專利名稱：提高番茄作物產(chǎn)量的啟動(dòng)子序列和基因構(gòu)建體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子序列，當(dāng)將其可操作地連接植物中的下游植物基因時(shí)，
能夠提高所述植物，尤其是番茄的農(nóng)作物產(chǎn)量。本發(fā)明還涉及包含所述可操作地連接
所述下游植物基因的啟動(dòng)子序列的茄科(Solanaceae)植物，尤其是番茄植物(Solan咖
lyco節(jié)i固)，以及獲得所述植物的方法和通過(guò)該方法可獲得的植物。 番茄(Sola誦lycooersi固,也稱為Ucooersiconesculentum)是 一 種茄科
(Mm^m)或茄屬植物。它是作為一年生植物生長(zhǎng)的短期多年生植物，并且與馬鈴薯是
近親。果實(shí)(即番茄)是一種可食的、鮮亮顏色(通常為紅色，這是因?yàn)橛蟹鸭t素色素)
的漿果，野生植物具有l(wèi)-2cm的直徑，通常在栽培形式中要大得多。由于其可食的果實(shí)，因
此該植物如今在全世界廣為種植，這是全世界主要的新鮮市場(chǎng)蔬菜。 番茄植物的生長(zhǎng)習(xí)性通常分類為有限的或無(wú)限的。該分類取決于枝系對(duì)于持續(xù)合 軸生長(zhǎng)的能力。無(wú)限型栽培品種(其中頂端分生組織無(wú)限生長(zhǎng)，并且花從腋生分生組織長(zhǎng) 出)產(chǎn)生無(wú)限生長(zhǎng)的枝系，而有限型栽培品種(其中頂端分生組織轉(zhuǎn)化成頂生花)產(chǎn)生日 漸減少節(jié)點(diǎn)的枝系，直至枝條以兩個(gè)花序終止并且發(fā)育成灌木叢的形式。這種植物結(jié)構(gòu)學(xué) 的變化歸因于SELF-PRUNING (SP)基因的突變(P皿eli等，Development 125 :1979-1989， 1998)，并且對(duì)于這種作物是很重要的發(fā)展，因?yàn)橛邢扌妥魑锟梢杂脵C(jī)械進(jìn)行收獲，因此主 要用于加工工業(yè)，而無(wú)限型作物通常在溫室中種植并且用于新鮮市場(chǎng)。
Fridman等(Mol. Genet. Genomics 266:821-826,2002)在之前已經(jīng)指出，在sp/ sp S. Esculentum背景中命名為PW9-2-5的QTL的S. Pennellii等位基因的基因滲入導(dǎo)致 在花團(tuán)之間具有兩片葉子的半有限型生長(zhǎng)(標(biāo)示為spi = 2)。他們提出，來(lái)自S. Penellii 的SP9D基因，SP9Dpen，是植物結(jié)構(gòu)學(xué)的變化的候選基因，并且也是所謂的固固含量(SSC) 或折射率(這間接地與味道相關(guān))變化的候選基因。SP9D基因?qū)儆贑ETS基因家族 (CENTR0RADIALIS，頂生花)，并且認(rèn)為該基因家族在有限型植物結(jié)構(gòu)學(xué)中起到關(guān)鍵作用 (Carmel-Goren， Plant Mol. Biol. 52 ;1215-1222,2003)。 番茄具有六個(gè)CETS基因家族成員，命名為SP，分布在五個(gè)不同的染色體SP2I、 SP3D、 SP5G、 SP6A和SP9D上，其中是根據(jù)bin位置來(lái)命名的(Pan等，Genetics 155: 309-322,2000)。第六個(gè)成員，SP，位于染色體6， bin E上，并且已知是改變番茄有限 型(sp/sp)/無(wú)限型(SP/_)表型的基因。種系發(fā)育關(guān)系將SP3D、SP5G和SP6A與擬南芥 (ArabidoDsis)FT基因歸為一組。SP9D和SP與擬南芥TFL-1歸為一組，并且SP2I與擬南 芥的開花期母體基因(MFT)位于相同的分枝中(Carmel-Goren等，出處同上)。不論該基 因之間的種系發(fā)育關(guān)系如何，其表達(dá)模式不同。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SP5G表達(dá)主要在子葉中，而 SP3D主要在花器官中表達(dá)，而在營(yíng)養(yǎng)器官葉中的表達(dá)低。對(duì)于SP6A，到目前為止還沒(méi)有發(fā) 現(xiàn)任何表達(dá)。SP9D主要在苗端中表達(dá)，并且在根中具有高表達(dá)，而SP2I在所有測(cè)試的器官 中均有表達(dá)。盡管已知這些表達(dá)模式，但是除SP以外，關(guān)于它們的功能知之甚少。
在最近的數(shù)十年間，無(wú)限型番茄育種主要集中于產(chǎn)量、抗病性以及果實(shí)品質(zhì)方面， 例如一致的成熟度和口味。由于新的生產(chǎn)方法，改善的害蟲整治以及更適合于新的生產(chǎn)方 法的品種，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)量的提高，但是產(chǎn)量的增長(zhǎng)開始放緩。每個(gè)植株具有超過(guò)5個(gè)或15個(gè)果實(shí)的新品種使得產(chǎn)量增加2-4%。 由于缺乏關(guān)于確定番茄產(chǎn)量方面的知識(shí)，使具有較高產(chǎn)量品種的開發(fā)受到阻礙。 Xiao(2004 ;ISHS Acta Horticulturae 654(International workshop on models for plant growth and controlof product quality in horticultural production關(guān)于用 于園藝生產(chǎn)中的植物生長(zhǎng)和產(chǎn)品質(zhì)量控制的模型的國(guó)際專題討論))和Heuvelink(2005 ; ISHS Acta Horticulturae 691 (InternationalConference on sustainable greenhouse systems (關(guān)于持久性溫度系統(tǒng)的國(guó)際會(huì)議)-greensys 2004 ;43-50)模擬了在花團(tuán)之間具 有兩片葉子而不是常規(guī)的三片葉子的番茄品種將同化作用轉(zhuǎn)向果實(shí)，從而導(dǎo)致維持葉面積 指數(shù)(LAI)時(shí)的較高產(chǎn)量。他們通過(guò)摘除每個(gè)第二片葉子并且將LAI保持在3以上來(lái)驗(yàn)證 了模擬數(shù)據(jù)。如模擬的那樣，產(chǎn)量大致提高了 10%。 在花團(tuán)之間具有2片葉子的栽培品種不是已知的，然而，存在在花團(tuán)之間具有2 片葉子，即具有合軸指數(shù)=2(spi = 2)的野牛番茄親緣棺物，例如Sola皿m neorickii、 Sola皿m chmielewskii、 Sola皿mchilense、 SolMium peruviMium禾口 Sola皿m pe皿ellii。 在與S.加nellii種間雜交的Fl雜種的栽培型番茄中，合軸指數(shù)為2的特性相對(duì)于合軸指 數(shù)為3是隱性的(P皿eli等，1998，出處同上)。然而，鄧1 = 2的遺傳基礎(chǔ)到目前為止是未 知的。 隨著世界人口持續(xù)增長(zhǎng)，對(duì)于新鮮蔬菜，諸如番茄的需求也不斷全球性增長(zhǎng)。因
此，對(duì)于提高蔬菜植物，諸如番茄的產(chǎn)量的手段和方法存在著持續(xù)需求。 本發(fā)明的目的在于提供提高茄科植物的作物產(chǎn)量的新手段和方法。 特別地，本發(fā)明的目的在于提供提高番茄(S. ly障rsi固)的作物產(chǎn)量的新手
段和方法。 該目的是通過(guò)提供SP3D啟動(dòng)子序列來(lái)實(shí)現(xiàn)的，該序列能夠指導(dǎo)可操作地連接所 述啟動(dòng)子序列的下游SP3D基因的轉(zhuǎn)錄，其中該啟動(dòng)子序列源自合軸指數(shù)為2的茄科物種， 用于降低合軸指數(shù)為3或更高的植物的合軸指數(shù)。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子序列包含在所述SP3D基因的起始密碼子上游的 位置62-61核苷酸(即在位置-62和-61核苷酸處)的CA基序。 在導(dǎo)致本發(fā)明的研究中，鑒定了引起spi = 2的CETS基因家族的新基因。因此， 證明了含有來(lái)自染色體3的S.pe皿ellii La716插入片段的基因滲入系49015-2呈現(xiàn)出2 的合軸指數(shù)?；趫D譜定位和表型，得出結(jié)論來(lái)自系49015-2的spi = 2的特性是由標(biāo)示 為"SP3Dpen"的來(lái)自S. pennellii的SP3D基因引起的。 根據(jù)本發(fā)明，隨后發(fā)現(xiàn)了 spi = 2的特性不是由基因自身引起的，而是由于基因通 過(guò)所述啟動(dòng)子的調(diào)控所引起的。特別地，證明了 2的合軸指數(shù)與SP3D基因起始密碼子的啟 動(dòng)子序列62-61核苷酸上游的CA基序相關(guān)，即，在位置-62上的核苷酸是C，位置-61上的 核苷酸是A。 如上所述，在番茄(S. ly障rsi固)的合軸枝條中，營(yíng)養(yǎng)階段和生殖階段有規(guī)律 地交替。常規(guī)地，初生莖在產(chǎn)生8-10片葉子后長(zhǎng)出，然后從最上端側(cè)面(腋生)繼續(xù)生長(zhǎng)， 但是位于花序以下。然后該枝條通常在結(jié)束而依此開始另一個(gè)花期之前長(zhǎng)出另外3片葉 子，依此類推。因此，該枝條主要由大量重復(fù)的合軸單位組成，每個(gè)單位由3個(gè)生長(zhǎng)節(jié)點(diǎn)和 一個(gè)頂生花序組成，將其稱為具有3的合軸指數(shù)(spi = 3)。
根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了通過(guò)引入到與具有合軸指數(shù)為3或更高的茄科植物中的 SP3D基因可操作連接的上述啟動(dòng)子序列之一，得到的植物與不具有所述啟動(dòng)子的植物相比 具有降低的合軸指數(shù)。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，合軸指數(shù)降至合軸指數(shù)為2。因此，優(yōu)選，所得植物具有2的 合軸指數(shù)，即枝條主要由兩個(gè)生長(zhǎng)節(jié)點(diǎn)和一個(gè)頂端花序組成的合軸單位組成的植物。根據(jù) 本發(fā)明，"合軸指數(shù)為2"指的是在1. 6禾P 2. 5之間并且包括1. 6禾P 2. 5的平均合軸指數(shù)，更 優(yōu)選1. 7至2. 4，甚至更優(yōu)選1. 8至2. 3，最優(yōu)選1. 9至2. 2。 根據(jù)本發(fā)明，因此發(fā)現(xiàn)了將啟動(dòng)子序列可操作地連接SP3D基因時(shí)，其導(dǎo)致了植物 中增加的作物產(chǎn)量。因此，例如，具有從3降至2的合軸指數(shù)的植物大部分在花團(tuán)之間具有 2片葉子而非3個(gè)，使得與spi = 3的相似物相比，合軸短了大概1/3，這將導(dǎo)致每單位植物 長(zhǎng)度的花團(tuán)數(shù)量的增加。此外，連續(xù)的花團(tuán)在時(shí)間上出現(xiàn)的更早，因此還能獲得每時(shí)間單位 的花團(tuán)數(shù)量的增加。而且，發(fā)現(xiàn)了啟動(dòng)子序列可以導(dǎo)致增加的作物產(chǎn)量而沒(méi)有SP9Dpen的 半有限型生長(zhǎng)習(xí)性。 此外，當(dāng)將啟動(dòng)子可操作地連接SP3D基因時(shí)，其產(chǎn)生幾個(gè)其他的有益性狀，如在
6-8片葉子之后，而不是大約10片葉子之后第一個(gè)花團(tuán)的產(chǎn)生。此外，在這些植物中每花團(tuán)
上可以保持更多的果實(shí)(大概每個(gè)花團(tuán)上多于一個(gè)果實(shí))。這些特征導(dǎo)致每米或每時(shí)間單
位的果實(shí)串?dāng)?shù)量的增加和/或每串果實(shí)數(shù)量的增加，從而獲得更高的作物產(chǎn)量。 根據(jù)本發(fā)明值得注意的是，術(shù)語(yǔ)"作物產(chǎn)量"被定義為每米植物的枝條和分枝，或
每單位時(shí)間(從作物開始栽種至作物死亡或生長(zhǎng)季節(jié)結(jié)束，例如以月表示)的產(chǎn)品(例如，
果實(shí)，如，番茄)量(例如以kg表示)。含有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的植物的作物產(chǎn)量的提高指
的是與不含有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的相同植物的作物產(chǎn)量相比的作物產(chǎn)量提高。 在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列源自茄科物種，其選自Solan咖
。e皿ellii、 Sola皿m neorickii、 Sola皿m chmielewskii、 Sola皿m chilense禾口 Sola皿m
。eruviMium。 在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列包含與SEQ IDN0 :1的核苷酸1 至624具有至少75%同一性的核苷酸序列(圖2) 根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，啟動(dòng)子序列包含與SEQ ID N0 :1的核苷酸1至 624具有至少85 % ，更優(yōu)選至少90 % ，更優(yōu)選至少95 % ，最優(yōu)選至少99 %同一性的核苷酸序 列。 根據(jù)本發(fā)明，措詞"具有X%同一性的核苷酸序列"指的是如下的核苷酸序列該 核苷酸序列XX的核苷酸與SEQ ID NO :1的特定核苷酸序列(即，核苷酸1至624)相同。 因此，這可以包括具有624個(gè)核苷酸相同數(shù)量的核苷酸序列，但是其中XX的核苷酸與所述 SEQ ID NO :1的核苷酸l-624，和/或SEQ ID NO :1所述部分的片段相比是不同的，其包含 XX的原始核苷酸，(混合形式也是可能的)。應(yīng)當(dāng)理解，在所有情況下，應(yīng)當(dāng)存在CA基序， 并且啟動(dòng)子應(yīng)當(dāng)具有啟動(dòng)子活性。 在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列源自S. Pe皿ellii，并且由SEQ ID NO :1的
核苷酸1至624的核苷酸序列組成。 因此，根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有可操作地連接SP3D基因的如上所述的本發(fā)明的 啟動(dòng)子序列的茄科植物，特別是番茄，與不含有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的相同植物相比，在每米枝條和分枝和/或每時(shí)間單位上產(chǎn)出更多kg的果實(shí)。 Lifschitz等(PNAS 103， 6398-6403， 2006)之前報(bào)道了 SP3D基因是sft (單花花 團(tuán))番茄突變的原因基因。Sft突變植物開花晚，每個(gè)花序的花數(shù)量減少(每個(gè)花團(tuán)1或2 朵花)，并且具有無(wú)限花序。顯示了單花花團(tuán)(sft)突變是由于SP3D基因突變?cè)斐傻?。顯 示了在組成型35S啟動(dòng)子控制下高度表達(dá)SFT的植物保持合軸生長(zhǎng)模式，但是具有為2的 合軸指數(shù)而不是3。 35S :SFT根狀莖上的sft突變幼芽的嫁接可以拯救野生型的表型(包 括spi 二3)，證明了SP3D/SFT通過(guò)系統(tǒng)信號(hào)介導(dǎo)了其功能。根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子序列及其 對(duì)合軸指數(shù)的影響，以及因此對(duì)茄科植物，尤其是番茄的作物產(chǎn)量的影響已經(jīng)被Lifschitz 等公開。 可以引入本發(fā)明的啟動(dòng)子序列，與任何活性SP 3D基因可操作地連接。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，SP3D基因包含與SEQ ID NO :1的核苷酸625至7307具有 至少75%同一性的基因組核苷酸序列。優(yōu)選，序列同一性為85% ，更優(yōu)選90% ，甚至更優(yōu)選 95%，最優(yōu)選99%。本發(fā)明還涉及這些SP3D基因本身。 在特別優(yōu)詵的實(shí)施方案中，SP3D某因是S.De皿ellii的SP3D基因，SP3Dpen，其具 有由SEQ ID NO :1的核苷酸625至7307構(gòu)成的基因組核苷酸序列。 本發(fā)明還涉及基因構(gòu)建體，包含上述啟動(dòng)子序列和源自上述SP3D基因的cDNA序 列。例如，可以使用已知的分子生物技術(shù)將該基因構(gòu)建體引入植物中，以提供具有降低的合 軸指數(shù)的茄科，優(yōu)選地番茄的遺傳修飾植物。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，cDNA序列包含與圖3中所示的SP3Dpen的cDNA序列具有 至少75%同一性的核苷酸序列。優(yōu)選，序列同一性為85% ，更優(yōu)選90% ，甚至更優(yōu)選95% ， 最優(yōu)選99%。 在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，cDNA序列由圖3中所示的核苷酸序列組成。 本發(fā)明還涉及提供具有降低的合軸指數(shù)的茄科植物的方法，包括將如上所述的啟
動(dòng)子序列引入到具有3或更高合軸指數(shù)的茄科植物的基因組中，該啟動(dòng)子序列與下游SP3D
基因可操作地連接，或?qū)⑷缟纤龅幕驑?gòu)建體引入到所述植物中，使得所得到的植物與
沒(méi)有所述啟動(dòng)子序列的所述植物相比，具有降低的合軸指數(shù)。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，合軸指數(shù)降至合軸指數(shù)為2。 本發(fā)明還涉及提高合軸指數(shù)為3或更高的茄科植物的作物產(chǎn)量的方法，包括將如 上所述的啟動(dòng)子序列引入到具有3或更高合軸指數(shù)的茄科植物的基因組中，該啟動(dòng)子序列 與下游SP3D基因可操作地連接，或?qū)⑷缟纤龅幕驑?gòu)建體引入到所述植物中。
在上述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述植物優(yōu)選選自S. habrochaites， S. cheesmaniae， S. pimpinellifolium和番茄，和/或從其產(chǎn)生的植物。在特別優(yōu)選的實(shí)施 方案中，該植物是番茄。術(shù)語(yǔ)"從其產(chǎn)生的植物"指的是，例如，源自兩個(gè)所選物種雜交的植 物，例如，源自S. habrochaites和番茄雜交的植物。 可以通過(guò)傳統(tǒng)育種技術(shù)的基因滲入，如以下所述的技術(shù)，或可替換地，通過(guò)使用本 領(lǐng)域技術(shù)人員公知的合適分子生物技術(shù)，將啟動(dòng)子序列和/或基因構(gòu)建體引入到這些植物 中。例如，可以通過(guò)轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔等來(lái)實(shí)現(xiàn)將啟動(dòng)子序列引入到植物細(xì)胞中，或?qū)?含有本發(fā)明的啟動(dòng)子序列和SP3D基因的cDNA序列的合適基因構(gòu)建體引入到植物細(xì)胞中。 使用土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化也是可能的。然后可以將細(xì)胞再生成完整植物。
根據(jù)本發(fā)明，顯示了通過(guò)將與SP3D基因可操作連接的本發(fā)明的啟動(dòng)子序列引入，或通過(guò)將本發(fā)明的基因構(gòu)建體引入到合軸指數(shù)通常為3或更高(例如合軸指數(shù)為3)的茄科物種中，現(xiàn)在可以獲得具有降低的合軸指數(shù)，優(yōu)選合軸指數(shù)為2的植物，這將導(dǎo)致作物產(chǎn)量的提高。 此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)就番茄(S. lyco節(jié)i固)而言，第一個(gè)花團(tuán)在6-8片葉子之后，而非大約10片葉子之后產(chǎn)生。此外，在這些植物中可以保持每個(gè)花團(tuán)更多的果實(shí)(大概每個(gè)花團(tuán)多于一個(gè)果實(shí))。因而，與不包含啟動(dòng)子序列的相同植物相比，可以獲得導(dǎo)致作物產(chǎn)量提高的植物。 可以引入本發(fā)明的啟動(dòng)子序列，與植物內(nèi)源性的SP3D基因(S卩，正常存在于所述植物中的SP3D基因)可操作地連接。在這種情況下，只引入啟動(dòng)子序列，即，通過(guò)本發(fā)明的啟動(dòng)子序列的選定的重組體替代內(nèi)源性啟動(dòng)子序列，選定的重組體與所述植物的內(nèi)源性SP3D基因可操作地連接。然而，也可能引入啟動(dòng)子和SP3D兩者，或根據(jù)如上所定義的本發(fā)明的基因構(gòu)建體。假使將啟動(dòng)子和SP3D基因一起引入到植物中，則兩者因而對(duì)所述植物都是內(nèi)源性的。 本發(fā)明還涉及通過(guò)所述方法可得到的茄科植物，并且其具有降低的合軸指數(shù)，優(yōu)選合軸指數(shù)為2，以及涉及從其產(chǎn)生的種子和其它植物部分，如植物細(xì)胞、器官和組織，例如根狀莖。番茄育種中的一般做法包括將番茄品種嫁接到抗病根狀莖上以控制土壤傳播疾病。根狀莖通常比非嫁接番茄更強(qiáng)健。嫁接可以例如在番茄X野生親緣雜種上的上胚軸上，第一片葉子之前進(jìn)行。 優(yōu)選，本發(fā)明的植物選自S. habrochaites， S. cheesmgmiae， S. pimpinellifoli咖和番茄，和/或從其產(chǎn)生的植物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該植物為番茄。
此外，本發(fā)明還涉及茄科植物，尤其是通常合軸指數(shù)為3或更高、在其基因組中含有如上所述的與SP3D基因可操作連接的啟動(dòng)子序列、并且因此具有降低的合軸指數(shù)、優(yōu)選合軸指數(shù)為2的植物。再者，SP3D基因?qū)τ谥参锟梢允莾?nèi)源性的或外源性的。本發(fā)明還涉及植物種子和/或源自所述植物的上述其它植物部分。 優(yōu)選，所述植物選自S. habrochaites， S. cheesmaniae， S. 。im。inellifolium禾口番
茄和/或由其衍生的植物。 優(yōu)選，所述植物為番茄。 通過(guò)以下的實(shí)施例和附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。

圖1顯示了用于篩選S.pe騰llii BAC庫(kù)和選擇植物的啟動(dòng)子序列。
圖2顯示了 SEQ ID N0 :1的核苷酸序列，即，包括啟動(dòng)子序列的SP3Dpen基因的基因組核苷酸序列(核苷酸1-624) 。 CA基序用粗體和下劃線標(biāo)出；灰色框以及雙下劃線表示SP3D密碼子，小寫體表示與番茄相比，CDS中的SNP。 圖3顯示了SP3Desc cDNA及其氨基酸翻譯(即源自番茄(也稱為L(zhǎng). esculentum))與SP3Dpen cDNA及其氨基酸翻譯的比對(duì)，這表明在編碼區(qū)中的4個(gè)核苷酸變化(灰色框)是同義的。 圖4顯示了核苷酸544-580的SP3Dpen啟動(dòng)子片段與其它茄科野生親緣的比對(duì)，
表明了用箭頭指出的CT或TA基序與spi = 3關(guān)聯(lián)，CA基序與spi = 2關(guān)聯(lián)。 圖5顯示了 SP3Dpen啟動(dòng)子區(qū)域1_624與其它茄科野生親緣的DNA序列比對(duì)，表明了 CA基序的多態(tài)上游和下游與spi = 2或spi = 3的特性無(wú)關(guān)?；疑珫疟硎?lt; 49%的 匹配。 圖6是具有或不具有SP3D基因的F1雜種的育種方案。黑色框中的名字是 SP3Dpen，白色框中的是SP3Desc，灰色框中的是雜合的。 圖7是一個(gè)表格，其中比較了純合的和雜合的Fl雜種的表型。以4株植物的平均 結(jié)果給出結(jié)果。15751是本發(fā)明的番茄植物，其包含本發(fā)明的啟動(dòng)子，與純合形式的SP 3D 基因可操作地連接，15753是本發(fā)明的番茄植物，其包含雜合形式的啟動(dòng)子/SP3D基因。清 楚純合的和雜合的植物與植物15769相比都具有降低的合軸指數(shù)，植物15769是常規(guī)的不 含有本發(fā)明啟動(dòng)子/SP3D基因遺傳組成的番茄植物。SPI是合軸指數(shù)。#果實(shí)是收獲的果 實(shí)總數(shù)，#花團(tuán)是在試驗(yàn)期間(即總共4個(gè)月)形成的花團(tuán)總數(shù)，"#葉片l花團(tuán)"是第一個(gè) 花團(tuán)之前葉片的總數(shù)。
實(shí)施例 實(shí)施例1 SP3Doen的克降和分離 SP3D Sola誦esculent咖基因(登錄號(hào)AY186735)被用于克隆Solan咖 oennelii la716基因。用引物SP3D-f2/SP3D-r篩詵S. oenneliiBAC文庫(kù)92 。C 30 〃 ， 60°C 30〃 ，72°C 60〃 ， 40個(gè)循環(huán)，從而獲得帶有SP 3Dpen的BAC52， lc06el1(圖1)
隨后，用BamHI/Spel對(duì)BAC51， lc06el1進(jìn)行雙重消化，并在pUC18Xbal/BamHI雙 重消化物中連接，以產(chǎn)生亞克隆體。隨后，用SP3D-f2/SP3D-r標(biāo)記物對(duì)亞克隆體進(jìn)行篩選 以鑒定帶有SP3Dpen的單個(gè)克隆。將克隆KEZ504進(jìn)行測(cè)序，并且其含有來(lái)自S.pe騰llii 的完整SP3D基因/基因座，標(biāo)示為SP3Dpen，SEQ ID N0:l(圖2)。番茄SP3D cDNA，登錄號(hào) AY186735與S. pennellii SP3D cDNA的比較顯示，SP3Dpen具有4個(gè)核苷酸變化。兩個(gè)單 核苷酸多態(tài)性(SNP)位于第一個(gè)外顯子中的位置15 (T => C)和120(C => T)上，第三個(gè) SNP位于第二個(gè)外顯子中的位置270 (C => T)上，第四個(gè)SNP位于第四個(gè)外顯子中的位置 387(G=>A)上，參見(jiàn)圖3。所有這些SNP都是同義的。因此可以推定，spi = 2的特性不
是由基因自身引起的而是由于基因的調(diào)控引起的。
實(shí)施例2 啟動(dòng)子中的因果SNP，野生親緣植物 茄屬物種的決定性因素之一是合軸指數(shù)。在花團(tuán)之間具有兩片葉子的物種 (spi = 2)是Sola皿m neorickii， So 1 a皿m chmie 1 ewskii， Sola皿m chilense， Sola皿m peruvia誦禾卩Sola誦pe騰llii。在花團(tuán)之間具有三片葉子的物禾中(spi = 3)是 S. habrochaites， S. cheesmaniae， S. pimpinellifolium禾口番燕。 為了驗(yàn)證spi = 2是由基因上游的變化引起的假設(shè)，對(duì)若干野生親緣植物進(jìn)行 了研究。使用引物SP3D-10fa和dSP3D-rl對(duì)所述物種的53個(gè)野生親緣植物重新測(cè)序。 在53個(gè)野生親緣植物組中，ll個(gè)代表S. cheesmaniae，2個(gè)代表S. chilense， 7個(gè)代表 S. habrochaites， 10個(gè)代表S. neorickii， 1個(gè)代表S. 。e皿ellii， 7個(gè)代表S. 。eruviMium， 11個(gè)代表S. chmielewskii， 1個(gè)代表番茄和3個(gè)代表S. pimpinellifolium。
序列比較顯示了在所有spi = 2的親緣植物中基因起始上游的CA基序62-61核苷酸，spi 二3的物種呈現(xiàn)出CT或TA核苷酸基序，參見(jiàn)圖4。然而，CA基序上游和下游的 多樣性與合軸指數(shù)無(wú)關(guān)(參見(jiàn)附圖5)。
實(shí)施例3 具有或不具有SP3Doen的Fl雜種的表型 將帶有來(lái)自S. oennellii la716的SP3Dpen的基因基因滲入系49015-2與Enza Zaden番茄系0T1464和0T1690進(jìn)行雜交。所得的Fl雜種與0T1464進(jìn)行回交，或者在 0T1690雜交的情形下進(jìn)行自交。用dCAPS標(biāo)記物dSP3D-lfr選擇具有SP3Dpen的植物；引 物dSP3D-f/dSP3D-r， PCR條件92。C 30 〃 ， 55 。C 60 〃和72 。C 60 〃 40個(gè)循環(huán)，用HpyCH4V消 化，在3% ms-8瓊脂糖(Hispanagar)上分離。除了 dSP3D-lfr標(biāo)記物外，標(biāo)記物輔助回交 已經(jīng)用于鑒定最高的回歸親本，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，這將得到0T1464背景的 植物NT05-96cll，和用于0T1690背景的NT05-108h10和NT05-108e12。這些單體植物經(jīng)過(guò) 2次自交，再次用dSP3D標(biāo)記物并且通過(guò)標(biāo)記物輔助回交進(jìn)行選擇，獲得0T1464背景的植物 111B6和0T1690背景的植物117F1和117G1 。此后，通過(guò)雜交制得Fl雜種，通過(guò)111B6xl 11F1 獲得15751 (純合的SP 3Dpen) 、111B6xll7Gl獲得15753 (雜合的)、0T1690x0T1464獲得 15769，作為SP3Desc純合對(duì)照，參見(jiàn)圖6。 在2006年6月-2006年10月底期間，在常規(guī)栽培實(shí)踐下在溫室中栽培每個(gè)變種 的4株植物，并且通過(guò)計(jì)算連續(xù)花團(tuán)之間的葉片數(shù)、第一個(gè)花團(tuán)之前的葉片數(shù)、平均果實(shí)重 量、產(chǎn)量、果實(shí)和花團(tuán)數(shù)來(lái)評(píng)估合軸指數(shù)。SP3Dpen的平均合軸指數(shù)為2. 4，雜合植物為2. 5， SP3Desc為2. 7(圖7)。如預(yù)期的那樣，第一個(gè)花團(tuán)之前的葉片數(shù)已經(jīng)改變并且從Sp3Desc 的7. 5降至Sp3Dpen和雜合雜種的5. 8。雜種間的平均果實(shí)重量相似，為57至59g/每個(gè)果 實(shí)。如預(yù)期的那樣，花團(tuán)的數(shù)量增加了，從SP3Desc的9增至SP3Dpen的14。每個(gè)花團(tuán)的果 實(shí)數(shù)從SP3Desc的6. 7增至SP3Dpen的7. 6。在該生長(zhǎng)期期間，純合的SP3Dpen Fl雜種的 總產(chǎn)量大概增加了O. 7kg。 這些數(shù)據(jù)顯示與不含有本發(fā)明的啟動(dòng)子序列的植物相比，含有所述啟動(dòng)子序列的 植物在5個(gè)月以后觀察到總產(chǎn)量的提高，這歸因于花團(tuán)數(shù)量的增力n，以及在純合的SP3Dpen 的情況下，還歸因于每個(gè)花團(tuán)的果實(shí)數(shù)量的增加。因此，每個(gè)雜種的4株植物的總產(chǎn)量分別 從SP3Desc的3. 5kg增至SP3Desc/pen的5. Okg和SP3Dpen的6. Okg。
借助于SP3Dpen的產(chǎn)量提高歸因于SP3Dpen的啟動(dòng)子序列，其包含基因起始上游 的CA基序62-61核苷酸。
權(quán)利要求
SP3D啟動(dòng)子序列，其能夠指導(dǎo)可操作地連接所述啟動(dòng)子序列的下游SP3D基因的轉(zhuǎn)錄，其中該啟動(dòng)子序列源自合軸指數(shù)為2的茄科(Solanaceae)物種，用于降低合軸指數(shù)為3或更高的植物的合軸指數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的啟動(dòng)子序列，其中所述啟動(dòng)子序列包含在所述SP3D基因起始密碼 子上游的位置62-61核苷酸的CA基序。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動(dòng)子序列，其中所述啟動(dòng)子序列源自茄科物種，選自 Sola皿m pe皿ellii， Sola皿m neorickii， Sola皿mchmielewskii， Sola皿m chilense禾口 SolMium peruviMium。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的啟動(dòng)子序列，其中所述啟動(dòng)子序列包含與SEQ ID N0:1(圖 2)的核苷酸1至624具有至少75%同一性的核苷酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的啟動(dòng)子序列，包含與SEQ ID NO :1的核苷酸1至624具有至少 85%同一性的核苷酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的啟動(dòng)子序列，包含與SEQ ID NO :1的核苷酸1至624具有至少 90%同一性的核苷酸序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的啟動(dòng)子序列，包含與SEQ ID NO :1的核苷酸1至624具有至少 95%同一性的核苷酸序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的啟動(dòng)子序列，包含與SEQ ID NO :1的核苷酸1至624具有至少 99%同一性的核苷酸序列。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的啟動(dòng)子序列，其中所述啟動(dòng)子序列源自S.pe騰llii并 且由SEQ ID NO :1的核苷酸1至624的核苷酸序列構(gòu)成。
10. 含有根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的啟動(dòng)子序列和源自植物SP3D基因的cDNA序列的 基因構(gòu)建體。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的基因構(gòu)建體，其中cDNA序列包含與圖3中所示的SP3Dpen的 cDNA序列具有至少75%同一性的核苷酸序列。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的基因構(gòu)建體，其中cDNA序列包含與圖3中所示的SP3Dpen的 cDNA序列具有至少85%同一性的核苷酸序列。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的基因構(gòu)建體，其中cDNA序列包含與圖3中所示的SP3Dpen的 cDNA序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的基因構(gòu)建體，其中cDNA序列包含與圖3中所示的SP3Dpen的 cDNA序列具有至少95%同一性的核苷酸序列。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的基因構(gòu)建體，其中cDNA序列包含與圖3中所示的SP3Dpen的 cDNA序列具有至少99%同一性的核苷酸序列。
16. 根據(jù)權(quán)利要求10至15任一項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其中cDNA序列由圖3中所示的核苷 酸序列構(gòu)成。
17. 提供合軸指數(shù)降低的茄科植物的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求l-8任一項(xiàng)的與下游 SP3D基因可操作連接的啟動(dòng)子序列引入到所述植物的基因組中，或?qū)⒏鶕?jù)權(quán)利要求9至15 任一項(xiàng)的基因構(gòu)建體引入到所述植物中，使得與不具有所述啟動(dòng)子序列或基因構(gòu)建體的植 物相比，具有啟動(dòng)子序列或基因構(gòu)建體的植物的合軸指數(shù)得到降低。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中合軸指數(shù)降至合軸指數(shù)為2。
19. 提高合軸指數(shù)為3或更高的茄科植物的作物產(chǎn)量的方法，包括將與下游SP3D基因 可操作連接的如上所述的啟動(dòng)子序列引入到所述植物的基因組中，或?qū)?quán)利要求9-15任 一項(xiàng)的基因構(gòu)建體引入到所述植物中。
20. 根據(jù)權(quán)利要求17、 18或19的方法，其中所述植物選自S. habrochaites, S. cheesmaniae， S. pimpinellifolium禾口番茄(Slycopersicum)禾口 /或從其產(chǎn)生白勺禾直凈勿。
21. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述植物為番茄。
22. 根據(jù)權(quán)利要求17-21任一項(xiàng)的方法可得到的植物。
23. 源自根據(jù)權(quán)利要求22的植物的種子或其他植物部分。
24. 茄科植物，其基因組中包含與SP3D基因可操作連接的根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的 啟動(dòng)子序列，其中與不具有所述啟動(dòng)子序列的相同植物相比，所述植物具有降低的合軸指 數(shù)。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24的植物，其中所述植物選自S. habrochaites, S. cheesmaniae, S.Diiroinellifolium和番茄和/或從其產(chǎn)生的植物。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25的植物，其中所述植物為番茄。
27. 根據(jù)權(quán)利要求24、25或26的植物，具有2的合軸指數(shù)。
28. 源自根據(jù)權(quán)利要求24-27任一項(xiàng)的植物的種子和/或其他植物部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種SP3D啟動(dòng)子序列，其能夠指導(dǎo)可操作地連接所述啟動(dòng)子序列的下游SP3D基因的轉(zhuǎn)錄，其中該啟動(dòng)子序列源自合軸指數(shù)為2的茄科物種，用于降低合軸指數(shù)為3或更高的植物的合軸指數(shù)。本發(fā)明還涉及提供合軸指數(shù)降低的茄科植物，尤其是番茄的方法，包括將與下游SP3D基因可操作連接的根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)啟動(dòng)子序列引入到所述植物的基因組中，或?qū)⒏鶕?jù)權(quán)利要求9至15任一項(xiàng)的基因構(gòu)建體引入到所述植物中，使得與不具有所述啟動(dòng)子序列或基因構(gòu)建體的植物相比，具有啟動(dòng)子序列或基因構(gòu)建體的植物的合軸指數(shù)得到降低，還涉及通過(guò)所述方法可得到的植物。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101755052SQ200780053784
公開日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2007年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月10日
發(fā)明者F·赫拉爾, J·J·M·拉姆巴爾克, J·W·G·赫爾登斯, M·P·范斯蒂, M·伊柯瑪 申請(qǐng)人:安莎種子公司