專利名稱：用啟動子模板擴(kuò)增核苷序列的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微陣列技術(shù)已經(jīng)成為一種產(chǎn)生和分析基因表達(dá)概況的有力工具。然而，微陣列表達(dá)分析通常需要一般無法獲得的大量RNA(見Wang等，BioTechniques 34394-400(2003))。已經(jīng)開發(fā)了幾種RNA擴(kuò)增技術(shù)來克服這些問題。然而，這些技術(shù)通常會出現(xiàn)稱為擴(kuò)增偏倚(bias)的現(xiàn)象(參見，例如，美國專利6582906)。在這些情況下，擴(kuò)增的RNA分子群體不能相應(yīng)表示原始樣品中存在的RNA分子群體。
例如，在Eberwine及其同事公開的方法中(參見，例如，美國專利5545522；5716785；5891636；5958688和6291170)，復(fù)合寡核苷酸(compound oligonucleotide)被用于擴(kuò)增，其中的寡核苷酸與T7啟動子和引物一起提供。用復(fù)合寡核苷酸從最初的mRNA轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生cDNA拷貝，隨后合成第二鏈以產(chǎn)生雙鏈cDNA。由復(fù)合寡核苷酸的啟動子部分引導(dǎo)RNA擴(kuò)增，并從cDNA的第二鏈轉(zhuǎn)錄。由于第二鏈被用于轉(zhuǎn)錄，因此Eberwine法產(chǎn)生的擴(kuò)增的RNA與最初的mRNA序列反義。
然而，由于所用酶的持續(xù)加工能力不完全(即酶不能維持與核酸分子的結(jié)合)和RNA聚合酶啟動子的定位，Eberwine法在其每個(gè)步驟中都引入了3’偏倚(參見，例如，美國專利6582906和美國專利公開US2003/0104432)。例如，用于產(chǎn)生第一鏈cDNA的復(fù)合寡核苷酸將啟動子放置在與信使的3’末端相對應(yīng)的cDNA的5’末端。這與RNA聚合酶無法完整轉(zhuǎn)錄一些模板(可能由于長的聚腺苷酸尾區(qū)域或模板中二級和三級結(jié)構(gòu)的干擾)相結(jié)合可能在擴(kuò)增的反義RNA群體中造成3’偏倚。此外，如果DNA聚合酶不能完成第二鏈cDNA的合成，這些cDNA將缺乏功能性啟動子，導(dǎo)致擴(kuò)增群體中代表原始RNA分子的減少(或者可能完全缺乏)。
發(fā)明概述申請人發(fā)明了從各種核酸模板產(chǎn)生有義RNA(sRNA)分子的方法，其中的單鏈RNA聚合酶啟動子不能用體外轉(zhuǎn)錄sRNA分子的DNA聚合酶延伸。申請人發(fā)現(xiàn)，采用不能延伸的啟動子模板比采用可作為DNA聚合酶介導(dǎo)的第二鏈cDNA合成起點(diǎn)的啟動子引物更加有效。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及產(chǎn)生sRNA分子的方法，該方法包括提供具有5’和3’末端的單鏈cDNA分子；在所述單鏈cDNA分子的3’末端加上寡脫氧核苷酸尾；使單鏈RNA聚合酶啟動子模板與所述寡脫氧核苷酸尾退火，其中所述單鏈RNA聚合酶啟動子模板不能用DNA聚合酶延伸；延伸所述寡脫氧核苷酸尾，從而所述單鏈RNA聚合酶啟動子模板被轉(zhuǎn)變成雙鏈RNA聚合酶啟動子；和用識別所述雙鏈RNA聚合酶啟動子的RNA聚合酶啟動RNA轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生sRNA分子。
本發(fā)明的另一方面涉及產(chǎn)生sRNA分子的方法，所述方法包括提供具有5’和3’末端的RNA(例如mRNA)轉(zhuǎn)錄物；從所述RNA(例如mRNA)轉(zhuǎn)錄物合成具有5’和3’末端的單鏈cDNA分子；在所述單鏈cDNA分子的3’末端加上寡脫氧核苷酸尾；使單鏈RNA聚合酶啟動子模板與所述寡脫氧核苷酸尾退火，其中所述單鏈RNA聚合酶啟動子模板不能用DNA聚合酶延伸；延伸所述寡脫氧核苷酸尾，從而所述單鏈RNA聚合酶啟動子模板被轉(zhuǎn)變成雙鏈RNA聚合酶啟動子；和用識別所述雙鏈RNA聚合酶啟動子的RNA聚合酶啟動RNA轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生sRNA分子。
申請人還發(fā)明了從各種核酸模板產(chǎn)生有義RNA分子的試劑盒，其中，不能用DNA聚合酶延伸的單鏈RNA聚合酶啟動子模板被用于sRNA分子的體外轉(zhuǎn)錄。
因此，本發(fā)明的再一方面涉及產(chǎn)生至少一種sRNA分子的試劑盒，該試劑盒中裝有不能用DNA聚合酶延伸的單鏈RNA聚合酶啟動子模板，和用所述模板產(chǎn)生sRNA分子的指導(dǎo)材料。一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含至少一種將寡脫氧核苷酸尾加到具有5’和3’末端的單鏈cDNA分子3’末端的第一種酶，和至少一種將所述RNA聚合酶啟動子模板轉(zhuǎn)變成雙鏈RNA聚合酶啟動子的第二種酶。
附圖簡述

圖1a-f都是描述本發(fā)明方法實(shí)施方案的流程圖。
圖2描述了在用溴化乙錠染色的1％瓊脂糖變性凝膠上觀察到的用本發(fā)明方法產(chǎn)生的各種量的sRNA。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明涉及產(chǎn)生sRNA分子的方法和試劑盒。術(shù)語“sRNA分子”、“RNA分子”、“mRNA分子”和“cDNA分子”分別指單個(gè)分子、單一種類的多個(gè)分子和不同種類的多個(gè)分子。所述方法包括在至少一種單鏈cDNA分子的3’末端加上寡脫氧核苷酸尾；使單鏈RNA聚合酶啟動子模板與所述寡脫氧核苷酸尾退火，其中所述單鏈RNA聚合酶啟動子模板不能用DNA聚合酶延伸；和延伸所述寡脫氧核苷酸尾，從而所述單鏈RNA聚合酶啟動子模板被轉(zhuǎn)變成雙鏈RNA聚合酶啟動子。所得含有啟動子的單鏈cDNA然后用于體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用RNA聚合酶產(chǎn)生一種或多種sRNA分子。這種sRNA分子代表了獲得單鏈cDNA的原始RNA(例如mRNA)轉(zhuǎn)錄物的擴(kuò)增拷貝。
本發(fā)明的方法不同于常規(guī)的在第一鏈cDNA分子的5’末端摻入啟動子序列的技術(shù)。在那些技術(shù)中，就原始mRNA轉(zhuǎn)錄物而言，RNA轉(zhuǎn)錄的方向與第一鏈cDNA合成的方向相同，從而制得在接近原始mRNA轉(zhuǎn)錄物3’聚腺苷酸尾的核苷酸含有偏倚的反義RNA分子。通過將啟動子序列摻入cDNA分子的3’末端，本發(fā)明的方法能夠拷貝和擴(kuò)增原始RNA(列如mRNA)轉(zhuǎn)錄物兩端的遺傳信息。與通過現(xiàn)有技術(shù)方法獲得的sRNA分子相比，所得sRNA分子更能代表各原始RNA(例如mRNA)轉(zhuǎn)錄物的完整長度并能更好地反應(yīng)mRNA轉(zhuǎn)錄物混合物中各RNA(例如mRNA)轉(zhuǎn)錄物的相對豐度。本發(fā)明的方法也可與隨機(jī)引導(dǎo)(priming)組合，而不會引入任何額外的引導(dǎo)偏倚。所述sRNA分子可含有聚腺苷酸尾以更加有效地用于下游測定。此外，由于摻入了在其3’末端被封閉的RNA聚合酶啟動子模板，這樣可以防止DNA聚合酶介導(dǎo)的模板轉(zhuǎn)變成雙鏈RNA聚合酶啟動子期間會帶來問題的第二鏈cDNA合成，因此本發(fā)明的方法比常規(guī)技術(shù)更加有效(參見，例如，WO 02/065093)。
本發(fā)明的方法利用了分子生物學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。揭示常規(guī)分子生物學(xué)方法的基礎(chǔ)課本包括Sambrook等的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)(第三版，2001)和Ausubel等的《分子生物學(xué)最新進(jìn)展》(Current Protocols inMolecular Biology)(1994)。
許多合成第一鏈cDNA分子的方法和商業(yè)試劑盒是本領(lǐng)域熟知的。其例子包括SuperscriptTM雙鏈cDNA合成試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)、Array 50TM、Array 350TM和Array 900TM檢測試劑盒(Genisphere，Hatfield，PA)以及CyScribeTM標(biāo)記后試劑盒(Amersham，Piscataway，NJ)。通常，來自感興趣來源的高質(zhì)量mRNA分子(即原始mRNA轉(zhuǎn)錄物)被用作反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板。RNA可獲自任何組織或細(xì)胞來源，包括在任何生物或環(huán)境樣品中發(fā)現(xiàn)的病毒體、原核和真核來源。優(yōu)選的來源是真核組織，更優(yōu)選哺乳動物組織，最優(yōu)選人類組織。在其它實(shí)施方案中，模板RNA的形式可以是微小RNA(“miRNA”)。微小RNA是非常大的一組在生物中天然產(chǎn)生的小RNA，至少其中的一些調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。MiRNA可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如微小RNA分離試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)；QuickPrep微小RNA純化試劑盒(Amersham PharmaciaBiotech Inc.，Piscataway，NJ)從RNA制備。
任何反轉(zhuǎn)錄酶都可用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，包括熱穩(wěn)定酶和RNA酶H-反轉(zhuǎn)錄酶。優(yōu)選使用RNA酶H-反轉(zhuǎn)錄酶。
第一鏈cDNA合成的引物可通過商業(yè)獲得或者用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)合成和純化。第一鏈cDNA合成的引物包括在其3’末端含有寡脫氧胸苷尾的單鏈寡脫氧核苷酸。這種尾的長度通常約為10-30個(gè)核苷酸，優(yōu)選長度約17-24個(gè)核苷酸，并與任何含有3’聚腺苷酸尾的原始RNA(例如mRNA)轉(zhuǎn)錄物退火(見圖1a)?；蛘呖捎秒S機(jī)引物啟動反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。該引物的長度通常約4-20個(gè)核苷酸，優(yōu)選長度約6-9個(gè)核苷酸，并沿各原始RNA(例如mRNA)轉(zhuǎn)錄物的長度與各個(gè)位置退火。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將知道，相比用寡脫氧胸苷引物產(chǎn)生的sRNA分子，使用隨機(jī)引物可最終導(dǎo)致產(chǎn)生較好代表各原始RNA(例如mRNA)轉(zhuǎn)錄物完整長度的sRNA分子。此外，在所公開方法的最初步驟中使用隨機(jī)引物來產(chǎn)生cDNA意味著可用通常無法擴(kuò)增的RNA，如降解的RNA或衍生自細(xì)菌的RNA來產(chǎn)生擴(kuò)增的sRNA分子。所述隨機(jī)引物可被修飾以使其5’末端含有長度約10-30個(gè)核苷酸，優(yōu)選長度約17-24個(gè)核苷酸的寡脫氧胸苷區(qū)域，從而在隨后的體外轉(zhuǎn)錄中制得的擴(kuò)增的sRNA分子將含有聚腺苷酸尾。
第一鏈cDNA合成之后，RNA通常被降解，然后再純化第一鏈cDNA分子(見圖1b)。可采用任何降解RNA的方法，如用NaOH處理?；蛘撸墒筊NA保持原樣，從RNA/cDNA雙鏈體純化第一鏈cDNA分子。存在許多純化DNA分子的方法和試劑盒。其例子包括MinEluteTMPCR純化試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)、SpinPrepTMPCR提純試劑盒(Novagen，Madison，WI)以及其它基于類似DNA分離原理的純化系統(tǒng)。
第一鏈cDNA純化之后在cDNA分子的3’末端加上單鏈寡脫氧核苷酸尾(見圖1c)?？捎萌魏卧趩捂淒NA上加上脫氧核苷酸的方法摻入寡脫氧核苷酸尾。優(yōu)選在存在合適的脫氧核苷酸時(shí)用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶或其它合適的酶在單鏈cDNA上加上寡脫氧核苷酸尾。優(yōu)選的，所述寡脫氧核苷酸尾是同聚物尾(即聚脫氧腺苷、聚脫氧鳥苷、聚脫氧胞苷或聚脫氧胸苷)。優(yōu)選的，所述寡脫氧核苷酸尾是聚脫氧胸苷尾，其長度通常約為3到500個(gè)以上核苷酸，優(yōu)選長度約20-100個(gè)核苷酸。
在單鏈cDNA分子的3’末端加上單鏈寡核苷酸尾之后，單鏈RNA聚合酶啟動子模板被加到3’寡脫氧核苷酸尾上(見圖1d)。這是通過3’寡脫氧核苷酸尾和存在于單鏈RNA聚合酶啟動子模板3’末端的互補(bǔ)脫氧核苷酸序列之間的互補(bǔ)堿基配對實(shí)現(xiàn)的。例如，如果寡核苷酸尾是聚脫氧胸苷尾，則啟動子模板將在其3’末端含有腺苷堿基序列，其長度通常約為3到50個(gè)以上核苷酸，優(yōu)選長度約10-30個(gè)核苷酸。對于被認(rèn)為是相互互補(bǔ)的序列，3’啟動子模板序列的特定核苷酸序列不一定要與3’寡脫氧核苷酸尾的特定核苷酸序列互補(bǔ)，3’啟動子模板序列的長度也不需要與3’寡脫氧核苷酸尾的長度相同。精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，所要求的只是兩個(gè)序列之間要有充足的互補(bǔ)性，從而RNA聚合酶啟動子模板將與cDNA分子3’末端的的寡脫氧核苷酸尾退火。
單鏈RNA聚合酶啟動子模板在其5’末端還含有被RNA聚合酶特異性識別的啟動子序列。可采用任何RNA聚合酶，只要特定的啟動子序列已知被聚合酶識別即可。優(yōu)選地，采用的啟動子序列被噬菌體RNA聚合酶，如T7、T3或SP6 RNA聚合酶識別。T7聚合酶啟動子有義序列的例子是TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO1)。T3聚合酶啟動子有義序列的例子是AATTAACCCTCACTAAAGG(SEQ ID NO2)。SP6聚合酶啟動子有義序列的例子是AATTTAAGGTGACACTATAGAA(SEQ ID NO3)。
單鏈RNA聚合酶啟動子模板還在其3’末端被封閉從而不能用DNA聚合酶延伸。這樣，加入DNA聚合酶(如Klenow DNA聚合酶)能將單鏈啟動子模板轉(zhuǎn)變成雙鏈RNA聚合酶啟動子，但不能催化第二鏈cDNA的合成(見圖1e)。申請人發(fā)現(xiàn)，相比使用能作為DNA聚合酶介導(dǎo)的第二鏈cDNA合成起點(diǎn)的啟動子引物，使用不能用DNA聚合酶延伸的啟動子模板能更精確地維持未擴(kuò)增的RNA樣品中發(fā)現(xiàn)的mRNA轉(zhuǎn)錄物的相對豐度?？捎萌魏畏椒ǚ忾]啟動子模板，只要這種方法能使啟動子模板不能用DNA聚合酶延伸即可，例如在合成期間或之后加上末端封閉基團(tuán)、化合物或分子。優(yōu)選地，啟動子模板可用3’氨基修飾劑(modifier)、3’脫氧終止子、3’雙脫氧終止子或類似分子封閉。合適的封閉劑不限于這里所述的那些，并且可包括任何能防止DNA聚合酶延伸RNA聚合酶啟動子模板3’末端的分子。
盡管本發(fā)明的方法宜在不存在第二鏈cDNA合成時(shí)進(jìn)行，但本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員將了解，可在采用隨機(jī)引物將單鏈啟動子模板轉(zhuǎn)變成雙鏈RNA聚合酶啟動子期間任選合成第二鏈cDNA。隨機(jī)引物將沿著第一鏈cDNA的各個(gè)位置退火，且與啟動子模板不同，隨機(jī)引物可在啟動子合成期間通過DNA聚合酶延伸。各種第二鏈cDNA片段可任選結(jié)合在一起以形成一個(gè)第二鏈cDNA分子。這種第二鏈cDNA分子在體外轉(zhuǎn)錄期間可穩(wěn)定(例如，除去二級和三級結(jié)構(gòu))第一鏈cDNA，從而導(dǎo)致較高的sRNA分子產(chǎn)量。
單鏈啟動子模板轉(zhuǎn)變成雙鏈RNA聚合酶啟動子之后可加入合適的RNA聚合酶和核糖核苷酸啟動體外轉(zhuǎn)錄(見圖1f)。這種轉(zhuǎn)錄可導(dǎo)致產(chǎn)生大量擴(kuò)增的sRNA。進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的方法和試劑盒是本領(lǐng)域熟知的，其中包括MEGAscriptTM轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion，Austin，TX)和AmpliScribeTM高產(chǎn)率轉(zhuǎn)錄試劑盒(Epicentre Technologies，Madison，WI)。
可用上述同樣的方法對所得sRNA分子再進(jìn)行幾輪擴(kuò)增。例如，從寡脫氧胸苷介導(dǎo)的第一鏈cDNA產(chǎn)生的sRNA分子(即，第一輪sRNA分子)將在其3’末端具有再生的聚腺苷酸尾，這種尾可作為第二輪寡脫氧胸苷介導(dǎo)的第一鏈cDNA合成的引導(dǎo)位點(diǎn)?；蛘撸捎秒S機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄第一輪sRNA分子的第一鏈cDNA。寡脫氧胸苷和隨機(jī)引物的組合和混合物也可用于第二輪cDNA合成。然后如上所述將啟動子模板加入第二輪cDNA分子，然后在合適RNA聚合酶的作用下進(jìn)行第二輪體外轉(zhuǎn)錄。進(jìn)行額外輪數(shù)的擴(kuò)增使得在第一輪擴(kuò)增中可使用較小量的mRNA。
可用市售的聚腺苷酸加尾試劑盒將聚腺苷酸尾加到缺少聚腺苷酸尾的擴(kuò)增的sRNA分子(如從常規(guī)的隨機(jī)引物介導(dǎo)的第一鏈cDNA產(chǎn)生的那些)的3’末端。這種試劑盒的一個(gè)例子是Poly(A)試劑盒(Ambion)?；蛘?，在合適的緩沖液中將聚腺苷酸聚合酶(購自Amersham、Invitrogen和Ambion)與ATP以及擴(kuò)增的sRNA分子混合可用來在sRNA分子的3’末端合成聚腺苷酸尾。加入聚腺苷酸尾增加了下游試驗(yàn)可用的擴(kuò)增sRNA分子的數(shù)目和類型，并允許在那些試驗(yàn)中使用更加便宜的RNA標(biāo)記替代物。
用本發(fā)明方法產(chǎn)生的sRNA分子可直接用于任何對于mRNA來說是典型用途的用途，其中包括基因表達(dá)研究、遺傳克隆和減除雜交。例如，可用隨機(jī)引物、寡脫氧胸苷引物或其組合首先將sRNA分子反轉(zhuǎn)錄成cDNA分子。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可在存在可檢測標(biāo)記的核苷酸如熒光標(biāo)記的核苷酸時(shí)進(jìn)行。這種核苷酸包括用Cy3和Cy5標(biāo)記的核苷酸?；蛘?，cDNA分子可在合成后標(biāo)記。優(yōu)選地，cDNA分子是在合成后采用3DNATM技術(shù)(Genisphere)用核酸樹狀聚體(dendrimer)標(biāo)記的。這些樹狀聚體還描述于Nilsen等，J.Theor.Biol.，l87273-284(1997)；Stears等，Physiol.Genomics 393-99(2000)；和美國專利5175270；5484904；5487973；6072043；6110687和6117631。
從本發(fā)明的sRNA分子產(chǎn)生的標(biāo)記的單鏈cDNA分子被用作基因表達(dá)研究的探針。cDNA分子可與含有互補(bǔ)多核苷酸的核酸微陣列退火。優(yōu)選地，該微陣列是GeneChip微陣列(Affymetrix，Santa Clara，CA)。由于用本發(fā)明方法產(chǎn)生的sRNA分子更能代表各原始RNA(例如mRNA)轉(zhuǎn)錄物的完整長度并能更好反映各原始RNA(例如mRNA)轉(zhuǎn)錄物的相對豐度，因此基因表達(dá)研究獲得的結(jié)果相比那些用先前的核酸擴(kuò)增技術(shù)得到的結(jié)果更有意義(例如更加準(zhǔn)確)。
本發(fā)明還提供了包含供實(shí)施本發(fā)明方法的試劑的試劑盒或套裝(package)。這種試劑盒可用于各種研究和診斷應(yīng)用。例如，本發(fā)明的方法和試劑盒可用來幫助比較分析不同細(xì)胞或組織、相同細(xì)胞或組織的不同亞群、相同細(xì)胞或組織的不同生理狀態(tài)、相同細(xì)胞或組織的不同不同發(fā)育階段或者相同組織的不同細(xì)胞群中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)。這種分析可揭示統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的基因表達(dá)水平的差異，這種差異取決于所分析的細(xì)胞或組織，并且然后可用于幫助診斷各種疾病狀態(tài)。
根據(jù)本發(fā)明可制備多種試劑盒。例如，試劑盒中可含有不能用DNA聚合酶延伸的單鏈RNA聚合酶啟動子模板(例如，含有3’封閉劑或者與3’端連接的封閉部分的模板)以及用這種模板產(chǎn)生sRNA分子的指導(dǎo)材料。盡管所述指導(dǎo)材料通常包括書寫或印刷材料，但不限于此。能夠儲存這種說明并將它們傳達(dá)給最終用戶的任何介質(zhì)都包括在本發(fā)明之內(nèi)。這種介質(zhì)包括但不限于電儲存介質(zhì)(例如，磁盤、帶、盒式磁盤、芯片)、光學(xué)介質(zhì)(例如，CD ROM)等。這種介質(zhì)可包括能提供這種指導(dǎo)材料的因特網(wǎng)地址。
本發(fā)明的試劑盒還可裝有一種或多種以下組分或試劑反轉(zhuǎn)錄酶；RNA酶抑制劑；將寡脫氧核苷酸尾連接到單鏈cDNA分子的酶(例如，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)；將RNA聚合酶啟動子模板轉(zhuǎn)變成雙鏈RNA聚合酶啟動子的酶(例如，Klenow酶)；和識別啟動子的RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶)。該試劑盒還裝有緩沖液、引物(例如，寡脫氧胸苷引物、隨機(jī)引物)、核苷酸、標(biāo)記的核苷酸、無RNA酶的水、容器、小瓶、反應(yīng)管、以及與本發(fā)明方法產(chǎn)生sRNA分子相容的組分。所述組分和試劑可單獨(dú)提供或與合適的儲存介質(zhì)一起提供在容器內(nèi)。
下面的實(shí)施例將描述本發(fā)明方法的特定實(shí)施方案。這些實(shí)施例只是為了闡述而不能理解為以任何方式進(jìn)行限制。
實(shí)施例實(shí)施例1第一鏈cDNA的合成簡言之，將1-10μl用RNAqueous試劑盒(Ambion)純化的大鼠腦總RNA(至多1μg)與2μl寡dT24引物(50ng/μl)(5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3’；SEQ ID NO4)混合，并加入無RNA酶的水至11μl。該RNA/引物混合物在80℃加熱10分鐘并立即在冰上冷卻1-2分鐘。混合物然后與9μl主混合物溶液混合，使其終體積為20μl，其中含有50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM二硫蘇糖醇(DTT)、0.5mM各種dNTP、10U Superase-InTM(Ambion)和200U SuperscriptTM反轉(zhuǎn)錄酶II(Invitrogen)。將混合物短暫離心并在42℃培育2小時(shí)。加入3.5μl 0.5M NaOH/50mMEDTA并在65℃加熱15分鐘以中止反應(yīng)。短暫離心后用5μl 1M Tris-HCl，pH 7.5中和反應(yīng)物并用1X TE，pH8.0調(diào)至50μl。反應(yīng)物用MinEluteTMPCR純化試劑盒(Qiagen)按照制造商的步驟純化。第一鏈cDNA分子用10μl由制造商提供的EB緩沖液洗脫。
第一鏈cDNA的加尾第一鏈cDNA分子在80℃加熱10分鐘并立即在冰上冷卻1-2分鐘。然后將10μlcDNA分子與15μl主混合物溶液混合，使其終體積為25μl，其中含有6.5μl無RNA酶的水、1X加尾緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 7.0，10mM MgCl2)、1.5mM dTTP和30U末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Invitrogen)。將混合物短暫離心并在37℃培育30分鐘。在80℃加熱15分鐘并在室溫冷卻1-2分鐘以中止反應(yīng)。
T7啟動子的合成在寡脫氧胸苷加尾的cDNA分子中加入2μl含3’氨基修飾劑(5’-TAA TAC GACTCA CTA TAG GGA AAA AAA AAA AAA AAA AX-3’；SEQ ID NO5)的T7 RNA聚合酶啟動子模板(250ng/μl)，混合物在37℃培育10分鐘以使該鏈退火。然后將27μl加尾的cDNA/啟動子模板混合物與23μl主混合物溶液混合，使其終體積為50μl，其中含有14μl無RNA酶的水、1X聚合酶緩沖液(10mMTris-HCl，pH 7.0，10mM MgCl2)、0.4mM各種nNTP和20U大DNA聚合酶I(Klenow酶)(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)。將混合物短暫離心并在室溫培育30分鐘。反應(yīng)物用1X TE，pH 8.0調(diào)至100μl。反應(yīng)物用MinEluteTMPCR純化試劑盒按照制造商的步驟純化。T7啟動子-cDNA分子用10μl由制造商提供的EB緩沖液洗脫。
體外轉(zhuǎn)錄將1μl T7 RNA聚合酶啟動子模板加入T7啟動子-cDNA分子并用RNA酶-水將體積調(diào)至17μl?；旌衔镌?7℃加熱10-15分鐘以重新退火T7啟動子DNA鏈，然后與13μl主混合物溶液混合物使終體積為30μl，其中含有1X反應(yīng)緩沖液、5mM各種rNTP和2μl T7 RNA聚合酶(MEGAscriptTM轉(zhuǎn)錄試劑盒，Ambion)。將混合物短暫離心并在37℃的加熱塊上培育15分鐘，然后在37℃的空氣雜交器中培育6-14小時(shí)。擴(kuò)增的sRNA分子用Rneasy試劑盒按照制造商的方法純化。sRNA分子用50μl無RNA酶的水洗脫，用相同的洗脫液再次洗脫，并用UV-分光光度法在260/280的波長下量化。
實(shí)施例2采用實(shí)施例1的方法，但用隨機(jī)引物代替寡dT24引物進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。簡言之，將1-10μl總RNA(至多1μg)與2μl隨機(jī)9聚體引物(250ng/μl)(5’-NNN NNNNNN-3’；SEQ ID NO6)混合，并加入無RNA酶的水至11μl。該RNA/引物混合物在80℃加熱10分鐘并立即在冰上冷卻1-2分鐘?；旌衔锶缓笈c9μ1主混合物溶液混合，使其終體積為20μl，其中含有50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM二硫蘇糖醇、0.5mM各種dNTP、10U Superase-InTM和200U SuperscriptTM反轉(zhuǎn)錄酶II。將混合物短暫離心并在42℃培育2小時(shí)。加入3.5μl 0.5M NaOH/50mM EDTA并在65℃加熱15分鐘以中止反應(yīng)。短暫離心后用5μl 1M Tris-HCl，pH 7.5中和反應(yīng)物并用1X TE，pH 8.0調(diào)至50μl。反應(yīng)物用MinEluteTMPCR純化試劑盒按照制造商的步驟純化。第一鏈cDNA分子用10μl由制造商提供的EB緩沖液洗脫，并按實(shí)施例1的描述進(jìn)一步處理。
實(shí)施例3采用實(shí)施例1或2的方法，但在第一鏈cDNA合成之后不對RNA進(jìn)行處理(即不進(jìn)行堿水解)，然后將其加到MiniEluteTM純化柱。第一鏈cDNA分子用10μl由制造商提供的EB緩沖液洗脫，并按實(shí)施例1的描述進(jìn)一步處理。
實(shí)施例4采用Poly(A)加尾試劑盒(Ambion)將聚腺苷酸尾加到用實(shí)施例2和3的隨機(jī)引物法產(chǎn)生的擴(kuò)增的sRNA分子上。用Array350TM檢測試劑盒(Genisphere)將聚腺苷酸加尾的sRNA轉(zhuǎn)變成標(biāo)記的cDNA，并用該檢測試劑盒產(chǎn)品手冊中公布的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)與微陣列雜交。
實(shí)施例5目測觀察用溴化乙錠染色的1％瓊脂糖變性凝膠上通過上述方法產(chǎn)生的各種量的sRNA。從圖2中可以看到，相比商品化的基于Eberwine的方法(表示為MessageAmpTM，Ambion，泳道B-D)，本發(fā)明的方法(表示為SenseAmp，泳道E-G)產(chǎn)生了較多擴(kuò)增的RNA分子。用本發(fā)明方法獲得的產(chǎn)量比原始RNA樣品放大了1000倍。通過比較用MessageAmpTM產(chǎn)生的擴(kuò)增的反義RNA(aRNA)和用本發(fā)明方法產(chǎn)生的擴(kuò)增的sRNA得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明，就維持未擴(kuò)增的原始RNA樣品中發(fā)現(xiàn)的mRNA轉(zhuǎn)錄物的相對豐度而言，本發(fā)明的方法比基于Eberwine的方法更精確。泊松對數(shù)相關(guān)系數(shù)分別為0.93和0.86。未擴(kuò)增樣品和擴(kuò)增樣品之間完全相關(guān)反映為泊松對數(shù)相關(guān)系數(shù)為1.00。
實(shí)施例6采用實(shí)施例1或3的寡脫氧胸苷法，但對純化的sRNA分子進(jìn)行第二輪RNA擴(kuò)增。
簡言之，含第一輪擴(kuò)增的sRNA分子的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物用30μl無RNA酶的水從Rneasy柱洗脫，并用相同的洗脫液再次洗脫。洗脫液與1μl寡dT24引物(50ng/μl)(SEQID NO4)和2μl隨機(jī)9聚體引物(25ng/μl)(SEQ ID NO6)混合并加入無RNA酶的水至37μl。RNA/引物混合物在80℃加熱10分鐘并立即在冰上冷卻1-2分鐘?；旌衔锶缓笈c23μl主混合物溶液混合，使其終體積為60μl，其中含有50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM二硫蘇糖醇(DTT)、0.33mM各種dNTP、10USuperase-InTM和200U SuperscriptTM反轉(zhuǎn)錄酶II。將混合物短暫離心并在42℃培育2小時(shí)。反應(yīng)物用1X TE，pH 8.0調(diào)至100μl。反應(yīng)物用MinEluteTMPCR純化試劑盒按照制造商的步驟純化。第一鏈cDNA分子用10μl由制造商提供的EB緩沖液洗脫。
第一鏈cDNA分子在80℃加熱10分鐘并立即在冰上冷卻1-2分鐘。然后將10μlcDNA分子與15μl主混合物溶液混合，使其終體積為25μl，其中含有6.5μl無RNA酶的水、1X加尾緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 7.0，10mM MgCl2)、1.5mM dTTP和30U末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶。將混合物短暫離心并在37℃培育30分鐘。在80℃加熱15分鐘并在室溫冷卻1-2分鐘以中止反應(yīng)。
在寡脫氧胸苷加尾的cDNA分子中加入2μl含3’氨基修飾劑(SEQ ID N05)的T7RNA聚合酶啟動子模板(250ng/μl)，混合物在37℃培育10分鐘以使該鏈退火。然后將27μl加尾的cDNA/啟動子模板混合物與23μl主混合物溶液混合，使其終體積為50μl，其中含有14μl無RNA酶的水、1X聚合酶緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.0，10mMMgCl2)、0.4mM各種nNTP和20U大DNA聚合酶I(Klenow酶)。將混合物短暫離心并在室溫培育30分鐘。反應(yīng)物用1X TE，pH 8.0調(diào)至100μl。反應(yīng)物用MinEluteTMPCR純化試劑盒按照制造商的步驟純化。T7啟動子-cDNA分子用10μl由制造商提供的EB緩沖液洗脫。
將1μl T7 RNA聚合酶啟動子模板加入T7啟動子-cDNA分子并用RNA酶-水將體積調(diào)至16μl。混合物在37℃加熱10-15分鐘以重新退火T7啟動子DNA鏈，然后與24μl主混合物溶液混合物使終體積為40μl，其中含有1X反應(yīng)緩沖液、7.5mM各種rNTP和4μl T7 RNA聚合酶(MEGAscriptTM轉(zhuǎn)錄試劑盒)。將混合物短暫離心并在37℃的加熱塊上培育15分鐘，然后在37℃的空氣雜交器中培育6-14小時(shí)。擴(kuò)增的sRNA分子用Rneasy試劑盒按照制造商的方法純化。
第二輪sRNA分子用50μl無RNA酶的水洗脫，用同樣的洗脫液再次洗脫，用UV-分光光度法在260/280的波長下量化，并目測用溴化乙錠染色的1％的瓊脂糖變性凝膠。
實(shí)施例7產(chǎn)生sRNA分子的試劑盒含有以下組分寡dT24引物(50ng/μl)；隨機(jī)9聚體(9mer)引物(250ng/μl)；dNTP混合物(各種10mM)；Superase-InTM(Ambion)；dTTP加尾混合物(10mM)；10X反應(yīng)緩沖液(100mM Tris-HCl，pH7.0，100mM MgCl2)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(15-30U/μl)；T7 RNA聚合酶啟動子模板(50ng/μl)；Klenow酶(1-7.5U/μl)；和無核酸酶的水。
這些組分放在編號的試管中再放在一容器內(nèi)，該容器中裝有用所述試劑盒組分產(chǎn)生擴(kuò)增的sRNA分子的印刷說明手冊。
本說明書中引用的所有出版物，包括專利文獻(xiàn)和非專利文獻(xiàn)，表示本發(fā)明所述技術(shù)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員的水平。所有這些出版社本全文納入本文作為參考，其程度如同逐一并單獨(dú)引用各出版物并納入本文作為參考。
盡管這里已經(jīng)參照特定實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解為這些實(shí)施方案只是為了闡述本發(fā)明的原則和應(yīng)用。因此應(yīng)理解，可對所例舉的實(shí)施方案進(jìn)行諸多修改并設(shè)計(jì)出其它的方案，而這不會背離如以下權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生有義RNA分子的方法，所述方法包括a)提供具有5’和3’末端的單鏈cDNA分子；b)在所述單鏈cDNA分子的3’末端加上寡脫氧核苷酸尾；c)使單鏈啟動子模板與所述寡脫氧核苷酸尾退火，其中所述單鏈啟動子模板不能用DNA聚合酶延伸；d)延伸所述寡脫氧核苷酸尾，從而使得所述單鏈啟動子模板轉(zhuǎn)變成雙鏈啟動子；和e)用識別所述雙鏈啟動子的RNA聚合酶啟動RNA轉(zhuǎn)錄，由此產(chǎn)生有義RNA分子。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，a)包括提供具有5’和3’末端的mRNA轉(zhuǎn)錄物；和從所述mRNA轉(zhuǎn)錄物合成單鏈cDNA分子。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述單鏈cDNA分子的合成包括使rnRNA分子與RNA酶H-反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述單鏈cDNA分子的合成還包括使所述mRNA分子與寡脫氧胸苷引物反應(yīng)。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述單鏈cDNA分子的合成還包括使所述mRNA分子與隨機(jī)引物反應(yīng)。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，所述方法還包括在加上寡脫氧核苷酸尾之前純化所述單鏈cDNA分子。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，所述方法還包括在純化所述單鏈cDNA分子之前降解所述mRNA轉(zhuǎn)錄物。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述寡脫氧核苷酸尾是同聚物尾。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述同聚物尾是聚脫氧胸苷尾。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶將所述寡脫氧核苷酸尾加到所述單鏈cDNA分子的3’末端。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述單鏈啟動子模板通過一系列存在于所述模板3’末端的互補(bǔ)脫氧核苷酸與所述寡脫氧核苷酸尾退火。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述單鏈啟動子模板包擴(kuò)T7、T3或SP6 RNA聚合酶啟動子。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述單鏈啟動子模板在3’末端被3’氨基修飾劑、3’脫氧終止子或3’雙脫氧終止子封閉。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括用隨機(jī)引物合成第二鏈cDNA，從而在啟動RNA轉(zhuǎn)錄之前產(chǎn)生隨機(jī)引導(dǎo)的第二鏈cDNA片段。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述隨機(jī)引導(dǎo)的第二鏈cDNA片段在啟動RNA轉(zhuǎn)錄之前結(jié)合在一起。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，RNA轉(zhuǎn)錄是用T7、T3或SP6 RNA聚合酶啟動的。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括擴(kuò)增所得的sRNA分子。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述sRNA擴(kuò)增是用寡脫氧胸苷和隨機(jī)引物的組合啟動的。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述sRNA擴(kuò)增是用寡脫氧胸苷引物啟動的，且所得sRNA分子包含聚腺苷酸尾。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述sRNA擴(kuò)增是用隨機(jī)引物啟動的。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括在所得sRNA分子上加上聚腺苷酸尾。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，用聚腺苷酸聚合酶加上所述聚腺苷酸尾。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括反轉(zhuǎn)錄所得sRNA分子，從而產(chǎn)生單鏈cDNA分子。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述反轉(zhuǎn)錄包括在所述單鏈cDNA分子中摻入可檢測標(biāo)記的核苷酸。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述可檢測標(biāo)記的核苷酸包含熒光染料。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述熒光染料是cy3或cy5。
27.如權(quán)利要求23所述的方法，所述方法還包括在所得cDNA分子中加入至少一個(gè)可檢測標(biāo)記。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述可檢測標(biāo)記是通過核酸樹狀聚體加到cDNA分子上的。
29.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述mRNA轉(zhuǎn)錄物來源于哺乳動物。
30.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述mRNA轉(zhuǎn)錄物來源于人。
31.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述mRNA轉(zhuǎn)錄物分離自包含降解RNA的生物來源。
32.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，a)包括提供具有5’和3’末端的miRNA分子；和從所述miRNA分子合成單鏈cDNA分子。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，a)還包括在所述miRNA分子上加上聚腺苷酸尾。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，用聚腺苷酸聚合酶加上所述聚腺苷酸尾。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述單鏈cDNA分子的合成還包括使所述miRNA分子與寡脫氧胸苷引物反應(yīng)。
36.一種用于產(chǎn)生至少一種sRNA分子的試劑盒，所述試劑盒中包含不能用DNA聚合酶延伸的單鏈RNA聚合酶啟動子模板，和包括用所述模板產(chǎn)生sRNA分子的說明書的指導(dǎo)材料。
37.如權(quán)利要求36所述的試劑盒，所述試劑盒還包含至少一種將寡脫氧核苷酸尾加到具有5’和3’末端的單鏈cDNA分子3’末端的第一種酶，和至少一種將所述RNA聚合酶啟動子模板轉(zhuǎn)變成雙鏈RNA聚合酶啟動子的第二種酶，其中所述指導(dǎo)材料還包括用所述模板和所述第一種和第二種酶產(chǎn)生sRNA分子的說明書。
38.如權(quán)利要求37所述的試劑盒，其特征在于，所述RNA聚合酶啟動子模板包括T7 RNA聚合酶啟動子模板，其中所述第一種酶包括末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，所述第二種酶包括Klenow酶，且其中所述試劑盒還包含以下組分寡dT24引物；隨機(jī)9聚體引物；dNTP混合物；RNA酶抑制劑；dTTP加尾混合物；10X反應(yīng)緩沖液；T7 RNA聚合酶；無核酸酶的水；和其中所述產(chǎn)生sRNA分子的指導(dǎo)材料還包括用所述模板、所述第一種和第二種酶和所述組分產(chǎn)生sRNA分子的說明書。
39.一種探測核酸微陣列的方法，所述方法包括使核酸微陣列與權(quán)利要求24或27所述的可檢測標(biāo)記的cDNA接觸。
全文摘要
提供了產(chǎn)生有義RNA分子的方法和試劑盒。所述有義RNA分子可用于各種研究和診斷用途，如涉及核酸微陣列的基因表達(dá)研究。
文檔編號C12Q1/68GK1985006SQ200580014395
公開日2007年6月20日 申請日期2005年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月1日
發(fā)明者R·C·蓋茨, J·斯西沃姆 申請人:杰尼斯菲爾股份有限公司