏病。這樣的試劑盒可以任選地含有選擇性地檢測至少一種另外的miRNA在所述樣品中的存在的試劑,其中所述另外的miRNA是miR-301a、miR-545或miR-301a和miR-545。在某些實施方案中，所述試劑與miRNA特異性地雜交。
[0018]在本文描述的方法或試劑盒的某些實施方案中，所述受試者可以是哺乳動物，例如，人。
[0019]在本文描述的方法或試劑盒中，通過執(zhí)行軟件分類算法，可以確定至少一種miRNA的水平相對于合適對照的差異。
[0020]在所述方法和試劑盒的某些實施方案中，所述樣品可以是體液，例如，血液、淋巴液、尿或唾液。所述樣品可以是無細胞的樣品和/或無微囊泡的樣品。在一個實施方案中，所述樣品是血漿。在另一個實施方案中，所述樣品是血清。
[0021]在所述方法和試劑盒的某些實施方案中，其中選擇或使用一種miRNA,所述miRNA是(a)除了 miR-191 以外的 miRNA, (b)除了 miR_15b 以外的 miRNA, (c)除了 miR-142_3p以外的miRNA，(d)除了 Let-7g以外的miRNA，和/或(e)除了 Let_7d以外的miRNA。
[0022]在所述方法和試劑盒的某些實施方案中，其中所述樣品是CSF，所述miRNA是(a)除了 miR-15b 以外的 miRNA，和 / 或(b)除了 miR-191 以外的 miRNA。
[0023]【專利附圖】

【附圖說明】和表格
[0024]圖1A和IB:使用nCounter miRNA測定，得自組群I (20個阿爾茨海默氏病(AD)或輕度認知損害(MCI)患者(11個AD ;9個MCI)和20個正常對照(NC)患者)的標準化的miRNA表達的散布圖。
[0025]圖2:使用TaqMan RT-qPCR得到的線性倍數(shù)變化值的散布圖，所述值為得自組群
1(20個AD或MCI患者和20個NC患者)的各個候選miRNA生物標志物對于平均NC值標準化的值。
[0026]圖3:使用TaqMan RT-qPCR得到的線性倍數(shù)變化值的散布圖，所述值為得自組群
2(20個AD和17個NC患者)的各個候選miRNA生物標志物對于平均對照值標準化的值。
[0027]表1:可從PrecisionMed, Inc.得到的組群I中的患者的細節(jié)，包括診斷、年齡、性別、MMSE評分和就診次數(shù)。
[0028]表2:miRNA生物標志物和用于標準化的miRNA的序列和miRBASE登錄號。
[0029]表3:對于組群I樣品(20個AD或MCI (11個AD ;9個MCI)和20個NC)，候選miRNA生物標志物在Nanostring和TaqMan平臺之間的平均倍數(shù)變化值的關聯(lián)。
[0030]表4:使用組群I樣品的子集(11個AD和20個NC)，從TaqMan qPCR的相對Ct值數(shù)據(jù)；使用數(shù)據(jù)來產(chǎn)生候選miRNA生物標志物的標記模式以區(qū)分AD和NC患者。
[0031]表5:可從PrecisionMed, Inc.得到的組群2中的患者的細節(jié),包括診斷、年齡、性別、MMSE評分和就診次數(shù)。
[0032]表6:使用TaqMan RT-qPCR miRNA測定得到的候選miRNA生物標志物在組群I和組群2中的平均倍數(shù)變化值(對于平均對照值標準化)的關聯(lián)。
[0033]表7:使用組群2樣品(20個AD和17個NC)從TaqMan qPCR得到的相對Ct值數(shù)據(jù)，將其用作使用從組群I數(shù)據(jù)得到的標記預測AD和NC患者狀態(tài)的算法的輸入(表4)。
[0034]表8A-8C:指示阿爾茨海默氏病的候選miRNA生物標志物標記。
[0035]表9A-9B:具有>75%的準確度的miRNA生物標志物標記的準確度、特異性、靈敏度和AUC (曲線下面積)。
[0036]表10:使用組群2樣品進行預測，選擇的8個miRNA標記組合的準確度、特異性、靈敏度和AUC (曲線下面積)。
[0037]表11:使用組群2樣品進行預測，各個miRNA的準確度、特異性、靈敏度和AUC (曲線下面積)。【具體實施方式】
[0038]I ?簡介
[0039]本發(fā)明提供了新穎的miRNA生物標志物，其指示阿爾茨海默氏病，且其可以用于準確地診斷受試者中的阿爾茨海默氏病。另外，提供了用于監(jiān)測阿爾茨海默氏病的進程的方法，治療患有阿爾茨海默氏病的受試者的方法，和用于診斷阿爾茨海默氏病的試劑盒。在某些實施方案中，所述方法需要檢測合適的樣品(優(yōu)選血液、血漿、血清、尿或唾液)中的細胞外的循環(huán)miRNA。
[0040]2.定義
[0041]在詳細闡述本發(fā)明之前，提供要在本文中使用的某些術語的定義。除非另外定義，否則在本文中使用的所有技術和科學術語具有與本領域技術人員通常理解相同的含義。
[0042]術語“一個”和”一種”和”所述”和類似指示物在描述本發(fā)明的上下文中(特別是在下述權利要求中)的應用應當解釋為覆蓋單數(shù)和復數(shù)，除非在本文中另外指出或與上下文明顯矛盾。除非另外指出，否則術語“包含、“具有”、“包括”和“含有”應當解釋為開放式術語(即，是指“包括、但不限于”)。除非在本文中另外指出，否則本文中對值范圍的列舉僅僅意圖充當個別地提及列舉的或在該范圍內(nèi)的每個單獨值的速記方法，并且將每個單獨值并入說明書中，如同個別地列舉它。
[0043]術語”受試者”意圖包括，能夠遭受或罹患與CNS障礙有關的癡呆的動物，所述CNS障礙包括神經(jīng)變性疾病諸如阿爾茨海默氏病、或直接地或間接地涉及阿爾茨海默氏病的任意障礙。受試者的例子包括哺乳動物，例如，人類、非人靈長類動物、狗、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、小鼠、兔、大鼠和轉(zhuǎn)基因的非人動物。在某些實施方案中，所述受試者是人，例如，遭受阿爾茨海默氏病或阿爾茨海默氏病相關的癡呆的人，處于遭受阿爾茨海默氏病或阿爾茨海默氏病相關的癡呆的風險中的人，或者潛在地能夠遭受阿爾茨海默氏病或阿爾茨海默氏病相關的癡呆的人。
`[0044]術語“治療”在本文中用于表示解除、減輕或緩解受試者中的疾病的至少一種征狀。例如，關于阿爾茨海默氏病，術語“治療”包括:解除、減輕或緩解認知損害(諸如記憶和/或定向的病損)或總體功能(所有功能，包括日常生活活動)的病損，和/或減慢或逆轉(zhuǎn)總體或認知損害的進行性衰退。因此，術語“治療”也包括:在疾病的臨床表現(xiàn)或疾病的征狀之前延遲或阻止發(fā)作，和/或減少疾病征狀的發(fā)展或惡化的風險。
[0045]治療劑或它們的組合的“治療有效量”是，足以治療受試者的疾病的量。例如，就阿爾茨海默氏病治療劑而言，治療有效量可以是，已經(jīng)被證實會提供與阿爾茨海默氏病的臨床上可觀察的基線征象和征狀相比可觀察的治療益處的量。
[0046]術語”約”或”大約”通常是指在給定的值或范圍的5%內(nèi)，或更優(yōu)選1%內(nèi)。
[0047]3.阿爾茨海默氏病的miRNA生物標志物
[0048]本發(fā)明涉及這樣的微RNA( “miRNA”)生物標志物:與“正?！笔茉囌?即，沒患阿爾茨海默氏病的受試者)相比，其被發(fā)現(xiàn)在得自患有阿爾茨海默氏病(AD)的受試者的生物樣品中差別地存在。如果在樣品中的一種miRNA生物標志物或一組miRNA生物標志物的表達水平之間的差異被確定為統(tǒng)計上顯著的，那么一種miRNA生物標志物或一組miRNA生物標志物在樣品之間差別地存在。統(tǒng)計顯著性的常見試驗包括、但不限于:t-檢驗、AN0VA、Kniskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-ffhitney和比值比。單獨的或組合的miRNA生物標志物可以用于提供受試者患有或沒患阿爾茨海默氏病的相對風險的量度。
[0049]miRNA是小型非編碼RNA，其通過不同的機制參與調(diào)芐基因表達，所述機制包括翻譯抑制。miRNA最初從DNA轉(zhuǎn)錄為過長的初級miRNA轉(zhuǎn)錄物(“初級-miRNA”)，其大小范圍為數(shù)百至數(shù)千個核苷酸。初級-miRNA在細胞核中被酶復合物Drosha-DGCR8加工以形成莖-環(huán)前體miRNA ( “前-miRNA”)。前-miRNA被蛋白輸出蛋白5運輸至細胞質(zhì)，在此處它被酶Dicer切割以產(chǎn)生成熟的(有功能的)miRNA。人基因組編碼超過1300種miRNA，它們已經(jīng)在“miRBase:The microRNA Database”(http://www.mirbase.0rg/)編入目錄。已經(jīng)報道了在眾多細胞和組織類型中的miRNA表達和細胞外(例如，在生物流體中)miRNA表達。
[0050]通過將得自患有阿爾茨海默氏病的受試者的生物樣品中的miRNA的表達水平與得自“正?！笔茉囌?即，沒患AD的受試者)的樣品進行對比，并鑒別差別地存在的miRNA，發(fā)現(xiàn)了阿爾茨海默氏病的miRNA生物標志物。以此方式鑒別出7種差別地存在的miRNA生物標志物，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)當在血漿中測量時它們會指示阿爾茨海默氏病:miR-191、miR-15b、let_7d、let-7g、miR-142_3p、miR-301a 和 miR-545 (參見表 2)。這些 miRNA 生物標志物現(xiàn)在可以用于確定受試者(例如，以前不知道其阿爾茨海默氏病狀態(tài)的受試者或疑似患有阿爾茨海默氏病的受試者)的阿爾茨海默氏病狀態(tài)。這可以如下實現(xiàn):測定得自受試者的生物樣品中的 miR-191、miR-15b、let_7d、let_7g、miR-142_3p、miR_301a 和 miR-545中的一種或多種或它們的組合的水平。這些miRNA生物標志物中的一種或多種的水平相對于得自正常受試者的生物樣品中的水平的差異，指示所述受試者具有阿爾茨海默氏病。
[0051]與正常受試者相比具有一種或多種miRNA生物標志物水平差異的受試者可能患有阿爾茨海默氏病，包括早期阿爾茨海默氏病、中等或中期阿爾茨海默氏病、或重度或晚期阿爾茨海默氏病。在一個實施方案中，一種或多種miRNA生物標志物的水平可以用于診斷具有早期阿爾茨海默氏病的特有征狀的受試者中的阿爾茨海默氏病，其也被稱作前驅(qū)阿爾茨海默氏病?；加性缙诎柎暮Ｄ喜〉氖茉囌咄ǔ＞哂?4-30的MMSE評分。經(jīng)常自己報告或者由配偶和/或護理人員報告關于輕度記憶喪失和減退的執(zhí)行復雜任務的能力的主訴。
[0052]在另一個實施方案中，一種或多種miRNA生物標志物的水平可以用于診斷具有“中等嚴重程度的認知減退”的特有征狀的受試者中的阿爾茨海默氏病，其也被稱作“中等”或“中期”阿爾茨海默氏病。中等嚴重程度的認知減退的特征在于，重大的記憶缺失和認知功能缺陷的出現(xiàn)。在該階段，指示日?；顒拥囊恍┹o助。
[0053]在另一個實施方案中，一種或多種miRNA生物標志物的水平可以用于診斷具有“重度認知減退”的特有征狀的受試者中的阿爾茨海默氏病，其也被稱作“中等”或“中期”阿爾茨海默氏病。在重度認知減退中，記憶困難繼續(xù)惡化，顯著的人格改變可能出現(xiàn)，且受影響的個體的常規(guī)日?；顒油ǔＰ枰獜V泛幫助。
[0054]在另一個實施方案中，一種或多種miRNA生物標志物的水平可以用于診斷具有“極重認知減退”的特有征狀的受試者中的阿爾茨海默氏病，其也被稱作“重度”或“晚期”阿爾茨海默氏病。晚期阿爾茨海默氏病或極重認知減退是該疾病的最終階段。個體通常喪失對他們的環(huán)境做出應答的能力、說話能力，并最終喪失控制活動的能力(參見，例如，http://www.alz.0rg)。
[0055]在另一個實施方案中，一種或多種miRNA生物標志物的水平可以用于診斷具有0-26的MMSE評分(例如、0-10的MMSE評分、0_20的MMSE評分、0_26的MMSE評分等)的受試者中的阿爾茨海默氏病。“MMSE”表示，在認知評估領域中使用的弱智狀態(tài)檢查。在麗SE過程中，醫(yī)師或其它醫(yī)學專業(yè)人員詢問患者一系列問題，所述問題被設計成試驗多種日常心智技能。經(jīng)常詢問的問題包括，例如，記憶和重復3種常見物體的名稱，陳述年、日期、季節(jié)和星期，以7的步長從100倒計數(shù)，向后拼寫詞語“world”，說出檢查人員指向的熟悉物體的名稱，鑒別檢查人員的辦公室的位置，在檢查人員陳述常見短語以后重復它，復制2個聯(lián)鎖的形狀的圖像，和遵循分成3個部分的系列指令(例如，撿起一塊紙，將它對折，和將它放在地板上)。麗SE檢查的最大評分是30點。一般而言，具有27-30的麗SE評分的患者被認為不具有認知損害，具有21-26的MMSE評分的患者被認為具有輕度認知損害，具有11-20的MMSE評分的患者被認為具有中等認知損害，和具有0-10的MMSE評分的患者被認為具有重度認知損害。在某些實施方案中，具有0-16的MMSE評分的患者被認為具有高等(中等嚴重程度至重度)阿爾茨海默氏病。
[0056]在一個實施方案中，一種或多種miRNA生物標志物的水平可以用于監(jiān)測受試者中的阿爾茨海默氏病的進程。受試者的阿爾茨海默氏病狀態(tài)可以隨時間變化。例如，所述疾病可以隨時間惡化或改善。隨著這樣的惡化或改善,一種或多種miRNA生物標志物的水平可以變化，如在得自受試者的樣品中所檢測到的。例如，miR-191、miR-15b、let-7d、let_7g、miR-142-3p、miR-301a和/或miR-545中的一種或多種的水平隨著阿爾茨海默氏病的發(fā)展而降低。因而，可以如下監(jiān)測受試者中的阿爾茨海默氏病的進程:測定得自受試者的第一樣品中的一種或多種miRNA生物標志物的水平，和測定得自受試者的第二樣品中的一種或多種miRNA生物標志物的水平，其中所述第二樣品是在所述第一樣品之后得到。所述第二樣品中的水平與所述第一樣品中的水平的對比指示疾病進展。例如，miR-191、miR-15b、let-7d、let-7g、miR-142_3p、miR-301a和/或miR-545中的一種或多種的水平從第一樣品至第二樣品的降低指示，所 述受試者已經(jīng)發(fā)展阿爾茨海默氏病，或者所述疾病已經(jīng)惡化。相反，miR-191、miR-15b、let_7d、let-7g、miR-142_3p、miR-301a 和 / 或 miR-545 中的一種或多種的水平從第一樣品至第二樣品的增加指示，所述疾病已經(jīng)改善。在一個實施方案中，所述一種或多種 miRNA 生物標志物是 miR-191、miR-15b、let_7d、let-7g、miR-142_3p 和它們的組合。
[0057]可以如下測定得自試驗受試者的生物樣品中的miRNA生物標志物的水平是否不同于在正常受試者中存在的miRNA生物標志物的水平:將得自試驗受試者的樣品中的miRNA生物標志物的水平與合適對照進行對比。技術人員可以為目標測定選擇適當對照。例如，合適對照可以是得自已知受試者(例如，已知為正常受試者的受試者，或已知患有阿爾茨海默氏病的受試者)的生物樣品。如果合適對照得自正常受試者，試驗受試者中的miRNA生物標志物的水平相對于合適對照的統(tǒng)計上顯著的差異指示，所述受試者患有阿爾茨海默氏病。如果合適對照得自已知患有阿爾茨海默氏病的受試者，與這樣的對照相當或低于這樣的對照的水平指示阿爾茨海默氏病，反映了得自正常受試者的樣品中存在的水平的差異。在一個實施方案中，miRNA生物標志物的水平的差異是降低。合適對照也可以是參比標準。參比標準充當用于對比的參照水平，使得試驗樣品可以與參比標準進行對比，以便推斷受試者的阿爾茨海默氏病狀態(tài)。參比標準可以代表已知受試者(例如，已知為正常受試者的受試者，或已知患有阿爾茨海默氏病的受試者)中的一種或多種miRNA生物標志物的水平。同樣地，參比標準可以代表已知受試者群體(例如，已知為正常受試者的受試者群體，或已知患有阿爾茨海默氏病的受試者群體)中的一種或多種miRNA生物標志物的水平。所述參比標準可以如下得到:例如，從多個個體收集樣品，并測定收集的樣品中的miRNA生物標志物的水平，由此產(chǎn)生涵蓋平均化的群體的標準。這樣的參比標準代表一群個體中的miRNA生物標志物的平均水平。參比標準也可以如下得到:例如，將測定存在于得自多個個體的單個樣品中的miRNA生物標志物的水平平均化。這樣的標準也代表一群個體中的miRNA生物標志物的平均水平。參比標準也可以是一組值，每個值代表一群個體中的已知受試者的miRNA生物標志物的水平。在某些實施方案中，可以將試驗樣品與這樣的值集合進行對比，以便推斷受試者的阿爾茨海默氏病狀態(tài)。在某些實施方案中，所述參比標準是絕對值。在這樣的實施方案中，可以將試驗樣品與絕對值進行對比，以便推斷受試者的阿爾茨海默氏病狀態(tài)。在一個實施方案中，通過執(zhí)行軟件分類算法，做出樣品中的一種或多種miRNA的水平與合適對照之間的對比。技術人員可以容易地預見到根據(jù)目標測定可以是適當?shù)钠渌线m對照。前述合適對照是示例性的，且無意是限制性的。
[0058]通常，得自試驗受試者的生物樣品中的miR-191、miR-15b、let_7d、let_7g、miR-142-3p、miR-301a和/或miR-545中的一種或多種的水平相對于代表分別在正常受試者中的 miR-191、miR-15b、let_7d、let_7g、miR-142_3p、miR_301a 和 / 或 miR-545 中的一種或多種的水平的合適對照的降低，指示所述試驗受試者患有阿爾茨海默氏病。在所述合適對照代表患有阿爾茨海默氏病的受試者中的miRNA生物標志物的水平的情況下，與這樣的對照的水平相當或更低的 miR-191、miR_15b、let_7d、let_7g、miR-142_3p、miR_301a 和/或miR-545中的一種或多種的水平通常指示阿爾茨海默氏病。
[0059]在試驗受試者中測定2種或更多種miRNA生物標志物的水平的某些情況下，與合適對照相比，可以存在一種或多種miRNA生物標志物的水平的降低，且一種或多種另外的miRNA生物標志物的水平?jīng)]有 變化或增加。在這樣的情況下,一種或多種miRNA生物標志物的水平相對于代表正常受試者中的miRNA生物標志物的水平的合適對照的差異，指示所述試驗受試者患有阿爾茨海默氏病。通過執(zhí)行如本文中所述的軟件分類算法，可以輔助這樣的差異的確定。
[0060]4.生物樣品
[0061]可以在得自受試者的生物樣品中測定一種或多種miRNA生物標志物的表達水平。得自受試者的樣品是源自受試者的樣品?？梢栽趶氖茉囌叩玫揭院筮M一步加工這樣的樣品。例如，可以從樣品分離出RNA。在該實施例中，從樣品分離出的RNA也是得自受試者的樣品。可以從基本上任意來源得到可用于測定一種或多種miRNA生物標志物的水平的生物樣品，因為已經(jīng)報道了在遍布于體內(nèi)的細胞、組織和流體中的miRNA表達。但是，在本發(fā)明的一個方面，可以非侵襲性地在得自受試者的樣品中檢測指示阿爾茨海默氏病的一種或多種生物標志物的水平。經(jīng)常在得自腦脊液(CSF)或腦組織的樣品中測量阿爾茨海默氏病的現(xiàn)有生物標志物(例如，Ah_42、p-tau等)。最常見地，通過腰椎穿刺術得到CSF，所述腰椎穿刺術是伴有危險因素(包括流血進椎管中、脊柱性頭痛和感染)的疼痛操作。對腦組織樣品的生物標志物檢測目前就診斷活受試者中的阿爾茨海默氏病而言是不實用的，且主要被用于在死后證實通過其它方式做出的診斷。因此，優(yōu)選的是，所述樣品得自腦組織以外的來源。本文描述的miRNA生物標志物指示阿爾茨海默氏病，且可以在非侵襲性地得到的生物樣品中檢測出。
[0062]在一個優(yōu)選的實施方案中，用于測定一種或多種miRNA生物標志物的水平的生物樣品是含有循環(huán)miRNA (例如，細胞外miRNA)的樣品。細胞外miRNA會在眾多生物學材料中自由循環(huán)，所述生物學材料包括體液，諸如得自循環(huán)系統(tǒng)的流體，例如，血液樣品或淋巴樣品，或得自其它體液諸如CSF、尿或唾液。因此，在某些實施方案中，用于測定一種或多種m i RNA生物標志物的水平的生物樣品是體液，例如，血液、其級分、血清、血漿、尿、唾液、淚水、汗液、精液、陰道分泌物、淋巴液、支氣管分泌、CSF等。在某些實施方案中，所述樣品是非侵襲性地得到的樣品。在某些實施方案中，所述樣品得自除了 CSF以外的體液。
[0063]循環(huán)miRNA包括在細胞中的miRNA (細胞miRNA)、在微囊泡中的細胞外miRNA (微囊泡相關的miRNA)和與細胞或微囊泡無關的細胞外miRNA (細胞外的非囊泡的miRNA)。在某些實施方案中，用于測定一種或多種miRNA生物標志物的水平的生物樣品(例如，含有循環(huán)miRNA的樣品)可以含有細胞。在其它實施方案中，所述生物樣品可以不含有或基本上不含有細胞(例如，血清樣品)。所述樣品同樣可以不含有或基本上不含有微囊泡。例如，不含有或基本上不含有微囊泡的樣品是這樣的樣品:其中所述樣品的微囊泡含量低至足以避免干擾準確地測定所述樣品中的非囊泡miRNA的水平的能力。在某些實施方案中，含有循環(huán)miRNA (例如，細胞外miRNA)的樣品是血液衍生的樣品。示例性的血液衍生的樣品類型包括，例如，血漿樣品、血清樣品、血液樣品等。在其它實施方案中，含有循環(huán)miRNA的樣品是淋巴樣品。循環(huán)miRNA也存在于尿和唾液中，且源自這些來源的生物樣品同樣適合用于測定一種或多種miRNA生物標志物的水平。
[0064]5.測定樣品中的miRNA生物標志物的水平
[0065]通過任意合適的方法，可以測定生物樣品中的一種或多種miRNA生物標志物的水平?？梢允褂萌我饪煽康挠糜跍y量樣品中的miRNA的水平或量的方法。通常，可以從樣品(包括其級分)檢測和定量miRNA，所述樣品例如是通過關于mRNA已知的多種方法分離的RNA的樣品，所述方法包括:例如，基于擴增的方法(例如，聚合酶鏈式反應(PCR)、實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、定量聚合酶鏈`式反應(qPCR)、滾環(huán)擴增等)、基于雜交的方法(例如，雜交陣列(例如，微陣列)、NanoString分析、RNA印跡分析、支鏈DNA(bDNA)信號放大、原位雜交等)和基于測序的方法(例如，下一代測序方法，例如，使用Illumina或1nTorrent平臺)。其它示例性的技術包括核糖核酸酶保護測定(RPA)和質(zhì)譜法。
[0066]在某些實施方案中，在分析之前，將RNA轉(zhuǎn)化成DNA(cDNA)?？梢允褂贸Ｒ?guī)技術通過分離的miRNA的反轉(zhuǎn)錄來制備cDNA。miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒是已知的和商購可得
的。合適的試劑盒的例子包括、但不限于mirVana? TaqMan?miRNA轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion, Austin, TX)和 TaqMail?miRNA 轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Applied Biosystems, Foster
City, CA)。通用引物或特異性引物(包括miRNA-特異性的莖-環(huán)引物)是已知的和商購可得的，例如，可得自Applied Biosystems。在某些實施方案中，在測量之前擴增miRNA。在其它實施方案中，在擴增過程中測量miRNA的水平。在其它實施方案中，在測量之前不擴增miRNA的水平。在下面更詳細地描述了一些示例性的適合用于測定樣品中的miRNA的水平的方法。這些方法僅僅通過例證來提供，并且技術人員會明白，同樣可以使用其它合適的方法。[0067]A.基于擴增的方法
[0068]存在許多用于檢測miRNA核酸序列的水平的基于擴增的方法，包括、但不限于，PCR、RT-PCR、qPCR和滾環(huán)擴增。其它基于擴增的技術包括，例如，連接酶鏈式反應、多路可連接的探針擴增、體外轉(zhuǎn)錄(IVT)、鏈置換擴增、轉(zhuǎn)錄介導的擴增、RNA(Eberwine)擴增和本領域技術人員已知的其它方法。
[0069]一種典型的PCR反應包括多個選擇性地擴增靶核酸物質(zhì)的步驟或循環(huán):變性步驟，其中使靶核酸變性；退火步驟，其中使一組PCR引物(即，正向和反向引物)與互補DNA鏈對合；和延伸步驟，其中熱穩(wěn)定的DNA聚合酶延伸所述引物。通過重復這些步驟多次，擴增DNA片段以產(chǎn)生與靶序列對應的擴增子。典型的PCR反應包括20個或更多個變性、退火和延伸的循環(huán)。在許多情況下，退火和延伸步驟可以并行地進行，在該情況下，所述循環(huán)僅含有2個步驟。在PCR擴增之前，可以執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄反應(其產(chǎn)生與miRNA具有互補性的cDNA序列)。反轉(zhuǎn)錄反應包括使用例如基于RNA的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)和引物。
[0070]用于miRNA的定量實時PCR的試劑盒是已知的，且是商購可得的。合適的試劑盒
的例子包括、但不限于:TaqMan?miRN A Assay (Applied Biosystems)和 mirVana?
qRT-PCR miRNA檢測試劑盒(Ambion)?？梢栽谀孓D(zhuǎn)錄酶之前將miRNA連接至含有通用引物序列、聚腺苷酸化的序列或銜接子序列的單鏈寡核苷酸，并使用與通用引物序列互補的引物、聚⑴引物、或包含與銜接子序列互補的序列的引物進行擴增。
[0071]在某些情況下，可以開發(fā)定制的qRT-PCR測定，用于測定miRNA水平。例如，使用包含延伸的反轉(zhuǎn)錄引物和鎖定核酸修飾的PCR的方法，可以開發(fā)用于測量生物樣品(例如，體液)中的miRNA的定制qRT-PCR測定?？梢匀缦略囼灦ㄖ频膍iRNA測定:在化學合成的與靶序列相對應的miRNA的系列稀釋液上運行該測定。這允許確定每個測定的定量的檢測限度和線性范圍。此外，當用作標準曲線時，這些數(shù)據(jù)允許估測在生物樣品中測得的miRNA的絕對豐度。
[0072]可以任選地檢查擴增曲線，以證實在每個擴增圖的線性范圍內(nèi)評估Ct值。通常，線性范圍跨幾個數(shù)量級。對于每種測定的候選miRNA，可以得到化學合成形式的miRNA，并在稀釋系列中進行分析，以確定測定的靈敏度限度和定量的線性范圍。例如，可以根據(jù)如在下述文獻中描述的2(_A AC(T))方法來確定相對表達水平:Livak等人，Analysisof relative gene expression data using real-time quantitative PCR andthe2(-A A C (T)) Method.Methods (2001) Dec: 25 (4): 402-8 0
[0073]在某些實施方案中，在單個反應體積中擴增2種或更多種miRNA。例如，多路q-PCR，諸如qRT-PCR，能夠在一個反應體積中同時擴增和定量至少2種目標miRNA，其中使用超過一對引物和/或超過一種探針。所述引物對包含至少一種特異性地結合每種miRNA的擴增引物，且所述探針被標記，使得它們可彼此辨別開，從而允許同時定量多種miRNA。
[0074]滾環(huán)擴增是一種由DNA-聚合酶驅(qū)動的反應，其可以在等溫條件下以線性或幾何動力學復制環(huán)化的寡核苷酸探針(參見，例如，Lizardi等人，Nat.Gen.(1998) 19(3):225-232; Gusev 等人,Am.J.Pathol.(2001) 159(1): 63-69 ; Nal Iur 等人，Nucleic Acids Res.(2001) 29 (23):E118)。在有 2 種引物(一種與 DNA 的(+)鏈雜交，另一種與(_)鏈雜交)存在下，鏈置換的復雜模式會導致在90分鐘或更短的時間內(nèi)產(chǎn)生每種DNA分子的超過IO9個拷貝。使 用單一引物，可以形成閉環(huán)DNA分子的串聯(lián)連接的拷貝。所述過程還可以使用基質(zhì)相關的DNA來實現(xiàn)?？梢阅孓D(zhuǎn)錄用于滾環(huán)擴增的模板。該方法可以用作在非常低的miRNA濃度的miRNA序列和表達水平的高敏指示(參見，例如，Cheng等人,Angew Chem.1nt.Ed.Engl.(2009) 48 (18): 3268-72; Neubacher 等人,Chembiochem.(2009) 10(8): 1289-91)。
[0075]B.基于雜交的方法
[0076]可以使用基于雜交的方法來檢測miRNA，所述方法包括、但不限于雜交陣列(例如，微陣列)、NanoString分析、RNA印跡分析、支鏈DNA (bDNA)信號放大和原位雜交。
[0077]微陣列可以用于同時測量大量miRNA的表達水平?？梢允褂枚喾N技術來制造微陣列，所述技術包括:將細尖針印刷在載玻片上，使用預制的掩模的照相平板印刷術，使用動態(tài)微鏡裝置的照相平板印刷術，噴墨印刷，或在微電極陣列上的電化學。也可使用微流體TaqMan低密度陣列，其基于微流體qRT-PCR反應陣列，以及有關的基于微流體qRT-PCR的方法。
[0078]在微陣列檢測的一個例子中，以約20 ii M的終濃度，將與人有義miRNA序列對應的不同寡核苷酸(例如，200+5’-氨基修飾的C6寡物)印跡在三維CodeLink載玻片(GE健康/Amersham Biosciences)上，并根據(jù)生產(chǎn)商的推薦進行處理。使用Enzo BioArray末端標記試劑盒(Enzo LifeSciences Inc.),用生物素化的ddUTP標記從20 ii g TRIzol純化的總RNA合成的第一鏈cDNA。可以根據(jù)改進的Affymetrix Antisense基因組陣列方案執(zhí)行雜交、染色和洗滌。
[0079]Axon B-4000掃描儀和Gene-Pix Pro4.0軟件或其它合適的軟件可以用于掃描圖像。除去背景減去 以后的非陽性點和通過ESD操作檢測到的離群值。將得到的信號強度值標準化為前芯片中位值，然后用于得到每個miRNA的幾何平均值和標準誤差?？梢詫⒚總€miRNA信號轉(zhuǎn)化成2基對數(shù)(log base2)，并可以進行單樣品t檢驗?？梢栽谛酒蠄?zhí)行每個樣品的獨立雜交，其中將每個miRNA印跡多次以增加數(shù)據(jù)的穩(wěn)健性。
[0080]微陣列可以用于疾病中的miRNA的表達繪圖。例如，可以從樣品提取RNA，并任選地，從總RNA中按照尺寸選擇miRNA?？梢詫⒐押塑账峤宇^連接至miRNA的5’和3’末端，并將得到的連接產(chǎn)物用作RT-PCR反應的模板。有義鏈PCR引物可以具有與它的5’末端連接的熒光團，由此標記PCR產(chǎn)物的有義鏈。將PCR產(chǎn)物變性，然后與微陣列雜交。與陣列上的對應miRNA捕獲探針序列互補的PCR產(chǎn)物(被稱作靶核酸)將經(jīng)由堿基配對與連接有捕獲探針的點雜交。然后當使用微陣列激光掃描儀激發(fā)時，所述點將發(fā)熒光。
[0081]然后使用許多陽性和陰性對照和陣列數(shù)據(jù)標準化方法，以特定miRNA的拷貝數(shù)的方式評價每個點的熒光強度，這將導致特定miRNA的表達水平的評估。
[0082]還可以不經(jīng)miRNA的尺寸選擇直接使用從體液樣品提取的含有miRNA的總RNA。例如，使用T4RNA連接酶和熒光團標記的短RNA接頭，可以在3’末端標記RNA。與陣列上的對應miRNA捕獲探針序列互補的熒光團標記的miRNA將經(jīng)由堿基配對與連接有捕獲探針的點雜交。然后使用許多陽性和陰性對照和陣列數(shù)據(jù)標準化方法，以特定miRNA的拷貝數(shù)的方式評價每個點的熒光強度，這將導致特定miRNA的表達水平的評估。
[0083]可以采用幾種類型的微陣列，包括、但不限于，印點的寡核苷酸微陣列、預制的寡核苷酸微陣列或印點的長寡核苷酸陣列。
[0084]還可以使用nCounter 分析系統(tǒng)(NanoString Technologies, Seattle, WA)不經(jīng)擴增地檢測miRNA。該技術采用2種基于核酸的在溶液中雜交的探針(例如，報告探針和捕獲探針)。雜交以后，除去多余的探針，并根據(jù)生產(chǎn)商的方案分析探針/靶標復合物。可從NanoString Technologies得到nCounter miRNA測定試劑盒,其能夠以極大特異性區(qū)分高度類似的miRNA。
[0085]還可以使用分支DNA(bDNA)信號放大來檢測miRNA(參見，例如，Urdea, NatureBiotechnology (1994), 12:926-928)?；赽DNA信號放大的miRNA測定是商購可得的。一
種這樣的測定是 QuantiGene*: 2.0miRNA Assay (Affymetrix, Santa Clara, CA)。
[0086]RNA印跡和原位雜交也可以用于檢測miRNA。適合用于執(zhí)行RNA印跡和原位雜交的方法是本領域已知的。
[0087]C.基于測序的方法
[0088]同樣可以使用可得到的先進的測序方法。例如，可以使用Illumina?下一代測序(例如，合成測序或TruSeq方法,其中使用例如HiSeq、HiScan、GenomeAnalyzer或MiSeq系統(tǒng)(Illumina, Inc., San Diego, CA))來檢測 miRNA。還可以使用 1n Torrent 測序(1nTorrent Systems, Inc., Gulliford, CT)或其它合適的半導體測序方法來檢測miRNA。
[0089]D.其它miRNA檢測工具
[0090]使用RNA酶繪圖，可以使用質(zhì)譜法來定量miRNA?？梢杂镁哂懈咛禺愋缘腞NA內(nèi)切核酸酶(RNA酶)(例如，RNA酶H，其在所有未修飾的鳥苷殘基的3’ -側(cè)切割)酶促地消化分離的RNA，然后通過MS或串聯(lián)MS(MS/MS)方案來分析它們。開發(fā)的第一種方案利用內(nèi)切核酸酶消化物的在線色譜分離 ，其中使用與ES1-MS直接聯(lián)接的反相HPLC。相對于基于RNA序列預見到的質(zhì)量的質(zhì)量偏移，可以揭示轉(zhuǎn)錄后修飾的存在。然后可以分離具有異常質(zhì)荷比值的離子用于串聯(lián)MS測序，以定位轉(zhuǎn)錄后修飾的核苷的序列布局。
[0091]基質(zhì)輔助的激光解吸/電離質(zhì)譜法(MALD1-MS)也已經(jīng)被用作得到關于轉(zhuǎn)錄后修飾的核苷的信息的分析方案。通過分離步驟可以將基于MALDI的方案與基于ESI的方案區(qū)分開。在MALD1-MS中，使用質(zhì)譜儀來分離miRNA。
[0092]為了分析有限量的完整miRNA，可以采用與nanoESI_MS偶聯(lián)的毛細管LC系統(tǒng)，其中使用線性離子阱-軌道離子阱雜合質(zhì)譜儀(LTQ Orbitrap XL, Thermo Fisher
Scientific)或串聯(lián)四極飛行時間質(zhì)譜儀(QSTAR?XL, Applied Biosystems),其配
有定制納米噴霧離子源、Nanovolume Valve (Valeo Instruments)和無分流納米HPLC系統(tǒng)(DiNa，KYA Technologies) 0將分析物/TEAA加載到納米-LC阱柱上，脫鹽，然后濃縮。從阱柱洗脫完整miRNA，并直接地注射進C18毛細管柱，并使用遞增極性的溶劑梯度通過RP-HPLC色譜分離。使用允許以負極性模式掃描離子的電離電壓，從連接至毛細管柱的噴霧器尖部噴灑色譜洗脫液。
[0093]用于miRNA檢測和測量的其它方法包括，例如，鏈侵入測定(Third WaveTechnologies, Inc.)、表面等離子體共振(SPR)、cDNA、MTDNA (金屬 DNA; AdvanceTechnologies, Saskatoon, SK)和單分子方法,諸如由US Genomics開發(fā)的方法。使用新穎的組合表面酶反應和納米顆粒擴增的SPR成像(SPRI)的方案，可以以微陣列形式檢測多種miRNA。聚腺苷酸聚合酶的表面反應會在雜交于鎖定核酸(LNA)微陣列上的miRNA上產(chǎn)生聚腺苷酸尾巴。然后將DNA修飾的納米顆粒吸附到聚腺苷酸尾巴上，并用SPRI檢測。該超靈敏的納米顆粒擴增的SPRI方法學可以用于在attamole水平的miRNA繪圖。
[0094]E.擴增的或未擴增的miRNA的檢測
[0095]在某些實施方案中，使用標記、染料或標記的探針和/或引物來檢測擴增的或未擴增的miRNA。技術人員基于檢測方法的靈敏度和靶標的豐度會認識到哪種檢測方法是適當?shù)摹ＨQ于檢測方法的靈敏度和靶標的豐度，在檢測之前可能需要或不需要擴增。本領域技術人員會認識到其中miRNA擴增為優(yōu)選的檢測方法。
[0096]探針或引物可以包括標準的(A、T或U、G和C)堿基或修飾的堿基。修飾的堿基包括、但不限于AEGIS堿基(得自Eragen Biosciences),其已經(jīng)描述在例如美國專利號5，432，272,5, 965，364和6，001, 983中。在某些方面，通過天然的磷酸二酯鍵或不同的化學鍵連接堿基。不同的化學鍵包括、但不限于肽鍵或鎖定核酸(LNA)鍵，后者描述在例如美國專利號7, 060, 809中。
[0097]在另一個方面，存在于擴增反應中的寡核苷酸探針或引物適合用于監(jiān)測作為時間的函數(shù)而產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物的量。在某些方面，使用具有不同單鏈特性(相對于雙鏈特性)的探針來檢測核酸。探針包括、但不限于:5'-外切核酸酶測定(例如，TaqMan?)探針(參見美國專利號5，538，848)、莖-環(huán)分子信標(參見，例如，美國專利號6，103，476和5，925，517)、無莖的或線性的信標(參見，例如，W09921881、美國專利號6，485，901和6，649，349)、肽核酸(PN A)分子信標(參見，例如，美國專利號6，355，421和6，593，091)、線性PNA信標(參見，例如美國專利號6，329，144)、非-FRET探針(參見，例如，美國專利號6，150，097)、Sunrise?/AmplifluorB? 探針(參見，例如，美國專利號 6，548，250)、莖-環(huán)和雙鏈體Scorpion?探針(參見，例如，美國專利號6，589，743)、凸環(huán)探針(參見，例如，美國專利號6，590，091)、假結探針(參見，例如，美國專利號6，548，250)、cyclicon (參見，例如，美國專利號 6，383，752)、MGB Eclipse? 探針(Epoch Biosciences)、發(fā)夾探針(參見，例如，美國專利號6，596，490)、PNA照亮探針、抗引物淬滅探針(Li等人，Clin.Chem.53:624-633(2006))、自裝配納米顆粒探針和在例如美國專利號6，485，901中描述的二茂鐵改性的探針。
[0098]在某些實施方案中，在擴增反應中的一種或多種引物可以包括標記。在其它實施方案中，不同的探針或引物包含可彼此辨別開的可檢測標記。在某些實施方案中，可以用2種或更多種可辨別的標記來標記核酸，諸如探針或引物。
[0099]在某些方面，將標記連接至一個或多個探針，且所述標記具有下述性能中的一種或多種:(i)提供可檢測信號；(ii)與第二標記相互作用以修飾由所述第二標記提供的可檢測信號，例如，F(xiàn)RET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)穩(wěn)定化雜交，例如，雙鏈體形成；和(iv)提供結合復合物或親和集合的成員，例如，親和力、抗體-抗原、離子絡合物、半抗原-配體(例如，生物素-抗生物素蛋白)。在其它方面，使用大量已知技術中的任一種，可以完成標記的使用，所述技術采用已知的標記、連接、連接基團、試劑、反應條件以及分析和純化方法。
[0100]可以通過直接或間接方法來檢測miRNA。在一種直接檢測方法中，通過與核酸分子連接的可檢測標記物，檢測一種或多種miRNA。在這樣的方法中，可以在與探針結合之前標記miRNA。因此,通過篩選與探針結合的標記的miRNA,檢測結合。所述探針任選地在反應體積中連接至珠子。[0101]在某些實施方案中，通過與標記的探針的直接結合來檢測核酸，隨后檢測所述探針。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用FIexMAP微球(Luminex)來檢測核酸，諸如擴增的miRNA，所述FIexMAP微球與綴合有探針以捕獲期望的核酸。一些方法可以包括:例如，用熒光標記修飾的多核苷酸探針進行檢測，或分支DNA(bDNA)檢測。
[0102]在其它實施方案中，通過間接檢測方法來檢測核酸。例如，可以將生物素化的探針與抗生蛋白鏈菌素-綴合的染料組合以檢測結合的核酸。抗生蛋白鏈菌素分子會結合擴增的miRNA上的生物素標記，并通過檢測與抗生蛋白鏈菌素分子連接的染料分子來檢測結合
的miRNA。在一個實施方案中，所述抗生蛋白鏈菌素-綴合的染料分子包含Phycolink?
抗生蛋白鏈菌素R-藻紅蛋白(PROzyme)。其它綴合的染料分子是本領域技術人員已知的。
[0103]標記包括、但不限于:發(fā)射光的、散射光的和吸收光的化合物，其產(chǎn)生或淬滅可檢測的熒光的、化學發(fā)光的或生物發(fā)光的信號(參見，例如，Kricka, L.,Nonisotopic DNAProbe Techniques, Academic Press, San Diego(1992)和 Garman A.,Non-RadioactiveLabeling, Academic Press (1997)) 0在某些實施方案中，使用包括報告物熒光團和猝滅劑熒光團的雙重標記的熒光探針。應當理解，選擇具有具有獨特發(fā)射波譜的熒光團對，使得它們可以容易地區(qū)分開。
[0104]在某些實施方案中，標記是用于增強、穩(wěn)定或影響雙鏈體的雜交的雜交穩(wěn)定化部分，例如，嵌入劑和嵌入染料(包括、但不限于，溴化乙錠和SYBR-Green)、小溝結合劑和交聯(lián)官能團(參見，例如，Blackburn 等人，編“DNA and RNA Structure” in Nucleic Acidsin Chemistry and Biology(1996))。
[0105]在其它實施方案中，可以使用依賴于雜交和/或連接來定量miRNA的方法，包括寡核苷酸連接(OLA)方法和允許將與靶核酸序列雜交的可辨別探針與未結合的探針分離開的方法。作為一個例子，如在美國
【發(fā)明者】Z·德茲索, P·庫瑪 申請人:衛(wèi)材R&D管理有限公司