專利名稱：膀胱癌診斷和/或預(yù)后方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的應(yīng)用領(lǐng)域在保健領(lǐng)域內(nèi)，主要在"腫瘤泌尿科學(xué)"和"分子生物學(xué)"領(lǐng)域
內(nèi)。本發(fā)明特別地旨在膀胱癌診斷和預(yù)后方法。
背景技術(shù)：
膀胱癌(bladder cancer)或膀胱癌(vesical cancer)是前列腺癌之后的第二普 遍的泌尿生殖道月中瘤[Jemal A， Thomas A， Murray T， Th皿M. Cancer statistics, 2002. CACancer J Clin 2002;52:23-47]。在全球范圍內(nèi)，其在所有由于癌癥死亡的男性和女 性中分別占3%和1 % 。在絕對(duì)值方面，這意味著每年約95， 000名男性和約35， 000名女 性由于該病理而死亡。發(fā)病與死亡之間的比率根據(jù)各國發(fā)展程度而異。作為極端實(shí)例， 可提及的是在北美洲區(qū)域該比率可能接近0.2，而在撒哈拉以南的非洲地區(qū)其可能增加至 0. 6[Edwards BK，Brown ML，Wingo PA et al. Annual report to the nation on thestatus of cancer，1975—2002， featuring population—based trends in cancertreatment. J Natl Cancer Inst 2005;97 :1407-27 ;Pisani P，Parkin DM，Bray F，F(xiàn)erlay J. Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990. Int JCancer 1999 ;83 :18-29]。
與其他腫瘤不同，實(shí)際上暫時(shí)并未查明家族遺傳素質(zhì)因素。相反，已查明若干與膀 胱腫瘤強(qiáng)烈相關(guān)的環(huán)境因素。最重要的因素之一是吸煙，不僅由于其關(guān)系到疾病，而且由于 其在人群中的發(fā)生率。已觀察到吸煙者具有比非吸煙者高三倍的患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)。事實(shí)上， 三分之一的膀胱腫瘤與煙草消費(fèi)有關(guān)。令人遺憾地，存在于煙草中的致癌劑仍沒有被清楚 鑒別[Burch JD， Rohan TE，Howe GR et al. Risk of bladder cancer by sourceand type of tobacco exposure :a case—control study. Int J Cancer 1989 ;44 :622—28 ;Zeegers MP，Kellen E，Buntinx F，van den Brandt PA. The association betweensmoking，beverage consumption,diet and bladder cancer :a systematic literaturereview. World J Urol 2004 ;21 :392-401]。 在膀胱中能在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)不同類型的病癥。其中，存在良性變化如上皮細(xì)胞增 生、尿道上皮化生和Von Bru皿巢。相反，發(fā)育異常相當(dāng)于在大致介于正常上皮和癌之間的 病癥。最后，在膀胱中發(fā)現(xiàn)不同類型的尿道上皮癌，其可分為腺癌、鱗狀腫瘤和過渡型細(xì)胞 癌(TCC)。 超過90X的膀胱腫瘤是TCC。在它們?cè)\斷時(shí)，大約75%為淺表性腫瘤，20%為 侵入肌肉層(浸潤性或侵入性TCC)和5%為已經(jīng)轉(zhuǎn)移的。淺表性情況中，大約20%通 過單一的外科手術(shù)治愈，然而手術(shù)后50至70%復(fù)發(fā)一次或多次，但絕不變?yōu)榻櫺阅[ 瘤。這些淺表性腫瘤的10至30%變?yōu)榻櫺阅[瘤。這些腫瘤是侵入性的預(yù)后差的腫瘤， 5年后的死亡率為50%，在轉(zhuǎn)移的情況下，2年后的死亡率為100% [Sanchez-Carbayo M， SocciND， Charytonowicz E et al. Molecular profiling of bladder cancer using cDNAmicroarrays :defining histogenesis and biological phenotypes.Cancer Res2002 ;62 :6973-80 ;Adshead JM， Kessling AM， 0gden CW. Genetic initiation, progression and prognostic markers in transitional cell carcinoma of thebladder :a summary of the structural and transcriptional changes, and the role ofdevelopmental genes. Br J Urol 1998 ;82 :503-12 ;Babaian RJ， Johnson 0F， Llamas L， Ayala AG. Metastases from transitional cell carcinoma of urinarybladder. Urology 1980 ;16 :142-44]。 淺表性和侵入性TCC的遺傳途徑盡管有關(guān)，不過看來明顯不同。淺表性腫瘤最常 見的發(fā)展似乎是增生、非典型性和最后低級(jí)別乳頭狀TCC。在侵入性腫瘤中，最常見這樣 發(fā)展從非典型性到發(fā)育異常，然后轉(zhuǎn)化為原位腫瘤(Tis)，最終至浸潤性腫瘤[Knowles MA. What we could do now :molecular pathology of bladder cancer Mol Pathol 2001 ; 54 :215-21]。 目前的診斷系統(tǒng)基于尿細(xì)胞學(xué)(由尿中的鱗狀上皮細(xì)胞)和通過膀胱鏡直接觀 察膀胱的組合。后者實(shí)際上是腫瘤的主要診斷和跟蹤技術(shù)。其通過尿道進(jìn)行，因此其對(duì) 于患者是侵入性的并相當(dāng)令人厭煩。相信該技術(shù)的靈敏性和特異性相當(dāng)高，盡管實(shí)際技術(shù) 中的改進(jìn)(熒光膀胱鏡檢查法)表明可能并非如此而且淺表性腫瘤中觀察到的部分復(fù)發(fā) 可歸因于其不可見部分中的不完全切除[Jones JS. DNA-based molecular cytology for bladder cancersurveillance. Urology 2006 ;67 :35-45]。尿細(xì)胞學(xué)反之是對(duì)于高級(jí)別 腫瘤具有高靈敏性和特異性的非侵入性診斷技術(shù)。然而，該技術(shù)顯示檢測(cè)低級(jí)別腫瘤的 局限性[Bastacky S， Ibrahim S， Wilczynski SP， Murphy麗.The accuracy of urinary cytology in dailypractice. Cancer 1999;87:118-28]。而且，細(xì)胞學(xué)的解釋高度依賴觀 察者，因此它們可能是觀察者間不同的，特別是在低級(jí)腫瘤方面。 所有這些局限已導(dǎo)致對(duì)更可靠的非侵入性膀胱癌標(biāo)記物的研究。發(fā)現(xiàn)對(duì)膀胱 TCC具有高靈敏性和特異性的非侵入性標(biāo)記物會(huì)非常有助于臨床實(shí)踐。事實(shí)上，若干研 究描述了尿中新的腫瘤標(biāo)記物，如對(duì)膀胱腫瘤抗原醒P22[Wiener HG， Mian C， Haitel A， PychaA， Schatzl G， Marberger M. Can尿bound diagnostic tests replace cystoscopy inthe management of bladder cancer J Urol 1998 ;159 :1876—80 ;Soloway MS， Briggman V， Carpinito GA et al. Use of a new tumor marker, urinary NMP22, in thedetection of occult or rapidly recurring transitional cell carcinoma of the urinarytract foliowing surgical treatment. J Urol 1996 ;156 :363-67]、纖維蛋白降 角率產(chǎn)物[Schmetter BS，Habicht KK，Lamm DL et al.A multicenter trial evaluation of thefibrin/fibrinogen degradation products test for detection and monitoring of bladdercancer. J Urol 1997 ;158 :801-5，]、端粒酶[Takihana Y， Tsuchida T， Fukasawa M，Araki I，Tanabe N，Takeda M. Real—time quantitative analysis for humantelomerase reverse transcriptase mRNA and human telomerase RNA componentmRNA expressions as markers for clinicopathologic parameters in urinary bladdercancer. Int J Urol 2006 ;13 :401-8]的試驗(yàn)，基于熒光原位雜交的試驗(yàn)[Hailing KC， KingW， Sokolova IA et al.A comparison of BTA stat，hemoglobin dipstick,telomeraseand Vysis Uro Vysion assays for the detection of urothelial carcinoma carcinomain urine. J Urol 2002; 167 :2001-6]或流式細(xì)胞術(shù)[Takahashi C， Miyagawa I， K麗noS， 0shimura M. Detection of telomerase activity in prostate cancer by needlebiopsy. Eur Urol 1997 ;32 : 494—98 ;Trott PA，Edwards L. Comparison of bladderwashings and urine cytology in
6the diagnosis of bladder cancer. J Uroll973 ;110 :664-66]，但是盡管其中大多數(shù)具 有比尿細(xì)胞學(xué)更高的靈敏性，后者也仍然是最特異性的[Bassi P， De M， V， De Lisa A et al. Non_diagnostic tests tests for bladdercancer :a review of the literature. Urol Int 2005 ;75 :193-200]。 已知在尿道上皮腫瘤中發(fā)現(xiàn)許多變化很大的遺傳性病癥，因此目前的趨勢(shì)是搜索 能表明癌存在于分析樣品中的遺傳性標(biāo)記物(在DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平)。此外，能用同 樣的標(biāo)記物辨別患者腫瘤的侵入性是非常引人入勝的，因?yàn)檫@會(huì)提供更個(gè)性化和有效的治 療。最后，一些該標(biāo)記物可能是開發(fā)抗癌新藥的治療靶點(diǎn)。 直至最近，分析基因表達(dá)模式的能力限于每次試驗(yàn)少數(shù)幾種基因。新技術(shù)例如DNA 芯片已完全改變?cè)撉樾巍，F(xiàn)在可以在單次試驗(yàn)中分析數(shù)千基因[Duggan DJ， Bittner M， Chen Y，Meltzer P，Trent JM. Expression profiling using cDNA microarrays. NatGenet 1999 ;21 :10_14 ;Granjeaud S， Bertucci F， Jordan BR.Expression profiling :DNA arrays in many guises. Bioessays 1999;21:781-90]。因此，包括膀胱腫瘤的所有腫瘤 類型的大量表達(dá)結(jié)果已開始發(fā)表于文獻(xiàn)中[Sanchez-Carbayo M，Socci ND，Charytonowicz Eet al. Molecular profiling of bladder cancer using cDNAmicroarrays :defining histogenesis and biological phenotypes. Cancer Res2002 ;62 :6973—80 ;Ramaswamy S， Tamayo P， Rifkin Ret al. Multiclass cancerdiagnosis using tumor gene expression signatures. Proc Natl Acad Sci USA2001. 98 :15149-54 ;Sanchez-Carbayo M， Socci ND， Lozano JJet al. Genediscovery in bladder cancer progression using cDNA microarrays. Am J Patho12003 ;163 :505_16 ;Sanchez—Carbayo M， Capodieci P， Cordon-Cardo C. Tumorsuppressor role of KiSS-l in bladder cancer :loss of KiSS-l expression isassociated with bladder cancer progression and clinical outcome. Am J Patho12003 ;162 :609-17 ;Dyrskjot L，Thykjaer T，Kruhoffer Met al. Identifying distinctclasses of bladder carcinoma using microarrays. Nat Genet 2003 ;33 : 90-96]，盡管大部分結(jié)果沒有全部公開。盡管如此，迄今，用特定的膀胱癌標(biāo)記物進(jìn)行的 研究集中于一種或很少的幾種基因[Olsburgh J， Harnden P， Weeks Ret al. Uroplakin geneexpression in normal human tissues and locally advanced bladder cancer. JPathol 2003 ;199 :41-49 ;Fichera E，Liang S，Xu Z，Guo N，Mineo R，F(xiàn)ujita-Yamaguchi Y. A quantitative reverse transcription and polymerase chain reactionassay for human IGF—II allows direct comparison of IGF—II mRNA levels incancerous breast,bladder, and prostate tissues. Growth Horm IGF Res2000 ;10 :61—70 ;Simoneau M， Aboulkassim T0， LaRue H， Rousseau F， Fradet Y. Four tumor suppressor loci on chromosome 9qin bladder cancer :e vidence fortwo novel candidate regions at 9q22. 3and 9q31. Oncogene 1999 ;18 :157-63]。 已知這些腫瘤的性質(zhì)是非常異質(zhì)的，看來用單一標(biāo)記物鑒別所有或大多數(shù)癌是不 大可能的。因此為了表征大多數(shù)腫瘤，看來有必要組合幾種最好的標(biāo)記物至某些類型的程度。 此外，盡管尿道上皮組織的直接分析對(duì)于發(fā)展常規(guī)診斷方法是最舒服的選擇對(duì) 象，如上所述，所述方法為非侵入性的也會(huì)是非常有益的，這是因?yàn)楹笳呓档突颊呱钯|(zhì)量并代表高得多的保健經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 看來與全部膀胱上皮接觸并因此具有腫瘤塊的膀胱液(bladder f luid)(尿或膀 胱洗液(bladder washing))是良好的用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物的選擇對(duì)象，因?yàn)樗鼈兇慝@得 要分析樣品的容易的非侵入性途徑。因此，在搜索膀胱TCC的非侵入性診斷方法中，大量 工作已集中于尿中腫瘤標(biāo)記物的研究。實(shí)際上，具有該目的的不同試驗(yàn)已出現(xiàn)于市場(chǎng)上(N MP22， UroVysion， I匪noCyt， Accu-Dx等)。 仍未出現(xiàn)于市場(chǎng)上的一個(gè)選擇對(duì)象是通過確定膀胱癌標(biāo)記物的基因表達(dá)檢測(cè) 尿樣中的膀胱TCC。實(shí)際上，存在一些建議該方法的有用性的研究，盡管它們用一種或 少數(shù)幾禾中標(biāo)記物基因進(jìn)行研究[Parekattil SJ， Fisher HA， Kogan BA. Neural network usingcombined urine nuclear matrix protein—22， monocyte chemoattractant protein—land urinary intercellular adhesion molecule-l to detect bladder cancer. J Urol2003 ;169 :917-20 ;Eissa S， Ke麗y G， Swellam M， EI Fadle AA， Abd EI—Aal AA， EIAhmady 0. Comparison of cytokeratin 20 RNA and angiogenin in voided urinesamples as diagnosis tools for bladder carcinoma. Clin Biochem 2004 ;37 :803-10 ;Larsson PC， Beheshti B， Sampson HA， Jewett MA， Shipman R. Allelic deletionfingerprinting of urine cellsediments in bladder cancer. Mol Diagn 2001 ;6 :181-88]。 適應(yīng)這些需求，本發(fā)明人在重要的研究工作之后已鑒別出14種膀胱腫瘤標(biāo)記物 基因，由此他們已開發(fā)膀胱癌診斷和預(yù)后方法，該方法基于通過從膀胱液提取的RNA的定 量實(shí)時(shí)PCR的這些基因的基因表達(dá)的檢測(cè)和定量，以及他們隨后通過"報(bào)警系統(tǒng)"的計(jì)算機(jī)組合。 附圖簡述

圖1 (A-J):用膀胱洗液的完整RNA(BW0)(圖1A)和部分降解RNA(BW1、 BW2、 BW3) (圖1B、1C、1D)、膀胱腫瘤(T0、T1、T2、T3)(圖1E、1F、1G、1H)和對(duì)照樣品池(C)(圖11)的 樣品的Agilent 2100生物分析儀獲得的電泳圖譜，以及具有各分析樣品的核糖體RNA帶 (28S和18S)的凝膠(圖1J)。對(duì)于具有可比較品質(zhì)的RNA樣品，數(shù)字0、1、2和3指定為降 解增加次序的樣品。 圖2 : (a)在各陣列(array)中100個(gè)最不同表達(dá)基因的陣列對(duì)(pairs of array) 之間比較的半矩陣。半矩陣的上下灰色陰影部分顯示膀胱洗液(BW)陣列對(duì)之間和腫瘤 (T)陣列對(duì)之間的用不同降解度RNA雜交的共同基因的差異性表達(dá)百分?jǐn)?shù)。半矩陣的非 陰影部分對(duì)應(yīng)于膀胱洗液和腫瘤陣列對(duì)之間共同基因的差異性表達(dá)百分?jǐn)?shù)。(b)芯片 (microarray)中含有的所有克隆的無監(jiān)督聚類，包括具有染色交換(DS)的復(fù)制物。
圖3 :在36種另外的腫瘤膀胱洗液樣品中，通過在cDNA芯片和與膀胱癌相關(guān)的 4種差異性表達(dá)基因(KRT20、 GSN、 IGF2和CCL2)的定量實(shí)時(shí)RT-PCR(qRT-PCR)的生效。 正值表示與對(duì)照相關(guān)的腫瘤膀胱洗液中的過表達(dá)。樣品依賴于根據(jù)腫瘤階段和級(jí)別的 1og2ratio在圖表中分組低級(jí)別淺表性腫瘤(8pTa和3pTl)，高級(jí)別淺表性腫瘤(5pTa、 5pTl和4pTis)和侵入性腫瘤(9pT2和2pT4)。 圖4 :通過無監(jiān)督球形聚類(global cluster)(歐幾里得(Euclidean)距離和 UPGMA)的樣品分類。pT2j、pT2—2和pT2—3 (浸潤性腫瘤)；PTlHG_l、pTlHG_2和PT1HG_3 (高級(jí)別淺表性腫瘤)；pTlLG_l、 PT1LG_2、 PT1LG_3 (低級(jí)別淺表性腫瘤)。
圖5 :池和其中含有的單個(gè)樣品的定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)結(jié)果。表分為池(左部) 和單個(gè)樣品(右側(cè))。池的欄表示池編號(hào)(No.)、在芯片中觀察到的表達(dá)水平(i! arrays) 和通過qRT-PCR定量的水平(qRT-PCR)。單個(gè)樣品的第一欄對(duì)應(yīng)于在以下欄(1_5)中指出 的池中含有的單個(gè)樣品的表達(dá)的算數(shù)平均值(mean)。各行對(duì)應(yīng)于一個(gè)基因(TCN1、S0RBS1、 MYHll、 SRPX、 CRH、 KRT14、 RRM2、 F0SB、 CEACAM6、 CES1)，其對(duì)于各池具有不同的表達(dá)水平。
圖6 :60種單獨(dú)的膀胱液樣品通過384種基因的無監(jiān)督球形聚類的分類(歐幾里 得距離和UPGMA)。樣品的命名遵循如下規(guī)則如果樣品以字母"B"開始，其稱為腫瘤膀胱洗 液樣品；如果以"CB"開始，其稱為對(duì)照膀胱液樣品；如果首字母"RV"出現(xiàn)在樣品編號(hào)之后， 其稱為膀胱洗液樣品；另一方面，如果首字母"O"出現(xiàn)，其稱為尿樣，腫瘤級(jí)別和腫瘤樣品 的病理狀況在下劃線后指出。箭頭指出樣品的不良分類，它們表明與確立的種類TJ1G(高 級(jí)別腫瘤);T_LG(低級(jí)別腫瘤)和C(對(duì)照)相關(guān)。 圖7(A和B) :140種單獨(dú)的膀胱液樣品通過96種基因的無監(jiān)督球形聚類的分類 (歐幾里得距離和UPGMA)。箭頭指出樣品的不良分類，它們表明與確立的種類(C，對(duì)照；圖 7A以及T，腫瘤樣品；圖7B)相關(guān)。樣品的命名遵循以下規(guī)則如果樣品以字母"B"開始，其 稱為腫瘤膀胱液樣品；如果以"CB"開始，其稱為對(duì)照膀胱液樣品；如果首字母"R"出現(xiàn)的樣 品編號(hào)之后，其稱為膀胱洗液樣品；另一方面，如果首字母"O"出現(xiàn)，其稱為尿樣。
圖8 (A-T):膀胱癌用的384種診斷、預(yù)后和內(nèi)源性對(duì)照基因列表。該列表已由通過 具有不同階段和腫瘤級(jí)別的膀胱腫瘤組織樣品與對(duì)照膀胱粘膜樣品的池的Affymetrix芯 片的分析獲得。 圖9 (A-D):膀胱癌用的96種診斷、預(yù)后和內(nèi)源性對(duì)照基因列表。該列表已通過在 含有圖8的384種基因的微流體卡中的60種膀胱液樣品的分析獲得。指出了選擇來用于 TaqMan Low Density Array微流體卡的基因符號(hào)禾口 TaqMan Gene Expression Assay的名 稱。 圖10(A和B):膀胱癌用的48種診斷、預(yù)后和內(nèi)源性對(duì)照基因列表。該列表已通 過在含有圖9的96種基因的微流體卡中的140種膀胱液樣品的分析獲得。指出了選擇來 用于Taq Man Low Density Array微流體卡的基因符號(hào)禾口Taq Man Gene ExpressionAssay 的名稱。 發(fā)明目的 本發(fā)明的目的涉及體外非侵入性膀胱癌診斷和/或預(yù)后方法，其基于在作為所述
疾病遺傳標(biāo)記物的某些基因和/或其組合的基因表達(dá)的膀胱液中的檢測(cè)和定量。 同樣，所述基因作為膀胱癌診斷和/或預(yù)后遺傳標(biāo)記物的用途也是本發(fā)明的目的。 最后，本發(fā)明的另一目的涉及膀胱癌診斷和/或預(yù)后試劑盒，其基于所述基因作
為該疾病遺傳標(biāo)記物的的用途。 發(fā)明描述 本發(fā)明的主要目的是開發(fā)體外非侵入性膀胱癌診斷和/或預(yù)后方法，其基于作為 所述疾病的遺傳標(biāo)記物的某些基因的檢測(cè)和定量。 為了實(shí)施該方法，起始點(diǎn)是由對(duì)其進(jìn)行某些基因和/或其組合的表達(dá)模式的檢測(cè)和定量的受試者獲得的膀胱液樣品。將所得結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考值相比， 由此確立診斷和/或預(yù)后。 本發(fā)明中所用術(shù)語"受試者"涉及人類。 從受試者獲得的膀胱液樣品可以是尿或膀胱洗液樣品，其能通過任何常規(guī)方法獲 得。 在本發(fā)明中，理解膀胱癌診斷方法為其使得檢測(cè)和定量化腫瘤和對(duì)照樣品(來自 健康個(gè)體)之間的差異性表達(dá)基因(診斷基因)。 預(yù)后方法涉及那些使得檢測(cè)不同種類的腫瘤中的差異性表達(dá)基因(預(yù)后基因)， 其使得在各情況下根據(jù)侵入性和個(gè)性化治療分類腫瘤。 不同種類的過渡型細(xì)胞癌(TCC)的腫瘤分類目前基于病理解剖實(shí)驗(yàn)室中的宏觀 和微觀觀察。它們的分類通過基于腫瘤深度和細(xì)胞微觀外表的大致標(biāo)準(zhǔn)化觀察決定。近來 的分子研究看來表明實(shí)際上存在主要區(qū)分淺表性類型腫瘤和浸潤性腫瘤的兩種不同的基 因譜(genetic profile)。 因此，淺表性膀胱腫瘤稱為Ta、Tis和Tl。 Ta癌是外植癌，其是非侵入性的或限于
上皮。Tis是原位癌(扁平淺表性腫瘤)，T1是侵入皮下結(jié)締組織或侵入固有層的腫瘤。 在本發(fā)明中，縮寫HG用于確定高級(jí)別腫瘤而LG用于確定低級(jí)別腫瘤。 Ta和Tl癌能通過經(jīng)尿道切除(TUR)根治。盡管高級(jí)別(HG) Tis和Tl是限于粘膜
的淺表性癌，但是因?yàn)樗鼈兪歉呒?jí)別腫瘤，也已用分子生物學(xué)技術(shù)和通過臨床經(jīng)驗(yàn)證明它
們具有高度惡性和侵入潛能。 此外，浸潤性膀胱癌分為T2、T3和T4。因此，T2涉及侵入肌肉膀胱層的腫瘤。該 種類依次分為侵入淺表性肌肉層或內(nèi)半部的T2a，和侵入深肌肉層或外半部的T2b。 T3涉及 侵入肌肉層以外或侵入膀胱周脂肪的腫瘤。該種類依次分為具有微觀侵入的T3a，和具有宏 觀侵入的T3b。最后，T4涉及侵入臨近膀胱的結(jié)構(gòu)，其依次分為具有前列腺、子宮或陰道侵 入的T4a和具有骨盆壁或腹壁侵入的T4b。 基因的基因表達(dá)的檢測(cè)和定量能通過任何適于本發(fā)明目的的非侵入性分子生物 學(xué)技術(shù)例如表達(dá)芯片、定量實(shí)時(shí)PCR、 northern印記、常規(guī)PCR等進(jìn)行。
具體地，使用DNA陣列允許獲得很大量基因的表達(dá)結(jié)果，使得在各試驗(yàn)中測(cè)試數(shù) 千基因。使用該技術(shù)要求大量具有良好品質(zhì)的RNA(非降解的)。 定量實(shí)時(shí)PCR技術(shù)(qRT-PCR)優(yōu)選用于本發(fā)明中檢測(cè)和定量診斷基因和/或預(yù)后 基因。除了可允許使用具有相當(dāng)降解度的RNA而不影響最終結(jié)果之外，該技術(shù)還更精確。同 樣，其使得定量化感興趣基因的具體RNA。在特定實(shí)施方案中，使用的雜交探針是T叫man探 針。 將在膀胱液樣品中基因表達(dá)的檢測(cè)和定量中獲得的結(jié)果與來自健康受試者的樣 品中所述基因的常規(guī)參考值比較。標(biāo)記物基因水平的提高或降低通常通過將由對(duì)應(yīng)于試驗(yàn) 受試者的樣品分析獲得的結(jié)果與平行分析的對(duì)照樣品的結(jié)果比較來評(píng)價(jià)。各樣品分類的最 終決定通過基于標(biāo)記物基因表達(dá)值的"報(bào)警系統(tǒng)"作出，因此，如果任何觀察到的值相對(duì)于 對(duì)照樣品中預(yù)期的值顯示非常明顯的偏離，則最終分類為腫瘤分類的可能性大大增加，而 與"給出報(bào)警"的基因無關(guān)。 更具體地，在本發(fā)明的主要方面，非侵入性膀胱癌診斷和/或預(yù)后方法包括從
10受試者收集膀胱液樣品，以在所述樣品中進(jìn)行ANXAIO、 C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、 KRT20、MAGEA3、P0STN、PPP1R14D、SLC1A6、TERT、ASAM和MCM10基因組合表達(dá)模式的檢測(cè)和 定量。將所得結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考值比較。 膀胱液樣品優(yōu)選為尿，因?yàn)槠浍@得要容易得多。然而，偶爾以常規(guī)方式得到膀胱洗 液，獲得具有更好品質(zhì)的RNA。 位于4q32. 3的ANXA 10 (膜聯(lián)蛋白A10)基因(也稱為ANX14)參與細(xì)胞分裂調(diào)控 和不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，但是它們的精確作用仍未確定。 C14orf78(染色體14開放讀碼框78)基因(也稱為AHNAK2或KIAA2019)位于 14q32.33。其作用仍未確定。 位于lq31的CTSE(組織蛋白酶E)基因(也稱為CATE)編碼胞內(nèi)蛋白酶。 位于8ql3的CRH(促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素)基因(也稱為CRF)編碼在下丘腦
響應(yīng)應(yīng)激分泌的促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素。 位于11pl5.5的IGF2(胰島素樣生長因子2(促生長因子A))基因(也稱為
11orf43、FLJ22066、FLJ44734、 INSIGF)編碼胰島素樣生長因子。 KLF9 (Kru卯el樣因子9)基因(也稱為BTEB1)編碼轉(zhuǎn)錄因子。位于17q21. 2的KRT20 (角蛋白20)基因(也稱為K20 ;CK20 ;KRT21 ;MGC35423)
編碼負(fù)責(zé)賦予上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和完整性的中間絲(intermediate filament)的蛋白質(zhì)形成部分。 MAGEA3 (黑色素瘤抗原家族A，3)基因(也稱為HIP8 ;HYPD ;MAGE3 ;MAGEA6 ; MGC14613)位于Xq28。其作用未知。 POSTN(periostin，成骨細(xì)胞特異性因子)基因(也稱為PN ;0SF-2 ;PDLPOSTN ;MGC 119510 ;MGC119511 ;periostin ;RP11-412K4. 1)位于13ql3. 3，具有與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性相關(guān)的作 用。PPP1R14D(蛋白質(zhì)磷酸酶l，調(diào)節(jié)(抑制劑)亞單位14D)基因(也稱為GBPI-1 ;
FLJ20251 ;MGC119014 ;MGC119016 ;CPI17樣)位于15ql5. l，編碼磷酸酶。 位于19pl3. 12的SLC1A6 (溶質(zhì)載體家族1 (高親合性天冬氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋
白)，成員6)基因(也稱為EAAT4 ;MGC33092 ;MGC43671)參與胞內(nèi)運(yùn)輸。位于5pl5. 33的TERT(端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶)基因(也稱為TP2 ;TRT ;EST2 ;TCS1 ;
hEST2)編碼具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的端粒聚合酶。 位于llq24. 1的ASAM(脂肪細(xì)胞特異性粘附分子)基因(也稱為ASAM ;ACAM ; CLMP ;FLJ22415)參與細(xì)胞粘附。 最后，位于10pl3的MCM10(微型染色體維持缺陷IO(釀酒酵母(S. cerevisiae)))
基因(也稱為CNA43 ;PR02249 ;MGC 126776)編碼涉及基因組復(fù)制啟動(dòng)的蛋白質(zhì)。 在本發(fā)明的另一方面，體外非侵入性膀胱癌診斷和/或預(yù)后方法包括從受試者收
集膀胱液樣品，以在所述樣品中進(jìn)行ANXA10 、 CTSE、 CRH、 IGF2 、 KRT20 、 MAGEA3 、 SLC1A6 、 TERT
和MCM10基因組合的表達(dá)模式的檢測(cè)和定量。將所得結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考
值比較。 在本發(fā)明的另一方面，體外非侵入性膀胱癌診斷和/或預(yù)后方法包括從受試者收 集膀胱液樣品，以在所述膀胱液樣品中進(jìn)行選自C14orf 78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、 ASAM及其組合的基因表達(dá)的檢測(cè)和定量。將所得結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考值比較。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)特別方面，預(yù)期所述基于C14orf78基因表達(dá)的個(gè)體檢測(cè)和 定量的診斷和/或預(yù)后方法。 在本發(fā)明的另一特定方面，預(yù)期所述基于KLF9基因表達(dá)的個(gè)體檢測(cè)和定量的診 斷和/或預(yù)后方法。 在本發(fā)明的另一特定方面，預(yù)期所述基于POSTN基因表達(dá)的個(gè)體檢測(cè)和定量的診 斷和/或預(yù)后方法。 在另一特定方面，預(yù)期所述基于PPPIR14D基因表達(dá)的個(gè)體檢測(cè)和定量的診斷和/ 或預(yù)后方法。 在本發(fā)明的另一特定方面，預(yù)期所述基于ASAM基因表達(dá)的個(gè)體檢測(cè)和定量的診 斷和/或預(yù)后方法。 在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案中，預(yù)期基于選自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、 ASAM及其組合的基因以及此外至少一種選自ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6、 TERT及MCM10的基因的檢測(cè)和定量的體外非侵入性膀胱癌診斷和/或預(yù) 后方法。 在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)前述方法，預(yù)期關(guān)注于膀胱癌診斷的體外非侵入性 方法，其包括從受試者收集膀胱液樣品以進(jìn)行ANXAIO、 C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、 KRT20、MAGEA3、P0STN、PPP1R14D、SLC1A6和TERT基因的組合的表達(dá)模式的檢測(cè)和定量。將 所得結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考值比較。 在本發(fā)明的另一方面，體外非侵入性膀胱癌診斷方法包括從受試者收集膀胱液樣 品，以進(jìn)行ANXA10、CTSE、CRH、IGF2、KRT20、MAGEA3、SLC1A6和TERT基因的組合的表達(dá)模式 的檢測(cè)和定量。將所得結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考值比較。 在本發(fā)明的另一方面，體外非侵入性膀胱癌診斷方法包括從受試者收集膀胱液樣 品，以進(jìn)行選自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D及其組合的基因表達(dá)的檢測(cè)和定量。將 所得結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考值比較。 在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，所述診斷方法基于C14orf78基因的檢測(cè)和定量。
在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案中，所述診斷方法基于KLF9基因的檢測(cè)和定量。
在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案中，所述診斷方法基于POSTN基因的檢測(cè)和定量。
在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案中，所述診斷方法基于PPPIR14D基因的檢測(cè)和定 在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案中，所述診斷方法基于選自C14orf78、KLF9、P0STN、 PPP1R14D及其組合的基因和此外的至少一種選自ANXA10、CTSE、CRH、IGF2、KRT20、MAGEA3、 SLC1A6及TERT的基因的表達(dá)的檢測(cè)和定量。 在本發(fā)明的另一方面，預(yù)期體外非侵入性膀胱癌預(yù)后方法，其包括從受試者收集 膀胱液樣品，以進(jìn)行ASAM和MCM10基因組合的表達(dá)模式的檢測(cè)和定量。將所得結(jié)果與膀胱 液中所述基因的常規(guī)參考值比較。 本發(fā)明的另一方面提供體外非侵入性膀胱癌預(yù)后方法，其包括從受試者收集膀胱 液樣品，以進(jìn)行ASAM基因表達(dá)的檢測(cè)和定量。將所得結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考 值比較。
在本發(fā)明的另 一方面，預(yù)期使用ANXA10 、 C14orf 78 、 CTSE、 CRH、 IGF2 、 KLF9 、 KRT20 、 MAG EA3、P0STN、PPP1R14D、SLC1A6、TERT、ASAM和MCM10基因的組合作為膀胱癌診斷和/或 預(yù)后標(biāo)記物。 本發(fā)明的另一方面關(guān)注使用ANXA10、CTSE、CRH、IGF2、KRT20、MAGEA3、SLC1A6、TERT 和MCM10基因的組合作為膀胱癌診斷和/或預(yù)后標(biāo)記物。 在本發(fā)明的另一方面，預(yù)期使用選自C14orf78、KLF9、P0STN、PPPlR14D、ASAM及其 組合的基因作為膀胱癌診斷和/或預(yù)后標(biāo)記物。 在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，預(yù)期使用C14orf78基因作為膀胱癌診斷和/或預(yù)后 標(biāo)記物。 在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案中，預(yù)期使用KLF9基因作為膀胱癌診斷和/或預(yù)后 標(biāo)記物。 在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案中，預(yù)期使用POSTN基因作為膀胱癌診斷和/或預(yù) 后標(biāo)記物。 在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案中，預(yù)期使用PPP1R14D基因作為膀胱癌診斷和/或 預(yù)后標(biāo)記物。 在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案中，預(yù)期使用ASAM基因作為膀胱癌診斷和/或預(yù)后 標(biāo)記物。 本發(fā)明的另一方面關(guān)注組合使用選自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、 ASAM及 其組合的基因與至少一種選自ANXA10、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6、 TERT及 MCM10的基因作為膀胱癌診斷和/或預(yù)后標(biāo)記物。本發(fā)明的另一方面涉及使用ANXAIO、 C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、 KRT20、 MAGEA3、 P0STN、 PPP1R14D、 SLC1A6和TERT基因的組合作為膀胱癌診斷標(biāo)記物。
本發(fā)明的另一方面關(guān)注使用ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6和 TERT基因的組合作為膀胱癌診斷標(biāo)記物. 本發(fā)明的另一方面涉及使用選自C14orf78、KLF9、P0STN、PPPlR14D及其組合的基 因作為膀胱癌診斷標(biāo)記物. 在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，預(yù)期使用C14orf78基因作為膀胱癌診斷標(biāo)記物。
同樣，在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案中，預(yù)期使用KLF9基因作為膀胱癌診斷標(biāo)記
物。

物。 在本發(fā)明的另一方面，預(yù)期使用選自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D及其組合 的基因與至少一種選自ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2， KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6及TERT的基因作 為膀胱癌診斷標(biāo)記物。 在本發(fā)明的另一方面，預(yù)期使用ASAM和MCM10基因的組合作為膀胱癌預(yù)后標(biāo)記 物。 在本發(fā)明的另一方面，預(yù)期使用ASAM基因作為膀胱癌預(yù)后標(biāo)記物。 本發(fā)明的另一方面涉及膀胱癌診斷和/或預(yù)后試劑盒，其包括適用于ANXA10、
在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案中，預(yù)期使用POSTN基因作為膀胱癌診斷標(biāo)記物。 在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案中，預(yù)期使用PPP1R14D基因作為膀胱癌診斷標(biāo)記
13C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、 KRT20、 MAGEA3、 P0STN、 PPP1R14D、 SLC1A6、 TERT、 ASAM和 MCM10基因的組合的表達(dá)模式的檢測(cè)和定量的一組探針。 在本發(fā)明的另一方面，膀胱癌診斷和/或預(yù)后試劑盒包括適用于ANXA10、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6、 TERT和MCM10基因的組合的表達(dá)模式的檢測(cè)和定量的 一組探針。 在本發(fā)明的另一方面，預(yù)期膀胱癌診斷和/或預(yù)后試劑盒，其基于適用于選自 C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、 ASAM及其組合的基因的檢測(cè)和定量的一組探針。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，所述基于用于選自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、ASAM及其組合的基因的檢測(cè)和定量化的一組探針的膀胱癌診斷和/或預(yù)后試劑 盒，另外包括適用于選自ANXA10 、 CTSE、 CRH、 IGF2 、 KRT20 、 MAGEA3 、 SLC1A6 、 TERT和MCM10的 基因的檢測(cè)和定量的一組探針。 在本發(fā)明的另一方面，預(yù)期膀胱癌診斷試劑盒，其基于適用于ANXA10、 C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、 KRT20、MAGEA3、 P0STN、 PPP 1R14D、 SLC1A6和TERT基因的組合的表達(dá) 模式的檢測(cè)和定量的一組探針。在本發(fā)明的另一方面，膀胱癌診斷試劑盒包括適用于ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、MAGEA3、 SLC1A6和TERT基因的組合的表達(dá)模式的檢測(cè)和定量的一組探針。
在本發(fā)明的另一方面，預(yù)期癌癥診斷試劑盒，其基于適用于選自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D及其組合的基因的檢測(cè)和定量的一組探針。在本發(fā)明的另一方面，所述基于適用于選自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D及
其組合的基因的檢測(cè)和定量的一組探針的試劑盒，另外包括適用于至少一種選自ANXAIO、
CTSE、 CRH、 IGF2、KRT20、MAGEA3、 SLC1A6和TERT的基因的檢測(cè)和定量的探針。 在本發(fā)明的另一方面，預(yù)期膀胱癌預(yù)后試劑盒，其基于適用于ASAM和MCM10基因
組合的表達(dá)模式的檢測(cè)和定量的一組探針。 在本發(fā)明的另一方面，預(yù)后試劑盒基于適用于ASAM基因檢測(cè)和定量的探針。
表1顯示作為膀胱癌診斷和/或預(yù)后遺傳標(biāo)記物鑒別出的14種基因。ASAM和 MCM10基因是用于預(yù)后的2種特異性基因。 以下給出用于說明本發(fā)明但不用于限制本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施例。 實(shí)施例 實(shí)施例膀胱液樣品中降解重要件的確定。 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最終目標(biāo)，首先有必要知道不同RNA降解水平對(duì)基因表達(dá)譜 (gene e鄧ression profile)的影響，因?yàn)橛砂螂滓?尿和/或膀胱洗液)獲得的RNA的品 質(zhì)通常低。還要確定由膀胱液獲得的基因表達(dá)譜與相應(yīng)腫瘤中獲得的那些是否匹配。
1.樣品選擇和RNA制備 選擇來自同一個(gè)診斷為高級(jí)別(G3)pT2的患者的腫瘤組織(T)和膀胱洗液 (BW)樣品[根據(jù)以下中所述方法Lopez-Beltran A， Sauter G， Gasser T， Hartma皿 A， Schmitz- 。,er BJ， Helpap B， Ayala AG， Tamboni P， K麗les MA， Sidransky D， Cordon-Cardo C， Jones PA， Cairns P， Simon R， Amin MB， Tyczynsky JE. Tumours of theUrinary System. In :Eble JN，Sauter G，Epstein JI，Sesterhenn IA (eds. )，Pathologyand Genetics of Tumours of the Urinary System and Male GenitalOrgans. World Health Organization Classification of Tumours丄yon :IARC Press ;2004 :89-157 ; Sobin LH， Wittekind CH. TNM Classification of Malignant Tumours. International Union Against Cancer. ，6th ed. New York :Jonh Wiley & Sons ;2002]。根據(jù)供應(yīng)商的說 明，用TRlzol (Invitrogen， Carlsbad, CA， USA)提取兩種樣品(TO和BW0)的RNA。然后將 兩種RNA(T0和BW0)的等分試樣通過將它們?cè)?0。C下保溫15 (Tl和BW1)分鐘、30(T2和 BW2)分鐘和60 (T3和BW3)分鐘降解，得到三種降解水平，如Xiang CC，Chen M，Ma L等人在 A new strategy to amplify degraded RNAfrom small tissue samples for microarray studies. Nucleic Acids Res 2003 ;31 :53中所述，區(qū)別在于使用水代替堿性緩沖液。
還從4名沒有膀胱病變證據(jù)的患者收集健康膀胱粘膜樣品(對(duì)照樣品)，以與前述 樣品相同的方式獲得RNA，4種RNA以等摩爾比混合(CO)。 在Agilent 2100 Bioanalyzer中分析1 ii 1各完整RNA和降解RNA，以確定各 RNA的品質(zhì)(根據(jù)Imbeaud S， Graudens E， Boulanger V等人在Towardsstandardization of RNA quality assessment using user—independent classifiers ofmicroc即illary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res 2005 ;33 :e56中所述的方法)(圖1. A-H)。 圖l(J)顯示各分析樣品的具有核糖體R NA(28S和18S)帶的凝膠，其中觀察到這些帶的逐 漸降解。 此外，從沒有膀胱病變的患者收集36種膀胱洗液(8低級(jí)別(LG)pTa，5高級(jí)別
(HG)pTa，3pTlLG，5pTlHG，4pTis，9pT2HG和2pT4HG)和14種對(duì)照膀胱洗液，以與前述情況相
同的方式提取RNA。 2.體外RNA擴(kuò)增和標(biāo)記 通過使用在T3啟動(dòng)子序列(T3N9)的3'添加修飾的具有9核苷酸隨機(jī)序列的引 物(隨機(jī)九聚物引物)擴(kuò)增5 ii g完整RNA(T0和BW0)和降解RNA(T1、 T2、 T3、 BW1、 BW2和 BW3)(根據(jù)Xiang CC， Chen M， Ma Let al.A newstrategy to amplify degradedRNA from small tissue samples for microarray studies. Nucleic Acids Res 2003 ;31 :e53)。 探針通過直接t示記f去合成(*艮據(jù)Richter A， Schwager C， Hentze S， AnsorgeW， Hentze 麗，Muckenthaler M. Comparison of fluorescent tag DNA labelingmethods used for expression analysis by DNA microarrays. Biotechniques 2002 ;33 :620_8，630).
3.陣列加工和數(shù)據(jù)分析 0ncochip-v2玻璃人cDNA芯片(htt。
〃gru。os. cnio. es/genomica/arrays/ reports/ochip v2.xls)用于將腫瘤和膀胱洗液(T0、 Tl、 T2、 T3、 BW0、 BW1、 BW2和BW3)兩 者RNA的四種逐漸降解的各等分試樣與來自健康膀胱粘膜樣品(CO)的RNA庫共雜交。用 G2565BA Microarray Sca皿erSystem(Agilent, Technologies, Waldbro皿，Germany)獲得 熒光圖像，使用Spotprogram(http://experimental, act, cmis. csiro. au/Spot)在R統(tǒng)計(jì) 環(huán)境(htto:〃w麗.r-OToiect. org)中定量TIFF圖像。芯片各點(diǎn)的最終強(qiáng)度測(cè)量如前述已 建議夷，樣計(jì)算(http:〃www. stat. berkeley. edu/users/terry/zarray/Html/image. html) (公眾在GE0數(shù)據(jù)庫可獲得的數(shù)據(jù)；GSE3192)。最后，獲得1111種符合所有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的有 效克隆，選擇各陣列100種最不相同表達(dá)的克隆進(jìn)行陣列間比較并計(jì)算它們之間共同基因 的百分?jǐn)?shù)。腫瘤組織陣列之間(85至91%)以及膀胱洗液陣列之間(78至93%)檢測(cè)到
15差異性表達(dá)的共同基因的高百分?jǐn)?shù)(圖2a)，這表明RNA降解實(shí)際上并不影響基因表達(dá)譜。
芯片中獲得的所有克隆的無監(jiān)督聚類也使用UPGMA(用算數(shù)平均值的非加權(quán)對(duì)群 法)和皮爾森對(duì)射變換進(jìn)行。該聚類表明在用具有不同降解水平的RNA(例如，BW0和BW1) 雜交的2種陣列之間鑒別出的共同基因百分?jǐn)?shù)偶爾高于相同陣列染色交換(DS)復(fù)制物 (例如，BWO與BWO-DS)之間的百分?jǐn)?shù)(圖2b)，這加強(qiáng)了當(dāng)用部分降解RNA作業(yè)時(shí)基因表 達(dá)譜實(shí)際上不變化的結(jié)論。 為了確定從膀胱洗液樣品獲得的基因表達(dá)譜與相應(yīng)腫瘤中獲得的那些是否匹配， 比較腫瘤組織陣列和膀胱洗液陣列之間差異性表達(dá)的共同基因百分?jǐn)?shù)。獲得腫瘤和膀胱洗 液之間的高度相似性(52至60% )，該相似性有賴于RNA降解條件。 總之，該數(shù)據(jù)提示部分降解的膀胱洗液RNA能用于使用芯片的基因表達(dá)研究，以 及該RNA是腫瘤基因表達(dá)的反映。
4.定量實(shí)時(shí)RT-PCR(aRT-PCR) 為了驗(yàn)證在特定患者芯片中獲得的結(jié)果能推廣到更長遠(yuǎn)的群體，通過qRT-PCR分 析在根據(jù)文獻(xiàn)涉及膀胱癌發(fā)生過程的陣列中4種差異性表達(dá)基因(KRT20， IGF2， GSN和 CCL2)。關(guān)于該驗(yàn)證，使用36種其他腫瘤膀胱洗液和14種對(duì)照膀胱洗液。
由lug RNA使用High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems， FosterCity ， USA)，根據(jù)供應(yīng)商的說明合成cDNA，除了反應(yīng)的最后體積減少至50 yl。 GUSB 基因用作內(nèi)源性對(duì)照。使用ABI PRISM 7000S DS(Applied Biosystems,FosterCity,USA) 中的Assays-on-DemancT Gene Expression Products,根據(jù)供應(yīng)商的說明進(jìn)行PCR，除了反 應(yīng)體積減少至20iU。 A ACt方法(ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User Bulletin #2 : Relative Quantification of Gene Expression P/N 4303859)用于計(jì)算相對(duì)于14種對(duì)照 樣品表達(dá)的平均值各基因表達(dá)的相對(duì)量。為了確立對(duì)照樣品中的參考值，獲得來自沒有膀 胱病變的患者的14種對(duì)照膀胱洗液表達(dá)值的算術(shù)平均值。 將表示為1og2ratio的該分析結(jié)果定義為表示為2為底數(shù)的對(duì)數(shù)的2種比較條件 (在這個(gè)情況下是內(nèi)源性對(duì)照相對(duì)于各指出基因)之間的比例或除法(比率)，對(duì)于KRT20 在81 %的樣品中證實(shí)了芯片結(jié)果，對(duì)GNS為89 %中，對(duì)IGF2為64 %中和對(duì)CCL2為89 %中 (圖3)。由單個(gè)患者分析獲得的芯片數(shù)據(jù)和由36名其他患者群組分析獲得的qRT-PCR數(shù) 據(jù)之間的高度一致性證實(shí)在芯片中獲得的基因表達(dá)譜不應(yīng)歸于單個(gè)患者分析。
5.實(shí)施例1的結(jié)論 通過cDNA芯片和qRT-PCR兩者，均可能使用膀胱洗液RNA以推論相應(yīng)膀胱腫瘤的 基因表達(dá)譜。 實(shí)施例2用于預(yù)測(cè)l樽型的候詵某因的最初確定 —旦了解可能在膀胱液樣品中確定基因表達(dá)譜，接下來的目標(biāo)是獲得盡可能廣泛 的特征基因表達(dá)數(shù)據(jù)。為了在連續(xù)階段的更廣泛樣品系列中逐漸分析或多或少增加的基因 選擇量，決定遵循通過在少量樣品中分析最大可能量基因開始的策略。 流程依次包括在該過程的所有關(guān)鍵步驟中確立非常嚴(yán)格的質(zhì)量控制。這包括在手 術(shù)室由F皿daci6Puigvert團(tuán)隊(duì)的外科大夫獲得具有期望特性的生物樣品，在適當(dāng)條件下 貯存并保藏樣品，通過實(shí)驗(yàn)室儀器進(jìn)行樣品的解剖病理分析和分子處理。
1.獲得并詵擇牛物樣品 在手術(shù)室使用冷手術(shù)鉗切除器(resector)(腫瘤樣品)或直接用剪刀(對(duì)照樣 品)獲得組織樣品。獲得的部分組織立即在-8(TC下冷凍，直至隨后加工用于RNA提取，剩 余部分送至病理解剖部門以用于其病理解剖分析。關(guān)于RNA提取，將該組織機(jī)械地均勻化， 根據(jù)TRlzol (Invitrogen，Calsbad，CA，USA)規(guī)程提取RNA。最后，通過分光光度法在260nm 下測(cè)量吸光度來定量RNA。
2.要研究的樣品纟目 已知淺表性腫瘤和侵入性腫瘤看來具有不同的基因譜(genetic profile)，決定 比較最極端的腫瘤組(低級(jí)別淺表性腫瘤與浸潤性腫瘤)。此外，還決定查明具有不明臨床 行為的腫瘤類型的分子情況(molecular prof ile)，這是因?yàn)樗鼈兪菧\表性但具有高度細(xì) 胞畸變的腫瘤(分類為高級(jí)別Tl、 pTl HG)，在很多情況下(約50% )以浸潤性腫瘤告終。 因此確定四個(gè)研究組-組l ;低級(jí)別(LG)淺表性腫瘤樣品，其僅侵入膀胱粘膜(病理上分類為pTa LG)。
_組2:高級(jí)別(HG)淺表性腫瘤樣品，其侵入皮下結(jié)締組織(病理上分類為pTl HG)。-組3 :浸潤性和高級(jí)別腫瘤樣品(病理上分類為pT2)。 [OH4]-組4 :健康膀胱粘膜樣品(對(duì)照)。 為了減少相當(dāng)高的生物學(xué)差異的目的，進(jìn)行同樣腫瘤類型，即具有相同解剖病理 學(xué)分類的樣品庫。因此，對(duì)于各組進(jìn)行4-5種腫瘤樣品的3個(gè)庫；pTa LG，pTl HG，pT2HG和 對(duì)照。 3. Aff，etrix芯片 盡管以前已經(jīng)利用基于cDNA的芯片平臺(tái)作業(yè)，但從文獻(xiàn)已知曾有其他基于寡核 苷酸的商業(yè)平臺(tái)能允許獲得更大量基因的表達(dá)結(jié)果。最后，決定使用Affymetrix平臺(tái) (http:〃www. affymetrix. com/index, affx)，已知對(duì)于該平臺(tái)存在大量在公共數(shù)據(jù)庫可獲 得的數(shù)據(jù)，事實(shí)上，所有文獻(xiàn)都提到它的高的結(jié)果品質(zhì)，允許測(cè)量最多的人基因表達(dá)的新芯 片(U133 plus 2.0)已剛剛投放市場(chǎng)。 Affymetrix芯片通過專業(yè)公司(Progenika)雜交并掃描，原始表達(dá)數(shù)據(jù)(或eel 文件)直接在R統(tǒng)計(jì)環(huán)境下使用RMA(Robust Multi array Analysis)算法分析。
4. Affymetrix芯片分析 —旦對(duì)各克隆已獲得標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)數(shù)據(jù)，就決定研究如何通過進(jìn)行無監(jiān)督聚類將已 選擇的不同樣品聚類到一起(圖4)。在后者中，能觀察到所有對(duì)照聚類到一起并明顯不同 于腫瘤，這表明在腫瘤和對(duì)照之間存在很多差異性表達(dá)基因(診斷基因)。此外，還觀察到 浸潤性腫瘤(pT2J、pT2—2和pT2—3)和高級(jí)別淺表性腫瘤(pTl HG_l、pTl HG—2和pTlHG—3) 的3個(gè)庫聚類到一起并且不同于低級(jí)別淺表性腫瘤(pTl LG_l、pTl LG_2、pTlLG_3)的3個(gè) 庫，這應(yīng)該允許定位任意一途徑的標(biāo)記物基因(預(yù)后基因)。 作為用于比較不同組和獲得最不同表達(dá)的基因的分級(jí)系統(tǒng)，決定使用以對(duì)數(shù)標(biāo)度 的具有最小平均值的組的最大強(qiáng)度與具有最大平均值的組的最小強(qiáng)度的比率。該測(cè)量相當(dāng) 于能通過比較組的任意復(fù)制物與其他組的任意復(fù)制物獲得的最小倍數(shù)變化。所得最終結(jié)果 為在腫瘤和對(duì)照之間具有十分明顯表達(dá)差異的真正數(shù)千基因。
5.通討定量實(shí)時(shí)PCR所得的芯片結(jié)果的驗(yàn)證 —旦基因依次從多到少差異性表達(dá)，決定使用完全獨(dú)立的，并根據(jù)文獻(xiàn)精確得多的技術(shù)定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)來驗(yàn)證結(jié)果。選擇十種最不同表達(dá)基因進(jìn)行該技術(shù)驗(yàn)證，它們的基因表達(dá)通過qRT-PCR使用芯片中雜交的完全相同的庫(為了能比較兩種技術(shù)的結(jié)果)并使用各庫的單個(gè)試驗(yàn)(為了能研究實(shí)際qRT-PCR技術(shù)的重復(fù)性)來定量(圖5)。在芯片與qRT-PCR間的比較中獲得回歸系數(shù)O. 978，其表明2種技術(shù)間非常良好的重復(fù)性。當(dāng)比較通過qRT-PCR獲得的單個(gè)樣品的算數(shù)平均值和通過相同技術(shù)獲得的庫中它們的表達(dá)時(shí)，回歸系數(shù)為0. 995，這證實(shí)著錄數(shù)據(jù)的事實(shí)，通過qRT-PCR的定量具有優(yōu)良的技術(shù)品質(zhì)。
6.實(shí)施例2的結(jié)論 考慮到通過在基因的小群體中使用兩種完全獨(dú)立的技術(shù)基因表達(dá)定量觀察到的結(jié)果，能夠推斷通過芯片觀察到的表達(dá)看來對(duì)于后續(xù)更廣泛和具體的分析用于限定候選基因堅(jiān)實(shí)組(robust group)是充分可靠的。 平行地，推斷盡管芯片適于定量基因表達(dá)，除了允許樣品中更高的RNA降解水平而沒有負(fù)面影響最終結(jié)果以外，qRT-PCR也仍然更精確。
實(shí)施例3候詵某閔的第一次詵擇 該研究的最終目的在于選擇涉及膀胱TCC的基因的減化組以及在定量它們的表達(dá)時(shí)獲得診斷和預(yù)后腫瘤信息。為此，已驗(yàn)證能使用兩種技術(shù)，DNA芯片和定量實(shí)時(shí)PCR。通過芯片技術(shù)，在各試驗(yàn)中測(cè)試數(shù)千種基因，然而需要比用qRT-PCR方法更大量的具有更好品質(zhì)的RNA進(jìn)行試驗(yàn)。此外，后者是更精確的技術(shù)，能夠定量化感興趣基因的精確數(shù)量。因此，在研究的后續(xù)階段，決定使用基于qRT-PCR的TaqMan Low DensityArray (TLDA)技術(shù)。
1.用于TagMan Low Density Arrays (TLDA)卡的384種基因的選擇
TLDA是微流體卡(microfluidic card)，含有最多384種基因用凍干引物和TaqMan探針(存在不同TLDA配置，其允許分析從同一卡中的384種基因，一直到同一樣品中的48種基因和8個(gè)樣品)。因此，從通過用組織RNA雜交的Affymetrix芯片前述進(jìn)行的試驗(yàn)中，已選擇384種基因的亞組。選擇腫瘤和對(duì)照之間最不同表達(dá)的基因(診斷基因)以及三個(gè)腫瘤組pTa LG、 pTl HG和pT2 HG之間的差異性表達(dá)基因(預(yù)后基因)。
此外，已知本項(xiàng)目的目的之一是用膀胱液作業(yè)，在項(xiàng)目該階段中的意圖是能研究384種基因，不用組織RNA，而是直接用膀胱液(尿或膀胱洗液)，如迄今已進(jìn)行的。
2.膀胱洗液和尿的收集和加工 在切除膀胱腫瘤之前或囊切除之前，通過手術(shù)時(shí)抽液加藥注射法(barbotageintraope ratively)收集膀胱洗液樣品。尿樣品通過在患者進(jìn)入手術(shù)室之前自發(fā)排尿來收集。膀胱洗液樣品和尿樣品在收集后都立即在冰中運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。樣品與1/25體積的pH8. 0的0. 5M EDTA混合，在1000Xg下離心10分鐘。將細(xì)胞沉淀(cell pellet)重懸浮于1ml TRIzol(Invitrogen，Calsbad，CA，USA)中，并在_80°C下冰凍直至RNA提取。
收集并貯存425種腫瘤膀胱洗液樣品，30種對(duì)照膀胱洗液樣品，43種腫瘤尿樣品和158種對(duì)照尿樣品。
3. RNA提取和cDNA合成 根據(jù)TRIzol (Invitrogen， Calsbad， CA， USA)程序提取RNA，并通過分光光度法測(cè)量在260nm下的吸光度定量。
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由lug腿使用High-Capacity cDNA Archive Kit(Applied Biosystems， Foster
City， USA)根據(jù)供貨商的說明合成cDNA，除了最后的反應(yīng)體積減少至50 yl。4.詵擇"TaaMan某因表汰產(chǎn)物"和定量實(shí)時(shí)RT-PCR(aRT-PCR). —旦了解感興趣的基因，在Applied Biosystems web (htto: 〃www.
appliedbiosystems. com/)選擇弓|物禾口熒光探針(TaqMan Assays_on_Demand Gene
Expression Products)用于通過qRT-PCR的基因表達(dá)定量。 配置微流體卡(TaqMan Low Density Array, TLDA)，其包括384個(gè)試驗(yàn)，相應(yīng)于診斷基因和預(yù)后基因以及內(nèi)源性對(duì)照基因(圖8)。該TLDA配置允許每卡分析單個(gè)樣品。圖8的表指出基因名稱和符號(hào)，以及其中發(fā)現(xiàn)差異性基因表達(dá)的Affymetrix克隆。還限定為了 TaqMan Low Density Array微流體卡選擇的TaqMan Gene ExpressionAssay (http: //www, a加liedbiosystems. com/)名稱。該試驗(yàn)名稱依次表明將在qRT-PCR中擴(kuò)增的基因區(qū)。最后指出將用該試驗(yàn)擴(kuò)增的一個(gè)主要轉(zhuǎn)錄本(Ref Seq或Gene BankmRNA)。
在ABI PRISM 9700HD SDS(A卯lied Biosystems, Foster City， USA)中根據(jù)供貨商的說明進(jìn)行PCR。 通過384-基因TLDA分析總共60種樣品 _39種膀胱洗液樣品 -15種對(duì)照膀胱洗液樣品 _3種腫瘤尿樣品 _3種周圍血液樣品；這已知以基于Affymetrix芯片的預(yù)先分析進(jìn)行，在推測(cè)純的
膀胱粘膜樣品中觀察到肌肉組織污染，并且有跡象懷疑在膀胱液樣品中存在免疫系統(tǒng)所致的污染。因此，決定分析3種淋巴細(xì)胞樣品，以能夠通過比較消除在血液中高度表達(dá)的基因(已知血液是來自具有膀胱腫瘤的患者的膀胱液樣品中的恒定污染物)。
5. 384-基因TLDA的分析 —旦進(jìn)行所有PCR，通過SDS 2. 1程序(A卯lied Biosystems)確立最適于各基因的閾值水平和基線水平，以及Ct (循環(huán)閾值)或原始表達(dá)數(shù)據(jù)。 隨后，計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)測(cè)量或ACt(目標(biāo)基因的Ct-內(nèi)源性對(duì)照的Ct，在這個(gè)情況下的內(nèi)源性對(duì)照為GUSB)，研究通過無監(jiān)督聚類(使用歐幾里得距離和U PGMA)各個(gè)樣品如何聚類在一起(圖6)。在該聚類中觀察到的第一分類水平在為周圍血液和膀胱液(膀胱洗液和尿)樣品的3種樣品中的區(qū)別。此外，膀胱液亞聚類至在聚類上部聚類到一起的一個(gè)樣品組(從B 155-RVJ2high樣品至B288-RVlJaG2high樣品)，其僅由腫瘤膀胱液樣品形成，以及在聚類下部的另一個(gè)樣品組(從B71-RV_TaG21oWCIS樣品至B109_RV_T2high樣品)，其由腫瘤和對(duì)照膀胱液的混合物形成。在上部聚類內(nèi)部，高級(jí)別和低級(jí)別腫瘤能依次被辨別出，而在下部聚類中存在幾乎僅具有對(duì)照樣品的聚類和具有對(duì)照和腫瘤混合物的另一個(gè)聚類，必須考慮已發(fā)生從庫中分析組織到各個(gè)樣品中膀胱液的變化，因此通過聚類的辨別能力損失是相對(duì)可預(yù)測(cè)的。 該分析的目的是將在使用更大數(shù)量樣品的下一階段中要研究的基因從384減少至96。對(duì)選擇最好基因的過程考慮不同參數(shù)，包括前述統(tǒng)計(jì)參數(shù)(最小倍數(shù)變化)，還包括2個(gè)比較組中位值的對(duì)數(shù)標(biāo)度比例(中位值倍數(shù)變化)和通過不同強(qiáng)度值基因的個(gè)體化人工分析。這使得減少初始組384種基因至試驗(yàn)下一階段所需的96種基因(圖9)。
棚列4.細(xì)白條二雄柳乂土曾力口i條/予脂肯p匕力 在本階段作業(yè)中，目的是增加腫瘤和對(duì)照樣品之間的辨別能力。為此，意圖是分析更多數(shù)量膀胱液樣品，和如果可能減少至少一半數(shù)量的該診斷和預(yù)后系統(tǒng)應(yīng)該基于其的初始原型的基因。 1.要分析的樣品和96-某因TLDA 配置包括96個(gè)試驗(yàn)的微流體卡(Taq Man Low Density A rrays)(圖9)，并以與
384種基因相同的方式加工，區(qū)別在于該TLDA配置允許每卡分析4種樣品。 通過96-基因TLDA分析總共80種樣品 _42種腫瘤膀胱洗液樣品 -8種對(duì)照膀胱洗液樣品 _15種腫瘤尿樣品 -15種對(duì)照尿樣品 2. 96-某因TLDA的分析 已知試驗(yàn)前階段(實(shí)施例3)中使用的技術(shù)與本實(shí)施例中剛好相同，在本階段中分析的基因已包括在前面分析的384-基因TLDA中，決定提取新的80種樣品并將其數(shù)據(jù)添加到實(shí)施例3的60種樣品(總共=140種樣品)。 第一次分析通過具有96種基因表達(dá)的140種樣品的無監(jiān)督聚類進(jìn)行，能觀察到2個(gè)明確辨別的大組(圖7)。在第一組中(圖7. B)，所有樣品都是腫瘤樣品而沒有例外。相反，在第二組中(圖7.A)，大部分樣品是對(duì)照，但是有一些具有不能與常規(guī)樣品區(qū)別開的基因譜的腫瘤樣品。從該結(jié)果能得到的結(jié)論是大多數(shù)腫瘤都具有與對(duì)照樣品不同的特征基因譜，盡管存在一些基因譜無法與常規(guī)樣品區(qū)別開所以它們不能被檢測(cè)到的情況。觀察到與實(shí)施例3相同的效果，盡管樣品中的辨別能力現(xiàn)在更高。 基于由聚類觀察到的數(shù)據(jù)，在嘗試使用其他分類算法(如區(qū)別線性分析，k近
鄰算法(KNN)，等等)的合適的探討性分析中，能觀察到與持久(pe rsisted)對(duì)照樣品
有關(guān)的一些腫瘤的辨別問題。新的作業(yè)假說是使用特定基因組的區(qū)別測(cè)量的普遍計(jì)算
(globalcalculation)用的任意系統(tǒng)具有相同問題。這由以下事實(shí)組成，由于腫瘤的高異質(zhì)
性，相對(duì)容易識(shí)別具有大多數(shù)相似變化的它們大部分的譜，盡管總有選擇用于它們分析的
基因的普遍行為未與對(duì)照樣品區(qū)別開的少數(shù)情況，這是因?yàn)樗鼈兏淖兞松贁?shù)途徑。 為了檢測(cè)多數(shù)和少數(shù)腫瘤，通過以下方式建立"報(bào)警系統(tǒng)"確立對(duì)照樣品在其間
變化的值的范圍，并添加置信區(qū)間以使得能確定這樣的點(diǎn)從其更高(或在未表達(dá)基因的
情況下更低)的表達(dá)將表明腫瘤，不管在其他基因中觀察到的表達(dá)值。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于，
盡管腫瘤具有與健康樣品類似的總體表達(dá)譜，但是如果觸發(fā)報(bào)警基因中之一，則肯定樣品
是腫瘤樣品。 開發(fā)所述系統(tǒng)的第一步驟是評(píng)價(jià)對(duì)照的表達(dá)范圍和它們的置信區(qū)間。因?yàn)閷?duì)于對(duì)照值非常重要的是沒有將錯(cuò)誤地改變范圍的技術(shù)誤差，決定排除沒有最小品質(zhì)水平的對(duì)照。為了計(jì)算該品質(zhì)測(cè)量，使用3種基因(GUSB、18S和PPIA)，其此外可用作所有基因相對(duì)定量用的內(nèi)源性對(duì)照(通過計(jì)算它們的幾何平均值)。通過分析各基因分布的個(gè)體行為，不可能證實(shí)滿足充分適于正態(tài)分布，因此不能確立基于其方差的置信區(qū)間。作為替代，決定確立具有不同的嚴(yán)格水平任意的固定置信區(qū)間(決定使用2倍、4倍或8倍對(duì)照值，該對(duì)照值具有更類似于作為閾值點(diǎn)的腫瘤的表達(dá)值)。 —旦確定對(duì)于各基因的閾值點(diǎn)，所有該信息都概括于具有針對(duì)腫瘤樣品的96種基因的矩陣中。不超過閾值水平的值標(biāo)記為O，超過閾值水平的那些標(biāo)記為l(對(duì)于每一嚴(yán)格水平)。為了選擇最好的基因(意圖用其減少譜至至少48種)，考慮兩種性質(zhì)1)基因能檢測(cè)更大數(shù)量的腫瘤(搜索具有更大的值1之和的基因)和2)該檢測(cè)盡可能地與其它報(bào)警基因獨(dú)立(為了能檢測(cè)最大量的少數(shù)途徑)。 結(jié)果，感興趣基因數(shù)能減少至小于48，盡管由于技術(shù)原因和保守，決定在隨后階段中對(duì)于它們的分析保持該數(shù)目，這是因?yàn)閷?duì)照中的一些區(qū)間可能不完全正確(由于迄今分析的對(duì)照樣品的低數(shù)目)。 為了使分析新樣品48種選擇基因的基因譜的過程自動(dòng)化(圖10)，創(chuàng)作計(jì)算機(jī)程序，其從由qRT-PCR獲得的Ct結(jié)果開始，能進(jìn)行診斷預(yù)測(cè)。該程序能使用不同參數(shù)文件(有賴于區(qū)間的嚴(yán)格性)，因此靈敏度(SN)和特異性(S P)值變化。使用最不嚴(yán)格的參數(shù)文件(閾值點(diǎn)為最接近腫瘤的對(duì)照的二倍)，獲得SN = 100%和SP = 100%。在第二參數(shù)文件(閾值點(diǎn)為最接近腫瘤的對(duì)照的4倍)中，獲得SN = 98. 96%和SP = 100% 。在最后的情況下(閾值點(diǎn)為最差對(duì)照的8倍)，獲得SN = 97. 93%和SP = 100% 。重要的是指出這些結(jié)果從用于生成參數(shù)文件的相同樣品上獲得，因此可能發(fā)生過度擬合，其在后續(xù)試驗(yàn)中有必要用新樣品評(píng)價(jià)。 實(shí)施例5最終諗斷樽型的開發(fā) 在項(xiàng)目該階段中的目的是測(cè)試并改善腫瘤預(yù)測(cè)模型以及減少用于實(shí)施該預(yù)測(cè)的基因數(shù)至最小。 對(duì)于該階段，有必要擴(kuò)增更多得多的腫瘤合對(duì)照樣品組。通過具有48種基因的微流體卡分析440種新樣品，其已添加至實(shí)施例3(60種樣品)和實(shí)施例4(80種樣品)的數(shù)據(jù)。 —旦進(jìn)行樣品中最低品質(zhì)的對(duì)照，它們通過前述定性報(bào)警模型來分析。所得結(jié)果(SN = 0. 81和SP = 0. 81)明顯不同于用實(shí)施例4的最終模型獲得的結(jié)果，因此決定嘗試改進(jìn)它，這是因?yàn)樗赡芫哂泻芏噙^度訓(xùn)練。 從各基因的離散化頻率直方圖的觀察，能夠觀察到腫瘤和對(duì)照樣品如何分布。由于具有大幅增加取樣的事實(shí)，分配間的重疊限制已經(jīng)明顯減少。還能觀察到盡管以非常低的頻率， 一些對(duì)照情況也具有與腫瘤非常類似的表達(dá)水平。 盡管在概念上的水平，也仍然認(rèn)為開發(fā)的定性報(bào)警系統(tǒng)對(duì)基因表達(dá)的細(xì)胞行為有
良好的近似，定量各基因重要性的不可能性表現(xiàn)出對(duì)其預(yù)測(cè)能力的嚴(yán)重限制。 基于相同的報(bào)警概念，決定嘗試開發(fā)定量模型，這通過使用貝氏條件概率定理
(Bayes， conditional probability theorem)是可會(huì)g的。 因?yàn)榉治龅臉悠窋?shù)足夠高，給出表達(dá)值，樣品是腫瘤或?qū)φ盏母怕誓軓挠^察到的表達(dá)頻率評(píng)價(jià)。 基于貝氏理論的模型的優(yōu)點(diǎn)之一是能獨(dú)立應(yīng)用于各傳感器基因。觀察到的基因表達(dá)將改變作為腫瘤的先驗(yàn)概率，給出后驗(yàn)概率，其能作為下一基因的先驗(yàn)概率再次使用。事實(shí)上，暗中假定不同基因之間的獨(dú)立性。 已可能應(yīng)用該模型的最終樣品數(shù)為308種腫瘤和156種對(duì)照。
當(dāng)該模型反復(fù)應(yīng)用于該48種基因時(shí)，獲得前述定性模型預(yù)測(cè)能力的明顯改進(jìn)(SN=0. 86和SP = 0. 92)，盡管通過研究頻率直方圖能夠觀察到很多基因看來沒有提供明顯信息至最終模型。因此，建議選擇對(duì)于獲取最大量樣品診斷信息充分且必要的基因亞組。
沒有明確方式通過使用定量模型進(jìn)行最感興趣基因的選擇。舊的定性模型不允許選擇最有益的基因，反過來它們之間具有更高的獨(dú)立性。對(duì)于新的定量模型采用定性模型檢測(cè)出的最好基因(CTSE、MAGEA3、CRH、SLClA6、PPPlR14D、IGF2、C14orf78和KLF9)的結(jié)果顯示出結(jié)果的重要改進(jìn)(SN = 0. 89和SP = 0. 96)。 在任何情況下，決定嘗試其他近似值。從48種基因頻率直方圖的目視分析，選擇明顯最多信息的亞組(ANXAIO、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 P0STN、 SLC1A6和TERT)，其具有彼此之間最多變化的直方圖(期望這個(gè)事實(shí)指出它們之間更高的獨(dú)立性)。所得結(jié)果還顯示出與48種基因的分析有關(guān)的明顯改進(jìn)(SN = 0. 90和SP = 0. 96)。 最后，由于通過定性模型獲得的基因亞組和目視選擇的基因均顯示出與初始定量模型有關(guān)的改進(jìn)，決定組合2近似值的基因(ANXAIO、 C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、KRT20、 MAGEA3、 P0STN、 PPP1R14D、 SLC1A6和TERT)。組合模型的結(jié)果略好于它們的任一者(SN = 0. 91和SP = 0. 96)。 —旦獲得模型，決定研究不良分類的腫瘤和對(duì)照中是否有任何共同模式。在對(duì)照的情況下，能夠檢測(cè)到明顯存在與泌尿系統(tǒng)(主要是前列腺、腎和陰莖)聯(lián)系的具有腫瘤的樣品。這些類型的樣品可能具有共同的具有膀胱腫瘤的表達(dá)模式，因此它們能夠淆亂預(yù)測(cè)模型。因此，決定從對(duì)照樣品中排除所有具有可能與泌尿系統(tǒng)聯(lián)系的腫瘤的情況。
對(duì)照樣品數(shù)從156減少至126，還有308種腫瘤樣品。在該新的群體上通過使用具有48種基因的定量模型觀察到重要改進(jìn)(SN = 0. 90和SP = 0. 93)。在8種最獨(dú)立基因的情況下，獲得SN = 0. 91和SP = 0. 97。在具有最感興趣直方圖的亞組中，獲得SN = 0. 91和SP二0.97。最后，在組合的基因亞組中，獲得SN = 0.93和SP = 0.97。通過用各前面選擇的亞組再次計(jì)算數(shù)據(jù)，通常能夠看出模型的能力已通過排除這些對(duì)照類型而增加。
關(guān)于不良分類腫瘤的研究，檢測(cè)到在該組中存在的囊切除數(shù)明顯增加。認(rèn)為先前的經(jīng)常在時(shí)間上非常接近于根治性手術(shù)進(jìn)行的經(jīng)尿道切除術(shù)(TUR)能改變觀察到的分子譜，這是因?yàn)槟[瘤物質(zhì)已從膀胱的上皮壁部分或完全地物理除去。盡管在該研究中沒有排除囊切除術(shù)的情況，這是因?yàn)閿?shù)據(jù)不是決定性的，建議在新群體的分析中不包括這些樣品種類。實(shí)施例6最終預(yù)后模型的開發(fā) 盡管最重要的關(guān)心事件是腫瘤預(yù)測(cè)(診斷預(yù)測(cè))，還對(duì)分類不同腫瘤類型有興趣(預(yù)后預(yù)測(cè))，這是本節(jié)的主要目的。該分類能允許進(jìn)一步在各情況下的個(gè)性化治療。
腫瘤分類目前基于病理解剖實(shí)驗(yàn)室中的宏觀和微觀觀察。它們的分類通過基于腫瘤深度和細(xì)胞微觀外觀的大致標(biāo)準(zhǔn)化觀察決定。近來的分子研究看來表明實(shí)際上有主要區(qū)分淺表性類型腫瘤和浸潤性腫瘤的兩種不同基因譜。 為進(jìn)行預(yù)后分類模型，必須正確區(qū)分腫瘤組的不同組。病理解剖觀察并不保證與樣品在分子水平下的行為匹配，因此僅從該分類派生預(yù)后模型看來不是好主意。除了考慮病理解剖學(xué)(AP)級(jí)別以外，選擇使用通過無監(jiān)督聚類的分類系統(tǒng)(其主要區(qū)分樣品至2個(gè)大組)。 作為有效淺表性腫瘤樣品組，對(duì)于它們有必要根據(jù)相應(yīng)于它們的組中的聚類來聚
22類到一起，而且根據(jù)AP它們?yōu)榈图?jí)別Ta、Tl腫瘤而與原位癌(cis)無關(guān)。浸潤性腫瘤屬于
相應(yīng)的聚類組，而且根據(jù)AP它們?yōu)楦呒?jí)別Tl、 T2、 T3或T4腫瘤以及任何存在CIS的腫瘤。 在定義為淺表性腫瘤的樣品組中，分類308種腫瘤中的129種。在定義為浸潤性
腫瘤的組中，分類308種腫瘤中的IOO種。最后，79種腫瘤樣品具有它們的病理解剖學(xué)分類
和它們的分子譜之間的不一致，或者并未明確定義為兩種主要聚類組內(nèi)。 用于創(chuàng)造能區(qū)別淺表性和浸潤性腫瘤的模型的方法與實(shí)施例5中用于獲得診斷
模型的方法完全相同。 當(dāng)采用48種基因應(yīng)用貝氏理論時(shí)，獲得良好的分類(SN = 0. 97和SP = 0. 96)。
通過分析頻率直方圖能觀察到，用于診斷的感興趣基因與預(yù)后基因在相當(dāng)程度上 重合。然而，存在一些基因(MCM10和ASAM)不適于診斷卻適于預(yù)后，因此將這兩種基因添 加至12種預(yù)先選擇的基因。所得具有14種基因的模型證實(shí)幾乎完美地作業(yè)(SN = 0. 99 和SP = 1. 00)。表1包括這14種基因，其包括選擇用于TaqMan Low Density Array微流 卡的基因符號(hào)禾口 TaqMan Gene Expression Assay名稱。表lTaqMan Gene基因符號(hào)Expression AssayANXA10Hs00200464mlC14orf78Hs00746838slCTSEHs00157213mlCRHHs00174941mlIGF2Hs00171254mlKLF9Hs00230918mlKRT20Hs00300643mlMAGEA3Hs00366532mlPOSTNHs00170815mlPPP1R14DHs00214613mlSLC1A6Hs00192604mlTERTHs00162669mlASAMHs00293345mlMCM10Hs00218560ml
權(quán)利要求
一種體外非侵入性膀胱癌診斷和/或預(yù)后方法，其包括a.從受試者收集膀胱液樣品；b.檢測(cè)和定量所述膀胱液樣品中ANXA10、C14orf78、CTSE、CRH、IGF2、KLF9、KRT20、MAGEA3、POSTN、PPP1R14D、SLC1A6、TERT、ASAM和MCM10基因的組合的表達(dá)模式；和c.將在步驟b)中得到的結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考值比較。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的體外非侵入性方法，其特征在于所述膀胱液樣品是尿。
3. —種體外非侵入性膀胱癌診斷和/或預(yù)后方法，其包括a. 從受試者收集膀胱液樣品；b. 檢測(cè)和定量所述膀胱液樣品中ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6、 TERT和MCM10基因的組合的表達(dá)模式；禾口c. 將在步驟b)中得到的結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考值比較。
4. 一種體外非侵入性膀胱癌診斷和/或預(yù)后方法，其包括a. 從受試者收集膀胱液樣品；b. 檢測(cè)和定量所述膀胱液樣品中選自C14orf78、 KLF9、 POSTN、 PPP1R14D、 ASAM及其組 合的基因的表達(dá)；禾口c. 將在步驟b)中得到的結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考值比較。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，包括C14orf78基因的檢測(cè)和定量。
6. 根據(jù)權(quán)利4的方法，包括KLF9基因的檢測(cè)和定量。
7. 根據(jù)權(quán)利4的方法，包括POSTN基因的檢測(cè)和定量。
8. 根據(jù)權(quán)利4的方法，包括PPPIR14D基因的檢測(cè)和定量。
9. 根據(jù)權(quán)利4的方法，包括ASAM基因的檢測(cè)和定量。
10. 根據(jù)權(quán)利4-9任一項(xiàng)的方法，另外包括至少一種選自ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、MAGEA3、 SLC1A6、 TERT和MCM10的基因的檢測(cè)和定量。
11. 一種體外非侵入性膀胱癌診斷方法，其包括a. 從受試者收集膀胱液樣品；b. 檢測(cè)和定量所述膀胱液樣品中ANXAIO、 C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、 KRT20、 MAGEA3、 P0STN、 PPP1R14D、 SLC1A6和TERT基因的組合的表達(dá)模式；禾口c. 將在步驟b)中得到的結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考值比較。
12. —種體外侵入性膀胱癌診斷方法，其包括a. 從受試者收集膀胱液樣品；b. 檢測(cè)并定量所述膀胱液樣品中ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6和 TERT基因的組合的表達(dá)模式；禾口c. 將在步驟b)中得到的結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考值比較。
13. —種體外非侵入性膀胱癌診斷方法，其包括a. 從受試者收集膀胱液樣品；b. 檢測(cè)和定量所述膀胱液樣品中選自C14orf78、KLF9、P0STN、PPPlR14D及其組合的基 因的表達(dá)；禾口c. 將在步驟b)中得到的結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考值比較。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，包括C14orf78基因的檢測(cè)和定量。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，包括KLF9基因的檢測(cè)和定量。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，包括POSTN基因的檢測(cè)和定量。
17. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，包括PPPIR14D基因的檢測(cè)和定量。
18. 根據(jù)權(quán)利要求13-17任一項(xiàng)的方法，另外包括至少一種選自ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6和TERT的基因的檢測(cè)和定量。
19. 一種體外非侵入性膀胱癌預(yù)后方法，其包括a. 從受試者收集膀胱液樣品；b. 檢測(cè)和定量所述膀胱液樣品中ASAM和MCM10基因的組合的表達(dá)模式；禾口c. 將在步驟b)中得到的結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考值比較。
20. —種體外非侵入性膀胱癌預(yù)后方法，其包括a. 從受試者收集膀胱液樣品；b. 檢測(cè)和定量所述膀胱液樣品中ASAM基因的表達(dá)；禾口c. 將在步驟b)中得到的結(jié)果與膀胱液中所述基因的常規(guī)參考值比較。
21. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于b)中基因表達(dá)的定量通過定量實(shí)時(shí) PCR進(jìn)行。
22. ANXA10、C14orf78、CTSE、CRH、IGF2、KLF9、KRT20、MAGEA3、POSTN、PPPlR14D、SLClA6、 TERT、ASAM和MCM10基因的組合作為膀胱癌診斷和/或預(yù)后標(biāo)記物的用途。
23. ANXA10、CTSE、CRH、 IGF2、KRT20、MAGEA3、 SLC1A6、 TERT和MCM10基因的組合作為膀 胱癌診斷和/或預(yù)后標(biāo)記物的用途。
24. 選自C14orf78、KLF9、POSTN、PPPlR14D、ASAM及其組合的基因作為膀胱癌診斷和/ 或預(yù)后標(biāo)記物的用途。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中C14orf78基因作為膀胱癌診斷和/或預(yù)后標(biāo)記物。
26. 根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中KLF9基因作為膀胱癌診斷和/或預(yù)后標(biāo)記物。
27. 根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中POSTN基因作為膀胱癌診斷和/或預(yù)后標(biāo)記物。
28. 根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中PPP1R14基因作為膀胱癌診斷和/或預(yù)后標(biāo)記物。
29. 根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中ASAM基因作為膀胱癌診斷和/或預(yù)后標(biāo)記物。
30. 選自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、 ASAM及其組合的基因與至少一種選自 ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6、 TERT及MCM10的基因的組合作為膀胱癌 診斷和/或預(yù)后標(biāo)記物的用途。
31. ANXA10 、 C14orf78 、 CTSE、 CRH、IGF2 、 KLF9 、 KRT20 、 MAGEA3 、 P0STN、 PPP1Rl4D、 SLC1A6 和TERT基因的組合作為膀胱癌診斷標(biāo)記物的用途。
32. ANXA10、CTSE、CRH、 IGF2、KRT20、MAGEA3、 SLC1A6和TERT基因的組合作為膀胱癌診 斷標(biāo)記物的用途。
33. 選自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D及其組合的基因作為膀胱癌診斷標(biāo)記物的 用途。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33的用途，其中C14orf78基因作為膀胱癌診斷標(biāo)記物.
35. 根據(jù)權(quán)利要求33的用途，其中KLF9基因作為膀胱癌診斷標(biāo)記物。
36. 根據(jù)權(quán)利要求33的用途，其中POSTN基因作為膀胱癌診斷標(biāo)記物。
37. 根據(jù)權(quán)利要求33的用途，其中PPP1R14D基因作為膀胱癌診斷標(biāo)記物。
38. 選自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D及其組合的基因與至少一種選自ANXAIO、 CTSE、CRH、 IGF2、KRT20、MAGEA3、SLC1A6及TERT的基因的組合作為膀胱癌診斷標(biāo)記物的用 途。
39. ASAM和MCM10基因的組合作為膀胱癌預(yù)后標(biāo)記物的用途。
40. ASAM基因作為膀胱癌預(yù)后標(biāo)記物的用途。
41. 一種用于實(shí)施權(quán)利要求1的方法的膀胱癌診斷和/或預(yù)后試劑盒，包括一組探 針，所述一組探針適于ANXAIO、 C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、 KRT20、 MAGEA3、 P0STN、 PPP1R14D、 SLC1A6、 TERT、 ASAM和MCM10基因的組合的表達(dá)模式的檢測(cè)和定量。
42. —種用于實(shí)施權(quán)利要求3的方法的膀胱癌診斷和/或預(yù)后試劑盒，包括一組探針， 所述一組探針適于ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6、 TERT和MCM10基因的 組合的表達(dá)模式的檢測(cè)和定量。
43. —種用于實(shí)施權(quán)利要求4的方法的膀胱癌診斷和/或預(yù)后試劑盒，包括一組探針， 所述一組探針適于選自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、 ASAM及其組合的基因的檢測(cè)和 定量。
44. 一種用于實(shí)施權(quán)利要求10的方法的膀胱癌診斷和/或預(yù)后試劑盒，包括一組探針， 所述一組探針選自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、 ASAM及其組合的基因以及至少一種 選自ANXA10、CTSE、CRH、IGF2、KRT20、MAGEA3、SLC1A6、TERT及MCMIO的基因的檢測(cè)和定量。
45. —種用于實(shí)施權(quán)利要求11的方法的膀胱癌診斷試劑盒，包括一組探針，所述一組 探針適于ANXA10 、 C14orf 78 、 CTSE、 CRH、 IGF2 、KLF9 、KRT20 、MAGEA3 、P0STN、PPP1 Rl4D、 SLC1A6 和TERT基因的組合的表達(dá)模式的檢測(cè)和定量。
46. —種用于實(shí)施權(quán)利要求12的方法的膀胱癌診斷試劑盒，包括一組探針，所述一組 探針適于ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6和TERT基因的組合的表達(dá)模式 的檢測(cè)和定量。
47. —種用于實(shí)施權(quán)利要求13的方法的膀胱癌診斷試劑盒，包括一組探針，所述一組 探針適于選自C14orf78、KLF9、POSTN、PPPlR14D及其組合的基因的檢測(cè)和定量。
48. —種用于實(shí)施權(quán)利要求18的方法的膀胱癌診斷試劑盒，包括一組探針，所述一 組探針適于選自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D及其組合的基因以及至少一種選自 ANXAIO、 CTSE、 CRH， IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6及TERT的基因的檢測(cè)和定量。
49. 一種用于實(shí)施權(quán)利要求19的方法的膀胱癌預(yù)后試劑盒，包括一組探針，所述一組 探針適于ASAM和MCM10基因的組合的表達(dá)模式的檢測(cè)和定量。
50. —種用于實(shí)施權(quán)利要求20的方法的膀胱癌預(yù)后試劑盒，所述試劑盒包括適于ASAM 基因檢測(cè)和定量的探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及體外非侵入性膀胱癌診斷和/或預(yù)后方法，其基于膀胱液中作為所述疾病遺傳標(biāo)記物的某些基因和/或其組合的基因表達(dá)的檢測(cè)和定量。還預(yù)期膀胱癌診斷和/或預(yù)后試劑盒，其基于使用適于所述基因的表達(dá)模式的檢測(cè)和定量的一組探針。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101730848SQ200780053065
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2007年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月20日
發(fā)明者依麗薩貝·阿爾斯·克里阿克, 安東尼奧·阿爾瓦雷斯·阿森西奧, 洛雷德斯·門瓜爾·布里切斯, 瑪麗亞·何塞·納瓦·卡帕羅斯, 莫伊塞斯·布爾塞特·阿爾瓦雷達(dá) 申請(qǐng)人:因達(dá)斯生物有限公司