專利名稱：：采用間充質(zhì)干細(xì)胞制備真皮乳頭組織的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于制備具有毛囊誘導(dǎo)能力的真皮乳頭組織的方法。
背景技術(shù)：
：除其他細(xì)胞之外，毛囊通過上皮和真皮之間的相互作用得以形成并維持，并且已經(jīng)指出真皮乳頭在毛囊的生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵作用(CohenJ.，JEmbryolE鄧Morphol.9:117-27,1961;01iverRF，JEmbryolExpMorphol.15(3):331-47,1966;以及01iverRF.，JEmbryolExpMorphol.18(1):43-51，1967)。在毛囊中，真皮乳頭與外根鞘相互作用以誘導(dǎo)毛發(fā)形成和生長(zhǎng)，并且保持由生長(zhǎng)期、中間期以及終止期構(gòu)成的毛發(fā)周期。在由遺傳、雄性激素或壓力引起的脫發(fā)的發(fā)展中，真皮乳頭逐漸退化，導(dǎo)致毛囊變性。有幾種脫發(fā)形式，包括男性型或女性型脫發(fā)以及斑禿。在過去，脫發(fā)通常通過將人造毛發(fā)植入頭皮的毛囊根球(rootbulbs)來治療，但是這樣的人造毛發(fā)植入方法導(dǎo)致一些嚴(yán)重問題，并且現(xiàn)在這樣的方法已經(jīng)被禁用。當(dāng)前，有兩種治療脫發(fā)的方法藥物或天然物質(zhì)治療，以及人發(fā)(humanhair)移植。藥物或天然物質(zhì)治療可以阻止脫發(fā)進(jìn)展或防止將來的毛發(fā)喪失，但當(dāng)長(zhǎng)期使用之后停止給藥時(shí)，可能加速毛發(fā)喪失。另一方面，人發(fā)移植涉及從枕部毛發(fā)生長(zhǎng)區(qū)取數(shù)簇天然毛發(fā)，并將它們移植至光禿區(qū)。盡管移植的毛發(fā)作為完整的毛囊安置于移植區(qū)，且成為經(jīng)歷正常生長(zhǎng)周期的永久性毛發(fā)，但是待移植的毛發(fā)數(shù)量非常有限，且在每次手術(shù)移植約2000根毛發(fā)絲的情況下，通常不可能實(shí)施超過三次這樣的手術(shù)。因此，當(dāng)前用于治療脫發(fā)的方法具有許多局限性，為了克服這些問題，許多研究者已經(jīng)嘗試通過體外培養(yǎng)毛囊細(xì)胞并在治療區(qū)移植它們來恢復(fù)毛囊。當(dāng)從毛囊分離的真皮乳頭細(xì)胞被培養(yǎng)出時(shí)，它們顯示了與皮膚的成纖維細(xì)胞相似的結(jié)構(gòu)。這些培養(yǎng)的乳頭細(xì)胞具有誘導(dǎo)毛囊形成的能力，這得到培養(yǎng)過程中所述細(xì)胞傾向于聚集這一事實(shí)的支持。換句話說，與皮膚的成纖維細(xì)胞不同，真皮乳頭細(xì)胞在培養(yǎng)的起始階段相互聚集。然而，所述能力并非被無限維持，且Reynolds等人已經(jīng)報(bào)道，當(dāng)在體外培養(yǎng)真皮乳頭細(xì)胞時(shí)，在約3至4個(gè)傳代數(shù)之后，真皮乳頭細(xì)胞逐漸喪失其先天的毛囊誘導(dǎo)能力(ReynoldsAJ等人，Development.122(10):3085—94，1996)。另一方面，Jahoda禾口Reynolds等人已經(jīng)報(bào)道，當(dāng)將培養(yǎng)了等于或少于3個(gè)傳代數(shù)的大鼠觸須毛真皮乳頭細(xì)胞植入大鼠的小耳皮膚傷口和背部時(shí)，從移植位點(diǎn)反常地出現(xiàn)了顯示觸須毛型特征的大毛纖維(JahodaCA.，Development.115(4):1103-9,1992;和ReynoldsAJ.等人，Development.115(2):587-93,1992)。上述報(bào)道表明，為了獲得用于移植的大量細(xì)胞，真皮乳頭細(xì)胞的初期培養(yǎng)階段應(yīng)該短暫且高效。通常，原代培養(yǎng)的產(chǎn)率隨著從中獲得培養(yǎng)細(xì)胞的源組織或器官的年齡增長(zhǎng)而減少。因此，為了用于毛發(fā)再生的細(xì)胞治療，研究者已經(jīng)將他們的注意力從分化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至胚胎干細(xì)胞或成人干細(xì)胞。例如，Kataoka等人已經(jīng)報(bào)道，當(dāng)移植從源于小鼠骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞和胎兒的上皮/真皮細(xì)胞的混合物獲得的漂浮細(xì)胞時(shí)，出現(xiàn)具有毛發(fā)生長(zhǎng)的皮膚再生，并且在毛囊中發(fā)現(xiàn)所移植的間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。該觀察結(jié)果表明，間充質(zhì)干細(xì)胞也可以有效地用于毛發(fā)再生。另外，Richardson等人已經(jīng)報(bào)道，毛囊真皮細(xì)胞可以分化成脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞，Martin等人已經(jīng)報(bào)道，源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞和毛囊真皮干細(xì)胞均分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及肌細(xì)胞。本發(fā)明的發(fā)明人注意到了這樣的事實(shí)，S卩，源自骨髓、脂肪或臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞具有與構(gòu)成真皮乳頭和真皮鞘的細(xì)胞相似的特征，因此，本發(fā)明的發(fā)明人已嘗試開發(fā)一種用于體外重構(gòu)真皮乳頭組織的有效方法。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于體外制備具有毛囊誘導(dǎo)能力的真皮乳頭組織的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用于制備大量真皮乳頭組織的方法，所述方法包括以下步驟1)在第一培養(yǎng)基(firstculturemedium)中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，該第一培養(yǎng)基含有600至1900mg/l的氨基酸和12至36mg/l的維生素；2)在含有2000至3000mg/l氨基酸和40至60mg/l維生素的第二培養(yǎng)基(secondculturemedium)中培養(yǎng)在步驟(1)中獲得的細(xì)胞，其中，該第二培養(yǎng)基補(bǔ)充有生長(zhǎng)因子且不含血清；3)將胰蛋白酶或膠原蛋白酶添加至步驟(2)中獲得的培養(yǎng)物，以使得細(xì)胞團(tuán)塊從培養(yǎng)皿分離，并經(jīng)歷自動(dòng)聚集，以形成真皮乳頭組織；以及4)收獲步驟(3)中獲得的真皮乳頭組織，并在第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)該組織。結(jié)合附圖，本發(fā)明的上述及其他目的和特征將會(huì)因本發(fā)明的以下描述而變得清楚，所述附圖分別顯示了圖IA是顯示間充質(zhì)干細(xì)胞自臍帶的臍帶膠質(zhì)(Whartonjelly)層流出和該細(xì)胞的結(jié)構(gòu)的光學(xué)顯微鏡圖；圖IB示出源自骨髓和臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)量結(jié)果；圖1C是顯示源自臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨和成脂分化的照片；圖2是顯示源自骨髓、脂肪組織和臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞在體外形成真皮乳頭組織的過程和真皮乳頭組織的結(jié)構(gòu)的照片；圖3是顯示本發(fā)明的真皮乳頭組織具有與完整毛囊的真皮乳頭相似的組分并具有毛囊誘導(dǎo)能力的照片；圖4是觀察真皮乳頭組織和試驗(yàn)實(shí)施例2中缺乏真皮乳頭的毛囊之間相互作用的實(shí)驗(yàn)的示圖；圖5是顯示當(dāng)由本發(fā)明方法制備的真皮乳頭組織與缺乏真皮乳頭的毛囊共培養(yǎng)時(shí)在體外形成毛球(hairbulb)的照片；圖6是顯示在將本發(fā)明制備的真皮乳頭組織和外根鞘細(xì)胞注入裸鼠背部皮膚的內(nèi)皮之后毛發(fā)生長(zhǎng)的照片。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的制備方法的特征在于包括在含有600至1900mg/l氨基酸和12至36mg/l維生素的傳統(tǒng)培養(yǎng)基(原代培養(yǎng)基)中培養(yǎng)源自骨髓、脂肪組織或臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞(步驟1)，并且在添加有0.1至10000ng/ml生長(zhǎng)因子的含有2000至3000mg/l氨基酸和40至60mg/l維生素的高濃度無血清培養(yǎng)基(繼代培養(yǎng)基)中培養(yǎng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞(步驟2)以制備真皮乳頭組織。在本發(fā)明方法的步驟(1)中，根據(jù)本領(lǐng)域的傳統(tǒng)方法，使源自骨髓、脂肪組織或臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞在普通細(xì)胞培養(yǎng)基中經(jīng)歷原代培養(yǎng)。用于本發(fā)明原代培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基可選自、但不限于DMEM(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)、DMEM/F_12、F_12、McCoy's5A、RPMI1640、Williams，mediumE以及IMDM(Iscove，sModifiedDulbecco'sMedium)?？赏ㄟ^達(dá)1至20傳代數(shù)的一系列原代培養(yǎng)步驟增殖間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明方法的步驟(2)中，然后在繼代培養(yǎng)基(其為高濃度培養(yǎng)基)中培養(yǎng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞，該培養(yǎng)基含有為普通培養(yǎng)基2至5倍濃度的氨基酸和維生素，同時(shí)添加有生長(zhǎng)因子，不使用任何基質(zhì)或基材?？稍诒景l(fā)明中使用的生長(zhǎng)因子包括、但不限于HGF(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、EGF(表皮生長(zhǎng)因子)以及NGF(神經(jīng)生長(zhǎng)因子)，可以以范圍為1至1000ng/ml的量添加至繼代培養(yǎng)基中。在本發(fā)明方法的步驟(3)中，使用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理步驟(2)中獲得的培養(yǎng)物，以使細(xì)胞從培養(yǎng)皿分離。酶處理賦予細(xì)胞流動(dòng)性并誘導(dǎo)細(xì)胞自聚集，縮短聚集體(真皮乳頭組織)形成的時(shí)間。當(dāng)胰蛋白酶或膠原蛋白酶被添加至培養(yǎng)基時(shí)，其中約90%的細(xì)胞在72小時(shí)之內(nèi)形成能夠再現(xiàn)真皮形成細(xì)胞的特征的自聚集體。例如，在25cm2培養(yǎng)皿上以1X106個(gè)細(xì)胞接種的情況，形成成百上千個(gè)自聚集體。在本發(fā)明方法的步驟(4)中，分離并保存前一步驟中形成的真皮乳頭組織。例如，使在步驟(3)中獲得的含有組織(自聚集體)的培養(yǎng)基經(jīng)歷離心，以收獲自聚集的細(xì)胞，并在步驟(2)中使用的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所獲得的沉淀物。由本發(fā)明方法制備的真皮乳頭組織在被植入裸鼠真皮時(shí)能夠通過與缺乏真皮乳頭的毛囊之間的相互作用而誘導(dǎo)毛囊形成，并形成具有毛發(fā)周期特征的新毛囊或促進(jìn)現(xiàn)有毛囊的毛發(fā)生長(zhǎng)。由于本發(fā)明中使用的繼代培養(yǎng)基含有上文提到的為普通培養(yǎng)基2至5倍的氨基酸和維生素，所以可以克服間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)過程中營(yíng)養(yǎng)素和氧氣耗竭的問題，改進(jìn)細(xì)胞的分化特征，導(dǎo)致有助于真皮乳頭組織形成。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的繼代培養(yǎng)基含有如下高濃度的氨基酸各30至200mg/l的L-精氨酸、L-天門冬酰胺、L-天門冬氨酸、L-胱氨酸2HC1、L-異亮氨酸、L-亮氨酸以及L-賴氨酸HC1;各30至210mg/l的L-苯丙氨酸、L-色氨酸以及L-酪氨酸；以及各50至600mg/l的其余必需氨基酸。另外，優(yōu)選的是，本發(fā)明的繼代培養(yǎng)基含有如下高濃度的維生素各0.02至lmg/1的生物素、D-Ca泛酸鹽以及核黃素作為可溶性維生素B;各3至16mg/l的氯化膽堿、葉酸、煙酰胺、妣哆醇*HC1以及硫胺素*HC1;10至15mg/l的無旋光肌醇；以及0.02至0.03mg/1的維生素B『更優(yōu)選地，本發(fā)明的培養(yǎng)基還包含0.03至0.07mg/1的谷胱甘肽，400至600mg/l的谷氨酰胺，以及1500至3Q00mg/1的D-葡萄糖。另外，更優(yōu)選地，本發(fā)明的繼代培養(yǎng)基包含3000至3500mg/1的碳酸氫鈉(NaHC03)以及2000至2500mg/l具有pH緩沖效應(yīng)的HEPES(N-[2-羥乙基]哌嗪-N'-[2_乙磺酸]);1.0至2.OmM的Ca和0.5至1.OmM的Mg，它們是細(xì)胞-細(xì)胞黏著必需的微量元素；各0.25至0.7nM的Cu、Fe、Mn以及Zn，它們是細(xì)胞代謝所必需的微量元素；以及4000至5000mg/l的氯化鈉，用于調(diào)整滲透壓為280至310mOsm/kg。另外，為了延長(zhǎng)毛囊的培養(yǎng)期，本發(fā)明的繼代培養(yǎng)基還包含皮質(zhì)甾醇(HC)、胰島素(D、轉(zhuǎn)鐵蛋白(T)以及亞硒酸鈉(S)。例如，優(yōu)選的是，繼代培養(yǎng)基含有10至100iig/l的皮質(zhì)甾醇、5至20mg/l的胰島素、5至20mg/l的轉(zhuǎn)鐵蛋白，以及0.005至0.02mg/l的亞硒酸鈉。還更優(yōu)選的是，使用包含如下組分的繼代培養(yǎng)基165mg/1的CaCl2，0.0001mg/1的CuS04-5H20、0.0001mg/l的Fe(N03)_9H20、330mg/l的KC1、0.076mg/l的KN03、98mg/1的MgS04、0.0001mg/l的MnCl2-4H20、4，800mg/l的NaCl、3360mg/1的NaHC03、lllmg/1的Na2HP04、0.0002mg/l的ZnS04-7H20、2000mg/l的D_葡萄糖、110mg/1的丙酮酸鈉、2383mg/1的HEPES、15mg/1的苯酚磺酞、50mg/1的L-丙氨酸、100mg/1的L-精氨酸、50mg/1的L-天門冬酰胺、60mg/1的L-天門冬氨酸、182.4mg/1的L-胱氨酸'2HC1、150mg/l的L-谷氨酸、584mg/l的L-谷氨酰胺、60mg/1的L-甘氨酸、62.lmg/1的L-組氨酸、210mg/1的L-異亮氨酸、210mg/1的L-亮氨酸、292mg/1的L-賴氨酸HCl、60mg/1的L-甲硫氨酸、132mg/1的L-苯丙氨酸、80mg/1的L-脯氨酸、84mg/1的L-絲氨酸、190mg/1的L-蘇氨酸、32mg/1的L-色氨酸、208mg/1的L-酪氨酸、188mg/1的L-纈氨酸、0.026mg/l的生物素、0.026mg/1的D-Ca泛酸鹽、8mg/1的氯化膽堿、16mg/1的葉酸、14.40mg/l的無旋光肌醇、8mg/1的煙酰胺、8mg/1的吡哆醇HC1、0.8mg/1的核黃素、3mg1/1的硫胺素HC1，以及0.026mg/l的維生素B12。優(yōu)選用于本發(fā)明的繼代培養(yǎng)基包含為本領(lǐng)域所使用的普通培養(yǎng)基2倍濃度的氨基酸和維生素，以提供細(xì)胞代謝的能量并維持細(xì)胞活力。其中D-葡萄糖的水平較低，D-葡萄糖被代謝成乳酸并作為能量來源起著較不重要的作用。繼代培養(yǎng)基中影響ATP合成量的L-谷氨酰胺的濃度固定在4mM。另外，繼代培養(yǎng)基包含0.7nM的鋅、0.25nM的鐵、0.4nM的銅以及0.5nM的鎂作為微量元素，并含有濃度分別40mM和10mM的碳酸氫鈉和具有pH緩沖能力的HEPES。本發(fā)明的繼代培養(yǎng)基包含終濃度分別1.5mM和0.8mM的鈣和鎂作為必需礦物，用于細(xì)胞間粘附，并還含有4500mg/1的氯化鈉，用來調(diào)整滲透壓至280至310mOsm/kg的范圍。另外，本發(fā)明的繼代培養(yǎng)基還可包含10mg/l的轉(zhuǎn)鐵蛋白作為鐵源，O.Olmg/1的亞硒酸鈉作為無機(jī)鹽；10yg/1的皮質(zhì)甾醇、10mg/1的胰島素以及O.2重量％的白蛋白作為激素；以及20ng/ml的生長(zhǎng)因子。另外，本發(fā)明的繼代培養(yǎng)基優(yōu)選通過重碳酸鹽和代謝物之間的緩沖相互作用維持在恒定的pH，這對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)是重要因素。S卩，由于本發(fā)明的繼代培養(yǎng)基具有與普通培養(yǎng)基相比更高濃度的氨基酸，諸如Williams'mediumE，由于銨(氨基酸的最終代謝物)濃度增加，pH可能增加。但是，所添加的作為緩沖劑的重碳酸鹽將培養(yǎng)基的pH維持在7.2至7.5。本發(fā)明的繼代培養(yǎng)基中的硫酸銅通過超氧化物歧化酶(SOD，存在于毛囊中的銅依賴性酶和抗氧化劑)的作用抑制由離子鍵引起的細(xì)胞凋亡，并且通過其他銅依賴性酶的作用通過抑制5a-還原酶-1和5a-還原酶_2剌激天然生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。另外，鋅是用于鋅指轉(zhuǎn)錄因子的激活的必需礦物組分。根據(jù)本發(fā)明制備的真皮乳頭組織是由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來的真皮乳頭細(xì)胞構(gòu)成的聚集體，具有與完整真皮乳頭相似的約100-200m的大小，并且，因?yàn)樗峭ㄟ^天然細(xì)胞接觸制備的，因而顯示了強(qiáng)力的直接的細(xì)胞間相互作用。使用蘇木素/伊紅的聚集體切片組織學(xué)觀察結(jié)果顯示出細(xì)胞緊密聚集。另外，根據(jù)本發(fā)明制備的真皮乳頭組織表現(xiàn)出表達(dá)4型膠原和層粘連蛋白(完整真皮乳頭的基底膜組分)，并且還表達(dá)多功能蛋白聚糖(用于鑒定毛囊誘導(dǎo)潛能的標(biāo)志物)。由于聚集體不需要任何外部剌激或用于細(xì)胞黏著和增殖的基質(zhì)，所以可以大量生產(chǎn)。這樣的聚集體顯示高毛囊誘導(dǎo)能力，這可通過細(xì)胞移植有效地用于治療脫發(fā)，并用于體外研究毛囊特征。下述實(shí)施例意在不限制本發(fā)明范圍的情況下進(jìn)一步說明本發(fā)明。燃輔你l1雄歸細(xì)燃根據(jù)表la至表ld所述的組合物制備出1升含有比傳統(tǒng)培養(yǎng)基更高濃度氨基酸和維生素的培養(yǎng)基，并將10mg/l胰島素、10mg/1轉(zhuǎn)鐵蛋白、0.Olmg/1亞硒酸鈉、10yg/1皮質(zhì)甾醇以及0.2重量％白蛋白(2g/l)添加至其中，以制備繼代培養(yǎng)基。表la<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表lb<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>輔你ll:l司碰f麵白術(shù)導(dǎo)使用磷酸鹽緩沖液洗滌分娩過程中獲得的臍帶3次，并從中去除血管周圍的平滑肌和上皮層。將剩下的臍帶膠質(zhì)層切成約3mmX3mm大小，并將碎片置于培養(yǎng)皿上，在培養(yǎng)箱中維持在37t:約4小時(shí)，直至碎片附著于培養(yǎng)皿底部。然后將補(bǔ)充有10%FBS的DMEM(Dulbecco'sModificationofEagle'sMedium)添加至該培養(yǎng)基中。1周之后，細(xì)胞開始從臍帶的臍帶膠質(zhì)流出，當(dāng)細(xì)胞占據(jù)培養(yǎng)皿底部約80%時(shí)，將培養(yǎng)基換成新培養(yǎng)基，在其中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至占據(jù)培養(yǎng)皿的約70%時(shí)，使用0.05%胰蛋白酶/0.02EDTA處理培養(yǎng)基以使細(xì)胞從培養(yǎng)皿分離，并調(diào)整濃度至5Xl()S個(gè)細(xì)胞/ml。然后，使得細(xì)胞與干細(xì)胞的標(biāo)志物CD73、CD90以及CD105的抗體反應(yīng)20分鐘。使用2倍體積的PBS洗滌細(xì)胞溶液，并使用流式緩沖液(于PBS中的1%低聚甲醛、0.1%疊氮化納以及0.5%BSA)。然后，使用FACScan(BDscience)對(duì)細(xì)胞溶液進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量，并使用CELLQUEST軟件(BDscience)分析。結(jié)果顯示細(xì)胞含有CD73、CD90以及CD105(圖IB)。另外，為了檢查細(xì)胞的分化能力，將它們接種至6孔培養(yǎng)板中，并將含有低濃度葡萄糖和補(bǔ)充有10X血清的DMEM添加至其中。培養(yǎng)細(xì)胞，直至它們占據(jù)約70%的培養(yǎng)皿。然后，使用用于成骨分化或成脂分化的新培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。用于成骨分化的培養(yǎng)基是添加有100nM地塞米松、0.05mM抗壞血酸2-磷酸鹽、lOmM的P-甘油磷酸酯、10-8M維生素D3以及10%FBS的DMEM，并且按約3天間隔使用新鮮培養(yǎng)基更換該培養(yǎng)基。3周之后，通過VonCossa染色方法鑒定細(xì)胞為干細(xì)胞(圖1C)。另外，應(yīng)用添加有1yM地塞米松、0.05mM甲基-異丁基黃嘌呤(IBMX)、10iig/ml胰島素、100mM吲哚美辛(idomethacin)以及10%FBS的DMEM作為成脂分化的培養(yǎng)基。在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞3天后，使用添加有10yg/ml胰島素和10%FBS的DMEM更換該培養(yǎng)基。按約3天間隔更換該培養(yǎng)基使用新鮮培養(yǎng)基更換該培養(yǎng)基。3周之后，通過油紅0染色鑒定細(xì)胞為干細(xì)胞(圖1C)。源自骨髓和脂肪的間充質(zhì)干細(xì)胞購(gòu)自CellA卯licationsInc.(USA)，通過文獻(xiàn)(Schilling等人，MolandCellEndocrinol.，271(1-2)，1-17，2007;Kern等人，StemCells，24(5)，1294-1301，2006)中公開的方法鑒定為干細(xì)胞。實(shí)施例2:真皮乳頭飽鄰的制備將源自實(shí)施例1中獲得的骨髓、脂肪組織和臍帶分別進(jìn)行在添加有10%FBS的匿EM中的單層培養(yǎng)，直至細(xì)胞占據(jù)培養(yǎng)皿的約80X。然后，使用繼代培養(yǎng)基(制備實(shí)施例1中制備的無血清高濃度培養(yǎng)基)更換培養(yǎng)基，并向其中添加20ng/ml的HGF(rhHGF，R&Dsystem)。按約3天間隔使用新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，3周之后，使用范圍為20至40iU/cm2量的胰蛋白酶處理培養(yǎng)物，以使細(xì)胞從培養(yǎng)皿分離。在使用胰蛋白酶處理之后約24小時(shí)，開始發(fā)生細(xì)胞聚集，并且完全聚集的細(xì)胞塊開始懸浮于培養(yǎng)基中。在500rpm下使用離心3分鐘從培養(yǎng)物分離懸浮的細(xì)胞聚集體。將細(xì)胞聚集體重懸浮于新鮮培養(yǎng)基中，并保持在培養(yǎng)容器中以保存其培養(yǎng)狀態(tài)，直至用于下述實(shí)驗(yàn)。圖2描述了從源自骨髓、脂肪組織和臍帶的真皮乳頭組織在體外形成的過程，和間充質(zhì)干細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。微輔你l1:餅璃'德織、隨^使用蘇木素/伊紅組織學(xué)染色方法觀察根據(jù)實(shí)施例2中所述方法制備的真皮乳頭組織的大小和接觸切片。圖3中顯示的結(jié)果揭示細(xì)胞緊密聚集，并對(duì)外部剌激引起的崩解具有抵抗力。另外，聚集體的大小為約100-200ym，與天然真皮乳頭組織相似。另外，為了證實(shí)4型膠原和層粘連蛋白(天然真皮乳頭的基底膜的組分)和多功能蛋白聚糖(用于驗(yàn)證毛囊誘導(dǎo)潛能的標(biāo)志物)是否在實(shí)施例2中制備的真皮乳頭組織中得到表達(dá)，采用文獻(xiàn)(Katsuoka等人，ArchDermtolRes，280(3)，140-144.1988;Bratka-Robia等人，VetDermatol,12(1)，1-6，2002;Soma等人，JDermatolSci.，39(3)，147-154,2005)中公開的方法。結(jié)果顯示它們均在本發(fā)明的真皮乳頭組織中表達(dá)(圖3)。試驗(yàn)實(shí)施例2:通過使用人工真皮乳頭組織形成毛囊為了檢驗(yàn)實(shí)施例2中制備的真皮乳頭組織是否可誘導(dǎo)毛囊形成，如下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將24孔培養(yǎng)板的各孔充滿約700y1膠原溶液，并保持在37。C培養(yǎng)箱中1小時(shí)，以誘導(dǎo)膠凝。將實(shí)施例2中制備的真皮乳頭組織和缺乏真皮乳頭的毛囊置于膠原凝膠上，使得它們之間形成300m的間隙，之后培養(yǎng)5至10分鐘，使得它們與凝膠表面接觸。在將700ii1膠原溶液倒到它上面并使其經(jīng)歷膠凝之后，將K-SFM培養(yǎng)基(GibcoBRL，N.Y.，U.S.A.)添加其中。該實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)圖示于圖4。約1周之后，外根鞘細(xì)胞被誘導(dǎo)包圍真皮乳頭。在約15天之后，觀察到外根鞘細(xì)胞的數(shù)量高至足夠形成毛球結(jié)構(gòu)，在約21天之后形成新的毛球(圖5)。這些表現(xiàn)與一篇文獻(xiàn)(Arase等人，SkinPharmacol,7(1-2)，12-15，1994)中先前報(bào)道的基本一致，該文獻(xiàn)公開了通過共培養(yǎng)人毛囊的真皮乳頭和缺乏毛囊的真皮乳頭而形成新毛球樣結(jié)構(gòu)。因此，已經(jīng)證實(shí)，根據(jù)本發(fā)明制備的真皮乳頭組織具有與天然真皮乳頭組織相同的毛囊誘導(dǎo)能力。試驗(yàn)實(shí)施例3:通過使用人工真皮乳頭組織體內(nèi)誘導(dǎo)毛囊形成將約100至150片實(shí)施例2中制備的真皮乳頭組織和外根鞘細(xì)胞(3X106個(gè)細(xì)胞)一起分散于1001生理鹽水中，并使用1ml注射器將501的所得到的混合物注入裸鼠的背部皮膚的內(nèi)皮，然后在注射點(diǎn)上放置一標(biāo)記。結(jié)果，在注射后45天于標(biāo)記區(qū)觀察到毛發(fā)生長(zhǎng)，意味著根據(jù)本發(fā)明制備的真皮乳頭組織具有體內(nèi)毛囊誘導(dǎo)能力(圖6)。盡管就上述具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)知道，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行不同的修改和改變，這些修改和改變也落在所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求一種用于制備真皮乳頭組織的方法，所述方法包括以下步驟1)在第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，該第一培養(yǎng)基含有600至1900mg/l的氨基酸和12至36mg/l的維生素；2)在含有2000至3000mg/l氨基酸和40至60mg/l維生素的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)在步驟(1)中獲得的細(xì)胞，其中，所述第二培養(yǎng)基補(bǔ)充有生長(zhǎng)因子且不含血清；3)將胰蛋白酶或膠原蛋白酶添加至步驟(2)中獲得的培養(yǎng)物，以使得細(xì)胞團(tuán)塊從培養(yǎng)皿分離，并經(jīng)歷自動(dòng)聚集，以形成真皮乳頭組織；以及4)收獲步驟(3)中獲得的真皮乳頭組織，并在第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)該組織。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞源自骨髓、脂肪組織或臍帶。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述第一培養(yǎng)基選自由DMEM(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)、DMEM/F_12、F_12、McCoy's5A、RPMI1640、Williams'mediumE以及MDM(Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium)組成的組。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，在步驟(1)中培養(yǎng)所述間充質(zhì)干細(xì)胞達(dá)1至20傳代數(shù)。5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述生長(zhǎng)因子選自由HGF(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、EGF(表皮生長(zhǎng)因子)以及NGF(神經(jīng)生長(zhǎng)因子)組成的組。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中，以范圍為1至1000ng/ml的量應(yīng)用所述生長(zhǎng)因子。7.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中，所述第二培養(yǎng)基包含各30至200mg/1的L_精氨酸、L-天門冬酰胺、L-天門冬氨酸、L-胱氨酸2HC1、L-異亮氨酸、L-亮氨酸以及L-賴氨酸HCl;各30至210mg/l的L_苯丙氨酸、L_色氨酸以及L_酪氨酸；各50至600mg/1的L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-組氨酸、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L_蘇氨酸以及L-纈氨酸；各O.Ol至2mg/1的生物素、D-Ca泛酸鹽以及核黃素；各3至16mg/1的氯化膽堿、葉酸、煙酰胺、妣哆醇HCl以及硫胺素HCl;10至15mg/l的無旋光肌醇；0.02至0.03mg/l的維生素B12;400至600mg/l的谷氨酰胺；1500至3000mg/l的D_葡萄糖；3000至3500mg/l的碳酸氫鈉(NaHC03);2000至2500mg/l的HEPES(N-[2-羥乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸]);1.0至2.OmM的Ca;0.5至1.OmM的Mg;各0.25至0.7nM的Cu、Fe、Mn以及Zn;以及4000至5000mg/l的氯化鈉。8.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中，所述第二培養(yǎng)基還包含胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、皮質(zhì)甾醇以及白蛋白。9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述真皮乳頭組織是由所述間充質(zhì)干細(xì)胞分化的細(xì)胞構(gòu)成的聚集體。10.—種由權(quán)利要求l的方法制備的真皮乳頭組織。全文摘要一種用于制備真皮乳頭組織的方法，該方法包括在具有一種特定組合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的步驟。該方法使得能夠在體外形成一定量具有毛囊誘導(dǎo)能力的真皮乳頭組織，并且因此可通過細(xì)胞移植有效地用于治療脫發(fā)。文檔編號(hào)C12N5/00GK101755046SQ200780053843公開日2010年6月23日申請(qǐng)日期2007年7月20日優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日發(fā)明者尹熙勳,樸正克,柳寶永,申連浩,金映真申請(qǐng)人:東國(guó)大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)