源自人皮膚真皮的成體干細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了從人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞和用于分離所述成體干細(xì)胞的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了從源自人皮膚真皮的成體干細(xì)胞分化的成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞及其分化方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于骨生成或脂肪生成的含有干細(xì)胞、成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞的組合物。本發(fā)明的分離方法能夠以容易且簡(jiǎn)單的方式高產(chǎn)率地獲得源自人皮膚真皮的成體干細(xì)胞?？梢苑蛛x、鑒定并且隨后使用用所述方法分離的源自人皮膚真皮的成體干細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因和生長(zhǎng)因子。
【專利說明】源自人皮膚真皮的成體干細(xì)胞
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002]在近些年，一直嘗試從組織分離具有多能性的成體干細(xì)胞。盡管這些成體干細(xì)胞是不利的，因?yàn)樗鼈兣c全能性胚胎干細(xì)胞不同，不能分化成所有細(xì)胞類型，但由于它們不存在胚胎干細(xì)胞的倫理問題，它們?cè)谘芯亢蛻?yīng)用中是有用的。然而，由于與胚胎干細(xì)胞不同，成體干細(xì)胞的數(shù)量非常少(預(yù)測(cè)低于相應(yīng)組織中約1-5%的細(xì)胞)，因此在從成體組織收集和分離它們時(shí)存在困難。
[0003]最后，干細(xì)胞研究的主要目的是用于治療。期望通過細(xì)胞移植或替換提供新的基于干細(xì)胞的細(xì)胞，來恢復(fù)特定器官或組織患病的病人的健康。研究人皮膚成體干細(xì)胞的期望在于，它們可以用于治療皮膚損傷如，燒傷或創(chuàng)傷，或皮膚疾病，如，潰瘍、特應(yīng)性過敏等。人皮膚由表皮、真皮、皮下組織和附器組成。已經(jīng)從表皮分離了表皮干細(xì)胞，并 且從附器毛發(fā)分離了毛囊干細(xì)胞。并且，已經(jīng)通過稱為懸浮培養(yǎng)的特殊培養(yǎng)系統(tǒng)從嚙齒動(dòng)物和人分離了真皮衍生的成體干細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了這些真皮衍生的成體干細(xì)胞(也稱為皮膚衍生的前體(SKP))作為中胚層細(xì)胞(如，脂肪、骨和肌肉細(xì)胞)是可分離的(Toma et al., 2001;Tomaet al., 2005)。
[0004]皮膚成體干細(xì)胞在皮膚組織中占據(jù)非常少的數(shù)量。據(jù)估計(jì)，表皮干細(xì)胞占據(jù)的數(shù)量小于角化細(xì)胞數(shù)量的1-5%,而真皮衍生的干細(xì)胞的數(shù)量也估計(jì)僅為2-3%。因此,在分離它們時(shí)存在困難，但已經(jīng)報(bào)道了幾種用于分離皮膚成體干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物(或生物標(biāo)志物)。目前，已知整聯(lián)蛋白α-6、⑶71、整聯(lián)蛋白β-1和ρ63是作為表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物(Webb et al., 2004; Yi et.，2008)，并且已知僅有CD200是用于毛囊干細(xì)胞(Garza etal.，2011)。
[0005]最近，據(jù)觀察，使用真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)從人真皮分離的真皮衍生的成體干細(xì)胞具有分化成脂肪、骨和軟骨細(xì)胞的多能性，并且發(fā)現(xiàn)它們是波形蛋白+/巢蛋白-(ChenFG et al.，2007)。然而，由于該方法與普通成纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)沒有太大差異，因此不能有效分離所述細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]技術(shù)問題
[0007]本發(fā)明涉及提供從人皮膚分離的人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞，其表達(dá)特定的基因和生長(zhǎng)因子作為生物標(biāo)志物。
[0008]技術(shù)方法
[0009]在一個(gè)概括方面中，本發(fā)明提供了人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞，其中與人皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，一種或多種選自Sox2 (SRY (性別決定區(qū)Y)-盒2)和SlOOb(S100鈣結(jié)合蛋白B)的基因是超表達(dá)的。[0010]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，通過傳代培養(yǎng)人皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞，將細(xì)胞與明膠或4型膠原蛋白反應(yīng)，并且分離粘附于明膠或4型膠原蛋白的細(xì)胞，從而獲得干細(xì)胞。
[0011]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，通過將成纖維細(xì)胞與明膠或4型膠原蛋白反應(yīng)1-5分鐘來獲得干細(xì)胞。
[0012]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，明膠可以溶解于蒸餾水中至0.l-lwt%的濃度，而4型膠原蛋白可以溶解于蒸餾水中至10-30 μ g/mL的濃度。
[0013]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，明膠或4型膠原蛋白可以在0-10°C下在基質(zhì)上涂覆16-24小時(shí)。
[0014]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，干細(xì)胞可以是其中與人皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比選自EGF (表皮生長(zhǎng)因子)、FGF4 (成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4)、TOGF-AA (血小板衍生的生長(zhǎng)因子-AA)、VEGFR-2 (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2)、VEGFR-3 (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3)和VEGF-D (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D)的一種或多種生長(zhǎng)因子超表達(dá)的干細(xì)胞。
[0015]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，干細(xì)胞可以是保藏號(hào)No:KCTCl 1995BP的干細(xì)胞。
[0016]在另一個(gè)概括方面中，本發(fā)明提供了從人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞分化的成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。
[0017]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，成骨細(xì)胞可以是其中與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比選自O(shè)GN (骨甘氨酸(osteoglycin))和ACAN (聚集蛋白聚糖(aggrecan))的一種或多種基因超表達(dá)的成骨細(xì)胞。
[0018]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，脂肪細(xì)胞可以是其中與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比選自PPARG (過氧化物酶體增殖因子激活受體Y)、LEP (瘦素)、AdipoQ (脂聯(lián)素，含ClQ和膠原蛋白結(jié)構(gòu)域)和FABP4 (脂肪結(jié)合蛋白4，脂肪細(xì)胞)的一種或多種基因超表達(dá)的脂肪細(xì)胞。
[0019]在另一個(gè)概括方面中，本發(fā)明提供了用于骨生成或脂肪生成的組合物，其含有人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞、成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞，作為活性組分。
[0020]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，組合物可以提供預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松、預(yù)防和治療皮膚老化、治療皮膚創(chuàng)傷、改善皮膚血液循環(huán)、增強(qiáng)皮膚體積或植皮的作用。
[0021]在另一個(gè)概括方面中，本發(fā)明提供了用于分離人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞的方法，包括傳代培養(yǎng)人皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞，將細(xì)胞與明膠或4型膠原蛋白反應(yīng)，并且分離粘附于明膠或4型膠原蛋白的細(xì)胞。
[0022]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，在分離方法中，可以將成纖維細(xì)胞與明膠或4型膠原蛋白反應(yīng)1-5分鐘。
[0023]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，在分離方法中，明膠可以溶解于蒸餾水中至0.l_lwt%的濃度，而4型膠原蛋白可以溶解于蒸餾水中至10-30 μ g/mL的濃度，然后與成纖維細(xì)胞反應(yīng)。
[0024]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，在分離方法中，可以將明膠或4型膠原蛋白在0-10°C下涂覆于基質(zhì)上16-24小時(shí)，然后與成纖維細(xì)胞反應(yīng)。
[0025]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，所述分離方法可以進(jìn)一步包括確認(rèn)與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，選自Sox2 (SRY (性別決定區(qū)Y)-盒2)和SlOOb (S100鈣結(jié)合蛋白B)的一種或多種基因是否超表達(dá)。
[0026]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，所述分離方法可以進(jìn)一步包括確認(rèn)與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，選自EGF (表皮生長(zhǎng)因子)、FGF4 (成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4)、TOGF-AA(血小板衍生的生長(zhǎng)因子-AA)、VEGFR-2 (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2)、VEGFR-3 (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3)和VEGF-D (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D)的一種或多種生長(zhǎng)因子是否超表達(dá)。
[0027]在另一個(gè)概括方面中，本發(fā)明提供了用于分化人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞的方法，包括將通過分離方法分離的人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。
[0028]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，所述分化方法可以包括:在成骨分化培養(yǎng)基中分化分離的干細(xì)胞；并確認(rèn)與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，分化的細(xì)胞是否超表達(dá)選自O(shè)GN (骨甘氨酸)和ACAN (聚集蛋白聚糖)的一種或多種基因。
[0029]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，所述分化方法可以包括:在脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基中分化分離的干細(xì)胞；并確認(rèn)與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，分化的細(xì)胞是否超表達(dá)選自PPARG (過氧化物酶體增殖因子激活受體Y)、LEP (瘦素)、AdipoQ (脂聯(lián)素，含ClQ和膠原蛋白結(jié)構(gòu)域)和FABP4 (脂肪結(jié)合蛋白4，脂肪細(xì)胞)的一種或多種基因。
[0030]有益效果
[0031]含有本發(fā)明的人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞、由干細(xì)胞分化的成骨細(xì)胞或由干細(xì)胞分化的脂肪細(xì)胞的組合物可以用作用于骨生成和脂肪生成的組合物。此外，根據(jù)本發(fā)明的分離方法允許容易且簡(jiǎn)單地以高產(chǎn)量獲得皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞，并且還允許利用在分離的皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因和生長(zhǎng)因子。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1顯示了作為干性(sternness)測(cè)量，使用明膠分離的皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞和皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞的集落形成能力的比較結(jié)果。
[0033]圖2顯示了與真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，分離的皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞中的Sox2 (a)和SlOOb (b)的表達(dá)各自提高2倍和3倍。研究了干細(xì)胞是否與通過現(xiàn)有方法分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞(波形蛋白+/巢蛋白_)相同或相似。波形蛋白(c)和巢蛋白(d)與真皮衍生的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)一樣，表明本發(fā)明的人真皮衍生的成體干細(xì)胞不同于通過現(xiàn)有方法分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞(波形蛋白+/巢蛋白_) (Chen FGet al., 2007)。
[0034]圖3顯示了分離的皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞，并且表達(dá)了成骨細(xì)胞代表性的遺傳標(biāo)志物，OGN (a)和ACAN (b)。
[0035]圖4顯示了分離的皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞，并且表達(dá)了脂肪細(xì)胞代表性的遺傳標(biāo)志物，PPARG (a), AdipoQ (b)、瘦素(c)和FABP4⑷。
[0036]圖5顯示了與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，分離的皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞中的細(xì)胞生長(zhǎng)因子EGF (a)和FGF4 (b)以及血管生成因子PDGF-A (C)、VEGFR-2 (d)、VEGFR-3 (e)和 VEGF-D (f)是超表達(dá)的。
[0037]圖6顯示了皮膚真皮中存在的血管。
[0038]圖7顯示了血管生成因子的譜系。[0039]最佳方式
[0040]在下文中，詳細(xì)描述本發(fā)明。
[0041]本發(fā)明的發(fā)明人努力研發(fā)了一種以高產(chǎn)量分離與表皮干細(xì)胞或毛囊干細(xì)胞相比尚未得到充分闡明的人真皮衍生的成體干細(xì)胞的方法。在研發(fā)過程中，他們發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞與明膠或4型膠原蛋白的粘附隨著時(shí)間而變化，并且基于該發(fā)現(xiàn)已經(jīng)完成了本發(fā)明。
[0042]本發(fā)明提供了人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞，其中與人皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，選自Sox2 (SRY (性別決定區(qū)Y)-盒2)和SlOOb (S100鈣結(jié)合蛋白B)的一種或多種基因是超表達(dá)的。
[0043]在各種類型的人成體干細(xì)胞的遺傳標(biāo)志物中，Sox2 (SRY (性別決定區(qū)Y)-盒2)和SlOOb (S100鈣結(jié)合蛋白B)在本發(fā)明的皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞中特異性地顯示出提高的表達(dá)，并且由本發(fā)明的發(fā)明人首次進(jìn)行了鑒定。
[0044]已知之前已知的皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞是巢蛋白-(無表達(dá))，波形蛋白+ (表達(dá))。由于本發(fā)明分離的皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，在巢蛋白和波形蛋白的表達(dá)中無差別，因此它們不同于現(xiàn)有的皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞。
[0045]在各種類型的皮膚成體干細(xì)胞中，已知使用4型膠原蛋白分離皮膚成體干細(xì)胞僅是針對(duì)表皮干細(xì)胞的。本發(fā)明的皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞是新的干細(xì)胞，其不同于現(xiàn)有的皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞，并且首次由本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)。
[0046]本發(fā)明還提供了用于分離皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞的方法，包括將人皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)2或3代，將細(xì)胞與明膠或4型膠原蛋白反應(yīng)，并且分離粘附于明膠或4型膠原蛋白的細(xì)胞，`并且通過分離方法分離人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞。
[0047]反應(yīng)可以進(jìn)行1-5分鐘，特別是4-5分鐘。如果反應(yīng)時(shí)間短于I分鐘，則不能以良好的產(chǎn)量獲得干細(xì)胞。并且，如果反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)于5分鐘，其他成纖維細(xì)胞可能混入干細(xì)胞中。也就是說，如果反應(yīng)時(shí)間為約5-30分鐘，那么粘附于4型膠原蛋白或明膠的細(xì)胞中的約50-60%是由于重力而粘附的其他成纖維細(xì)胞。
[0048]明膠或4型膠原蛋白的濃度可以為0.1-1% (對(duì)于明膠，重量/溶劑體積)或10-30 μ g/mL (對(duì)于4型膠原蛋白)。溶劑可以是蒸餾水，特別是三重蒸餾水?？梢詫⒛z原蛋白在0.25%乙酸中制成lmg/mL母液,然后用三重蒸懼水稀釋,供使用。
[0049]此外，明膠或4型膠原蛋白可以在0-10°C，特別是4°C下，在基質(zhì)上涂覆16-24小時(shí)。
[0050]基質(zhì)可以選自聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯-聚丙烯共聚物、金屬、硅和玻璃，但不限于此。金屬可以是鎳、金或銀，但不限于此。特別是，基質(zhì)可以是常用的培養(yǎng)容器。基質(zhì)的形狀沒有特別限制。例如，基質(zhì)可以是球形顆粒、平板、管等形式?？梢愿鶕?jù)已知方法來進(jìn)行涂覆。
[0051]所述分離方法可以進(jìn)一步包括確認(rèn)與人皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，分離的細(xì)胞是否超表達(dá)選自Sox2 (SRY (性別決定區(qū)Y)-盒2)和SlOOb (S100鈣結(jié)合蛋白B)的一種或多種基因。
[0052]所述分離方法可以進(jìn)一步包括，確認(rèn)與人皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，分離的細(xì)胞是否超表達(dá)一種或多種生長(zhǎng)因子，所述生長(zhǎng)因子選自EGF (表皮生長(zhǎng)因子)、FGF4 (成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4)、H)GF-AA (血小板衍生的生長(zhǎng)因子-AA)、VEGFR-2 (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2)、VEGFR-3 (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3)和VEGF-D (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D)。與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，本發(fā)明分離的皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞可以超表達(dá)選自EGF(表皮生長(zhǎng)因子)、FGF4 (成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4)、PDGF-AA (血小板衍生的生長(zhǎng)因子-AA)、VEGFR-2 (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2)、VEGFR-3 (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3)和VEGF-D (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D)的一種或多種生長(zhǎng)因子。
[0053]本發(fā)明還提供了用于分化人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞的方法，包括將通過分離方法分離的人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞，并且提供了由人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞分化的成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。
[0054]在分化方法中，可以將分離的干細(xì)胞在成骨分化培養(yǎng)基(hMSC間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基，Lonza PT-3002)中分化14天，同時(shí)每2_3天更換一次培養(yǎng)基(參見實(shí)施例4)。所述分化方法可以進(jìn)一步包括，確認(rèn)與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，分化的細(xì)胞是否超表達(dá)選自O(shè)GN (骨甘氨酸)和ACAN (聚集蛋白聚糖)的一種或多種基因。與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，本發(fā)明中分化的成骨細(xì)胞可以超表達(dá)選自O(shè)GN (骨甘氨酸)和ACAN (聚集蛋白聚糖)的一種或多種基因。
[0055]在分化方法中，可以將分離的干細(xì)胞在脂肪生成分化培養(yǎng)基中分化7天，所述培養(yǎng)基特別是DMEM培養(yǎng)基，更特別是含有10%胎牛血清、0.1%胰島素、I μ M地塞米松、0.5mMIBMX和I μ M曲格列酮的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)以2_3天的間隔更換培養(yǎng)基(參見實(shí)施例5)。所述分化方法可以進(jìn)一步包括，確認(rèn)與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，分化的細(xì)胞是否超表達(dá)選自PPARG (過氧化物酶體增殖因子激活受體Y)、LEP (瘦素)、AdipoQ (脂聯(lián)素，含ClQ和膠原蛋白結(jié)構(gòu)域)和FABP4 (脂肪結(jié)合蛋白4，脂肪細(xì)胞)的一種或多種基因。與人皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，本發(fā)明分化的脂肪細(xì)胞可以超表達(dá)選自PPARG、LEP、AdipoQ和FABP4的一種或多 種基因。
[0056]本發(fā)明還提供了用于骨生成或脂肪生成的組合物，其含有皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞、由皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞分化的成骨細(xì)胞或由皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞分化的脂肪細(xì)胞，作為活性成分。
[0057]本發(fā)明組合物的組合物提供了預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松、預(yù)防和治療皮膚老化、治療皮膚創(chuàng)傷、促進(jìn)皮膚血液循環(huán)、增強(qiáng)皮膚體積或植皮的作用。組合物可以是通常施用于皮膚的任何形式。特別是，其可以是外部施用于皮膚上的組合物，如化妝品組合物或藥物組合物。
[0058]化妝品組合物可以是例如基礎(chǔ)化妝品組合物、彩妝化妝品組合物、頭發(fā)化妝品組合物、身體化妝品組合物等，并且配方類型沒有特別限制。
[0059]例如，化妝品組合物可以配制成溶液、懸浮液、乳劑、糊狀物、凝膠、霜?jiǎng)?、洗劑、粉劑、肥阜、含表面活性劑清潔劑、油、粉?powder fundation)、乳液底妝(emulsionfoundation)、臘質(zhì)底妝(wax foundation)、噴霧劑等,但不限于此。更特別是,可以配制成基礎(chǔ)化妝品，如軟化洗劑、營(yíng)養(yǎng)洗劑、牛奶洗劑、身體洗劑、營(yíng)養(yǎng)霜、按摩霜、保濕霜、護(hù)手霜、精油、眼霜、清潔霜、清潔泡沫、潔膚水、粉餅(pack)、凝膠、貼劑、水包油型(0/W)乳劑、油包水型(0/W)乳劑等，彩妝，如唇膏、隔離霜、粉底等，清潔劑，如洗發(fā)水、漂洗劑、身體清潔劑、牙膏、漱口水等，或頭發(fā)護(hù)理化妝品，如生發(fā)油、頭發(fā)定型劑，例如，凝膠或摩絲，染發(fā)劑等。
[0060]化妝品組合物可以含有化妝品可接受的介質(zhì)或基質(zhì)，并且可以作為任何局部施用制劑來提供，例如，溶液、凝膠、無水固體或糊狀物、水包油型乳劑、懸浮液、微乳劑、微膠囊、微粒、離子囊泡分散體(脂質(zhì)體)和/或非離子囊泡分散體、霜?jiǎng)⒆o(hù)膚洗劑、牛奶洗劑、粉劑、膏劑、噴霧劑或遮瑕棒(conceal stick)?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域常用的方法來制備這些組合物。
[0061]當(dāng)本發(fā)明的制劑是溶液或乳劑時(shí)，可以將溶劑、溶解劑或乳化劑用作載體。例如，可以使用水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、甘油脂族酯、聚乙二醇或山梨聚糖的脂肪酸酯。
[0062]當(dāng)本發(fā)明的制劑是懸浮液時(shí)，液體稀釋劑，如水、乙醇或丙二醇，懸浮劑，如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯山梨聚糖酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁(aluminum metahydroxide)、斑脫土、瓊脂、黃苗膠等,可以用作載體。
[0063]當(dāng)本發(fā)明的制劑是糊狀物、霜?jiǎng)┗蚰z時(shí)，動(dòng)物油、植物油、蠟、石蠟、淀粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、斑脫土、硅石、滑石、氧化鋅等，可以用作載體。
[0064]當(dāng)本發(fā)明的制劑是粉末或噴霧劑時(shí)，乳糖、滑石、硅石、氫氧化鋁、硅酸鈣或聚酰胺粉末可以用作載體。特別是，當(dāng)制劑是噴霧劑時(shí)，其可以進(jìn)一步含有推進(jìn)劑，如氯氟烴、丙烷/ 丁烷或二甲醚。
[0065]當(dāng)本發(fā)明的制劑是含表面活性劑的清潔劑時(shí)，脂族醇硫酸酯、脂族醇醚硫酸酯、磺基琥拍酸單酯、輕乙基磺酸酯(isethionate)、咪唑啉(imidazolinium)衍生物、甲基?；撬狨ァ⒓“彼狨?、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基酰胺甜菜堿、脂族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧基化甘油脂肪酸酯等，可以用作載體。
[0066]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的化妝品組合物可以進(jìn)一步含有增稠劑。本發(fā)明的化妝品組合物中所含的增稠劑可以是甲基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基羥基鳥嘌呤、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羧基乙烯基聚合物、聚季銨鹽、鯨蠟硬脂醇、硬脂酸、卡拉膠等。特別是，可以使用選自羧甲基纖維素、羧基乙烯基聚合物和聚季銨鹽中的一種或多種。最特別是，可以使用羧基乙烯基聚合物。
[0067]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，所述化妝品組合物可以按照需要含有各種適當(dāng)?shù)幕|(zhì)和添加劑，它們的種類和含量是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定的。所述化妝品組合物可以含有本領(lǐng)域常用的可接受的添加劑，如防腐劑、著色劑等。
[0068]特別是，防腐劑可以是苯氧乙醇、1，2-己二醇等，并且可以使用合成香精。
[0069]此外，本發(fā)明的化妝品組合物可以含有選自水溶性維生素、油溶性維生素、多肽、多糖、鞘脂和海藻提取物的物質(zhì)。此外，其可以進(jìn)一步含有油、脂肪、保濕劑、潤(rùn)膚劑、表面活性劑、有機(jī)或無機(jī)色素、有機(jī)粉末、UV吸收劑、防腐劑、消毒劑、抗氧化劑、植物提取物、pH控制劑、醇、著色劑、香精、血液循環(huán)刺激劑、冷卻劑、止汗劑、純水等。
[0070]然而，可以包含在化妝品組合物中的成分不限于此。并且，可以在沒有不利地影響本發(fā)明的目的和作用的范圍內(nèi)確定成分的含量。
[0071]在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，可以通過將常用的無機(jī)或有機(jī)載體、賦形劑或稀釋劑加入作為活性成分的皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞中，將藥物組合物制成用于非腸道給藥的固體、半固體或液體制劑。用于非腸道給藥的制劑可以是用于經(jīng)皮給藥的選自滴劑、膏劑、洗劑、凝膠劑、霜?jiǎng)?、貼劑、噴霧劑、懸浮劑和乳劑的制劑，但不限于此。
[0072]可以包含在組合物中的載體、賦形劑或稀釋劑可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、寡糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、海藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。
[0073]組合物的每種制劑可以進(jìn)一步含有本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮到制劑類型、使用目的等而毫無困難地選擇的上述成分。
[0074]此外，當(dāng)本發(fā)明的組合物用作藥物組合物時(shí)，其可以進(jìn)一步含有藥物佐劑，如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕或乳化促進(jìn)劑、用于控制滲透壓的鹽或緩沖劑等，或其他治療上有用的物質(zhì)，并且可以根據(jù)常用方法制成用于口服或非腸道給藥的各種制劑。
[0075]將考慮相關(guān)因素來確定活性成分的實(shí)際給藥劑量，所述相關(guān)因素如病癥的嚴(yán)重程度、選擇的給藥途徑、個(gè)體的年齡、性別、體重和身體狀況等。
[0076]活性成分的一般給藥劑量為約0.001-2000mg/kg/天，更特別為0.5-2.5mg/kg/天。皮膚上的外部應(yīng)用可以一天進(jìn)行一次或幾次。
實(shí)施例
[0077]下文中，將通過實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。然而，以下實(shí)施例只是用于說明性的目的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚本發(fā)明的范圍不受實(shí)施例的限制。
[0078][實(shí)施例1]使用明膠或4型膠原蛋白從人真皮衍生的成纖維細(xì)胞分離RA/SA細(xì)胞
[0079]人真皮衍生的成纖維細(xì)胞(正常人真皮成纖維細(xì)胞，NHDF)購自Lonza，Inc.(ffalkersville, MD, USA, NHDF-Ad-Der Fibroblasts, CC-2511)。將人真皮衍生的成纖維細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中，在37°C和5%C02的條件下，在75-cm2T-燒瓶上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0080]將5mL0.1-1%明膠或10-30 μ g/mL4型膠原蛋白涂覆在IOOim培養(yǎng)皿上，在4°C下持續(xù)16-24小時(shí)。使用0`.25%胰蛋白酶(胰蛋白酶-EDTA)從100-mm培養(yǎng)皿中分離人真皮衍生的成纖維細(xì)胞后，將細(xì)胞在1200rpm下離心5分鐘。除去培養(yǎng)基后，將細(xì)胞加入5mLDMEM培養(yǎng)基中，然后懸浮。然后,將細(xì)胞在培養(yǎng)皿上孵育,所述培養(yǎng)皿上已經(jīng)用明膠或4型膠原蛋白涂覆了 5分鐘，并且按照粘附于培養(yǎng)皿的細(xì)胞(RA ;快速粘附)和在5分鐘內(nèi)沒有粘附于培養(yǎng)皿但在4小時(shí)內(nèi)粘附的細(xì)胞(SA:緩慢粘附)進(jìn)行分離。
[0081][實(shí)施例2]分離的RA/SA細(xì)胞的集落形成試驗(yàn)
[0082]進(jìn)行集落形成試驗(yàn)來比較使用明膠或4型膠原蛋白分離的RA/SA細(xì)胞的集落形成能力(干性)。
[0083]將分離的RA/SA細(xì)胞接種于6-孔培養(yǎng)皿上，I X IO2個(gè)細(xì)胞/孔。培養(yǎng)14天后，用含有10%乙醇和0.1%結(jié)晶紫的溶液將細(xì)胞在室溫下染色5分鐘，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌4次，并且在顯微鏡下觀察。
[0084]結(jié)果顯示于圖1中。如從圖1中可以看到的，分離的RA細(xì)胞顯示出提高的集落形成能力(下文中，將RA細(xì)胞稱為人真皮衍生的成體干細(xì)胞，而將SA細(xì)胞稱為人真皮衍生的成纖維細(xì)胞)。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)將本發(fā)明中分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞在2011年8月8日保藏在韓國(guó)生物科學(xué)與生物技術(shù)研究所(KRIBB)的韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏號(hào)為 KCTCl 1995BP。
[0085][實(shí)施例3]通過測(cè)量mRNA表達(dá)選擇人真皮衍生的成體干細(xì)胞的遺傳標(biāo)志物
[0086]用2mL PBS洗滌實(shí)施例1中分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞和真皮衍生的成纖維細(xì)胞，并且使用TRIzol試劑(Invitrogen, Carlasbad, CA, USA)從細(xì)胞分離RNA。使用Qiagen RNeasy試劑盒(Qiagen, Valencia, CA),將分離的RNA再純化一次，并且使用Agilent2100 生物分析儀(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)分析 RNA 的質(zhì)量° 使用 Superscript Reverse Transcriptase (RT)試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)由RNA合成cDNA，并且通過實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-RT-PCR)定量分析。
[0087]使用TaqMan 基因表達(dá)試驗(yàn)試劑盒(Applied Biosystems,Foster City,CA)(Sox2基因引物:Hs01053049_sl，SlOOb基因引物:Hs00389217_ml)分析了分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞和真皮衍生的成纖維細(xì)胞中Sox2和SlOOb基因的表達(dá)模式的變化，已知Sox2和SlOOb基因是成體干細(xì)胞的特征性遺傳標(biāo)志物。結(jié)果顯示于圖2的a和b中。與人真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞顯示出基因的表達(dá)高約2-3倍。此外，研究了巢蛋白(Hs00707120_sl)和波形蛋白(Hs00185584_ml)基因的表達(dá)，用于與之前已知的呈現(xiàn)出巢蛋白_/波形蛋白+的人真皮衍生的成體干細(xì)胞進(jìn)行比較。在本發(fā)明分離的人真皮衍生成體干細(xì)胞中巢蛋白(Hs00707120_sl)和波形蛋白(Hs00185584_ml)都得到了表達(dá)，并且與真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平?jīng)]有差異(圖2的c和d)。因此，可以看出，本發(fā)明分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞是之前沒有鑒定過的新的真皮衍生的成體干細(xì)胞。
[0088]使用P < 0.05,通過成對(duì)斯氏t檢驗(yàn)(Student’s t_test)測(cè)試時(shí),表達(dá)的增加是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
[0089][實(shí)施例4]人真皮衍生的成體干細(xì)胞分化能力的確認(rèn)
[0090]為了確認(rèn)使用明膠或4型膠原蛋白分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞的分化能力，誘導(dǎo)細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。
[0091]使用Lonza, In c.(ffalkersville, MD, USA)的成骨分化培養(yǎng)基(hMSC間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基，PT-3002)來誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞的分化。將分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞和真皮衍生的成纖維細(xì)胞接種于6-孔培養(yǎng)皿上，20 X IO4個(gè)細(xì)胞/孔，并且使用成骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化14天，通過基因表達(dá)試驗(yàn)來證實(shí)這一情況。
[0092]使用含有10%胎牛血清、0.1%胰島素、I μ M地塞米松、0.5mMIBMX和I μ M曲格列酮的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞的分化。將分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞和真皮衍生的成纖維細(xì)胞接種于6-孔培養(yǎng)皿上，20 X IO4個(gè)細(xì)胞/孔，并且使用脂肪生成分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化7天，通過基因表達(dá)試驗(yàn)來證實(shí)這一情況。
[0093][實(shí)施例5]測(cè)量由分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞和真皮衍生的成纖維細(xì)胞分化的成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中的分化生物標(biāo)志物的表達(dá)
[0094]誘導(dǎo)分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞和真皮衍生的成纖維細(xì)胞各自分化成成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞后，使用TaqMan基因表達(dá)試驗(yàn)試劑盒(Applied Biosystems, Foster City,CA) (0GN 基因引物:Hs00247901_ml, ACAN 基因引物:Hs00153936_ml, PPARG 基因引物:Hs01115513_ml，瘦素基因引物:Hs00174877_ml, AdipoQ 基因引物:Hs00605917_ml, FABP4基因引物:Hs01086177_ml)，以與實(shí)施例3中的相同方式評(píng)價(jià)了 OGN和ACAN(它們是成骨細(xì)胞的生物標(biāo)志物)以及PPARG、瘦素、AdipoQ和FABP4 (它們是脂肪細(xì)胞的生物標(biāo)志物)的表達(dá)模式的變化。結(jié)果顯示于圖3和圖4中。與真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞顯示出基因的表達(dá)高約2倍。使用P < 0.05，通過成對(duì)斯氏t檢驗(yàn)測(cè)試時(shí)，表達(dá)的增加是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的[0095][實(shí)施例6]分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞中特異性分泌的生長(zhǎng)因子的選擇
[0096]使用生長(zhǎng)因子陣列(Raybio, Norcross, GA, USA),研究了從分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞的培養(yǎng)物分泌的生長(zhǎng)因子的表達(dá)模式。
[0097]將分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞和真皮衍生的成纖維細(xì)胞接種于6-孔培養(yǎng)皿上，20X 104個(gè)細(xì)胞/孔。培養(yǎng)細(xì)胞后，使用生長(zhǎng)因子陣列測(cè)試培養(yǎng)物。用2mL阻斷緩沖劑在室溫下將細(xì)胞培養(yǎng)物處理30分鐘，然后將ImL培養(yǎng)物在室溫下孵育2小時(shí)。隨后，用2mL洗滌緩沖液洗滌5分鐘5次后，將培養(yǎng)物在室溫下與生物素化抗生長(zhǎng)因子抗體反應(yīng)2小時(shí)。用2mL洗滌緩沖液進(jìn)一步洗滌5分鐘5次后，用2mL HRP綴合的鏈霉抗生素處理培養(yǎng)物，孵育2小時(shí)，用洗滌緩沖液洗滌，用檢測(cè)緩沖液孵育并用LAS-3000 (Fuji Film)顯影。
[0098]分析了總共41種生長(zhǎng)因子。與人真皮衍生的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物相比時(shí)，人真皮衍生的成體干細(xì)胞的培養(yǎng)物顯示出生長(zhǎng)因子EGF、FGF4、PDGF-AA, VEGFR-2、VEGFR-3和VEGF-D有10%或更高的增加(圖5)。特別是，由于EGF和FGF4是表皮和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的重要生長(zhǎng)因子，因此預(yù)期本發(fā)明分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞有助于治療和恢復(fù)老化或受損的真皮。此外，由于VEGFR-2、VEGFR-3和VEGF-D是參與血管生成的重要生長(zhǎng)因子，因此本發(fā)明中分離的人真皮衍生的成體干細(xì)胞可以通過允許毛細(xì)血管的生長(zhǎng)或移動(dòng)確保將營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)給真皮(參見圖6和圖7)。
[0099]使用P ( 0.05，通過成對(duì)斯氏t檢驗(yàn)測(cè)試時(shí)，生長(zhǎng)因子表達(dá)的提高是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
`[0100]盡管已經(jīng)顯示和描述了示例性實(shí)施方案，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在沒有脫離本發(fā)明所附權(quán)利要求限定的精神和范圍的情況下，可以對(duì)其進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)的各種變化。
[0101]此外，可以進(jìn)行許多改變，使得特定的情況或材料適用于本發(fā)明的教導(dǎo)，而沒有脫離其基本范圍。因此，確定本發(fā)明不限于預(yù)期作為實(shí)施本發(fā)明的最佳方式公開的特定示例性實(shí)施方案，而是本發(fā)明將包括落入所附權(quán)利要求范圍內(nèi)的所有實(shí)施方案。
[0102][保藏號(hào)]
[0103]保藏機(jī)構(gòu):韓國(guó)生物科學(xué)與生物技術(shù)研究所
[0104]保藏號(hào):KCTC11995BP
[0105]保藏日:2011年8月8日
[0106]國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約
[0107]國(guó)際表
[0108]原始保藏情況收條
[0109]按照Rule7.1
[0110]至:沈重炫
[0111]株式會(huì)社愛茉莉太平洋技術(shù)研究院
[0112]大韓民國(guó)446-729京畿道龍仁市器興區(qū)甫羅洞
[0113]314-1
[0114]
【權(quán)利要求】
1.人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞，其中與人皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，選自Sox2 (SRY (性別決定區(qū)Y)-盒2)和SlOOb (S100鈣結(jié)合蛋白B)的一種或多種基因是超表達(dá)的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞,其中通過傳代培養(yǎng)人皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞、將所述細(xì)胞與明膠或4型膠原蛋白反應(yīng)以及分離粘附于所述明膠或4型膠原蛋白的所述細(xì)胞來獲得所述干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞，其中通過將所述成纖維細(xì)胞與明膠或4型膠原蛋白反應(yīng)1-5分鐘來獲得所述干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞，其中所述明膠溶解于蒸餾水中至0.l-lwt%的濃度，而所述4型膠原蛋白溶解于蒸餾水中至10-30 μ g/mL的濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞，其中所述明膠或4型膠原蛋白在0-10°C下在基質(zhì)上涂覆16-24小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞是與人皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比選自EGF (表皮生長(zhǎng)因子)、FGF4 (成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4)、PDGF-AA (血小板衍生的生長(zhǎng)因子-AA)、VEGFR-2 (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2)、VEGFR-3 (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3)和VEGF-D (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D)的一種或多種生長(zhǎng)因子超表達(dá)的干細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞是保藏號(hào)為KCTCl 1995BP的干細(xì)胞。
8.由權(quán)利要求1所述的人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞分化的成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞?！?br> 9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的成骨細(xì)胞，其中所述成骨細(xì)胞是與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比選自O(shè)GN (骨甘氨酸)和ACAN (聚集蛋白聚糖)的一種或多種基因超表達(dá)的成骨細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的脂肪細(xì)胞，其中所述脂肪細(xì)胞是與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比選自PPARG (過氧化物酶體增殖因子激活受體Y)、LEP (瘦素)、AdipoQ (脂聯(lián)素，含ClQ和膠原蛋白結(jié)構(gòu)域)和FABP4 (脂肪結(jié)合蛋白4，脂肪細(xì)胞)的一種或多種基因超表達(dá)的脂肪細(xì)胞。
11.一種用于骨生成或脂肪生成的組合物，其包含權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞、成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞作為活性成分。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用于骨生成或脂肪生成的組合物，其中所述組合物提供預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松、預(yù)防和治療皮膚老化、治療皮膚創(chuàng)傷、促進(jìn)皮膚血液循環(huán)、增強(qiáng)皮膚體積或植皮的作用。
13.一種用于分離人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞的方法，包括傳代培養(yǎng)人皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞，將所述細(xì)胞與明膠或4型膠原蛋白反應(yīng)，以及分離粘附于所述明膠或4型膠原蛋白的所述細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用于分離人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞的方法，其中將所述成纖維細(xì)胞與明膠或4型膠原蛋白反應(yīng)1-5分鐘。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用于分離人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞的方法，其中將所述明膠溶解于蒸餾水中至0.l-lwt%的濃度，而將所述4型膠原蛋白溶解于蒸餾水中至10-30 μ g/mL的濃度，然后與所述成纖維細(xì)胞反應(yīng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用于分離人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞的方法，其中將所述明膠或4型膠原蛋白在0-10°C下在基質(zhì)上涂覆16-24小時(shí)，然后與所述成纖維細(xì)胞反應(yīng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用于分離人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞的方法，其進(jìn)一步包括確認(rèn)與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，選自Sox2 (SRY (性別決定區(qū)Y)-盒2)和SlOOb (S100鈣結(jié)合蛋白B)的一種或多種基因是否超表達(dá)。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用于分離人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞的方法，其進(jìn)一步包括確認(rèn)與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比，選自EGF (表皮生長(zhǎng)因子)、FGF4 (成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4XF1DGF-AA (血小板衍生的生長(zhǎng)因子-AA)、VEGFR_2 (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受:體2)、VEGFR-3 (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3)和VEGF-D (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D)的一種或多種生長(zhǎng)因子是否超表達(dá)。
19.一種用于分化人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞的方法，包括將通過根據(jù)權(quán)利要求13至18中任一項(xiàng)的所述方法分離的所述人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用于分化人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞的方法，其包括: 在成骨分化培養(yǎng)基中分化所述分離的干細(xì)胞；和 確認(rèn)所述分化的細(xì)胞與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比是否超表達(dá)選自O(shè)GN (骨甘氨酸)和ACAN (聚集蛋白聚糖)的一種或多種基因。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用于分化人皮膚真皮衍生的成體干細(xì)胞的方法，其包括: 在脂肪生成分化培養(yǎng)基中分化所述分離的`干細(xì)胞；和 確認(rèn)所述分化的細(xì)胞與皮膚真皮衍生的成纖維細(xì)胞相比是否超表達(dá)選自PPARG (過氧化物酶體增殖因子激活受體Y)、LEP (瘦素)、AdipoQ (脂聯(lián)素，含ClQ和膠原蛋白結(jié)構(gòu)域)和FABP4 (脂肪結(jié)合蛋白4，脂肪細(xì)胞)的一種或多種基因。
【文檔編號(hào)】C12N5/077GK103827294SQ201280041267
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月24日
【發(fā)明者】沈重鉉, 梁承夏, 李泰龍, 姜鶴熙, 申東旭 申請(qǐng)人:株式會(huì)社愛茉莉太平洋