專利名稱：：尿膀胱癌抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明公開了一種尿膀胱癌抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒及其制備方法，屬于免疫分析醫(yī)學領域。
背景技術：
：膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，90%以上為移行細胞癌，膀胱移行細胞癌(transitionalcellcarcinomaofbladder)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，多發(fā)生于50-70歲之間。其中80%以上為表淺腫瘤，有10%20%發(fā)展為浸潤性膀胱癌。目前對膀胱癌診斷和術后復査主要靠膀胱鏡和尿細胞學檢查。膀胱鏡檢査雖然準確，但難以發(fā)現(xiàn)原位癌或扁平癌；尿細胞學檢査雖無創(chuàng)，且特異性較好，但敏感性低，對于分期較低、分化較好的腫瘤，其敏感性僅為30%或更低，而且受診斷醫(yī)師主觀因素的影響較大。膀胱鏡和尿脫落細胞學檢査的局限性限制了對膀胱癌診斷的應用，故尋求新的診斷方法十分必要。因此許多學者在宏觀、微觀乃至基因水平上不懈地探索，發(fā)現(xiàn)了尿膀胱癌抗原(UBC)這一膀胱腫瘤瘤標物。UBC的實質(zhì)為膀胱腫瘤來源的CKs片段8和18，目前，UBC的免疫檢測方法主要是酶聯(lián)免疫吸附實驗，但其靈敏度低，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性。本發(fā)明采用化學發(fā)光法檢測UBC，具有儀器設備簡單、操作方便，靈敏度高，線性響應范圍寬和易于實現(xiàn)自動化等顯著優(yōu)點。用本方法檢測UBC，對浸潤性膀胱腫瘤敏感性較酶聯(lián)免疫吸附實驗高，而且對早期、分化較好的腫瘤，其敏感性也較高，特異性基本和酶聯(lián)免疫吸附實驗相符。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)檢測方法敏感性不高、步驟繁瑣、儀器要求高、技術要求高、患者痛苦等缺點，又較酶聯(lián)免疫實驗靈敏度大大提高，臨床上進行該項檢測能評估分級和預測膀胱腫瘤的復發(fā)，能幫助治療和提高預后。UBC雖不能單獨用于膀胱腫瘤的診斷，也不能替代膀胱鏡檢查，但能根據(jù)其結(jié)果適當減少和延長膀胱鏡檢査的次數(shù)和時間，可作為膀胱鏡檢查的重要輔助手段。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一種使用化學發(fā)光免疫分析法定量測定尿膀胱癌抗原試劑盒，本發(fā)明還提供一種制備上述試劑盒的方法，其為本發(fā)明的尿膀胱癌抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒由尿膀胱癌抗原校準品、尿膀胱癌抗原單克隆抗體包被的固相載體、尿膀胱癌抗原單克隆抗體酶標記物、上述酶所作用的化學發(fā)光底物、以及濃縮洗滌液組成。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒；所述酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶；所述化學發(fā)光底物為1,2-二氧乙垸類衍生物、魯米諾或異魯米諾；所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1,2—二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star;所述濃縮洗滌液為Tris-HCL洗滌液或PBST洗滌液。本發(fā)明提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟1)配制尿膀胱癌抗原校準品；2)以尿膀胱癌抗原單克隆抗體包被固相載體；3)以酶標記尿膀胱癌抗原單克隆抗體；4)配制上述酶所作用的化學發(fā)光底物液；5)配制濃縮洗滌液；6)分裝上述尿膀胱癌抗原校準品、酶標記的尿膀胱癌抗原單克隆抗體、該酶所作用的化學發(fā)光底物和濃縮洗滌液，最后將各組分組裝為成品。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述包被固相載體包括以下步驟在包被緩沖液中加入尿膀胱癌抗原單克隆抗體制成工作液，將其負載于固相載體上，4'C過夜，用封閉液封閉。其中包被緩沖液選用0.046MpH4.6的檸檬酸緩沖液。封閉液選用PBS緩沖液。在上述方法中，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。在上述方法中，所述酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。在上述方法中，所述化學發(fā)光底物為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾。在上述方法中，所述1,2-二氧乙垸類衍生物為(金剛烷)-1,2-二氧乙浣、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l,2-二氧乙垸(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。在上述方法中，所述濃縮洗滌液為Tris-HCL洗滌液或PBST洗滌液。發(fā)明人采用了辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)兩個系統(tǒng)進行實驗研究，用HRP或ALP對抗體進行標記，然后加入待測抗原使之結(jié)合，HRP或ALP催化發(fā)光底物使之分解而產(chǎn)生發(fā)光信號。HRP作用的底物為魯米諾、異魯米諾衍生物，此類物質(zhì)價格便宜，基本實現(xiàn)了國產(chǎn)化，是當前在臨床應用最廣的一類發(fā)光劑。ALP作用的底物為1,2-二氧乙垸類衍生物(AMPPD)，它是一種新型的化學發(fā)光劑，屬二氧雜環(huán)丁垸類，性能十分穩(wěn)定，5'C下保存的固體AMPPD幾乎不分解。本發(fā)明通過使用化學發(fā)光增強劑，增強了化學發(fā)光的強度，延長發(fā)光時間。尿膀胱癌抗原單克隆抗體酶標記物采用辣根過氧化物酶標記尿膀胱癌抗原單克隆抗體時，使用改良過碘酸鈉法進行標記；尿膀胱癌抗原單克隆抗體酶標記物采用堿性磷酸酶標記尿膀胱癌抗原單克隆抗體時，使用戊二醛法進行連接標記。尿膀胱癌抗原單克隆抗體包被固相通過物理吸附作用完成。本發(fā)明人考察了不同緩沖體系對尿膀胱癌抗原單克隆抗體在固相上的物理吸附效率。本發(fā)明試劑盒以其高精確度、高靈敏度、操作步驟簡單、技術和儀器要求不高、成本低廉等顯著優(yōu)點，解決了購買進口試劑盒價格高的問題，又較酶聯(lián)免疫試劑盒靈敏度高，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價值的檢測手段。圖1為實施例1所制備的試劑盒中的校準品線性圖。圖2為分別使用本發(fā)明的試劑盒與酶聯(lián)免疫試劑盒測定臨床血樣對比圖。具體實施例方式實施例1尿膀胱癌抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒的制備一、酶標抗體制備辣根過氧化物酶標記尿膀胱癌抗原單克隆抗體采用改良過碘酸鈉法制備，用酶標抗體稀釋液以l:4000工作濃度稀釋酶標抗體；(1)辣根過氧化物酶標記尿膀胱癌抗原單克隆抗體的制備取lOmgHRP加lmlO.lmol/L醋酸鈉或水溶解，充分混勻，約5分鐘后加0.08mol/LNaI04，水溶液1.0ml混合后，置冰箱內(nèi)20分鐘，加0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml終止氧化反應，30分鐘后加21%NaCL溶液0.3ml，再加1.2ml冰冷的無水乙醇(AR)沉淀醛化酶，離心去上清，沉淀酶再用6ml80%冰冷的乙醇溶液浸泡洗滌一次后，離心傾去乙醇，沉淀用PH9.6的0.05mol/L碳酸鈉緩沖液2ml溶解，然后加入2ml羊或馬抗人IgG(內(nèi)含蛋白量20mg左右)，攪拌均勻，置冰箱內(nèi)過夜，次日取出加10mgNaBH4混勻，3小時后加等量飽和硫酸銨沉淀酶結(jié)合物，離心，去上清，沉淀用50%飽和硫酸銨洗漆一次，離心，再去上清，沉淀用0.01mol/LPBS3ml溶解，轉(zhuǎn)入透析袋中用生理鹽水透析除鹽(需換液5次)，如有沉淀需離心除去，上清呈淡棕色即為酶結(jié)合物。加60Q/。甘油PBS，一2(TC以下保存。(2)酶標抗體稀釋液配方:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>二、尿膀胱癌抗原校準品的配制以動物血清或蛋白緩沖液為基質(zhì)，加入尿膀胱癌抗原純品配制而成。制備的最終濃度為Ong/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。三、固相包被板的制備(1)包被采用0.046MpH4.6的CT緩沖液與適當濃度的尿膀胱癌抗原單克隆抗體混合制成包被液，并將其負載于固相載體上；具體地，所述包被方法為<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>溶解混勻后，調(diào)整pH值至4.6，加入5.0mg尿膀胱癌抗原單克隆抗體混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔110pL，4'C過夜。(2)封閉封閉液配方為<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，加雙蒸水定容，溶解混勻，測定pH值為7.0，甩掉包被液后，每孔分別加入封閉液300)LiL，室溫放置3小時。甩掉封閉液，室溫除濕干燥24小時。立即進行封袋，后置28。C保存。四、化學發(fā)光底物液本發(fā)明所使用的辣根過氧化物酶(HRP)的化學發(fā)光底物液的配制方法:化學發(fā)光底物A液<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>調(diào)整pH至7.27.4使用前用雙蒸水稀釋20倍使用。六、半成品及成品組成將上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品，經(jīng)抽檢合格后組裝為成品，4X:保存。綜上，在本發(fā)明的研究過程中，本發(fā)明的發(fā)明人首先對所用的原材料進行了篩選試驗和質(zhì)量鑒定，然后對包被方法進行了研究，選擇出最適合的包被緩沖液和封閉液，找到最佳的濃度條件，并且，配制出了能夠使酶標記物長期保持活性的酶標抗體稀釋液。實施例2尿膀胱癌抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒的制備除以戊二醛法將堿性磷酸酶與尿膀胱癌抗原單克隆抗體連接，用酶標抗體稀釋液以1:2000稀釋酶標記物，采用成分為Tris(24g)、HC1(15mL)、NaCl(160g)、KC1(4g)、雙蒸水(1000mL)、pH值為7.4的Tris-HCl濃縮洗滌液和以CSPD為發(fā)光底物液外，其余均以與實施例1相同的方法制備本發(fā)明的定量測定試劑盒。實施例34制備本發(fā)明的尿膀胱癌抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒除分別以塑料珠、塑料管作為載體外，其余均以與實施例1相同的方法制備本發(fā)明的定量測定試劑盒。實施例5制備本發(fā)明的尿膀胱癌抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒除以磁性顆粒作為載體，以經(jīng)典戊二醛法將尿膀胱癌抗原單克隆抗體連接于磁性顆粒表面外，其余均以與實施例1相同的方法制備本發(fā)明的定量檢測試劑盒。實施例6本發(fā)明的試劑盒的使用方法實施例1所述試劑盒的使用方法如下1)平衡所有檢測試劑和樣本至室溫；2)取需用量的板條；3)每孔、管依次加入25nL校準品/待測樣本；4)每孔、管依次加入酶標記物100|aL，于微量振蕩器上振蕩30秒使其混合均勻；5)37。C溫育60min;6)用稀釋后的濃縮洗滌液洗板5次，將固定在固相載體上的包被抗體一抗原一酶標抗體復合物與未結(jié)合物分離；7)每孔、管加入體積為100nL的化學發(fā)光底物液，室溫避光反應5min，在515min內(nèi)利用化學發(fā)光檢測儀進行檢測；8)使用Log(x)-Log(y)的雙對數(shù)數(shù)據(jù)擬合方式，進行標準曲線的建立，計算實驗測定結(jié)果。實施例7本發(fā)明的試劑盒的使用方法實施例2所述試劑盒的使用方法除酶標記物采用堿性磷酸酶，發(fā)光底物液用量為50ul/孔，室溫避光反應30min后用化學發(fā)光儀測量外，其余均與實施例6所述使用方法相同。實施例8本發(fā)明的試劑盒與酶聯(lián)免疫試劑盒的方法學鑒定比較本發(fā)明試劑盒按實施例5所述使用方法進行實驗，酶聯(lián)免疫試劑盒為外購，嚴格按期說明說步驟使用，兩種試劑盒的性能評價指標見表1。表1兩種診斷試劑盒的性能指標評價<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表1數(shù)據(jù)分析，本發(fā)明"尿膀胱癌抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒"的精密性、特異性和穩(wěn)定性均達到酶聯(lián)免疫試劑盒水平。并且，靈敏度顯著優(yōu)于酶聯(lián)免疫試劑盒。實施例9本發(fā)明的尿膀胱癌抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒與酶聯(lián)免疫試劑盒比較收集醫(yī)院確診膀胱移行細胞癌患者血清50份，泌尿系良性疾病患者血清20例，正常人血清200份。分別使用本發(fā)明實施例1的試劑盒和酶聯(lián)免疫試劑盒進行血樣檢測，統(tǒng)計實驗結(jié)果并進行相關分析，相關系數(shù)R=0.9456。對比實驗結(jié)果見表2。表2本發(fā)明試劑盒與酶聯(lián)免疫試劑盒的臨床實驗比對<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表2數(shù)據(jù)分析可知，在70份膀胱移行細胞癌患者中，用本發(fā)明試劑盒檢出68份陽性，酶聯(lián)免疫試劑盒檢出66份陽性，本發(fā)明試劑盒的臨床符合率要高于酶聯(lián)免疫試劑盒；在泌尿系良性疾病患者中，本發(fā)明試劑盒出現(xiàn)2份陽性，酶聯(lián)免疫試劑盒出現(xiàn)3份陽性，其中一份病人是確診為尿道感染，另一份為腎小球腎炎，而酶聯(lián)免疫試劑盒出現(xiàn)1份假陽性，說明在診斷膀胱移形細胞癌是要與泌尿系良性疾病鑒別診斷；在正常人血清中，本發(fā)明試劑盒出現(xiàn)1份陽性，而酶聯(lián)免疫試劑盒出現(xiàn)3份陽性，再次證明本發(fā)明試劑盒的臨床符合率高于酶聯(lián)免疫試劑盒。綜上所述，本發(fā)明試劑盒明顯優(yōu)于酶聯(lián)免疫試劑盒，為膀胱癌患者的診斷提供更為可靠的依據(jù)。權利要求1.一種尿膀胱癌抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由尿膀胱癌抗原校準品、尿膀胱癌抗原單克隆抗體包被的固相載體、尿膀胱癌抗原單克隆抗體酶標記物、上述酶所作用的化學發(fā)光底物、濃縮洗滌液組成。2、如權利要求1所述的試劑盒，特征在于，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。3、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。4、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物為1,2-二氧乙垸類衍生物、魯米諾或異魯米諾。5、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液為Tris-HCL洗漆液或PBST洗滌液。6、如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述1，2-二氧乙垸類衍生物為(金剛烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l,2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。7、一種制備權利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1)配制尿膀胱癌抗原校準品；2)以尿膀胱癌抗原單克隆抗體包被固相載體；3)以酶標記尿膀胱癌抗原單克隆抗體；4)配制上述酶所作用的化學發(fā)光底物液；5)配制濃縮洗漆液；6)分裝上述尿膀胱癌抗原校準品、酶標記的尿膀胱癌抗原單克隆抗體、該酶所作用的化學發(fā)光底物和濃縮洗滌液，最后將各組分組裝為成品。8、如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述包被固相載體的步驟包括包被、封閉。9、如權利要求8所述的方法，其特征在于，包被采用0.046MpH4.6的檸檬酸緩沖液與適當濃度的尿膀胱癌抗原單克隆抗體混合制成包被液，并將其負載于固相載體上；封閉液選用PBS-BSA緩沖液，然后進行干燥和封板處理。10、如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。全文摘要本發(fā)明公開了一種尿膀胱癌抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒及其制備方法。本發(fā)明所提供的試劑盒包括尿膀胱癌抗原校準品、尿膀胱癌抗原單克隆抗體包被的固相載體、尿膀胱癌抗原單克隆抗體酶標記物、上述酶作用的化學發(fā)光底物和濃縮洗滌液。該試劑盒的制備方法包括以下步驟1)配制校準品；2)包被固相載體；3)以酶標記抗體；4)配制化學發(fā)光底物液；5)配制濃縮洗滌液；6)分裝上述各組分，最后將各組分組裝為成品。本發(fā)明的試劑盒為膀胱癌的診斷提供重要的方法和依據(jù)。文檔編號G01N21/76GK101368961SQ20081010326公開日2009年2月18日申請日期2008年4月2日優(yōu)先權日2008年4月2日發(fā)明者于尚永,唐寶軍,宋勝利,應希堂,矯黎明,胡國茂申請人:北京科美東雅生物技術有限公司