專利名稱：含有ape1/ref-1的膀胱癌診斷用組合物及利用其的膀胱癌診斷儀的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有ΑΡΕΙ/Ref-l的膀胱癌診斷用組合物及利用其的膀胱癌診斷儀。
背景技術：
膀胱癌是在泌尿系統(tǒng)癌癥中最常見的癌癥，其產生原因也較多地被查明。主要被認為吸煙或者各種化學物質(例如，皮革等染色涂料、大氣污染物、人造甜味劑、硝酸鹽)被吸入到體內后，通過小便排泄出來的同時刺激膀胱壁，從而誘發(fā)癌癥。在傳統(tǒng)的膀胱癌檢查中使用從小便中找出非正常細胞的方法，但是其精確度低。此外，將導液管(導管)插入到膀胱后，摘除并檢查疑似癌變組織的膀胱鏡檢查是侵入式方法，從而具有較高的精確度。通常，如果在早期診斷出膀胱癌，則患者的生存率高，但是實際上不易在早期診斷出膀胱癌?，F(xiàn)有使用的膀胱癌診斷方法是使用切開身體的一部分的方法，但是其很難在早期診斷出膀胱癌。膀胱癌根據(jù)是否侵襲到膀胱肌層來區(qū)分為淺表性或者浸潤性癌癥，在診斷時平均大約30%的患者屬于浸潤性膀胱癌。由此，如果要延長患者的生存期，則最好在病變范圍小時進行早期診斷。由此，迫切需要開發(fā)與現(xiàn)有的各種膀胱癌診斷方法相比更有效率的診斷方法，換句話說，膀胱癌特異性生物標記物，其可進行早期診斷，并且可大量處理臨床標本，并且靈敏度及特異性高。另夕卜，APEl/Ref-1 (apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox factor-1)是由包括氧化還原區(qū)(redox region)、DNA修復區(qū)(DNA repair region)的318個氨基酸構成的多功能蛋白質。上述蛋白質被認為具有如下功能:在DNA損傷時復原損傷部位的APEl的功能，以及如AP-1、NF-kB 一樣的轉錄因子的還原性調節(jié)功能(redox function)(Gurusamy, Malik et al.2007)。APEl/Ref-1的轉錄因子還原性調節(jié)功能在許多轉錄因子的DNA結合區(qū)中將作為氧化型半胱氨酸(cysteine)的殘余物進行還原，從而執(zhí)行易于轉錄的作用(Xanthoudakis, Miao et al.1994; Tell, Damante et al.2005)。APEl/Ref-1存在于所有的細胞及組織，并且細胞內表達位置被認為根據(jù)細胞而有所不同。在轉錄階段及轉錄后階段的水平時對ΑΡΕΙ/Ref-l的表達調節(jié)進行調節(jié)。增加ΑΡΕΙ/Ref-l的表達的主要原因是活性氧簇(reactive oxygen species ;R0S)。在巨卩遼細胞及淋巴球對過氧化氫及次氯酸(hypochlorous acid ；H0CI)進行處理時，細胞內APEl/Ref-1的表達會增加，上述APEl/Ref-Ι的表達增加被認為用于保護細胞的毒性及氧化性損傷的細胞的適應反應(R_ana Boldogh et al.1998)。對于APEl/Ref-Ι的細胞內位置的報告有各種各樣。如果對ΑΡΕΙ/Ref-l的蛋白質序列進行分析，則可想到上述各種細胞內位置的多樣性。在APEl/Ref-Ι的氨基酸末端部位(endsite)存在有核定位信號(nuclear localization signal; NLS ) (Jackson, Theriotet al.2005)，并且被認為在作為半胱氨酸的93號和310號氨基酸的氮化合中存在有核輸出信號(nuclear export si gnal; NES)，上述核輸出信號將存在于核內的ΑΡΕΙ/Ref-l移動至細胞質(Qu，Liu et al.2007)。另外，在線粒體中也被確認有ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白質的表達(Chattopadhyay, Wiederhold et al.2006)。生成于細胞內的APEl/Ref-Ι蛋白質可游離至細胞外。在巨噬細胞中，根據(jù)內毒素的細胞活性及炎癥反應將ΑΡΕΙ/Ref-l游離至細胞外。由此，正確測定ΑΡΕΙ/Ref-l的能力被認為在心腦血管疾病、傳染疾病及腫瘤等許多生物學過程中對ΑΡΕΙ/Ref-l的潛在性作用等進行理解時很重要。但是，到目前為止還沒有對于ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白質是否作為膀胱癌診斷用標記物進行作用的報告，與此相關的研究也處于全無的狀態(tài)。由此，迫切需要生物標記物的開發(fā)，其在健康檢查時，從血液中簡便地早期診斷出膀胱癌，從而可增加患者的生存率。

發(fā)明內容
本發(fā)明者在對早期可迅速簡便正確地診斷出膀胱癌的生物標記物進行研究中，APEl/Ref-Ι蛋白質的濃度在與正常人的血清中ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白質的濃度相比較，在膀胱癌患者的血清中，特別是在2期以上的膀胱癌患者的血清中明顯地增加，并且與復發(fā)次數(shù)無關，對如下進行確認后完成了本發(fā)明:APE1/Ref-1蛋白質的濃度在膀胱癌患者的血清中增加。本發(fā)明提供含有ΑΡΕΙ/Ref-l的膀胱癌診斷用組合物。另外，本發(fā)明提供膀胱癌診斷儀，其含有特異性地結合于ΑΡΕΙ/Ref-l的抗體。另外，本發(fā)明提供一種測定ΑΡΕΙ/Ref-l的濃度的方法，該方法通過利用了特異性地結合于膀胱癌標記物即APEl/Ref-Ι的抗體的抗原-抗體結合反應在生物試樣中測定APEl/Ref-Ι 的濃度。本發(fā)明的APEl/Ref-Ι的濃度與正常人的血清中ΑΡΕΙ/Ref-l的濃度相比較，在膀胱癌患者的血清中，特別是在2期以上的膀胱癌患者的血清中明顯地增加。另外，在膀胱癌復發(fā)的情況下，與復發(fā)次數(shù)無關，APEl/Ref-Ι的蛋白質濃度與未復發(fā)的初期膀胱癌患者的血清中ΑΡΕΙ/Ref-l的蛋白質濃度相比較，在膀胱癌患者的血清中有明顯地增加。由此，本發(fā)明的ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白質可早期預測膀胱癌的診斷或者預后，因此可有效地使用為膀胱癌診斷用標記物。


圖1是表示ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白質的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)標準曲線的圖。圖2是在膀胱癌患者和正常人的血清中通過夾心酶聯(lián)免疫分析(SANDWICHELISA)法測定APEl/Ref-1蛋白質的濃度后進行比較的圖。圖3是表示根據(jù)膀胱癌各個階段的膀胱癌患者的血清中APEl/Ref-Ι蛋白質的濃度的圖。圖4是表示根據(jù)膀胱癌的復發(fā)次數(shù)及病變數(shù)的膀胱癌患者的血清中APEl/Ref-1蛋白質的濃度的圖[(A)Rtl:未復發(fā)，R1:復發(fā)次數(shù)為I次，R3:復發(fā)次數(shù)為3次，R7:復發(fā)次數(shù)為7次；⑶single:單發(fā)性 ，multiple:多發(fā)性]。
具體實施方式
本發(fā)明提供含有ΑΡΕΙ/Ref-l的膀胱癌診斷用組合物。另外，本發(fā)明提供含有抗體的膀胱癌診斷儀，上述抗體特異性地結合于APEl/Ref-10另外，本發(fā)明提供一種測定ΑΡΕΙ/Ref-l的濃度的方法，該方法通過利用了特異性地結合于膀胱癌標記物即APEl/Ref-Ι的抗體的抗原-抗體結合反應在生物試樣中測定APEl/Ref-Ι的濃度。以下，對本發(fā)明進行詳細說明。本發(fā)明的APEl/Ref-Ι蛋白質的濃度在膀胱癌患者的血清中高于正常人的血清中APEl/Ref-Ι蛋白質濃度的1.5 3.5倍，并且患膀胱癌的階段越高，特別是在2期以上的膀胱癌患者的血清中明顯地增加。另外，當膀胱癌復發(fā)時，與復發(fā)次數(shù)無關，ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白質的濃度在膀胱癌患者的血清中與在未復發(fā)的初期膀胱癌患者的血清中的APEl/Ref-Ι蛋白質的濃度相比較明顯地增加。由此，本發(fā)明的ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白質可早期預測膀胱癌的診斷或者預后，因此可有效地使用為膀胱癌診斷用標記物。另外，利用上述ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白質并根據(jù)通常使用于所屬領域的制造方法可易于制造本發(fā)明的膀胱癌診斷儀，本發(fā)明的上述膀胱癌診斷儀包括有特異性地結合于APEl/Ref-1的抗體。上述膀胱癌診斷儀可包括與抗體、二次抗體接合物、標志物進行發(fā)色反應的發(fā)色基質溶液、清洗溶液及酶反應停止溶液等，上述抗體特異性地結合于ΑΡΕΙ/Ref-l，上述二次抗體接合物(conjugate)接合有通過與基質反應而發(fā)色的標志物。優(yōu)選地，上述二次抗體接合物的標志物為進行發(fā)色反應的通常的發(fā)色劑，并且可使用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、喊性憐酸酶(alkaline phosphatase)、膠體金(coloid gold)、異硫氰酸突光素(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate)、羅丹明B異硫氰酸鹽(rhodamine-B-1sothiocyanate)等突光物質(fluorescein)及色素(dye)等。

優(yōu)選地，上述發(fā)色基質溶液根據(jù)標志物進行使用，可使用四甲基聯(lián)苯胺(3，3’，5，5’-Tetramethyl benzidine)、2, 2_聯(lián)氮-二(3_ 乙基-苯并噻唑_6_橫酸)二銨鹽(ABTS)、鄰苯二胺(o-phenylenediamine)等。此時，更優(yōu)選地,發(fā)色基質在溶解于緩沖溶液(0.1MNaOAc, Ph5.5)的狀態(tài)下提供。優(yōu)選地，清洗溶液包括磷酸鹽緩沖溶液、氯化鈉(NaCL)及吐溫20，并且更優(yōu)選為由0.02M磷酸鹽緩沖溶液、0.13M氯化鈉(NaCL)及0.05%吐溫20構成的緩沖溶液(PBST)。清洗溶液在抗原-抗體結合反應后，將抗原-抗體結合物與2次抗體進行反應，之后將適當量添加于固定體，從而進行3至6次清洗。反應停止溶液可使用為磺酸溶液。另外，本發(fā)明中，通過抗原-抗體結合反應在生物試樣中測定ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白質的濃度，從而可早期預測膀胱癌的診斷或者預后，上述抗原-抗體結合反應利用特異性地結合于作為膀胱癌標記物的APEl/Ref-Ι的抗體。具體地，將生物試樣與固定化于固定體的捕獲抗體進行接觸，并且將從固定化的捕獲抗體中剩余的試樣進行分離后，將固定化的捕獲抗體-分子靶向復合體與檢測抗體進行接觸。之后，利用可認知檢測抗體的檢測方法來在生物試樣中測定APEI/Ref-1蛋白質的濃度。換句話說，在膀胱癌患者和正常人的血清中測定ΑΡΕΙ/Ref-l的濃度后進行比較，從而如果在膀胱癌患者的血清中的APEl/Ref-Ι的濃度高于正常人的血清中的ΑΡΕΙ/Ref-l的濃度，則診斷為具有膀胱癌或者預測為會具有膀胱癌。特別是，APEl/Ref-Ι蛋白質的濃度在膀胱癌的階段越高，優(yōu)選地，2期以上的膀胱癌患者的血清中有明顯增加。上述生物試樣可包括從哺乳動物中提取的如組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、咳痰、小便一樣的試樣，但是并不限于此。上述試樣在使用之前可通過過濾、蒸餾、提取、濃縮、阻礙成分的失活、試劑的添加等進行預處理。用于上述抗原-抗體結合反應的固定體可使用硝酸纖維膜、聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride membrane)、聚乙烯樹脂或者由聚苯乙烯樹脂合成的96孔板以及形成為玻璃的載片等。上述抗原-抗體結合反應可利用通常的如下方法來執(zhí)行:酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、放射免疫分析法(radioimmnoassay, RIA)、夾心酶聯(lián)免疫吸附測試法(SANDWICHELISA)、蛋白質印跡法、免疫沉淀法、免疫組織化學染色法(immnohi stochemicalstaining)、流式細胞術測定法(Flow Cytometry)、突光活化細胞分類法(FACS)、酶基質發(fā)色法、抗原-抗體凝沉法等。本發(fā)明中，抗體可以是整體形態(tài)的抗體(以下稱為“全抗體”)或者其功能性的片段。上述全抗體可以是單體或者是結合有2個以上的全抗體的聚合體的形態(tài)。上述抗體的功能性片段為具有全抗體的中鏈及輕鏈可變區(qū)的抗體，實質上意味著認知與全抗體認知相同的抗原結合區(qū)(印itope)。在上述抗體的功能性的片段中包括有單鏈可變區(qū)片段(scFv)、(scFv) 2、Fab、Fab’及F (ab’)2等，但是并不限于此。上述單鏈可變區(qū)(scFv)意味著抗體片段，上述抗體片段中，中鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過連接肽進行連接，從而具有單鏈多肽形態(tài)。上述抗體結合于如酶、熒光物質、輻射物質及蛋白質等各種分子后可進行變形。變形的抗體可通過化學方法來進行變形并提取。上述變形方法通常使用于所屬領域。另外，上述抗體可提取為嵌合抗體(chimeric antibody),上述嵌合抗體結合有來自于非人類抗體中的可變區(qū)(variable re gion)和來自于人類抗體中的恒定區(qū)(constant region),或者包括有從非人類抗體中誘導的互補性決定區(qū)，從而提取為從人類抗體中誘導的結構區(qū)(framework region, FR)和結合有不變區(qū)的人源抗體(humanized antibody)。上述抗體可利用已知于所屬領域的方法來制造。以下，為了易于理解本發(fā)明，提供優(yōu)選實施例。但是以下實施例只是為了更易于理解本發(fā)明而提供的，而不是通過實施例限定本發(fā)明的內容。實施例1:在膀胱癌患者的血清中測定APEl/Ref-Ι蛋白質的濃度為了在膀胱癌患者的血清中測定APEl/Ref-Ι蛋白質的濃度，利用夾心酶聯(lián)免疫分析法來執(zhí)行如下所述的實驗。1.準備用于酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELSIA)的試樣為了測定膀胱癌患者和正常人的血清內的ΑΡΕΙ/Ref-l的量，利用裝有阻凝劑的全血采集管來采集正常人和膀胱癌患者的血液。從51名膀胱癌患者和56名為了健康檢查而提供幫助的正常人中分別采集IOml左右的血液。將上述采集的血液在常溫中進行搖動并放置后，在2500rpm的情況下進行10分鐘圓心分離，并且將上層液(即，血漿)進行分離。將分離的上層液在4°C低溫中保管后，在執(zhí)行夾心酶聯(lián)免疫分析時，每個試樣使用100μ I。2.決定用于酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELSIA)的抗體和標準物質
作為認知APEl/Ref-Ι的捕獲抗體使用了抗-ΑΡΕΙ/Ref-l多克隆抗體(Abeam, ab64865)。作為認知結合于捕獲抗體的ΑΡΕΙ/Ref-l的檢測抗體使用了抗-APEl/Ref-1單克隆抗體(Abcam，abl94)。作為ΑΡΕΙ/Ref-l的標志物質將從大腸菌中分離、純化的再組合人類APEl/Ref-1-His每5倍連續(xù)稀釋(0_25ng)而使用。3.夾心酶聯(lián)免疫分析法在涂層緩沖液(05.M碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6)中將捕獲抗體按照200ng/ml的濃度進行稀釋，從而涂層于用于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的96孔微孔板(BDFalcon3072，F(xiàn)ranklin, NJ)。在4°C中對板進行整夜涂層。為了去除未結合的APEl/Ref-1多克隆抗體，使用清洗溶液(PBS，0.05%Tween20)來將板清洗3次。在清洗后，使用250 μ I封閉溶液(PBS，5%Bovine Serum Albumin, BSA)來在常溫下將板封閉一個小時。將每100 μ I膀胱癌患者和正常人的血漿試樣分別添加至96孔板，并且在37°C下反應90分鐘。利用清洗溶液將板清洗5次。為了調查結合于捕獲抗體的ΑΡΕΙ/Ref-l的程度，將檢測抗體抗-ΑΡΕΙ/Ref-l單克隆抗體稀釋為200ng/ml的濃度，在常溫下反應2個小時。利用清洗溶液將板清洗7次。將認知檢測抗體的HRP-結合的抗-小鼠IgG 二次抗體按照1:5000進行稀釋，并且添加至板上。將板在常溫下反應30分鐘，并且使用清洗溶液清洗5次。在板中添加了四甲基聯(lián)苯胺(tetramethyl benzidine, TMB)過氧化物酶基質及過氧化物酶溶液(BD555214, Franklin, NJ)0將板在常溫下產生變色開始的同時反應4分鐘，并且有規(guī)則地進行搖動。將2.5M H2SO4作為反應停止液進行添加，并且在450nm的情況下測定了吸光度。4.決定根據(jù)本發(fā)明的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的標準范圍將純化并分離的再組合人類APEl/Ref-His在0_25ng范圍內連續(xù)稀釋，從而獲得表示直線性的標準曲線，并且表示于表I及圖1中。1.在膀胱癌患者和正常人的血清中利用夾心酶聯(lián)免疫分析法來測定APEl/Ref-1蛋白質的濃度后進行比較的結果表示于表2及圖2中，根據(jù)處于膀胱癌的各個階段的膀胱癌患者的血清中的APEl/R·ef-Ι蛋白質的濃度表示于圖3中，根據(jù)膀胱癌的復發(fā)次數(shù)及病變數(shù)的膀胱癌患者的血清中的APEl/Ref-Ι蛋白質的濃度表示于圖4中[(A)Rtl:未復發(fā),R1:復發(fā)次數(shù)為I次，R3:復發(fā)次數(shù)為3次，R7:復發(fā)次數(shù)為7次；(B)single:單發(fā)性，multiple:多發(fā)性]。表I
APEI/Rcf4iK吸光度零標準值(獅standard |
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20().54400.5110 0.52970.4S表權利要求
1.一種膀胱癌診斷用組合物，其特征在于，該組合物含有APEl/Ref-1。
2.根據(jù)權利要求1所述的膀胱癌診斷用組合物，其特征在于， 上述ΑΡΕΙ/Ref-l在2期以上的膀胱癌中具有特異性。
3.—種膀胱癌診斷儀，其特征在于，該診斷儀含有特異性地結合于ΑΡΕΙ/Ref-l的抗體。
4.一種測定ΑΡΕΙ/Ref-l的濃度的方法，其特征在于，該方法通過利用了特異性地結合于膀胱癌標記物即ΑΡΕΙ/Ref-l的抗體的抗原-抗體結合反應在生物試樣中測定APEl/Ref-1的濃度。
5.根據(jù)權利要求4所述的測定ΑΡΕΙ/Ref-l的濃度的方法，其特征在于，上述生物試樣包含選自由從哺乳動物中提取的組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、咳痰、及小便組成的組中的一種以上。
6.根據(jù)權利要求4所述的測定ΑΡΕΙ/Ref-l的濃度的方法，其特征在于， 上述抗原-抗體結合反應利用選自由酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、放射免疫分析法(radioimmnoassay, RIA)、夾心酶聯(lián)免疫吸附測試法(SANDWICH ELISA)、蛋白質印跡法、免疫沉淀法、免疫組織化學染色法(immnohistochemical staining)、流式細胞測定法(FlowCytometry)、突光 活化細胞分類法(FACS)、酶基質發(fā)色法及抗原-抗體凝沉法組成的組中的一種以上方法來進行。
7.根據(jù)權利要求4所述的測定ΑΡΕΙ/Ref-l的濃度的方法，其特征在于， 在膀胱癌患者的血清中ΑΡΕΙ/Ref-l的濃度高于在正常人的血清中ΑΡΕΙ/Ref-l的濃度的1.5 3.5倍。
8.根據(jù)權利要求4所述的測定ΑΡΕΙ/Ref-l的濃度的方法，其特征在于， 上述ΑΡΕΙ/Ref-l在2期以上的膀胱癌中具有特異性。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有APE1/Ref-1的膀胱癌診斷用組合物、含有特異性地結合于APE1/Ref-1的抗體的膀胱癌診斷儀，以及一種測定APE1/Ref-1的濃度的方法，該方法通過利用了特異性地結合于膀胱癌標記物即APE1/Ref-1的抗體的抗原-抗體結合反應在生物試樣中測定APE1/Ref-1的濃度。本發(fā)明的APE1/Ref-1的濃度與正常人的血清中APE1/Ref-1蛋白質的濃度相比較，在膀胱癌患者的血清中，特別是在2期以上的膀胱癌患者的血清中有明顯地增加。另外，在膀胱癌復發(fā)的情況下，與復發(fā)次數(shù)無關，APE1/Ref-1的濃度與未復發(fā)的初期膀胱癌患者的血清中APE1/Ref-1的濃度相比較，在膀胱癌患者的血清中有明顯地增加。由此，本發(fā)明的APE1/Ref-1蛋白質可早期預測膀胱癌的診斷或者預后，因此可有效地使用為膀胱癌診斷用標記物。
文檔編號G01N33/574GK103250055SQ201180059177
公開日2013年8月14日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權日2010年12月8日
發(fā)明者田炳和, 崔星兒, 申珠賢 申請人:忠南大學校產學協(xié)力團