專利名稱：：具有改善的表達(dá)和穩(wěn)定性的dna質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：總的來說，本發(fā)明涉及DNA疫苗和使用其的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及可用于DNA疫苗的具有改善的表達(dá)和穩(wěn)定性的DNA質(zhì)粒。
背景技術(shù)：
：DNA疫苗也稱為基因、質(zhì)?；蚨嗪塑账嵋呙纾砝没蜣D(zhuǎn)移用于針對(duì)抗原免疫接種的相對(duì)簡單和經(jīng)濟(jì)的方法。與DNA疫苗相關(guān)的低毒性有利于它的進(jìn)一步開發(fā)，但如果要將它成功地整合到臨床環(huán)境內(nèi)，那么需要改善這種方法的效力的另外策略(由Shaw和Strong，F(xiàn)rontBiosci.2006Jan1；11:1189-98綜述)。DNA疫苗接種可以克服常規(guī)疫苗策略的大多數(shù)缺點(diǎn)，并且具有用于未來疫苗的潛力。然而，商業(yè)產(chǎn)品仍未到達(dá)市場(chǎng)。一個(gè)可能的解釋可以是該技術(shù)無法在人中誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，但安全性也可能是基本問題(由Glenting和Wessels,MicrobCellFact.2005Sep6；426綜述)。pVR1020或1012質(zhì)粒(VICALInc.；LukeC.等人，JournaloflnfectiousDiseases,1997，175，91-97；HartikkaJ.等人，HumanGeneTherapy,1996，7，1205-1217，參見例如，美國專利號(hào)5,846,946；6,451,769；6,586,409和6,875,748)是利用多核苷酸序列插入的DNA質(zhì)粒載體。pVR1020質(zhì)粒衍生自pVR1012，并且包含人tPA信號(hào)序列。另外的DNA質(zhì)粒在例如美國專利號(hào)6,852,705；6,818,628；6,586,412；6,576,243；6,558,674；6,464,984；6,451,770；6,376,473和6,221,362中發(fā)現(xiàn)。然而，關(guān)于基于pVR1012的質(zhì)粒用于DNA疫苗接種存在缺點(diǎn)，例如質(zhì)粒不穩(wěn)定性和拷貝數(shù)異質(zhì)性。因此，需要有效的DNA疫苗，特別是就目的靶抗原、表位、免疫原、肽或多肽以足以引發(fā)保護(hù)應(yīng)答的量表達(dá)而言。本申請(qǐng)中任何文件的引用或鑒定并非承認(rèn)此種文件可用作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于下述實(shí)驗(yàn)觀察如預(yù)期的，在卡那霉素抗性基因啟動(dòng)子和翻譯起始之間插入轉(zhuǎn)座子取消卡那霉素抗性，并且出乎意料地，使得能夠高速率的質(zhì)粒復(fù)制。換言之，突變型(包含轉(zhuǎn)座子)的質(zhì)粒產(chǎn)率比親本質(zhì)粒產(chǎn)率高3倍。因此，假設(shè)卡那霉素抗性(“KanaR”)基因的表達(dá)效率對(duì)細(xì)菌中的質(zhì)粒復(fù)制有影響，即減少的卡那霉素抗性表達(dá)導(dǎo)致增加的質(zhì)粒復(fù)制率。特別地，高KanaR表達(dá)率可能代表強(qiáng)代謝負(fù)荷，這干擾最佳質(zhì)粒復(fù)制率和/或KanaR基因轉(zhuǎn)錄干擾復(fù)制起點(diǎn)(ORI)。本發(fā)明涉及可以包含卡那霉素抗性(“KanaR”)基因的DNA質(zhì)粒，其中卡那霉素抗性基因包含對(duì)于KanaR表達(dá)較不有效的啟動(dòng)子和/或較不有效的起始密碼子。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，KanaR啟動(dòng)子是Pl啟動(dòng)子。所得到的DNA質(zhì)粒導(dǎo)致更高的質(zhì)粒產(chǎn)率和更高的質(zhì)粒穩(wěn)定性，推測(cè)是由于減少的KanaR表達(dá)。有利地，DNA質(zhì)粒可以是pLLlO或pLL14。本發(fā)明還涉及可以包含卡那霉素抗性基因的DNA質(zhì)粒，其中將轉(zhuǎn)座子插入在KanaR啟動(dòng)子和翻譯起始之間，從而導(dǎo)致減少的KanaR表達(dá)。所得到的DNA質(zhì)粒導(dǎo)致更高的質(zhì)粒產(chǎn)率和更高的質(zhì)粒穩(wěn)定性，推測(cè)是由于減少的KanaR表達(dá)。本發(fā)明包含用于遞送和表達(dá)目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽的制劑，其中制劑可以包含本文公開的任何DNA質(zhì)粒和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、媒介物或賦形劑。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，載體、媒介物或賦形劑可以促進(jìn)載體或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)染和/或改善載體或蛋白質(zhì)的保存。有利地，目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽可以衍生自禽類、牛、犬、馬、貓或豬病毒或病原體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在動(dòng)物中刺激免疫應(yīng)答的方法，其可以包括給動(dòng)物的細(xì)胞施用有效量的本文公開的制劑，并且在細(xì)胞中表達(dá)目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽。本發(fā)明還提供了在動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，其可以包括給動(dòng)物的細(xì)胞施用有效量的本文公開的制劑，并且在細(xì)胞中表達(dá)目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽。有利地，動(dòng)物可以是禽類、牛、犬、馬、貓或豬。本發(fā)明還包含用于執(zhí)行上文描述的任何一種方法的試劑盒，其可以包含本文公開的DNA質(zhì)?；蛑苿┘由嫌糜趫?zhí)行在動(dòng)物中刺激或引發(fā)免疫應(yīng)答的方法的說明書。應(yīng)當(dāng)指出在本公開內(nèi)容且特別是權(quán)利要求和/或段落中，術(shù)語例如“包含”等可以具有在美國專利法中已歸于其的含義；例如，它們可以意指“包括”等；并且術(shù)語例如“基本上由......組成”具有在美國專利法中已歸于其的含義，例如，它們?cè)试S未明確描述的元件，但排除在現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)或影響本發(fā)明的基本或新型特征的元件。這些和其他實(shí)施方案在下述詳述中公開或由于下述詳述是顯而易見的，并且由下述詳述包含。附圖簡述給出作為例子但不意欲使本發(fā)明僅限制于所述具體實(shí)施方案的下述詳述與附圖結(jié)合可以最好地理解，其中圖1描述了如實(shí)施例1中鑒定的KanaR表達(dá)盒的3種潛在啟動(dòng)子Pl(SEQIDNO1)、P2(SEQIDNO2)和P3(SEQIDNO3)。P2和P3部分重疊；圖2描述了pVR1012的示意圖，舉例說明了KanaR轉(zhuǎn)錄方向和復(fù)制起點(diǎn)ORI的位置；圖3舉例說明了實(shí)施例1中的質(zhì)粒pVR1012的KanaR盒如何被克隆到誘變載體ρALTER-I內(nèi)；圖4描述了實(shí)施例1中的PacI限制位點(diǎn)如何被引入KanaRORF下游，產(chǎn)生質(zhì)粒pLL2,SwaI限制位點(diǎn)被引入上游，RsrII限制位點(diǎn)被引入下游，產(chǎn)生pLL4，并且最后使翻譯起始密碼子ATG突變成TTG，產(chǎn)生pLL6；圖5描述了實(shí)施例1中的pLL4的經(jīng)突變的KanaR盒如何被克隆到質(zhì)粒pVR1012內(nèi)，產(chǎn)生pLL7;圖6描述了實(shí)施例1中鑒定的rmB終止序列如何通過PCR從pSB062被克隆到質(zhì)粒pLL7內(nèi)，和后續(xù)PacIRsrII消化，以形成pLL9；圖7描述了實(shí)施例1中鑒定的speA終止序列通過合成寡核苷酸的退火被克隆到質(zhì)粒pLL7內(nèi)，和PacIRsrII消化，以形成pLLl1；圖8描述了質(zhì)粒pLL6的經(jīng)突變的翻譯起始序列如何通過MscIPacI消化被克隆到pLL9內(nèi)，以形成pLLlO;圖9舉例說明了實(shí)施例1中鑒定的啟動(dòng)子序列P2/P3(SEQIDNO2-3)與Pl(SEQIDNO1)、Pl(SEQIDNO1)和P2/P3(SEQIDNO2-3)如何分別通過URS11-URS12PCR、URS13-URS12PCR和URSl1-URS14PCR被克?。粓D10描述了啟動(dòng)子序列P2/P3(SEQIDNO2-3)與Pl(SEQIDNO1)如何被克隆到質(zhì)粒pLL9內(nèi)，以形成pLL13；圖11描述了啟動(dòng)子序列Pl(SEQIDNO1)如何被克隆到質(zhì)粒pLL9內(nèi)，以形成pLL14；圖12描述了啟動(dòng)子序列P2/P3(SEQIDNO2-3)如何被克隆到質(zhì)粒pLL9內(nèi)，以形成pLL15；圖13描述了啟動(dòng)子序列Pl(SEQIDNO1)如何被克隆到質(zhì)粒pLL7內(nèi)，以形成pLL16；圖14描述了用實(shí)施例1中鑒定的各種合適的啟動(dòng)子和終止子產(chǎn)生的幾種pVR1012衍生物。pLL13、pLL14、pLL15和pLL16構(gòu)建體具有在CMV啟動(dòng)子和KanaPl(SEQIDNO1)啟動(dòng)子之間的192堿基對(duì)缺失；圖15描述了pVR1012衍生物的示意圖，舉例說明了實(shí)施例1的pLL13至pLL16構(gòu)建體中缺失的192堿基對(duì)區(qū)；圖16描述了根據(jù)實(shí)施例1，分別在50μ1和100μ1細(xì)菌懸浮液稀釋物下，細(xì)菌菌落抵抗?jié)u增的卡那霉素濃度能力的2個(gè)曲線圖；圖17描述了在實(shí)驗(yàn)室生長條件下獲得的質(zhì)粒產(chǎn)率的曲線圖。實(shí)施例1的細(xì)菌菌落在具有Kana100μg/ml的液體LB培養(yǎng)基中生長；圖18描述了表示為與pLL14質(zhì)粒產(chǎn)率的比的質(zhì)粒產(chǎn)率(基線=100)。實(shí)驗(yàn)1描述了8-15個(gè)克隆/構(gòu)建體，實(shí)驗(yàn)2描述了關(guān)于pVR1012的6個(gè)克隆，關(guān)于pLL14的2個(gè)克隆和關(guān)于pLL16的25個(gè)克隆，以及實(shí)驗(yàn)3(關(guān)于pVR1012、pPB662和pLL14的25個(gè)克隆，和關(guān)于pLL19的20個(gè)克隆)；圖19描述了在實(shí)驗(yàn)室生長條件下獲得的質(zhì)粒產(chǎn)率的曲線圖。細(xì)菌菌落在EGLI培養(yǎng)基中生長。質(zhì)粒產(chǎn)率表示為與PVR1012親本質(zhì)粒產(chǎn)率的比(基線=100)；和圖20描述了顯示克隆異質(zhì)性的個(gè)別質(zhì)粒產(chǎn)率(對(duì)pVR1012構(gòu)建體平均值的指數(shù))(*:突變質(zhì)粒)，并且描述了根據(jù)實(shí)施例1的3個(gè)不同構(gòu)建體EGLI適應(yīng)克隆中的質(zhì)粒產(chǎn)率的曲線圖。變異性表示為指數(shù)，其中第一個(gè)克隆視為100%參照。碰本發(fā)明部分基于下述實(shí)驗(yàn)觀察如預(yù)期的，在卡那霉素抗性基因啟動(dòng)子和翻譯起始之間插入轉(zhuǎn)座子取消卡那霉素抗性，并且出乎意料地，使得能夠高速率的質(zhì)粒復(fù)制。換言之，突變型(包含轉(zhuǎn)座子)的質(zhì)粒產(chǎn)率比親本質(zhì)粒產(chǎn)率高3倍。因此，假設(shè)卡那霉素抗性(“KanaR”)基因的表達(dá)效率對(duì)細(xì)菌中的質(zhì)粒復(fù)制有影響，即減少的卡那霉素抗性表達(dá)導(dǎo)致增加的質(zhì)粒復(fù)制率。特別地，在營養(yǎng)限制的背景下，高KanaR表達(dá)率可能代表強(qiáng)代謝負(fù)荷，這干擾最佳質(zhì)粒復(fù)制率和/或KanaR基因轉(zhuǎn)錄干擾復(fù)制起點(diǎn)(ORI)。本發(fā)明包含任何預(yù)期的DNA質(zhì)粒，其中與例如無減少的KanaR表達(dá)的pVR1012質(zhì)?；蚱溲苌锉容^，KanaR表達(dá)減少，從而導(dǎo)致增加的質(zhì)粒產(chǎn)率和更高的質(zhì)粒穩(wěn)定性。本發(fā)明涉及可以包含KanaR的DNA質(zhì)粒，其中卡那霉素抗性基因包含對(duì)于KanaR表達(dá)較不有效的啟動(dòng)子和/或較不有效的起始密碼子。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，KanaR啟動(dòng)子是Pl啟動(dòng)子，并且起始密碼子是ATG。推測(cè)是由于減少的KanaR表達(dá)，所得到的DNA質(zhì)粒導(dǎo)致更高的質(zhì)粒產(chǎn)率和更高的質(zhì)粒穩(wěn)定性。有利地，DNA質(zhì)粒可以是pLLlO或pLL14。本發(fā)明還涉及可以包含卡那霉素抗性基因的DNA質(zhì)粒，其中將轉(zhuǎn)座子插入在KanaR啟動(dòng)子和翻譯起始之間，從而導(dǎo)致減少的KanaR表達(dá)。所得到的DNA質(zhì)粒導(dǎo)致更高的質(zhì)粒產(chǎn)率和更高的質(zhì)粒穩(wěn)定性，推測(cè)是由于減少的KanaR表達(dá)。表達(dá)載體是質(zhì)粒載體或DNA質(zhì)粒載體，特別是體內(nèi)表達(dá)載體。在一個(gè)具體的非限制性例子中，DNA質(zhì)粒載體包含pVR1020或1012質(zhì)粒(VICALInc.；LukeC.等人，JournalofInfectiousDiseases,1997,175,91-97；HartikkaJ.等人，HumanGeneTherapy,1996，7，1205-1217，參見例如，美國專利號(hào)5,846,946；6,451,769；6,586,409和6,875,748)的元件。pVR1020質(zhì)粒衍生自pVR1012，并且包含人tPA信號(hào)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，人tPA信號(hào)包含在Genbank中在登記號(hào)HUMTPA14下的氨基酸M(I)到氨基酸S(23)。在另一個(gè)具體的非限制性例子中，用作載體用于插入多核苷酸序列的質(zhì)?？梢园贕enbank中在登記號(hào)U28070下的氨基酸M(24)到氨基酸A(48)。關(guān)于在實(shí)踐中可以參考或采用的DNA質(zhì)粒的另外信息見于例如美國專利號(hào)6,852,705；6,818,628；6,586,412；6,576,243；6,558,674；6,464,984；6,451,770；6,376,473禾口6,221,362。在另一個(gè)實(shí)施方案中，質(zhì)?？梢允蔷哂锌敲顾乜剐曰虻娜魏钨|(zhì)粒，包括但不限于Clontech載體LivingColorsρAcGFPULivingColorspAcGFPl-Cl、LivingColorspAcGFP卜Ni、ρAmCyanl-CUpAmCyan卜Ni、pAsRed2_Cl、pAsRed2-Nl、pCMV-DsRed-Express、pDsRed2_l、pDsRed2_Cl、pDsRed2_Nl、pDsRed-Express-1、pDsRed-Express~C1、pDsRed-Express-Nl、pDsRed-Monomer-C1、pDsRed-Monomer-Nl、pHcRedl-1、pHcRedl-Cl、pHcRedl-Nl/1、pIRES2_DsRed2、pIRES2-DsRed-Express>pLPS-AcGFPl-NAcceptor、ProteasomeSensor>ρTimer>pZsGreenl—1、pZsGreenl—Cl、pZsGreenl—Nl、pZsYellowl-Cl禾口pZsYellowl-NlVector;Invitrogen載體pCR3、pCR3.1_Uni、pCRlOOO和pZErO-2.1和StratagenepCMV_3Tag、pBK-CMVPhagemid、ZAPExpress>pCMV—Script、pCMV—Tag、PCR—ScriptpMClneo和pMCIneoPolyA載體。還參考美國專利號(hào)6,942,975、6,887,702、6,849,442、6,846,970、6,825,012,6,806,399,6,803,230,6,790,607,6,696,278,6,667,150,6,624,344,6,620,990,6,610,909,6,585,976,6,573,437,6,570,067,6,562,584,6,528,703,6,503,748,6,475,731,6,410,317,6,410,314,6,387,654,6,376,744,6,350,934,6,303:，383、6,297,，054、6,284,，541、6:，258:，999、6:，255:，560、6，248:，937、6:,235,，518、6,174,,708,6:，127:，171、6:，121:，511、,117,,651,,054,,635,6:，037,,524,’018:，103、5,994,,625、,98L,191,’981:，182、5,,977,,439,5,,925,,544,,910,,488,5,,866,,404、5,851,,808、5,,851,,804、5,,830,,727,5,,824,,877、5,,792,,935、,783,,394、5,,750,,871、5,733,,753、5,,733,,744、5,,731,,179、5,,723,,746、5,,716,,803、5,,712，,112、5,,705,,361、5,654,180、5,,599,,670、5,,591,,577、5:，589:，623、5:，569:，834、5，567:，599、5:,565,，347、5,504,,005,5:，463:，174、5:,460,，952、’436:，138、’416:，250、5:，416:，011、5:，378:，618、5,256,,568,’169:，755、’137:，829、,053,,335,,004,,863,4:，935,,340,4:,920,,054,4,795,855、^1,782,022,生,771,002、4,626,510和4,567:,146c本發(fā)明還包含具有除卡那霉素抗性外的其他抗生素抗性基因的質(zhì)粒，例如但不限于氨芐青霉素、氯霉素、新霉素和四環(huán)素抗性。在一個(gè)實(shí)施方案中，質(zhì)?？梢允蔷哂邪逼S青霉素抗性基因的任何質(zhì)粒，包括但不限于，Clontech載體LivingColorspAcGFPl、ρAmCyan>pAsRed2、pbetagal-Basic、pbetagal-Control、pBITet>pBI_GTet>pBI-LTet>pCMVbeta、pCMV-Myc&pCMV-HA、pDsRed2、pDsRed-Express、pDsRed-MonomerVector、pGFP、pGFPuv、pHcRedl、pIRES、pIRESbleo3、、pIRESneo3、pIRESpuro3、pLP-IRESneoAcceptor、pLP-LNCXAcceptor、pLP-TRE2Acceptor、、pPUR、pRevTet-Off、pRevTet-Off-IN、pRevTet-On、pSEAP2-Basic>pSEAP2-Control>ρTet-Off>ρTet-On>pTet-tTS、ρTimer>ρTimer-1>pTK-Hyg、pTRE2>pTRE2hyg>pTRE2hyg2-6xHN>pTRE2hyg2_HA、pTRE2hyg2_Myc、pTRE2pur>pTRE2pur_6xHN、pTRE2pur-HA>pTRE2pur_Myc、pTRE_6xHN、pTRE-HA、pTRE-Myc、pTRE-Tight、pTRE-Tight_DsRed2、pZsGreen禾口pZsYellow;Invitrogen載體p2Bac、p2Bac/CAT/CAT、pAc5.1/V5-His>pAc5.1/V5_His/LacZ、pBAD-TOPO、pBlueBac、pBlueBac/His、pBlueBac/His/CAT、pBlueBac2、pBlueBac3、pBlueBac4、pBlueBac4/CAT、pcDNAl/Amp>pcDNA3/CAT>pcDNAIKpCMVSportUpCMVSport2,pCMVSport2.2、pCMVSport4、pCR3、pCR3.1_Uni、pCRBac、pCRT7/CT_LacZ、pCRT7/CT-TOPO>pCRT7/NT_E3、pCRT7/NT_TOPO、pDW232、pFastBacl、pMEP4、pMT/LacZ、pMT/V5-His-TOPO>pPIC3、pPIC3K、pRBK、pSL301、pSPORTl-CAT、pYesTrp2-RalGDS禾口pYesTrp2_RalGDS禾口StratagenePCR—Script、pBCPhagemid>pMClneo禾口pMClneoPolyA、pBlueScriptIIPhagemid禾口SuperCosI載體。還參考美國專利號(hào)6,987,006、6,972,322、6,916,611、6,887,702、6,803,230、6,790,607、ι6,706,524、6,696:，278、6:，667:，150、6:,569,，678、6:，562:，584、6:，544:，782、,521,449、6,503，748、6,486,，134、6:,410,，317、6,410,，314、6，387:，654、6，376:，192、6:，291,238、6，255:，071、6,221:，630、6:，140:，087、6:，127:，171、6:，025,,193,6:，025,,192,,010，875、5,981,,279,5,981,,182,,955,,363,,925,,544、,919,,676,,912,,153,5,,894,，060、5，877,,400,5,866,,404、5,,851,,808,5,,834,,191、5,,830,,727、,830,,690、5,,786:，162、5，776,,773、5,773,,697、5,,766,,940、5,,733,,753、5,,731，,193、5,,716，,803、5,,705,,361,5:，691，,155、5,602,,300、5,,527,,691、5,,504,,005、5,,470,■729、5，436:，138、5:，434,065,5,432,，082、5,378,，618、5,，290，691、5,,264,，354、5,，256,，568、5,，256,，546、5,，160，489、5，151,，364、5,147,789,5,143,836,5,126,252,5,093,251,5,081,022,4,997,767,4,988,622,4,935,364,4,920,054,4,889,806,4,879,230,4,876,202,4,845,031,4,808,519,4,766,072、4,752,574、4,703,012、4,634,678、487,835、4,349,629和4,340,674。在另一個(gè)實(shí)施方案中，質(zhì)?？梢允蔷哂新让顾乜剐曰虻娜魏钨|(zhì)粒，包括但不限于，Clontech載體pDNR—LacZDonorReporter、pDNR-SEAPDonorReporter>pLP-AcGFPl-CAcceptor、pLP-BacPAK9Acceptor>pLP-BacPAK9-6xHNAcceptor>pLP-CMV-HAAcceptor、pLP-CMV-MycAcceptor、pLP-CMVneoAcceptor、pLP-GADT7ADAcceptor>pLP"GBKT7DNA-Acceptor>pLP-IRESneoAcceptor、pLP-LNCXAcceptor、pLP-PROTet-6xHNAcceptor、pLP-RevTREAcceptor、pLPS-AcGFPI-NAcceptor和pLP_TRE2Acceptor；Invitrogen載體pLysS和pSPORTl-CAT和StratagenepBCPhagemid禾ΠPCR-Script載體。還參考美國專利號(hào)6,916,611、6,900，010、6,887,702、6,884,，576、6,846,，671、6,803，230、6,696，278、6,673,，537、6,667:，150、6,562,，584、6，548:，246、6:，503:，748、6，436:，694、6，420:，110、6:，410:，317、6,410,,314,6:，391:，640、6:，387,,654、,376,,192,6:，331:，527、6:，309:，883、’309:，830、6,291,,211,’255:，071、,252,,140,6,,221,,630,6:，146,,871,6:，127,,171、,107,,093,6,083,,750、,03L,151、,025,,192、6,,001,,564、,994,,132、,994,,066、5,,981,,182、5,955,,363、5,,932,,479、5,,928，,891、5,,925,,544、5,,925，,523、5,,908,,747、5,,866,,404、5,851,■808、5,,821,,093、5,,766,,940、5,,733,,753、5,,728,,571、5,,716,,803、5,,707,,830、5,639,，644、5,，591，577、5，470,,729,5,，437,，988、5，434,，065、5，256,，568、5,，256,，546、5,053,335、5,004,863、4,868,111、4,839,284、4,752,574和4,711,849。在另一個(gè)實(shí)施方案中，質(zhì)?？梢允蔷哂行旅顾乜剐曰虻娜魏钨|(zhì)粒，包括但不限于，Clontech載體pRevTet-OffVector、pRevTet-Off-INVector、pIRES載體、pIRESbleo3Vector、pIREShyg3Vector、pIRESneo3Vector、pIRESpuro3Vector、pLP-IRESneoAcceptorVector>ρTet-OffVector>pTet—OnVector、pIRES2-DsRed-ExpressVector、pLXINRetroviralVector、pIRES2_DsRed2Vector、ProteasomeSensorVector、pLXSNRetroviralVector、pCMV-DsRed-ExpressVector、LivingColorspAcGFPI-C1Vector、ρAmCyanl-ClVector、pAsRed2_ClVector、pDsRed2_ClVector、pDsRed-Express-C1Vector、pDsRed-Monomer-ClVector、pHcRedl-ClVector、pZsGreenl-ClVector、pZsYellowl-ClVector、LivingColorspAcGFPlVector、pDsRed2-lVector>pDsRed-Express-1Vector>pHcRedl-1Vector>ρTimerVector>pZsGreenl-1Vector>pQCXIXRetroviralVector>LRCXRetroviralVectorSet、pLNCX2RetroviralVector、pLP-LNCXAcceptorVector、pQCXINRetroviralVector、LivingColorspAcGFPl-NlVector、pAmCyanl-NlVector、pAsRed2_NlVector、pDsRed2_NlVector、pDsRed-Express-NlVector、pDsRed-Monomer-NlVector、pHcRedl-Nl/1Vector、pLPS-AcGFPI-NAcceptorVector>pZsGreenl-NiVector、pZsYellowl-NiVector禾口VP16MinimalDomainVectorSet；Invitrogen載體pcDNAl/Neo、pcDNA3/CAT(替換為pcDNA3.1/CAT)、pCR3(替換為pCR3.1)、pCR3.1_Uni和pRc/CMV和StratagenepCMV-3TagVectors、pCMV-ScriptVector>SuperCosIVector>ZAPExpressVector>pCMV—TagVectors、pMClneo和pMClneoPolyAVectors、PCR-ScriptCloningKits>VitalityhrGFPMammalianExpressionVectors>pBK—CMVPhagemidVector和LambdaZAP-CMVVector。還參考美國專利號(hào)7,026,525、6,942,995、6,905,818,6,815,185、(3,806,399、6,787,,687,6:，747:，189、6:,673,，602、6:，673:，537、,667,,150,6:,624,，344、6，620:，990、6,440,,444、6:，429,,357,6:，391:，633、6:，376,,192,,316,,253、,294,,187,6:，291,,211,6,255,,560、,252,,140、,248,,937,,232,,526、6,,221，,630、6,,210,,930、,207,,879,6,194,,636、6,,114，,146、6,,096,,717,6,,071,，512、5，998:，144、5,985,，560、5,969,211、5,955:，363、5，955:，319、5，939,288、5，902，577、5:，894:，060、5:，891，634、5,830，698、5,807:，742、5:，750:，871、5,733,，779、5，665:，565、5:，639,,663,5:，614:，381、5，583:，278、5,470,,726,5:，463,,174,5:，416:，011、5:，352,,605,,278,,056、,256,,568,5:，149,,636,5,017,,478、4:,957,,865、4:,935,,340,4:,839,,284、4,,792,,520、4,,766,,066,4:,752,,574,4,740.,463、4.,663.,285、4.,536.,475,4.,513.,086、4.,513,,085、4.,503.,155、4.,468.,462、4,460,688、4,430,434和4,416,994。在另一個(gè)實(shí)施方案中，質(zhì)?？梢允蔷哂兴沫h(huán)素抗性基因的任何質(zhì)粒，包括但不限于，Clontech載體pRevTet-OffVector、pRevTet-OnVector、pRevTet-Off-INVector、Creator-CompatiblePROTet6xHNBacterialExpressionSystem、PROTet6xHNBacterialExpressionSystem、pTRE-TightVector>ρTet-OffVector>ρTet-OnVector>Tet-OffGeneExpressionSystem、Tet-OnGeneExpressionSystem、Adeno-XTet—OffExpressionSystem1、Adeno-XTet-OnExpressionSystem1、Adeno-XViralDNA(ΡΙ-SceI/I-CeuI消化的)、Creator-CompatibleRevTet—OffRetroviralGeneExpressionSystem>Creator-CompatibleRevTet-OnRetroviralGeneExpressionSystem、pLP-RevTREAcceptorVector>pRevTREVector、RevTet—OffSystem、RevTet-OnSystem、pBITetVector、pBI_GTetVector>pBI-LTetVector、pTet—tTSVector、pLP-TRE2AcceptorVector>pTRE2Vector、pTRE2hygVector、pTRE2purVector>TetSystemApprovedFBS、US-Sourced(Y照射的)、pTRE-Tight-DsRed2Vector和VP16MinimalDomainVectorSet和Invitrogen載體pTet-tTak禾口pTet-Splice。還參考美國專利號(hào)6,924,101、6,905,836、6,777,229、(3,759,236、6,699:，702、6:，699，692、,696，278、6:，680:，301、6:,673,，537、6:,667,，150、6，642:，052、6,620,，618、,613，528、’544:，782、6:，541,,003,6:,503.,748,6:，482,,636,6:，440,,741,6,436,,694,’410:，317、6,,392,,121、,376,,192、,309.,883、,303,,383、,265,,562、6,261,,807、6,,221,,630,6,,218,,181、6,,136:，536、6，127:，171、6，080:，575、6，033，856、6,022,，731、6:，010，875、,958,，680、5:，955:，363、5:，891:，718、5:，869:，035、5，866:，410、5,858,，762、,851，796、’849:，576、5:，840,,521,5:，830,,727,5:，830,,690,5:，786,,162,5,766.,940,’637:，503、5,,593,,860,,585,,254、,527,,691、,516,,669、,508,,176、5,384,,259、5,,378,,618,5,,348,,886、5,,290,,691、5,,256,,568、5,,256,,546、5,,166,,070、5,158,,891、5,,151,,364、5,147,,789、5,,053,,335、4,,983,,522、4,,879，,230、4,,876，,202、4,874.,703、4.,778，761、4,,752,，574、4,，703,，012、4,，680,，260、4,，663,，285、4,，634,,677,4,631,259、4,581,335、4,374,200和4,349,629。術(shù)語質(zhì)粒包含任何DNA轉(zhuǎn)錄單位，其包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸及其在所需宿主或靶的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中體內(nèi)表達(dá)所需的元件；并且在這點(diǎn)上，應(yīng)當(dāng)指出超螺旋或非超螺旋的、環(huán)狀質(zhì)粒以及線性形式預(yù)期在本發(fā)明的范圍內(nèi)。每個(gè)質(zhì)粒包括下述或包含下述或基本上由下述組成除編碼抗原、表位或免疫原的多核苷酸外，任選地與異源肽序列、變體、類似物或片段融合，與啟動(dòng)子可操作地連接或處于啟動(dòng)子的控制下或依賴于啟動(dòng)子。一般而言，采用在真核細(xì)胞中起作用的強(qiáng)啟動(dòng)子是有利的。優(yōu)選的強(qiáng)啟動(dòng)子是人或鼠來源的，任選其他來源的例如大鼠或豚鼠的立即早期巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV-IE)。CMV-IE啟動(dòng)子可以包含實(shí)際啟動(dòng)子部分，這可以與增強(qiáng)子部分結(jié)合或不結(jié)合?？梢詤⒖糆P-A-260148、EP_A_323597，美國專利號(hào)5,168,062、5,385,839和4,968,615，以及PCT申請(qǐng)?zhí)朩087/03905。CMV-IE啟動(dòng)子有利地是人CMV_IE(BoshartM.等人，Cell.,1985，41，521-530)或鼠CMV-IE。在更一般的術(shù)語中，啟動(dòng)子為病毒或細(xì)胞來源的。除可以有利地用于本發(fā)明的實(shí)踐中的CMV-IE外的強(qiáng)病毒啟動(dòng)子是SV40病毒的早/晚期啟動(dòng)子或勞斯肉瘤病毒的LTR啟動(dòng)子?？梢杂欣赜糜诒景l(fā)明的實(shí)踐中的強(qiáng)細(xì)胞啟動(dòng)子是細(xì)胞骨架基因的啟動(dòng)子，例如結(jié)蛋白啟動(dòng)子(KwissaM.等人，Vaccine，2000,18，2337-2344)、或肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(MiyazakiJ.等人，Gene，1989，79，269-277)。這些啟動(dòng)子的功能亞片段，即維持足夠啟動(dòng)活性的這些啟動(dòng)子的部分，包括在本發(fā)明內(nèi)，例如根據(jù)PCT申請(qǐng)?zhí)朩098/00166或美國專利號(hào)6,156,567的截短的CMV-IE啟動(dòng)子可以用于本發(fā)明的實(shí)踐中。在本發(fā)明的實(shí)踐中的啟動(dòng)子因此包括全長啟動(dòng)子的衍生物和亞片段，其維持足夠啟動(dòng)活性且因此充當(dāng)啟動(dòng)子，優(yōu)選與衍生有衍生物或亞片段的實(shí)際或全長啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性基本上類似的啟動(dòng)活性，例如美國專利號(hào)6,156,567的截短的CMV-IE啟動(dòng)子的活性類似于CMV-IE全長啟動(dòng)子的活性。因此，在本發(fā)明的實(shí)踐中的CMV-IE啟動(dòng)子可以包含下述或基本上由下述組成或由下述組成全長啟動(dòng)子的啟動(dòng)子部分和/或全長啟動(dòng)子的增強(qiáng)子部分，以及衍生物和亞片段。優(yōu)選地，質(zhì)粒包含其他表達(dá)控制元件或基本上由其他表達(dá)控制元件組成。摻入穩(wěn)定序列是特別有利的，例如內(nèi)含子序列，優(yōu)選地hCMV-IE的第一個(gè)內(nèi)含子(PCT申請(qǐng)?zhí)朩089/01036)，兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II(vanOoyen等人，Science，1979，206，337-344)。關(guān)于除痘病毒外的質(zhì)粒和病毒載體的多腺苷酸化信號(hào)(多聚A)，還可以使用牛生長激素(bGH)基因的多聚(A)信號(hào)(參見美國專利號(hào)5,122,458)、或兔β-珠蛋白基因的多聚(A)信號(hào)或SV40病毒的多聚(A)信號(hào)。本發(fā)明提供了任何靶肽或多肽，有利地目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽通過本發(fā)明的DNA質(zhì)粒的表達(dá)。本發(fā)明考慮了任何目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽在本文公開的DNA質(zhì)粒中的表達(dá)。DNA質(zhì)粒可以表達(dá)一種或多種目的抗原、表位或免疫原。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，抗原、表位、免疫原、肽或多肽衍生自禽類、牛、犬、馬、貓或豬病毒或病原體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原、表位、免疫原、肽或多肽可以衍生自西尼羅河病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原、表位、免疫原、肽或多肽可以衍生自人病毒或病原體。根據(jù)本發(fā)明的禽類抗原、表位或免疫原可以衍生自馬雷克病病毒(MDV)(例如血清型1和2，優(yōu)選1)、新城疫病毒(NDV)、禽腎病病毒或傳染性法氏囊病病毒(IBDV),傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性貧血病毒或雞貧血病毒(CAV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、腦脊髓炎病毒或禽腦脊髓炎病毒(AEV或禽造白細(xì)胞組織增生病毒ALV)、火雞出血性腸炎病毒(HEV)、pneumovirosis病毒(TRTV)、雞瘟病毒(禽流感)、雞積水性心包炎病毒、禽呼腸孤病毒、大腸埃希桿菌(Escherichiacoli)、雞支原體(Mycoplasmagallinaram)、雞敗血支原體(Mycoplasmagallisepticum)、嗜血桿菌(Haemophilusavium)、雞巴氏桿菌(Pasteurellagallinarum)、禽多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocidagallicida)及其混合物。優(yōu)選地，對(duì)于MDV，免疫原有利地是gB和/或gD，例如gB和gD，對(duì)于NDV，免疫原有利地是HN和/或F，例如HN和F;對(duì)于IBDV,免疫原有利地是VP2；對(duì)于IBV，免疫原有利地是S(更有利地Si)和/或M和/或N，例如S(或Si)和M和/或N；對(duì)于CAV，免疫原有利地是VPl和/或VP2；對(duì)于ILTV，免疫原有利地是gB和/或gD；對(duì)于AEV，免疫原有利地是env和/或gag/pro,例如env和gag/pro或gag/pro；對(duì)于HEV，免疫原有利地是100K蛋白質(zhì)和/或六聯(lián)體；對(duì)于TRTV，免疫原有利地是F和/或G，并且對(duì)于雞瘟，免疫原有利地是HA和/或N和/或NP，例如HA和/或N和/或NP。根據(jù)本發(fā)明的?？乖?、表位或免疫原可以衍生自BHV-1、BRV、bPI_3和/或BCV病毒或選自包括但不限于下述的牛病原體牛呼吸道合胞病毒和牛病毒性腹瀉病毒。BRSV免疫原可以是BRSVF或G或N，例如BRSVF和/或G或N和/或G。BHV-I免疫原可以是gB禾Π/或gC禾Π/或gD。BVDV免疫原可以是EO蛋白質(zhì)(gp48)和/或E2蛋白質(zhì)(gp53)。BVDV可以是1型和/或2型。bPI_3免疫原可以是bPI_3F和/或ΗΝ。關(guān)于牛病原體的免疫原以及編碼其的核酸分子和表達(dá)其的構(gòu)建體，還參見美國專利號(hào)6,451,770、6,376,473、6,224,878。根據(jù)本發(fā)明的犬抗原、表位或免疫原可以衍生自麻疹病病毒、犬瘟熱病毒(CDV)、犬副流感2型病毒(CPI-2)、犬皰疹病毒1型(CHV-I)、狂犬病病毒(彈狀病毒)、犬細(xì)小病毒(CPV)、犬冠狀病毒(CCV)、犬腺病毒、伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)及其混合物。優(yōu)選地，對(duì)于CDV，免疫原有利地是F和/或HA(關(guān)于CDV免疫原和構(gòu)建體，還參見美國專利號(hào)6,309,647、5,756,102)；對(duì)于CPV，免疫原有利地是VP2;對(duì)于CCV，免疫原有利地是S和/或M；對(duì)于CHV-I,免疫原有利地是gB和/或gC和/或gD(關(guān)于CHV免疫原和構(gòu)建體，還參見美國專利號(hào)5,688,920、5,529,780)；對(duì)于狂犬病病毒，免疫原有利地是G(關(guān)于狂犬病聯(lián)合組合物，還參見美國專利號(hào)5,843,456)；對(duì)于伯氏疏螺旋體，免疫原有利地是OspA(關(guān)于OspA聯(lián)合組合物，還參見美國專利號(hào)6,368,603)根據(jù)本發(fā)明的馬抗原、表位或免疫原可以衍生自EHV-I和/或EHV-4病毒或選自包括但不限于下述的另一種馬病原體馬流感病毒(EIV)、東方腦脊髓炎病毒(EEV)、西方腦脊髓炎病毒(WEV)、委內(nèi)瑞拉腦脊髓炎病毒(VEV)、萊姆病因子、伯氏疏螺旋體、破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetani)、馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)和狂犬病病毒?？乖?、表位或免疫原可以是EHV糖蛋白例如gB、gD、gB+gD、gC和gE，對(duì)于EIV，免疫原有利地是HA、NP禾P/或N;對(duì)于腦炎病毒，免疫原有利地是C和/或El和/或E2;并且對(duì)于破傷風(fēng)梭菌，免疫原是破傷風(fēng)毒素的亞單位C的全部或部分。關(guān)于馬病原體的免疫原以及編碼其的核酸分子和表達(dá)其的構(gòu)建體，參考美國專利號(hào)6,395,283、6,248,333、5,338,683,6,183,750。根據(jù)本發(fā)明的貓抗原、表位或免疫原可以衍生自貓皰疹病毒I(FHV-I)、貓杯狀病毒(FCV)、狂犬病病毒(彈狀病毒)、貓細(xì)小病毒(FPV)、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)、貓白血病病毒(FeLV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、衣原體屬(Chlamydia)及其混合物。優(yōu)選地，對(duì)于FeLV，免疫原有利地是env和/或gag和/或pol，例如gag/pol；對(duì)于FPV，免疫原有利地是VP2;對(duì)于FIPV，免疫原有利地是S和/或M和/或N，例女口S禾口M禾口/或N(還參見美國專利號(hào)6,348,196和5,858,373以及免疫原及其構(gòu)建體)；對(duì)于FHV，免疫原有利地是gB和/或gC和/或gD，例如gB和gC和/或gD(關(guān)于皰疹病毒免疫原和表達(dá)其的構(gòu)建體；還參見美國專利號(hào)5,338,683、6,183,750)；對(duì)于FCV，免疫原有利地是C;對(duì)于FIV，免疫原有利地是env和/或gag和/或pro，例如gag/pro、env或env和gag/pro(還參見Tartaglia等人在1996年11月14日提交的美國申請(qǐng)序列號(hào)08/746,668中討論的免疫原和構(gòu)建體)；對(duì)于狂犬病病毒，免疫原有利地是G。根據(jù)本發(fā)明的豬抗原、表位或免疫原可以衍生自PRRS病毒和/或選自包括但不限于下述的豬病原體假性狂犬病病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒、豬傳染性胃腸炎病毒(冠狀病毒)、豬環(huán)狀病毒例如豬環(huán)狀病毒2型、輪狀病毒、豬腺病毒3型、大腸埃希桿菌、紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、支氣管炎博得特菌(Bordetellabronchiseptica)、梭菌屬屬種(Clostridiumspp.)、沙門氏菌屬屬種(Salmonellaspp.)、畐O豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)、豬鏈球菌(Streptococcussuis)>豬月市炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)禾口胸膜炎月市炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)。豬病原體的抗原、表位或免疫原可以包括假性狂犬病病毒gB、假性狂犬病病毒gC、假性狂犬病病毒gD、豬流感HA、豬流感ΝΑ、豬流感ΝΡ、豬繁殖和呼吸綜合征病毒的ORF4、豬繁殖和呼吸綜合征病毒的ORF7、PRRSV的ORF5、PRRSVORF3、PRRSVORF6、PRRSV開放讀碼框5(ORF5)和6(ORF6)、PRRSV開放讀碼框5(ORF5)和3(ORF3)和6(ORF6)、豬霍亂病毒E1、豬霍亂病毒E2基因、細(xì)小病毒屬VP2、豬環(huán)狀病毒2型ORF1、豬環(huán)狀病毒2型ORF2。關(guān)于豬病原體的免疫原、編碼其的核酸分子和表達(dá)其的構(gòu)建體，參考美國專利號(hào)6,517,843、6,497,883、6,391,314、6,379,676、6,217,883、6,207,165和美國專利公開2003003112以及W099/53047、W099/08706、W001/83737和WOOO/47756。本發(fā)明的DNA質(zhì)粒可以表達(dá)編碼E、prM、M或其組合或多蛋白(例如，E、或E和prM、或E和Μ、或E和prM和M、或多蛋白E_prM_M、或多蛋白prM_E、或多蛋白M-E，或其至少一個(gè)表位)的一種或多種西尼羅河病毒(“WNV”)多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，在制劑中的其他一種或多種載體包含這樣的多核苷酸、基本上由這樣的多核苷酸組成或由這樣的多核苷酸組成，所述多核苷酸編碼WN病毒的一種或多種其他蛋白質(zhì)，例如prM、Μ、prM-M或其表位，并且在合適的環(huán)境下，該載體表達(dá)WN病毒的一種或多種其他蛋白質(zhì)，例如prM、Μ、prM-M或其表位。如本文所使用的，術(shù)語“抗原”或“免疫原”意指在宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？乖梢园粴⑺馈p毒或活的整個(gè)生物體；生物體的亞單位或部分；包含具有免疫原性性質(zhì)的插入片段的重組載體；在呈遞給宿主動(dòng)物后能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的DNA碎片或片段；蛋白質(zhì)、多肽、肽、表位、半抗原或其任何組合。備選地，免疫原或抗原可以包含毒素或抗毒素。如本文所使用的，術(shù)語“免疫原性蛋白質(zhì)或肽”還指包括在這樣的意義上是免疫活性的肽和多肽，施用于宿主后，它能夠引起針對(duì)蛋白質(zhì)的體液和/細(xì)胞類型的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)片段是這樣的，使得它具有與總蛋白基本上相同的免疫活性。因此，根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)片段包含至少一個(gè)表位或抗原決定簇，或基本上由至少一個(gè)表位或抗原決定簇組成，或由至少一個(gè)表位或抗原決定簇組成。術(shù)語表位涉及能夠誘導(dǎo)體液類型(B細(xì)胞)和/或細(xì)胞類型(T細(xì)胞)的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)位點(diǎn)。術(shù)語“免疫原性蛋白質(zhì)或肽”進(jìn)一步考慮了對(duì)序列的缺失、添加和置換，只要多肽作用于產(chǎn)生如本文所定義的免疫應(yīng)答。在這點(diǎn)上，特別優(yōu)選的置換一般在性質(zhì)上是保守的，即在氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的那些置換。例如，氨基酸一般分成4個(gè)家族(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性-賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性-丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電的極性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)分類為芳香族氨基酸?？珊侠淼仡A(yù)測(cè)用異亮氨酸或纈氨酸分別替換亮氨酸，或反之亦然；用谷氨酸替換天冬氨酸，或反之亦然；用絲氨酸替換蘇氨酸，或反之亦然；或氨基酸用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸的相似保守替換，對(duì)生物活性將沒有主要影響。因此，具有與參照分子基本上相同的氨基酸序列但具有基本上不影響蛋白質(zhì)的免疫原性的氨基酸置換的蛋白質(zhì)在參照多肽的定義內(nèi)。術(shù)語“表位”指特異性B細(xì)胞和/或T細(xì)胞對(duì)其響應(yīng)的抗原或半抗原上的位點(diǎn)。該術(shù)語還可與“抗原決定簇”或“抗原決定位點(diǎn)”互換使用。識(shí)別相同表位的抗體可以在簡單的免疫測(cè)定法中進(jìn)行鑒定，所述免疫測(cè)定法顯示一種抗體阻斷另一種抗體與靶抗原的結(jié)合的能力。對(duì)組合物或疫苗的“免疫應(yīng)答”是宿主中對(duì)目的組合物或疫苗的細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的發(fā)展。通常，“免疫應(yīng)答”包括但不限于一種或多種下述效應(yīng)特異性針對(duì)目的組合物或疫苗中包括的一種或多種抗原的抗體、B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生。優(yōu)選地，宿主將顯示治療或保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而使得對(duì)新感染的抗性將增強(qiáng)和/或疾病的臨床嚴(yán)重性減少。此種保護(hù)將通過通常由受感染宿主顯示的癥狀的減少或缺乏、在受感染宿主中更快速的恢復(fù)時(shí)間和/或降低的病毒滴度加以證實(shí)。如本文所使用的，術(shù)語“免疫原性”蛋白質(zhì)或多肽還指引發(fā)如上所述的免疫應(yīng)答的氨基酸序列。如本文所使用的，“免疫原性”蛋白質(zhì)或多肽包括蛋白質(zhì)的全長序列、其類似物、或其免疫原性片段?！懊庖邞?yīng)答片段”意指這樣的蛋白質(zhì)片段，其包括一個(gè)或多個(gè)表位并且從而引發(fā)上文描述的免疫應(yīng)答。此種片段可以使用本領(lǐng)域眾所周知的任何表位定位技術(shù)進(jìn)行鑒定。參見例如，EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,第66卷(GlennE.Morris,編輯，1996)HumanaPress,Totowa,NJ。例如，線性表位可以這樣測(cè)定，例如在固體載體上同時(shí)合成大量肽，該肽對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)分子的部分，并且在肽仍與載體附著時(shí)使肽與抗體反應(yīng)。此種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且在例如美國專利號(hào)4,708,871；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA813998-4002；Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23709-715中描述，所述參考文獻(xiàn)全部整體引入本文作為參考。相似地，構(gòu)象表位通過測(cè)定氨基酸的空間構(gòu)象容易地鑒定，例如通過χ射線晶體學(xué)和二維核磁共振。參見例如，EpitopeMappingProtocols，同上?？商貏e應(yīng)用于小泰勒蟲(T.parva)的蛋白質(zhì)的方法在整體引入本文作為參考的PCT申請(qǐng)序列號(hào)PCT/US2004/022605中充分描述。合成抗原也包括在定義內(nèi)，例如多表位、側(cè)翼表位和其他重組抗原。參見例如，Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.232777-2781;Bergmann等人(1996)J.Immunol.1573242-3249；Suhrbier,A.(1997)Immunol，和CellBiol.75402-408；Gardner等人(1998)12thWorldAIDSConference,Geneva,Switzerland,Jun.28-Jul.3,1998。為了本發(fā)明的目的，免疫原性片段通常將包括分子的至少約3個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少約5個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少約10-15個(gè)氨基酸，并且最優(yōu)選25個(gè)或更多氨基酸。不存在對(duì)片段長度的臨界上限，這可以包含接近蛋白質(zhì)序列的全長，或甚至包含蛋白質(zhì)的至少一個(gè)表位的融合蛋白。因此，表達(dá)表位的多核苷酸的最低限度結(jié)構(gòu)是它包含核苷酸或基本上由核苷酸組成或由核苷酸組成，以編碼目的蛋白質(zhì)或多蛋白的表位或抗原決定簇。更有利地，編碼總蛋白或多蛋白的片段的多核苷酸包含編碼總蛋白或多蛋白的序列的最少21個(gè)核苷酸，有利地至少42個(gè)核苷酸，且優(yōu)選至少57、87或150個(gè)連續(xù)或鄰接核苷酸，或基本上由編碼總蛋白或多蛋白的序列的最少21個(gè)核苷酸，有利地至少42個(gè)核苷酸，且優(yōu)選至少57、87或150個(gè)連續(xù)或鄰接核苷酸組成，或由編碼總蛋白或多蛋白的序列的最少21個(gè)核苷酸，有利地至少42個(gè)核苷酸，且優(yōu)選至少57、87或150個(gè)連續(xù)或鄰接核苷酸組成。表位測(cè)定操作例如，產(chǎn)生重疊肽文庫(HemmerB.等人，ImmunologyToday，1998，19(4)，163-168)、Pepscan(Geysen等人，(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，81，3998-4002；Geysen等人，(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，82，178-182；VanderZeeR.等人，(1989)Eur.J.Immunol.，19，43-47；GeysenH.M.,(1990)SoutheastAsianJ.Trop.Med.PublicHealth,21,523-533；Multipin.RTM.PeptideSynthesisKitsdeChiron)和算法(DeGrootΑ.等人，(1999)NatureBiotechnology，17，533-561)，以及在PCT申請(qǐng)序列號(hào)PCT/US2004/022605中，無需過度實(shí)驗(yàn)即可在本發(fā)明的實(shí)踐中使用，所述參考文獻(xiàn)全部整體引入本文作為參考。關(guān)于用于測(cè)定免疫原或抗原的表位以及因此編碼此種表位的核酸分子的方法，還可以參考本文引用和引入的其他文件?！岸嗪塑账帷笔侨魏伍L度的聚合形式的核苷酸，其包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和以任何組合的類似物。多核苷酸可以具有三維結(jié)構(gòu)，并且可以執(zhí)行已知或未知的任何功能。術(shù)語“多核苷酸”包括雙鏈、單鏈和三螺旋分子。除非另有說明或要求，本文描述的其為多核苷酸的本發(fā)明的任何實(shí)施方案包含雙鏈形式和已知或預(yù)測(cè)構(gòu)成DNA、RNA或雜交分子的雙鏈形式的2個(gè)互補(bǔ)形式中的每一個(gè)。下述是多核苷酸的非限制性例子基因或基因片段、外顯子、內(nèi)含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可以包含經(jīng)修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物、尿嘧啶、其他糖和連接基團(tuán)例如氟核糖和硫醇鹽、以及核苷酸分支。核苷酸的序列可以在聚合(例如通過綴合)后用標(biāo)記組分進(jìn)一步修飾。在這個(gè)定義內(nèi)包括的其他類型的修飾是加帽、用類似物替換一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸、和引入用于使多核苷酸與蛋白質(zhì)、金屬離子、標(biāo)記組分、其他多核苷酸或固體載體附著的手段。多核苷酸可以通過化學(xué)合成獲得或源自微生物。本發(fā)明進(jìn)一步包含編碼目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽的多核苷酸的互補(bǔ)鏈?；パa(bǔ)鏈可以是聚合的且具有任何長度，并且可以包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和以任何組合的類似物。術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互換使用，以指任何長度的氨基酸殘基聚合物。聚合物可以是線性或分支的，它可以包含經(jīng)修飾的氨基酸或氨基酸類似物，并且它可以由非氨基酸的化學(xué)部分間斷。該術(shù)語還包含已天然或通過本發(fā)明修飾的氨基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙?；⒘姿峄?、或任何其他操作或修飾，例如與標(biāo)記或生物活性組分綴合。“分離的”多核苷酸或多肽是基本上不含它在其天然環(huán)境中與之結(jié)合的材料的那種?；旧喜缓庵钢辽?0%、有利地至少70%、更有利地至少80%、且更加有利地至少90%不含這些材料。雜交反應(yīng)可以在不同“嚴(yán)格性”條件下進(jìn)行。增加雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的條件是眾所周知的。參見例如，“MolecularCloningALaboratoryManual"，第2版(Sambrook等人1989)。相關(guān)條件的例子包括(按增加嚴(yán)格性的順序)25°C、37°C、50°C和68°C的溫育溫度；lOxSSC、6xSSC、lxSSC、O.lxSSC(其中SSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸鹽緩沖液)的緩沖液濃度，及其使用其他緩沖系統(tǒng)的等價(jià)物；0%、25%,50%和75%的甲酰胺濃度；5分鐘-24小時(shí)的溫育時(shí)間；1、2個(gè)或更多洗滌步驟；1、2或15分鐘的溫育時(shí)間；和6xSSC、lxSSC、O.lxSSC的洗滌溶液或去離子水。本發(fā)明進(jìn)一步包含編碼目的多肽的功能等價(jià)變體和衍生物的多核苷酸及其功能等價(jià)片段，其可以增強(qiáng)、減少或不顯著影響由其編碼的多肽的性質(zhì)。這些功能等價(jià)變體、衍生物和片段顯示保留生物活性的能力。例如，不改變編碼氨基酸序列的DNA序列中的變化，以及導(dǎo)致氨基酸殘基的保守置換的那些，一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸缺失或添加、和通過氨基酸類似物置換氨基酸殘基是將不顯著影響編碼的多肽性質(zhì)的那些。保守氨基酸置換是甘氨酸/丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；絲氨酸/蘇氨酸/甲硫氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，變體與目的多核苷酸或多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%,至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同源性或同一性。為了本發(fā)明的目的，序列同一性或同源性通過比較序列進(jìn)行測(cè)定，所述序列這樣比對(duì)，以便使重疊和同一性達(dá)到最大同時(shí)使序列空位降到最低。特別地，序列同一性可以使用許多數(shù)學(xué)算法中的任何進(jìn)行測(cè)定。用于比較2個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的非限制性例子是Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1990；87:2264-2268的算法，如Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1993；905873-5877中修飾的。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)例子是Myers和Miller，CABIOS1988；411-17的算法。此種算法并入ALIGN程序(版本2.0)內(nèi)，這是GCG序列比對(duì)軟件包的部分。當(dāng)利用ALIGN程序用于比較氨基酸序列時(shí)，可以使用PAM120權(quán)殘基表、12的空位長度罰分和4的空位罰分。用于鑒定局部序列相似性區(qū)域和比對(duì)的另一個(gè)有用算法是FASTA算法，如Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1988；85:2444-2448中描述的。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的用途有利的是WU-BLAST(WashingtonUniversityBLAST)版本2.0軟件。用于數(shù)個(gè)UNIX平臺(tái)的WU-BLAST版本2.0可執(zhí)行程序可以從ftp://blast.wustl.edu/blast/executables下載。這個(gè)程序基于WU-BLAST版本1.4，所述WU-BLAST版本1.4依次基于公眾域NCBI-BLAST版本1.4(Altschul和Gish，1996，Localalignmentstatistics，Doolirtle編輯，MethodsinEnzymology266460—480;Altschul等人，JournalofMolecularBiology1990；215403—410；Gish禾口States,1993；NatureGenetics3266-272；Karlin和Altschul，1993；Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5877;所述參考文獻(xiàn)全部引入本文作為參考)。一般而言，氨基酸序列的比較通過使已知結(jié)構(gòu)多肽的氨基酸序列與未知結(jié)構(gòu)多肽的氨基酸序列比對(duì)來完成。序列中的氨基酸隨后進(jìn)行比較，并且使同源的氨基酸組集中在一起。這種方法檢測(cè)多肽的保守區(qū)，并且說明氨基酸插入和缺失。氨基酸序列之間的同源性可以通過使用商購可得的算法進(jìn)行測(cè)定(還參見上文的同源性描述)。除本文在其他方面提及的這些外，還提及由美國生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)提供的程序BLAST、空位BLAST、BLASTN、BLASTP和PSI-BLASTo這些程序在本領(lǐng)域中廣泛用于這個(gè)目的，并且可以比對(duì)2個(gè)氨基酸序列的同源區(qū)。在套件中的所有搜索程序中，將空位比對(duì)程序整合至數(shù)據(jù)庫搜索其自身。需要時(shí)可以關(guān)閉空位。對(duì)于蛋白質(zhì)和BLASTP，空位長度1的缺省罰分(Q)是Q=9，而對(duì)于BLASTN，Q=10，但可以變成任何整數(shù)。對(duì)于蛋白質(zhì)和BLASTP，延伸空位的缺省每殘基罰分(R)是R=2，對(duì)于BLASTN，R=10，但可以變成任何整數(shù)。可以使用Q和R的值的任何組合，以便這樣比對(duì)序列，使得重疊和同一性達(dá)到最大同時(shí)使序列空位降到最低。缺省氨基酸比較矩陣是BLOSUM62，但可以利用其他氨基酸比較矩陣?yán)鏟AM。備選地或另外地，術(shù)語“同源性”或“同一性”例如就核苷酸或氨基酸序列而言，可以指2個(gè)序列之間的同源性的定量測(cè)量。序列同源性百分比可以計(jì)算為(Nref-Ndlf)*100/Nref，其中Ndlf是當(dāng)比對(duì)時(shí)2個(gè)序列中的非相同殘基總數(shù)目，并且其中Nref是序列之一中的殘基數(shù)目。因此，DNA序列AGTCAGTC將與序列AATCAATC具有75%的序列同一性(Nref=8；Ndlf=2)。備選地或另外地，術(shù)語“同源性”或“同一性”就序列而言，可以指具有相同核苷酸或氨基酸的位置數(shù)目除以2個(gè)序列中較短序列中的核苷酸或氨基酸數(shù)目，其中2個(gè)序列的比對(duì)可以依照Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman，ProcNatlAcadSciUSA1983；80726，引入本文作為參考)進(jìn)行測(cè)定，例如使用窗口大小20個(gè)核苷酸、字長4個(gè)核苷酸和空位罰分4，并且計(jì)算機(jī)輔助分析和序列數(shù)據(jù)(包括比對(duì))的解釋可以使用商購可得的程序(例如IntelligeneticsTMSuite，IntelligeneticsInc.CA)方便地執(zhí)行。當(dāng)RNA序列被說成與DNA序列相似或具有序列同一性或同源性程度時(shí)，DNA序列中的胸苷(T)視為與RNA序列中的尿嘧啶(U)等價(jià)。因此，RNA序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且可以衍生自DNA序列，通過DNA序列中的胸苷(T)視為與RNA序列中的尿嘧啶(U)等價(jià)。16并且無需過度實(shí)驗(yàn)，技術(shù)人員可以參考許多其他程序或參考文獻(xiàn)用于測(cè)定同源性百分比。本發(fā)明進(jìn)一步包含了這樣的目的多核苷酸，其包含在載體分子或表達(dá)載體中，并且與啟動(dòng)子元件且任選地與增強(qiáng)子可操作地連接?！拜d體”指重組DNA或RNA質(zhì)?；虿《荆浒隗w外或在體內(nèi)待遞送給靶細(xì)胞的異源多核苷酸。異源多核苷酸可以包含用于治療用途的目的序列，并且可以任選以表達(dá)盒的形式。如本文所使用的，載體無需在最終靶細(xì)胞或受試者中能夠復(fù)制。該術(shù)語包括克隆載體，還包括病毒載體。術(shù)語“重組體”意指半合成或合成來源的多核苷酸，其在自然界中不存在或以自然界中未發(fā)現(xiàn)的排列與另一種多核苷酸連接?！爱愒吹摹币庵秆苌运c之比較的其余實(shí)體遺傳上不同的實(shí)體。例如，多核苷酸可以通過基因工程技術(shù)放置到衍生自不同來源的質(zhì)?；蜉d體內(nèi)，并且是異源多核苷酸。從其天然編碼序列中取出并且與非天然序列的編碼序列可操作地連接的啟動(dòng)子是異源啟動(dòng)子。本發(fā)明的多核苷酸可以包含附加序列，例如在相同轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的附加編碼序列，控制元件(例如啟動(dòng)子)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)、在相同或不同啟動(dòng)子的控制下的附加轉(zhuǎn)錄單位，允許宿主細(xì)胞的克隆、表達(dá)、同源重組和轉(zhuǎn)化的序列，以及如可能是提供本發(fā)明的實(shí)施方案所需的任何此種構(gòu)建體。用于表達(dá)目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽的元件有利地存在于本發(fā)明載體中。以最低限度形式，這包含下述、基本上由下述組成或由下述組成起始密碼子(ATG)、終止密碼子和啟動(dòng)子，以及任選地用于特定載體(例如質(zhì)粒和特定病毒載體(例如非痘病毒的病毒載體))的多腺苷酸化序列。當(dāng)多核苷酸編碼載體中的多蛋白片段，例如有利地肽時(shí)，將ATG放置在讀碼框的5’處，并且終止密碼子放置在3’處?？梢源嬖谟糜诳刂票磉_(dá)的其他元件，例如增強(qiáng)子序列、穩(wěn)定序列，例如內(nèi)含子和允許蛋白質(zhì)分泌的信號(hào)序列。用于制備和/或施用用于在體內(nèi)或在體外表達(dá)本發(fā)明基因的基因產(chǎn)物的載體或重組體或質(zhì)粒的方法可以是任何所需方法，例如通過或類似于下述中公開的方法的方法，或下述中引用的文件中公開的方法美國專利號(hào)4,603,112；4,769,330；4,394,448；4,722,848；4,745,051；4,769,331；4,945,050；5,494,807；5,514,375；5,744,140；5,744,141；5,756,103；5,762,938；5,766,599；5,990,091；5,174,993；5,505,941；5,338,683；5,494,807；5,591,639；5,589,466；5,677,178；5,591,439；5,552,143；5,580,859；6,130,066；6,004,777；6,130,066；6,497,883；6,464,984；6,451,770；6,391,314；6,387,376；6,376,473；6,368,603；6,348,196；6,306,400；6,228,846；6,221,362；6,217,883；6,207,166；6,207,165；6,159,477；6,153,199；6,090,393；6,074,649；6,045,803；6,033,670；6,485,729；6,103,526；6,224,882；6,312,682；6,348,450和6,312,683；1986年10月16日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)920,197；WO90/01543；W091/11525；WO94/16716；WO96/39491；WO98/33510；EP265785；EP0370573；Andreansky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；9311313-11318；Ballay等人，EMBOJ.1993；43861-65；Feigner等人，J.Biol.Chem.1994；2692550-2561；Frolov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；9311371-11377；Graham,Tibtech1990；885-87；Granhaus等人，Sem.Virol.1992；3237-52；Ju等人，Diabetologia1998；41736-739；Kitson等人，J.Virol.1991；653068-3075；McClements等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；9311414-11420；Moss,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；9311341-11348；Paoletti,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；9311349-11353；Pennock等人，Mol.Cell.Biol.1984；4399-406；Richardson(編輯)，MethodsinMolecularBiology1995；39,“BaculovirasExpressionProtocols,“HumanaPressInc.；Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.1983；32156-2165;Robertson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；9311334-11340；Robinson等人，Sem.Immunol.1997；9271；和Roizman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；93:11307-11312。除提供在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的載體的例子外，本文引用和引入本文作為參考的文件還可以提供關(guān)于在本發(fā)明的組合物中或包括在本發(fā)明的組合物中待由一種或多種載體表達(dá)的肽或其片段的來源。本發(fā)明還涉及包含載體例如表達(dá)載體的制劑，例如治療組合物。制劑可以包含一種或多種載體、基本上由一種或多種載體組成或由一種或多種載體組成，例如表達(dá)載體，例如體內(nèi)表達(dá)載體，包含下述、基本上由下述組成或由下述組成(且有利地表達(dá))一種或多種目的抗原、表位或免疫原。有利地，載體包含且表達(dá)這樣的多核苷酸，所述多核苷酸包括下述、基本上由下述組成或由下述組成編碼(且有利地表達(dá))目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽的多核苷酸，在藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、賦形劑或媒介物中。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，制劑中的其他一種或多種載體包含這樣的多核苷酸、基本上由這樣的多核苷酸組成或由這樣的多核苷酸組成，所述多核苷酸編碼目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽或其片段的一種或多種其他蛋白質(zhì)，并且在合適的環(huán)境下，該載體表達(dá)目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽或其片段的一種或多種其他蛋白質(zhì)。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，制劑中的一種或多種載體包含這樣的多核苷酸、或基本上由這樣的多核苷酸組成或由這樣的多核苷酸組成，所述多核苷酸編碼目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽或其片段的一種或多種蛋白質(zhì)或其片段，一種或多種載體表達(dá)一種或多種多核苷酸。本發(fā)明制劑有利地包含至少2種載體、基本上由至少2種載體組成或由至少2種載體組成，所述至少2種載體包含下述、基本上由下述組成或由下述組成，并且有利地在體內(nèi)在合適條件下或適當(dāng)條件下或在合適的宿主細(xì)胞中有利地還表達(dá)下述來自不同編碼相同蛋白質(zhì)和/或不同蛋白質(zhì)，但有利地相同的蛋白質(zhì)的分離物的多核苷酸。制劑包含一種或多種載體，所述載體包含這樣的多核苷酸、基本上由這樣的多核苷酸組成或由這樣的多核苷酸組成，所述多核苷酸編碼且有利地在體內(nèi)有利地表達(dá)目的抗原或融合蛋白或其表位。本發(fā)明還涉及載體的混合物，所述載體包含下述、基本上由下述組成或由下述組成編碼且表達(dá)不同抗原、表位或免疫原，例如來自不同物種的抗原、表位、免疫原、肽或多肽，所述物種例如但不限于鳥類、犬、貓、牛、馬、人和豬。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，表達(dá)載體是用于在合適的細(xì)胞系統(tǒng)中體外表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。在分泌后或不在分泌后(如果不存在分泌，那么一般發(fā)生或執(zhí)行細(xì)胞裂解)，所表達(dá)的蛋白質(zhì)可以在或從培養(yǎng)上清液中收集，任選地通過常規(guī)方法例如超濾濃縮和/或通過純化手段純化，例如親和力、離子交換或凝膠過濾類型的層析法?！八拗骷?xì)胞”指原核或真核細(xì)胞，其已在遺傳上改變，或能夠通過施用外源多核苷酸例如重組質(zhì)?；蜉d體而在遺傳上改變。當(dāng)提及遺傳上改變的細(xì)胞時(shí)，該術(shù)語指最初改變的細(xì)胞及其后代。有利的宿主細(xì)胞包括但不限于，幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)、結(jié)腸癌(Caco-2)細(xì)胞、COS7細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、MCF-10A細(xì)胞、Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞、Madin-Darby牛腎細(xì)胞(MDBK)、貂肺(MvlLu)細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、U937細(xì)胞和VERO細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)Kl細(xì)胞。包含所需序列的多核苷酸可以插入合適的克隆或表達(dá)載體內(nèi)，并且可將載體再引入合適的宿主細(xì)胞內(nèi)用于復(fù)制和擴(kuò)增。多核苷酸可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法引入宿主細(xì)胞內(nèi)。包含目的多核苷酸的載體可以通過許多合適方法中的任何引入宿主細(xì)胞內(nèi)，包括直接攝取，胞吞作用，轉(zhuǎn)染，核轉(zhuǎn)染，f_配對(duì)，電穿孔，利用氯化鈣氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質(zhì)的轉(zhuǎn)染；微粒轟擊；脂轉(zhuǎn)染；和感染(其中載體是傳染性的，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)。引入載體或多核苷酸的選擇通常將依賴于宿主細(xì)胞的特征。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療有效量制劑的施用用于在靶細(xì)胞中遞送且表達(dá)目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽。治療有效量的測(cè)定對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是常規(guī)實(shí)驗(yàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑包含表達(dá)載體和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、媒介物或賦形劑，所述表達(dá)載體包含多核苷酸，所述多核苷酸表達(dá)目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、媒介物或賦形劑促進(jìn)載體或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)染和/或改善載體或蛋白質(zhì)的保存。藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或媒介物或賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或媒介物或賦形劑可以是0.9%NaCK例如鹽水)溶液或磷酸鹽緩沖液?？梢杂糜诒景l(fā)明方法的其他藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或媒介物或賦形劑包括但不限于聚(L-谷氨酸鹽)或聚乙烯吡咯烷酮。藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或媒介物或賦形劑可以是促進(jìn)載體(或在體外由本發(fā)明載體表達(dá)的蛋白質(zhì))施用的任何化合物或化合物組合；有利地，載體、媒介物或賦形劑可以促進(jìn)載體(或蛋白質(zhì))的轉(zhuǎn)染和/或改善載體(或蛋白質(zhì))的保存。劑量和劑量體積在本文中在一般描述中討論，并且還可以通過技術(shù)人員根據(jù)與本領(lǐng)域知識(shí)結(jié)合閱讀的本公開內(nèi)容進(jìn)行測(cè)定，無需任何過度實(shí)驗(yàn)。有利地但并非唯一適合于質(zhì)粒的包含季銨鹽的陽離子脂質(zhì)有利地是具有下式的那些權(quán)利要求1.包含卡那霉素抗性基因的DNA質(zhì)粒，其中(a)所述卡那霉素抗性基因包含SEQIDNO1的啟動(dòng)子和/或TTG起始密碼子，(b)所述卡那霉素抗性基因不包含SEQIDNO2的啟動(dòng)子、SEQIDNO3的啟動(dòng)子和/或轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，其中與包含SEQIDNO2的啟動(dòng)子、SEQIDNO3的啟動(dòng)子和/或轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的卡那霉素抗性基因比較，所述卡那霉素抗性基因的表達(dá)減少。2.權(quán)利要求1的DNA質(zhì)粒，其中與包含含有SEQIDNO:2的啟動(dòng)子、SEQIDNO:3的啟動(dòng)子和/或轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的卡那霉素抗性基因的DNA質(zhì)粒比較，所述減少的卡那霉素抗性基因表達(dá)導(dǎo)致更高的質(zhì)粒產(chǎn)率和更高的質(zhì)粒穩(wěn)定性。3.權(quán)利要求1或2的DNA質(zhì)粒，其中所述卡那霉素抗性基因包含SEQIDNO1的啟動(dòng)子。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的DNA質(zhì)粒，其中所述卡那霉素抗性基因包含TTG起始密碼子。5.權(quán)利要求1的DNA質(zhì)粒，其中所述DNA質(zhì)粒是pLLlO、pLL14、pLL16或pLL18。6.包含卡那霉素抗性基因的DNA質(zhì)粒，其中將轉(zhuǎn)座子插入在所述卡那霉素抗性基因啟動(dòng)子和翻譯起始之間，從而導(dǎo)致減少的卡那霉素抗性基因表達(dá)。7.權(quán)利要求6的DNA質(zhì)粒，其中與包含無轉(zhuǎn)座子插入在所述卡那霉素抗性基因啟動(dòng)子和翻譯起始之間的卡那霉素抗性基因的DNA質(zhì)粒比較，所述減少的卡那霉素抗性基因表達(dá)導(dǎo)致更高的質(zhì)粒產(chǎn)率和更高的質(zhì)粒穩(wěn)定性。8.用于遞送且表達(dá)目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽的制劑，其中所述制劑包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的質(zhì)粒和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、媒介物或賦形劑。9.權(quán)利要求8的制劑，其中所述載體、媒介物或賦形劑促進(jìn)所述載體或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)染和/或改善所述載體或蛋白質(zhì)的保存。10.權(quán)利要求8或9的制劑，其中所述目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽衍生自禽類、牛、犬、馬、貓或豬病毒或病原體。11.在動(dòng)物中刺激免疫應(yīng)答的方法，其包括給動(dòng)物的細(xì)胞施用有效量的權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的制劑，并且在所述細(xì)胞中表達(dá)所述目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽。12.在動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，其包括給動(dòng)物的細(xì)胞施用有效量的權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的制劑，并且在所述細(xì)胞中表達(dá)所述目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽。13.權(quán)利要求11或13的方法，其中所述動(dòng)物是禽類、牛、犬、馬、貓或豬。14.用于執(zhí)行權(quán)利要求11-13中的任何一種方法的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的DNA質(zhì)?；蛑苿┖陀糜趫?zhí)行權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的方法的說明書。全文摘要本發(fā)明涉及改善外源多肽的表達(dá)的組合物和方法，所述外源多肽例如目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽。更具體而言，本發(fā)明提供了在可用于DNA疫苗的組合物和方法中具有改善的表達(dá)和穩(wěn)定性的DNA質(zhì)粒。文檔編號(hào)C12N15/63GK102016045SQ200780053396公開日2011年4月13日申請(qǐng)日期2007年5月2日優(yōu)先權(quán)日2007年5月2日發(fā)明者J-C·奧堂奈特申請(qǐng)人:梅瑞爾有限公司