早期膀胱癌血清miRNAs特異表達(dá)譜及診斷模型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種早期膀胱癌血清miRNAs特異表達(dá)譜，由表達(dá)上調(diào)的miR-152，miR-148b-3p，以及表達(dá)下調(diào)的miR-3187-3p,miR-15b-5p,miR-27a-3p,miR-30a-5p構(gòu)成。所述早期膀胱癌血清miRNAs特異表達(dá)譜中特異表達(dá)miRNAs的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，如SEQIDNO：1～13所示。本發(fā)明還提供了一種早期膀胱癌血清miRNAs診斷模型，利用以下公式：logit(P＝BC)＝0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)－0.475*(miR-3187-3p)－0.2395*(miR-15b-5p)－0.625*(miR-27a-3p)－0.1693*(miR-30a-5p)計(jì)算，用于膀胱癌的早期診斷，經(jīng)ROC曲線分析，此血清miRNAs模型對(duì)膀胱癌具有較高的診斷效率，高于傳統(tǒng)的尿液脫落細(xì)胞學(xué),此模型能夠診斷膀胱癌早期患者(Ta和T1)。
【專利說(shuō)明】早期膀胱癌血清m i RNAs特異表達(dá)譜及診斷模型
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及早期膀胱癌血清miRNAs特異表達(dá)譜，其逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，以及診斷模型，屬于醫(yī)學(xué)診斷【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在我國(guó)其發(fā)病率和死亡率均居泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位，且近年有逐漸上升的趨勢(shì)。20% -30%的膀胱癌病人初診時(shí)已發(fā)生肌層浸潤(rùn)，而在最初診斷為非侵襲性膀胱癌的病人中，約15%的膀胱癌病人五年內(nèi)發(fā)展為侵襲性膀胱癌。因此，早期診斷和早期治療是改善膀胱癌預(yù)后、降低死亡率的關(guān)鍵。目前，用于膀胱癌的診斷方法主要包括膀胱鏡、尿脫落細(xì)胞學(xué)及影像學(xué)檢查等。膀胱鏡檢查雖然具有較高的診斷效能，但該檢查方法的有創(chuàng)性限制了其在膀胱癌篩查中的廣泛應(yīng)用；尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢查雖特異性較高，但敏感性較低，尤其對(duì)低分級(jí)腫瘤的敏感性僅為20%~40%，且易受監(jiān)測(cè)這主觀因素的影響；CT和超聲檢查不易發(fā)現(xiàn)膀胱內(nèi)較小的病變，對(duì)膀胱癌分期預(yù)測(cè)具有一定的有限性。尋找臨敏感性高和特異性高的早期腫瘤標(biāo)志物，建立一種安全有效的血清學(xué)膀胱癌診斷方法是臨床亟待解決的難題。
[0003]MicroRNA(miRNAs)是一類廣泛分布于真核生物的高度保守的、非蛋白編碼的單鏈小分子RNAs，通過(guò)對(duì)靶mRNA降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、代謝和凋亡等功能。以往研究證實(shí)，miRNAs在腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后存在密切的聯(lián)系。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，血清中存在豐富且穩(wěn)定的miRNAs，通過(guò)對(duì)比分析腫瘤患者和對(duì)照組血清中miRNAs表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)不同腫瘤具有其特定的miRNAs表達(dá)譜，為腫瘤的無(wú)創(chuàng)性早期診斷提供了新的依據(jù)。因此，確定膀胱癌miRNAs特異表達(dá)譜，篩選差異表達(dá)的miRNAs，建立膀胱癌血清miRNAs診斷模型，有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)膀胱癌的早期診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了膀胱癌患者血清miRNA特異表達(dá)譜，及其逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物、檢測(cè)試劑盒，以及診斷模型，為臨床上膀胱癌的早期發(fā)現(xiàn)和早期治療提供支持。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0006]一種早期膀胱癌miRNAs特異表達(dá)譜，由上調(diào)表達(dá)的miR-152, miR-148b_3p以及下調(diào)表達(dá)的 miR-3187_3p, miR-15b_5p, miR-27a_3p, miR-30a_5p 構(gòu)成。
[0007]所述miRNAs來(lái)自外周靜脈血的血清。
[0008]所述膀胱癌miRNAs特異表達(dá)譜中特異表達(dá)miRNAs的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物,如下:
[0009] ((l)miR-152的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:1所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:2所示:[0010]SEQIDNO: I:
[0011 ] 5 ’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC-3，；
[0012]SEQIDNO:2:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’ ；
[0013](2)miR-148b-3p的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:3所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:4所示:
[0014]SEQIDNO:3:
[0015]5， -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT-3，；
[0016]SEQIDNO:4:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’ ；
[0017](3)miR-3187-3p的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:5所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:6所示:
[0018]SEQIDNO:5:
[0019]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG-3’ ；
[0020]SEQIDNO:6:5，-ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3，；
[0021](4)miR-15b-5p的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:7所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:8所示:
[0022]SEQIDNO:7:
[0023]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC-3’ ；
[0024]SEQIDNO:8:5，-ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3，；
[0025](5)miR-27a-3p的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:9所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:10所示:
[0026]SEQIDNO:9:
[0027]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3’ ；
[0028]SEQIDNO:10:5，-ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3，；
[0029](6)miR-30a-5p的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:11所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:12所示:
[0030]SEQIDNO: 11:
[0031]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’ ；
[0032]SEQIDNO:12:5，-ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3，；
[0033](7)六種miRNAs的通用反向檢測(cè)引物如SEQIDNO:13所示:
[0034]SEQIDNO:13:5，-TGGTGTCGTGGAGTCG-3，。
[0035]一種用于早期膀胱癌診斷用試劑盒或生物芯片，包括上述特異表達(dá)miRNAs的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物。
[0036]一種早期膀胱癌血清miRNAs診斷模型。具體如下:運(yùn)用以下公式計(jì)算:
[0037]1git (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)-0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p)
[0038]公式中的“(miR-152) ”、“(miR-148b_3p) ”、“ (miR-3187_3p) ”、“miR-15b_5p) ”、“miR-27a-3p”、“miR-30a-5p”分別表示相對(duì)應(yīng)的miRNAs的表達(dá)量。
[0039]一種利用上述診斷模型診斷的方法，如下:首先，利用上述特異表達(dá)miRNAs的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物測(cè)定待診斷患者的血清中六種miRNAs的表達(dá)量，包括miR-152，miR-148b-3p, miR-3187_3p，miR-15b_5p，miR-27a_3p 和 miR-30a_5p，然后，運(yùn)用下述公式計(jì)算:
[0040]logit (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)-0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p)
[0041]將六種miRNAs的表達(dá)量分別輸入Matlab軟件(該軟件為所屬領(lǐng)域的常規(guī)軟件，為現(xiàn)有技術(shù)中已有的軟件)，若1git (P = BC)為1，可以判斷為膀胱癌；若1git (P = BC)為0，判斷為非膀胱癌。
[0042]本發(fā)明首先基于臨床常規(guī)收集的非侵襲性膀胱癌患者、侵襲性膀胱癌患者及對(duì)照者血清樣本篩查差異表達(dá)miRNAs的技術(shù)路徑，采用“miRNAscDNA文庫(kù)+文庫(kù)預(yù)擴(kuò)增+Miseq深度測(cè)序”的研究策略，對(duì)三組血清標(biāo)本中miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行了比對(duì)分析，共篩查出26個(gè)差異表達(dá)miRNAs，序列見表1。然后采用SYBRGreen的逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)上述26個(gè)差異表達(dá)miRNAs在膀胱癌患者及對(duì)照血清中的表達(dá)豐度進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定了與膀胱癌相關(guān)的6個(gè)miRNAs，包括表達(dá)上調(diào)的miR-152，miR-148b_3p以及下調(diào)表達(dá)的miR-3187-3p，miR-15b-5p，miR-27a-3p，miR-30a-5p，且自主設(shè)計(jì)了其反轉(zhuǎn)錄引物和前向反向檢測(cè)引物，具體見表2。進(jìn)而，提供了一種診斷膀胱癌的血清miRNAs表達(dá)模型:利用多元logistic回歸方法提供了一種膀胱癌血清miRNAs診斷模型的計(jì)算公式:
[0043]1git (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)-0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p)
[0044]ROC曲線分析顯示，此血清miRNAs模型對(duì)膀胱癌具有較高的診斷效率，高于傳統(tǒng)的尿液脫落細(xì)胞學(xué)，此模型能夠診斷膀胱癌早期患者(Ta和Tl)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0045]圖1:六種miRNAs在膀胱癌組和對(duì)照組中的表達(dá)，其中，A:miR-152 ；B:miR-148b_3p ；C:miR-3187_3p ；D:miR-15b_5p ；E:miR-27a_3p ；F:miR-30a_5p。
[0046]圖2:六種 miRNAs 對(duì)膀胱癌的診斷 ROC 曲線，其中，A:miR-152 ；B:miR-148b-3p ；C:miR-3187_3p ；D:miR-15b_5p ；E:miR-27a_3p ；F:miR-30a_5p。
[0047]圖3:建立的診斷模型(panel)及尿液脫落細(xì)胞學(xué)對(duì)膀胱癌的診斷ROC曲線。
[0048]圖4:建立的診斷模型對(duì)不同分期膀胱癌的診斷ROC曲線，其中，A:Ta ；B:T1 ；C:T2-T4。
[0049]圖2、3、4中，橫坐標(biāo):特異性；縱坐標(biāo):敏感性。
【具體實(shí)施方式】
[0050]以下結(jié)合實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的說(shuō)明。
[0051]實(shí)施例一
[0052]1、研究對(duì)象
[0053] 血清標(biāo)本共來(lái)自經(jīng)受試者同意的175例膀胱癌患者(BC)和165例排除泌尿系腫瘤的對(duì)照者。所有膀胱癌患者均來(lái)自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(以下稱本院)泌尿外科住院患者，均為首次入院接受治療的患者，入院前未曾接受任何藥物或手術(shù)治療，其分期和病理類型均經(jīng)膀胱鏡檢查或術(shù)后病理檢查確認(rèn)。對(duì)照者包括37名前列腺良性增生患者，25名尿路結(jié)石患者，19名膀胱炎患者和84名健康者。其中，獲取75名膀胱癌患者、16名前列腺良性增生患者、13名尿路結(jié)石患者、8名膀胱炎患者和38名健康者的尿液標(biāo)本。所有血清和尿液標(biāo)本均在患者接受任何藥物或手術(shù)治療前取得。
[0054]2、標(biāo)本采集
[0055]采集血清3ml，立即1600g離心5分鐘，然后16000g離心10分鐘，將分離上清液保存于-80°c待測(cè)。取3 μ I分離上清液與3 μ IRNA分離液混合，16000g離心10分鐘，分離上清，將上清1:10稀釋用于逆轉(zhuǎn)錄模板。留取中段尿15ml,立即1300g離心10min,取沉洛瑞氏染色進(jìn)行尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢查。
[0056]4、文庫(kù)構(gòu)建和Miseq測(cè)序
[0057]取凍存樣本于常溫下解凍,按miRNeasyMiniKit試劑盒(Qiagen公司)操作者說(shuō)明提取血清總RNA，總RNA濃縮后經(jīng)T4RNA連接酶作用，分別連接3’-1inker和5’_linker，然后通過(guò)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增建庫(kù)。使用KAPAqPCR試劑盒檢測(cè)文庫(kù)，若qPCR濃度大于InM且無(wú)dimer污染則確定為檢測(cè)合格。文庫(kù)檢測(cè)符合要求后，通過(guò)Miseq測(cè)序儀進(jìn)行深度測(cè)序分析。比對(duì)分析測(cè)序后獲得的序列和miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(miRBasel7.0)中人miRNA序列，獲取三組樣本已知miRNA的表達(dá)豐度。
[0058]5、RT_qPCR
[0059]使用One Step PrimeScript? miRNA cDNA SynthesisKit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara 公司)反轉(zhuǎn)錄上述mRNA成cDNA，再進(jìn)行PCR反應(yīng)，運(yùn)行于ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀(ABI公司)。
[0060]PCR 反應(yīng)體系(25 μ I):
[0061]模板DNA: 2u I
[0062]SYBRPremixExTaq II: 12.5 μ I
[0063]Dye I1:0.5 μ I
[0064]上游引物(10μ Μ):1 μ I
[0065]下游引物(10μ Μ):1 μ I
[0066]無(wú)菌水:8μ1
[0067]反應(yīng)條件為:95°C 30秒一I個(gè)循環(huán)；(95°C 5秒，57°C 34秒)一45個(gè)循環(huán)；添加
溶解曲線。
[0068]每個(gè)標(biāo)本均重復(fù)測(cè)定三次,miRNA表達(dá)量采用2- ΔΔ Ct進(jìn)行分析。
[0069]6、數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0070]通過(guò)SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,使用Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗(yàn)比較兩組樣本間miRNAs的濃度差異，P〈0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)多元logistic回歸分析建立miRNAs診斷模型和計(jì)算公式,診斷模型的診斷效能采用ROC曲線及曲線下面積AUC分析。
[0071]7、檢測(cè)結(jié)果
[0072]I)經(jīng)Miseq測(cè)序分析，膀胱癌組與對(duì)照組對(duì)比共得到26個(gè)差異表達(dá)的miRNAs (入選標(biāo)準(zhǔn):在任一組中拷貝數(shù)大于50 ;在膀胱癌組與對(duì)照組的表達(dá)量差異大于2倍)，其中上調(diào)的包括 miR-24-3p, miR-128, miR-98, miR-148b_3p，miR-152, miR-30d_5p，miR-1294 和let-7c,下調(diào)的包括 miR-484, let-7b_5p, let-7a_5p, miR-30a_5p，miR-181b_5p，miR-1228-5p, miR-181a_5p, miR-27a_3p, miR_3135b, miR-3187_3p, miR-185_5p, miR-15a_5p, miR_15b_5p, miR-92b_5p, miR-342_3p, miR-148a_3p, miR-501_3p，和 let_7i_5p。序列如表 I 所不(如 SEQIDNO: 14 ~39 所示)。
[0073]表1測(cè)序篩出的差異miRNAs序列
[0074]
【權(quán)利要求】
1.一種早期膀胱癌miRNAs特異表達(dá)譜，其特征在于:由上調(diào)表達(dá)的miR-152，miR-148b-3p,以及下調(diào)表達(dá)的 miR-3187_3p，miR-15b_5p，miR-27a_3p，miR-30a_5p 構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的早期膀胱癌miRNAs特異表達(dá)譜，其特征在于:所述miRNAs來(lái)自外周靜脈血的血清。
3.權(quán)利要求1所述的早期膀胱癌miRNAs特異表達(dá)譜中特異表達(dá)miRNAs的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，其特征在于:包括以下引物: (1)miR-152的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:1所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:2 所示:
SEQIDN0: I:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC_3’ ；
SEQIDNO:2:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’ ； (2)miR-148b-3p的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:3所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:4所示:
SEQIDNO:3:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT_3’ ；
SEQIDNO:4:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’ ； (3)miR-3187-3p的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:5所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:6所示:
SEQIDNO:5:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG_3’ ；
SEQIDNO:6:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3’ ； (4)miR-15b-5p的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:7所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:8所示:
SEQIDNO:7:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC_3’ ；
SEQIDNO:8:5’ -ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3’ ； (5)miR-27a-3p的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:9所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:10所示:
SEQIDNO:9:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT_3’ ；
SEQIDNO:10:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3’ ； (6)miR-30a-5p的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:11所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:12所示:
SEQIDNO:11:
5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’ ；
SEQIDNO:12:5’ -ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’ ； (7)六種miRNAs的通用反向檢測(cè)引物如SEQIDNO:13所示:
SEQIDNO:13:5’ -TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
4.一種用于早期膀胱癌診斷用試劑盒或生物芯片，其特征在于:包括特異表達(dá)miRNAs的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，如下: (1)miR-152的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:1所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:2所示:
SEQIDNO: I:
.5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC_3’ ；
SEQIDNO:2:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’ ； (2)miR-148b-3p的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:3所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:4所示:
SEQIDNO:3:
.5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT_3’ ；.
SEQIDNO:4:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’ ； (3)miR-3187-3p的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:5所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:6所示:
SEQIDNO:5:. . 5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG_3’ ；
SEQIDNO:6:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3’ ； (4)miR-15b-5p的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:7所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:8所示:
SEQIDNO:7:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC_3’ ；
SEQIDNO:8:5’ -ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3’ ； (5)miR-27a-3p的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:9所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:10所示:
SEQIDNO:9:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT_3’ ；
SEQIDNO:10:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3’ ； (6)miR-30a-5p的逆轉(zhuǎn)錄引物和前向檢測(cè)引物:逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:11所示，前向檢測(cè)引物的序列如SEQIDNO:12所示:
SEQIDNO:11: . 5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’ ；
SEQIDNO:12:5’ -ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’ ； (7)六種miRNAs的通用反向檢測(cè)引物如SEQIDNO:13所示:
SEQIDNO:13:5’ -TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
5.一種早期膀胱癌血清miRNAs診斷模型，其特征在于:運(yùn)用以下公式計(jì)算:
1git (P = BC) = 0.439 + 0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)—.0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—.0.1693*(miR-30a-5p)
公式中的“ (miR-152) ”、“ (miR-148b_3p) ”、“ (miR-3187_3p) ”、“miR-15b_5p) ”、“miR-27a-3p”、“miR-30a-5p”分別表示相對(duì)應(yīng)的miRNAs的表達(dá)量。
6.一種利用權(quán)利要求5所述的早期膀胱癌血清miRNAs診斷模型診斷的方法，其特征在于:首先，利用上述特異表達(dá)miRNAs的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物檢測(cè)待診斷患者的血清中六種 miRNAs 的表達(dá)量，包括 miR-152，miR-148b_3p，miR-3187-3p，miR-15b-5p，miR-27a_3p和miR-30a-5p，然后，運(yùn)用以下公式進(jìn)行計(jì)算: 1git (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)—0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395* (miR-15b_5p) — 0.625* (miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p) 將六種miRNAs的表達(dá)量分別輸入Matlab軟件，若1git (P = BC)為1，可判斷為膀胱癌；若1git (P = BC)為0，則判斷為非膀胱癌。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103993093SQ201410245237
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】王傳新, 杜魯濤, 蔣秀梅, 張欣, 楊詠梅 申請(qǐng)人:山東大學(xué)齊魯醫(yī)院