專利名稱：用于檢測分子相互作用的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測靶和探針分子之間的特異性相互作用的裝置和方法。
生物醫(yī)學(xué)測試通常是基于對以已知量和位置存在的分子(分子探針)和被檢測的未知分子(分子靶分子)之間的相互作用的檢測。在現(xiàn)代的測試中，探針是以支持物上的物質(zhì)文庫、即所謂的微陣列或芯片的形式排布，以便可以以平行的方式同時用各種不同的探針對樣品進(jìn)行分析(參見例如J.Lockhart，E.A.Winzeler，基因組學(xué)、基因表達(dá)和DNA陣列；Nature 2000，405，827-836)。這里所說的探針通常固定化在適合的基體上，例如在WO 00/12575中描述的那樣(參見例如US 5,412,087和WO 98/36827)，或者以預(yù)定的方式合成生產(chǎn)(參見例如US 5,143,854)用于微陣列的制備。
熒光基團(tuán)標(biāo)記的DNA或RNA分子形式的靶分子與微陣列的核酸探針之間那樣的結(jié)合，其先決條件是靶分子和探針分子都以單鏈核酸的形式存在。有效的、特異性的雜交只可能發(fā)生在這樣的分子之間。單鏈核酸靶分子和核酸探針分子一般可以通過熱變性，并優(yōu)化選擇參數(shù)例如溫度、離子強(qiáng)度和螺旋去穩(wěn)定化分子的濃度的方式獲得。因此，確信的是只有事實(shí)上完全互補(bǔ)即彼此對應(yīng)的序列的探針才能保持與靶序列的配對(A.A.Leitch，T.Schwarzacher，D.Jackson，I.J.Leitch，1994，In vitro Hybridisierung，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg/Berlin/Oxford)。
在生物學(xué)測試方法中使用微陣列的一個典型例子是在生物醫(yī)學(xué)診斷中檢測樣品中的微生物。在此是利用了這樣一個事實(shí)，即核糖體RNA(rRNA)的基因是廣泛分布的，并具有對相應(yīng)的種來說是特征性的序列部分。這些種特征性的序列被施加在單鏈DNA寡核苷酸形式的微陣列上。首先從被檢測的樣品中分離出被檢測的靶分子，并用標(biāo)記物例如熒光標(biāo)記物標(biāo)記。然后將標(biāo)記的靶DNA分子與固定在微陣列上的探針在溶液中保溫，通過相應(yīng)的清洗步驟除去非特異性發(fā)生的相互作用，并利用熒光光學(xué)評估的方式檢測特異性相互作用。通過這種方式，可能通過一個單一測試在一個樣品中同時檢測例如幾個微生物。在這種測試方法中，可以檢測到的微生物的數(shù)量理論上只依賴于已經(jīng)施加在微陣列上的特異性探針的數(shù)量。
在分別在固相表面上的微陣列和探針陣列的幫助下檢測分子相互作用的各種方法和技術(shù)體系已經(jīng)被描述，其中有些是可以商購的。
用于檢測分子相互作用的經(jīng)典系統(tǒng)是基于熒光團(tuán)標(biāo)記的光譜激發(fā)的靶分子的熒光強(qiáng)度的比較。熒光是特定分子當(dāng)受到特定波長的光激發(fā)時發(fā)射出它們自己的光的能力。此時，相繼發(fā)生了特征性的吸收和發(fā)射行為。在分析中，熒光信號增加的比率被假定為官能化表面上標(biāo)記的分子密度由于例如增加了靶和探針分子之間的分子相互作用的效率而增加。
具體來說，熒光信號的定量檢測是通過修改的熒光顯微鏡方法來進(jìn)行的。在這種情況下，通過濾光片或堇青石將具有吸收波長的光和具有發(fā)射波長的光分離開來，通過光學(xué)元件例如物鏡和透鏡將測量到的信號成像在適當(dāng)?shù)臋z測器，例如二維CCD陣列上。一般來說，分析是通過數(shù)字成像方法來進(jìn)行的。
目前為止，公知的技術(shù)解決方案根據(jù)它們所用的光學(xué)機(jī)構(gòu)和元件而不同。問題和限制因素可能來自于信號噪音(背景)，它基本上是由例如所用染料的去色和淬滅效應(yīng)，介質(zhì)、裝配元件和光學(xué)元件自身熒光，以及光學(xué)機(jī)構(gòu)中的散射、反射和二級光源所決定的。
這導(dǎo)致了對發(fā)展高靈敏度的、用于探針陣列的定性和定量比較的熒光檢測器的極大的技術(shù)努力。具體而言，對于中或高通量篩選來說，需要表現(xiàn)出某種程度自動化的特別適合的檢測系統(tǒng)。
對于用于讀出分子陣列的最適化標(biāo)準(zhǔn)epifluorescence機(jī)構(gòu)來說，已知的有基于CCD的檢測器，它在暗視野中通過入射光或透射光來執(zhí)行熒光團(tuán)的激發(fā)，以鑒別例如散射和反射這樣的光學(xué)效應(yīng)(參見例如C.E.Hooper等，在生命科學(xué)中使用增強(qiáng)式CCD相機(jī)進(jìn)行定量光子成像，Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence(1990)，p.337-344)。在這里，陣列的成像或者通過曝光或者通過使用較高分辨率的光學(xué)器件進(jìn)行光柵化來完成。多譜光源的使用允許相對容易地獲得不同的熒光團(tuán)，這可以通過使用不同的激發(fā)濾光片(組合)來進(jìn)行。但是，缺點(diǎn)是陣列的自身熒光和例如照明均勻性這樣的與系統(tǒng)相關(guān)的光學(xué)效應(yīng)要求復(fù)雜的照明光學(xué)裝置和濾鏡系統(tǒng)。
另外的定量檢測熒光信號的方法是基于熒光共聚焦顯微鏡。例如在US 5,304,810中描述的共聚焦掃描系統(tǒng)是基于通過兩個針孔沿著光軸選擇熒光信號。這就要求對樣品進(jìn)行大量的調(diào)整嘗試，或建立起有效的自動聚焦系統(tǒng)。這樣的系統(tǒng)在技術(shù)方案層面上是高度復(fù)雜的。所需的元件例如激光器、針孔、任選冷卻的檢測器如PMT、雪崩二極管、或CCD、復(fù)雜并高度精確的機(jī)械平移元件和光學(xué)裝置必須通過大量的努力來進(jìn)行最適化和整合(參見例如US 5,459,325；US 5,192,980；US5,834,758)。小型化的程度和價格受到元件的多樣性和功能性的限制。
目前，基于探針陣列的分析通常讀出的是熒光數(shù)值(參見例如A.Marshall和J.Hodgson，DNA芯片可能性的排列，Nature Biotechnology，16，1998，27-31；G.Ramsay，DNA芯片技術(shù)狀態(tài)，Nature Biotechnology，16，Jan.1998，40-44)。然而，上述檢測裝置和方法的缺點(diǎn)是高的信號背景導(dǎo)致的有限的精確性，有時相當(dāng)多的技術(shù)嘗試，以及與檢測方法相關(guān)的高花費(fèi)。
具體來說，已知有多種共聚焦系統(tǒng)，適合于檢測以陣列形式安裝在流體室中的小規(guī)模集成物質(zhì)文庫(參見例如US 5,324,633、US 6,027,880、US 5,585,639、WO 00/12759)。
然而，上述的方法和系統(tǒng)只能以非常有限的方式被改造用于檢測特別是安裝在流體系統(tǒng)中的大規(guī)模集成分子陣列，特別是由于其中發(fā)生的散射、反射和光學(xué)象差。此外，在這樣的大規(guī)模集成陣列中，對空間分辨率有極大的要求，但是到目前為止，這在技術(shù)上還不能實(shí)現(xiàn)。
因此，存在著對高度集成的陣列的需求，其中探針和靶之間的相互作用可以以極高的精確性并用相對而言很小的技術(shù)努力來定性和/或定量地檢測。
替代元件的選擇性和獲得性的增加促進(jìn)了替代成像技術(shù)的建立，例如熒光偏振和時間分辨的熒光用于與固體結(jié)合的分析。通過以偏振的方式激發(fā)的熒光團(tuán)扭曲偏振軸的效應(yīng)被用于以微量滴定形式定量。此外，也有方法建立了廉價的具有高通量的系統(tǒng)(HTS系統(tǒng))，使用了相應(yīng)修飾的聚合物箔作為偏振濾光片(參見I.Gryczcynski等.，可目測的偏振感測，Anal.Chem.1999，71，1241-1251)。
最近的進(jìn)展使用了無機(jī)材料的熒光，例如鑭系元素(M.Kwiatowski等，螯合物標(biāo)記的寡核苷酸的固相合成在三色連接酶介導(dǎo)的基因分析中的應(yīng)用，Nucleic Acids Research，1994，22，13)和量子點(diǎn)(M.P.Bruchez等，半導(dǎo)體納米晶體作為熒光生物標(biāo)記物，Science 1998，281，2013)。表現(xiàn)出長的發(fā)射時間、范圍在微秒級的染料，象鑭系元素螯合物，需要將染料轉(zhuǎn)化到流動相中，所以原位分辨檢測是不可能的。
在國際專利申請WO 00/72018中描述了用于檢測用金珠標(biāo)記的樣品的光學(xué)機(jī)構(gòu)以及通過銀放大效應(yīng)使它們可視化的機(jī)構(gòu)。然而這里描述的機(jī)構(gòu)只適合于靜態(tài)測量中的檢測。在靜態(tài)測量中，將靶與布置在探針陣列上的探針相互作用，在反應(yīng)開始后，在那些發(fā)生了相互作用的陣列元件上形成了沉淀，然后記錄下圖象，并根據(jù)沉淀形成的程度指派測量的灰度值濃度。
在WO 02/02810中提供了通過探針和靶在探針陣列上的分子相互作用在樣品中定性和/或定量檢測靶的方法，其中陣列元件上沉淀形成的時間依賴性行為以信號強(qiáng)度的形式被檢測，即執(zhí)行動力學(xué)測量。在描述沉淀的形成作為時間的函數(shù)的曲線的基礎(chǔ)上，給每個陣列元件指派定量陣列元件上探針和靶之間相互作用的值，從而也就是結(jié)合的靶的量。
這樣的動力學(xué)測量需要在例如特定的溫度條件下或在過程的特定階段中記錄圖象系列，例如在記錄的時間中在存在特定溶液的情況下。這需要高度集成的陣列中每個元件的復(fù)雜的合作，特別是在基因分型領(lǐng)域中應(yīng)用時。
此外，在許多生物醫(yī)學(xué)診斷測試中存在這樣的問題，即最初存在的靶分子的量不足以被檢測到，因此通常在實(shí)際測試步驟開始之前，首先必須從樣品中擴(kuò)增靶分子。一般來說，DNA分子的擴(kuò)增是通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來進(jìn)行的。對于RNA的擴(kuò)增來說，必須通過反轉(zhuǎn)錄將RNA分子轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的互補(bǔ)DNA(cDNA)。然后也可以通過PCR擴(kuò)增該cDNA。PCR是標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室方法(例如在Sambrook等(2001)分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，第三版，Cold Spring Harbor，N.Y.，Cold Spring HarborLaboratory Press中)。
通過PCR擴(kuò)增DNA相對較快，通過微型化方法在小體積中允許高樣品通量，并且能有效地進(jìn)行自動化操作。
但是，只通過擴(kuò)增來表征核酸是不可能的。在擴(kuò)增之后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行表征還需要使用一些分析方法，例如核酸序列測定、雜交、和/或電泳分離和分離方法。
一般來說，用于擴(kuò)增和檢測核酸的裝置和方法應(yīng)該被設(shè)計成需要盡可能少的實(shí)驗(yàn)人員的介入。允許對核酸進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，并且在該過程中實(shí)驗(yàn)人員只需要最少介入的方法的優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的。一方面，可以避免污染。另一方面，這種方法的可重復(fù)性相當(dāng)高，因?yàn)樗鼈兛梢赃_(dá)到自動化?？紤]到診斷方法的合法性，這也是極端重要的。
目前，有多種方法可以擴(kuò)增和檢測核酸，其中首先通過PCR擴(kuò)增靶物質(zhì)，然后通過與探針陣列進(jìn)行雜交確定靶序列的身份或遺傳狀態(tài)。一般來說，在雜交范圍內(nèi)，為了獲得足夠用于定性和定量檢測所需的處理量，被檢測的核酸分子或靶分子的擴(kuò)增是必需的。
核酸的PCR擴(kuò)增和它們的雜交檢測都受幾個基本性問題的影響。這也同樣適用于將核酸的PCR擴(kuò)增和它們的雜交檢測相結(jié)合的方法。
在將PCR擴(kuò)增和它的雜交檢測相結(jié)合的方法中，如果在被檢測的核酸或被檢測的靶分子中插入可檢測的標(biāo)記物，例如以熒光標(biāo)記的引物的形式，通常在實(shí)際檢測前要執(zhí)行清洗步驟。這樣的清洗步驟用于除去未轉(zhuǎn)化的引物，與擴(kuò)增的產(chǎn)物相比這些未轉(zhuǎn)化的引物的量大得多，以及用于除去帶有熒光標(biāo)記物的這些核苷酸，它們不參加檢測反應(yīng)或不與陣列上的核酸探針特異性雜交。通過這種方式，預(yù)計可以減少這些分子引起的高水平信號背景。但是，這樣一個額外步驟顯著地減慢了檢測方法。此外，那些與微陣列上的核酸探針特異性雜交的被檢測的核酸的檢測信號也顯著地降低了。后者主要是由于這樣的事實(shí)，即通過雜交結(jié)合的靶和溶解的靶之間的平衡在清洗步驟之后不再存在。已經(jīng)與陣列上的核酸探針雜交的核酸通過清洗而從結(jié)合位點(diǎn)上解離開來，因而與溶解的分子一起被洗掉。即便溶解的分子的清洗或漂洗步驟被執(zhí)行得比已經(jīng)雜交的核酸的解離更快，也僅僅留下可檢測到的信號。
因此，存在對高度集成的陣列的需求，其中探針和靶之間的相互作用可以以極高的精確性和相對而言很小的技術(shù)努力來定性和/或定量地檢測。
此外，存在著對裝置的需要，該裝置允許在一個反應(yīng)空間中執(zhí)行PCR和分析反應(yīng)，例如雜交反應(yīng)。
因此，擺在本發(fā)明面前的問題是克服上面提到的本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的問題，特別是由于分析方法和測試系統(tǒng)之間缺少相容性而引起的問題。
具體來說，擺在本發(fā)明面前的問題是分別提供方法和裝置，其中探針和靶之間在探針陣列上的相互作用可以以極高的精確性和高靈敏度以及以易于使用和成本效率高的方式來定性和/或定量地檢測。
擺在本發(fā)明面前的另一個問題是分別提供方法和裝置，用于核酸的擴(kuò)增和定性定量檢測，其中實(shí)驗(yàn)人員在檢測步驟中的介入可以被最小化。
擺在本發(fā)明面前的另一個問題是分別提供方法和裝置，用于核酸的定性和定量檢測，其中不損害靶分子和陣列上的探針分子之間的相互作用就能確保微陣列上相互作用檢測中的高信噪比。
擺在本發(fā)明面前的另一個問題是分別提供方法和裝置，通過它們可以在檢測中獲得高的動力學(xué)分辨率，即能夠確保在強(qiáng)的信號殘留中檢測弱的探針/靶相互作用。
擺在本發(fā)明面前的另一個問題是分別提供方法和裝置，它們允許以高通量速度幾乎同時對核酸進(jìn)行擴(kuò)增和表征。
這些以及其它擺在本發(fā)明面前的問題通過提供在發(fā)明權(quán)利要求中描述的實(shí)施方案得到了解決。
本發(fā)明提供了定性和/或定量檢測探針分子和靶分子之間的分子相互作用的方法，其中溶液的替換和/或除去，即具體來說是清洗或漂洗步驟可以被省略。
具體來說，本發(fā)明的這樣的方法包含下列步驟a)將含有靶分子的樣品放入帶有微陣列的反應(yīng)室中，其中微陣列含有底材，其上探針分子被固定在陣列元件上；b)檢測靶分子和固定在底材上的探針分子之間的相互作用，其中在將含有靶分子的樣品放入反應(yīng)室之后以及檢測步驟之前或之中不進(jìn)行反應(yīng)室中溶液的替換和/或不從反應(yīng)室中除去溶液。
此外，在本發(fā)明的范圍內(nèi)提供了適合于實(shí)行這些方法的裝置。
具體來說，在本發(fā)明的范圍內(nèi)提供了用于定性和/或定量檢測探針和靶分子之間的分子相互作用的裝置，包括a)具有底材的微陣列，其上探針分子被固定在陣列元件上，其中微陣列被安排在裝置的第一個表面上；以及b)反應(yīng)室，它在上面排列了微陣列的第一個表面和第二個表面之間形成，其中微陣列和第二個表面之間的距離是可變的。
具體來說，微陣列與第二個表面之間距離的可變性通常形成了本發(fā)明裝置的檢測平面，允許由不與微陣列的探針分子具有特異親和性，因而不與它們相互作用的標(biāo)記的靶分子引起的信號背景得以顯著減小或完全避免。
此外，本發(fā)明提供了用于定性和/或定量檢測探針和靶分子之間的分子相互作用的方法，包括下列步驟a將含有靶分子的樣品溶液放入上述的本發(fā)明裝置的反應(yīng)室中；以及b檢測靶分子和固定在底材上的探針分子之間的相互作用。
本發(fā)明用于檢測靶分子的方法和裝置的設(shè)計方式使得在執(zhí)行檢測方法和任選靶分子的擴(kuò)增過程中，反應(yīng)室中需要盡可能少的實(shí)驗(yàn)人員的介入。這樣提供的主要優(yōu)點(diǎn)是避免了污染。此外，與常規(guī)方法相比，本發(fā)明的方法的可重復(fù)性也顯著提高了，因?yàn)楸景l(fā)明的方法由于對外部介入進(jìn)行了最小化從而更便于自動化。根據(jù)診斷方法的要求，上述的優(yōu)點(diǎn)發(fā)揮了重要作用。
此外，為了描述本發(fā)明，使用了下面的定義在本發(fā)明的范圍內(nèi)，探針或探針分子或分子探針被理解為是指這樣的分子，它們由于特定的特征性結(jié)合行為或特定的反應(yīng)性而被用于檢測其它分子。每種能夠與固體表面結(jié)合并具有特異親和性的分子都可以用作布置在陣列上的探針。在優(yōu)選實(shí)施方案中，它們是生物聚合物，特別是肽、蛋白、抗原、抗體、碳水化合物、核酸等類別的生物聚合物和/或其類似物，和/或上述生物聚合物的混合聚合物。在特別優(yōu)選情況下，探針是核酸和/或核酸類似物。
具體來說，具有確定的已知的序列，被用于雜交方法中檢測靶分子的核酸分子被稱為探針。DNA和RNA分子都可以用作核酸。例如，核酸探針或寡核苷酸探針可以是具有10到100個堿基長度的寡核苷酸，優(yōu)選情況下具有15到50個堿基長度，更優(yōu)選情況下具有20到30個堿基長度。本發(fā)明中，典型情況下探針是單鏈的核酸分子或核酸類似物分子，優(yōu)選為具有至少一個與靶分子的序列區(qū)域互補(bǔ)的序列區(qū)域的單鏈DNA分子或RNA分子。根據(jù)檢測方法和使用的不同，探針可以被固定在固相支持底材上，例如以微陣列的形式。此外，根據(jù)檢測方法的不同，它們可以被放射性或非放射性標(biāo)記，以便它們可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中常規(guī)的檢測方法被檢測。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，靶或靶分子被理解為是指通過分子探針被檢測的分子。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，被檢測的靶是核酸。然而，本發(fā)明的探針陣列也可以以類似的方式用于檢測肽/探針相互作用、蛋白/探針相互作用、碳水化合物/探針相互作用、抗體/探針相互作用等。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如果靶是通過與布置在探針陣列上的探針進(jìn)行雜交而檢測的核酸或核酸分子，該靶分子通常含有40到10000個堿基長度的序列，優(yōu)選情況下含有60到2000個堿基長度的序列，更優(yōu)選情況下含有60到1000個堿基長度的序列，特別優(yōu)選情況下含有60到500個堿基長度的序列，最優(yōu)選情況下含有60到150個堿基長度的序列。任選地，它們的序列也可以含有引物的序列以及由引物確定的模板的序列區(qū)域。具體來說，靶分子可以是單鏈的或雙鏈的核酸分子，其一條或兩條鏈被放射性或非放射性標(biāo)記，以便它們可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中常規(guī)的檢測方法被檢測。
根據(jù)本發(fā)明，靶序列是指通過與探針雜交而被檢測的靶序列區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，它也稱作被探針尋址的該區(qū)域。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，物質(zhì)文庫被理解為是指大量不同的探針分子，優(yōu)選至少2到1000000個不同的分子，特別優(yōu)選至少10到10000個不同的分子，最優(yōu)選100到1000個不同的分子。在具體的實(shí)施方案中，物質(zhì)文庫也可以只包含至少50個或以下或至少30000個不同的分子。在優(yōu)選情況下，物質(zhì)文庫以陣列的形式布置在本發(fā)明裝置的反應(yīng)室內(nèi)的支持物上。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，探針陣列被理解為是指分子探針或物質(zhì)文庫在支持物上的布局，其中每個探針的位置是單獨(dú)確定的。優(yōu)選情況下，陣列包含了被稱為陣列元件的確定的位點(diǎn)或預(yù)定的區(qū)域，它們以特定的方式被特別優(yōu)選地布置，其中每個陣列元件通常只包含一種探針。
這里，分子或探針在支持物上的布局可以通過共價的或非共價的相互作用而產(chǎn)生。這里，探針被布置在支持物朝向反應(yīng)室的一面上。布局中，即陣列中的位置通常被稱為點(diǎn)。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，陣列元件、或預(yù)定區(qū)域、或點(diǎn)、或陣列點(diǎn)被理解為是指表面上被確定要安置分子探針的區(qū)域；所有被占據(jù)的陣列元件的總和構(gòu)成了探針陣列。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，支持元件、或支持物、或物質(zhì)文庫支持物或底材被理解是指其上安裝了探針陣列的固體。支持物，通常也被稱為底材或基體，可以是指例如物體支持物、或晶片或陶瓷材料。在具體的實(shí)施方案中，探針也可以直接固定在第一表面上，優(yōu)選在第一表面的分區(qū)上。
布置在底材或檢測表面上的陣列布局中的全體分子、或布置在底材或檢測表面的陣列布局中和支持物或底材上的全體物質(zhì)文庫通常被稱為“芯片”、“微陣列”、“DNA芯片”、“探針陣列”等。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，檢測平面被理解為是指本發(fā)明的裝置的第二個表面。在優(yōu)選情況下，布置在微陣列上的探針在檢測探針和靶的相互作用的過程中基本上位于檢測平面中，這實(shí)際上是由于微陣列和第二表面之間的距離被減小到幾乎為零。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，室體被理解為是指形成反應(yīng)室的固體。物質(zhì)文庫支持物或芯片通常是室體的一部分，其中物質(zhì)文庫支持物可以由與室體的其它部分不同的材料制成。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，反應(yīng)室或反應(yīng)空間被理解為是指在微陣列和第二表面或檢測平面之間形成的空間，在優(yōu)選情況下被設(shè)計為可變的微隙。反應(yīng)空間的側(cè)面被側(cè)壁所限制，這可以通過例如彈性密封墊來進(jìn)行。固定在微陣列上的探針位于面向反應(yīng)室內(nèi)部的一側(cè)上。反應(yīng)室或反應(yīng)空間的底部由陣列的第一或第二表面來界定。具體來說，第二表面或檢測平面與底材或微陣列的表面之間的距離被稱為反應(yīng)空間或反應(yīng)室或微隙的厚度。在本發(fā)明范圍內(nèi)，反應(yīng)空間通常只有小的厚度，例如厚度最多1cm、優(yōu)選情況下最多5mm、特別優(yōu)選情況下最多3mm、最優(yōu)選情況下最多1mm。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，微陣列和第二表面之間的距離被理解為是指微陣列底材表面，即微陣列面向反應(yīng)空間的一面，與面向反應(yīng)空間的第二表面的面之間的距離。如果微陣列與第二表面之間的距離幾乎為零，意味著底材表面均勻平坦地放置在第二表面上。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，微隙被理解為是指反應(yīng)空間，它可以被微陣列和第二表面之間的毛細(xì)作用力充滿。一般來說，微隙具有小的厚度，例如最多1mm，優(yōu)選情況下最多750μm，特別優(yōu)選情況下最多500μm。根據(jù)本發(fā)明，范圍在10μm到300μm、15μm到200μm和/或25μm到150μm之間的厚度優(yōu)選作為微隙的厚度。在具體的實(shí)施方案中，微隙的厚度為50μm、60μm、70μm、80μm或90μm。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如果反應(yīng)空間或反應(yīng)室的厚度超過2mm，則反應(yīng)空間或反應(yīng)室將不再被稱為微隙。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，倉(cartridge)或反應(yīng)倉被理解為是指具有室體和相應(yīng)外套的反應(yīng)室的單元。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，共聚焦熒光檢測系統(tǒng)被理解為是指熒光檢測系統(tǒng)，其中物體在物鏡的焦距平面上通過點(diǎn)光源照明。這里的點(diǎn)光源、物體和點(diǎn)光線檢測器準(zhǔn)確地位于光學(xué)共軛平面上。共聚焦系統(tǒng)的例子在A.Diaspro，共聚焦和二維光子顯微術(shù)基礎(chǔ)、應(yīng)用與進(jìn)展，Wiley-Liss，2002中有描述。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，為整個反應(yīng)室成像的熒光光學(xué)系統(tǒng)被理解為是指非共聚焦的熒光檢測系統(tǒng)，即熒光檢測系統(tǒng)，其中利用點(diǎn)光源的照明不只限于物體。因此這樣的熒光檢測系統(tǒng)沒有焦距限制。
本發(fā)明的范圍內(nèi)的常規(guī)陣列或微陣列在優(yōu)選例如1mm到4mm×1mm到4mm、優(yōu)選為2mm×2mm的方型表面上包含了大約50到10000、優(yōu)選為150到2000個不同種類的探針分子。在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它實(shí)施方案中，微陣列在幾mm2到幾cm2、優(yōu)選大約1mm2到10cm2、特別優(yōu)選為2mm2到1cm2、最優(yōu)選大約4mm2到6.25mm2的表面上包含了大約50到大約80000、優(yōu)選大約100到大約65000、特別優(yōu)選大約1000到大約10000個不同種類的探針分子。例如，常規(guī)的微陣列在2mm×2mm的表面上具有100到65000個不同種類的探針分子。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，標(biāo)記或標(biāo)記物被理解為是指可檢測的單位，例如熒光團(tuán)或其上可以連接可檢測單位的錨定基團(tuán)。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，擴(kuò)增反應(yīng)通常包含10到50個或更多的擴(kuò)增循環(huán)，優(yōu)選大約25到45個循環(huán)，特別優(yōu)選為大約40個循環(huán)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)優(yōu)選為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，擴(kuò)增循環(huán)是指循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的單一增加步驟。PCR的增加步驟也被稱為PCR循環(huán)。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，擴(kuò)增產(chǎn)物是指通過循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)、優(yōu)選通過PCR擴(kuò)增的核酸分子的增加或拷貝或擴(kuò)增而得到的產(chǎn)物。通過PCR方法擴(kuò)增的核酸分子也被稱為PCR產(chǎn)物。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，變性溫度被理解為是指在擴(kuò)增循環(huán)中雙鏈DNA被分開時的溫度。通常情況下、特別是在PCR中，變性溫度高于90℃，優(yōu)選大約95℃。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，退火溫度被理解為是指引物與被檢測的核酸雜交時的溫度。通常情況下、特別是在PCR中，退火溫度在50℃到65℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選大約60℃。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，鏈延伸溫度或延伸溫度被理解為是指通過插入單體元件合成核酸時的溫度。通常情況下、特別是在PCR中，延伸溫度在大約68℃到大約75℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選大約72℃。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，寡核苷酸引物或引物是指與被檢測的DNA、也被稱為靶DNA結(jié)合或雜交的寡核苷酸，其中在循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)中，被檢測的DNA的互補(bǔ)鏈的合成從結(jié)合位點(diǎn)開始。具體來說，引物是指優(yōu)選具有大約12到30個堿基的短的DNA或RNA寡核苷酸，它與較大的DNA或RNA分子的一部分互補(bǔ)，并在其3’-末端具有游離的3-羥基基團(tuán)。由于該游離的3’-羥基基團(tuán)，引物可以作為任何任選的DNA或RNA聚合酶的底材，該聚合酶在引物上以5’-3’的方向合成核苷酸。此處，新合成的核苷酸的序列由與引物雜交的模板序列中位于引物的游離3’-羥基之后的序列所預(yù)先決定。常規(guī)長度的引物包含12到50個核苷酸，優(yōu)選在15到30個核苷酸之間。
作為模板用于合成互補(bǔ)核酸鏈的雙鏈核酸分子或核酸鏈通常被稱為模板或模板鏈。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，分子相互作用或相互作用被理解為是指靶分子和固定化的探針分子之間特異性的、共價的或非共價的鍵。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，探針和靶分子之間的相互作用是雜交。
從互補(bǔ)的單鏈核酸分子形成雙鏈核酸分子或雙鏈體分子被稱為雜交。此時，結(jié)合優(yōu)選總是發(fā)生在A和T或G和C堿基對之間。在雜交的范圍內(nèi)，例如DNA-DNA雙鏈體、DNA-RNA雙鏈體或RNA-RNA雙鏈體可以形成。通過雜交，具有核酸類似物的雙鏈體也可以形成，例如DNA-PNA雙鏈體、RNA-PNA雙鏈體、DNA-LNA雙鏈體和RNA-LNA雙鏈體。雜交實(shí)驗(yàn)通常被用于檢測序列互補(bǔ)性，因此可以檢測兩個不同核酸分子的身份。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，處理被理解為是指純化、濃縮、標(biāo)記、擴(kuò)增、相互作用、雜交和/或清洗和漂洗步驟以及其它在利用物質(zhì)文庫檢測靶的過程中進(jìn)行的方法步驟。檢測本身不落入術(shù)語處理之下。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，樣品或樣品溶液或被分析物或溶液是被分析的液體，具體來說其中包含了被檢測以及可能需要被擴(kuò)增的靶分子。此外，除了常規(guī)的添加劑例如緩沖液之外，這種溶液中也可以包含執(zhí)行擴(kuò)增反應(yīng)所需的物質(zhì)，例如引物。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，從反應(yīng)室中替換反應(yīng)室中的溶液具體來說是指漂洗或清洗步驟。替換溶液用來例如除去用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記的、不能與微陣列上的探針發(fā)生特異性相互作用的分子，這可以在完成相互作用之后通過用無標(biāo)記的溶液替換樣品溶液來進(jìn)行。不與微陣列上的探針發(fā)生特異性相互作用的分子是例如用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記的、但在擴(kuò)增反應(yīng)中還沒有被轉(zhuǎn)化的引物，或者是用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記的、但在陣列上不具有互補(bǔ)探針的靶分子，所述互補(bǔ)探針與所述靶分子發(fā)生特異性相互作用。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，從反應(yīng)室中除去溶液被理解為是指這樣的步驟，通過該步驟可以將用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記的、但不與微陣列上的探針發(fā)生特異性相互作用的分子從反應(yīng)室中除去。不與微陣列上的探針發(fā)生特異性相互作用的分子是例如用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記的、但在擴(kuò)增反應(yīng)中還沒有被轉(zhuǎn)化的引物，或者是用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記的、但在陣列上不具有互補(bǔ)探針的靶分子，所述互補(bǔ)探針與所述靶分子發(fā)生特異性相互作用。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如果在將含有靶分子的樣品注入反應(yīng)室和檢測相互作用之間不進(jìn)行反應(yīng)室中溶液的替換和/或不從反應(yīng)室中除去溶液，可以想象在這段時期內(nèi)可以另外將溶液注入反應(yīng)室中，而不替換或除去已經(jīng)存在于反應(yīng)室中的溶液。
因此，本發(fā)明的第一個目標(biāo)包含了定性和/或定量檢測探針和靶分子之間的相互作用的方法，具體來說包含下列步驟a)將含有靶分子的樣品注入含有微陣列的反應(yīng)室中，其中微陣列含有底材，其上探針分子被固定在陣列元件上；b)檢測靶分子和固定在底材上的探針分子之間的相互作用。
其中在將含有靶分子的樣品注入反應(yīng)室之后和檢測步驟之前或之中不進(jìn)行反應(yīng)室中溶液的替換和/或不從反應(yīng)室中移出溶液。
在本發(fā)明的這個方面，本發(fā)明的方法的基本特征是在檢測被檢測的靶分子和固定在微陣列的底材上的探針分子之間的相互作用的過程中不進(jìn)行反應(yīng)室中溶液的替換或不從反應(yīng)室中取出溶液。也就是說，在相互作用后不需要漂洗或清洗步驟，以及/或在相互作用后不從反應(yīng)室中除去不與微陣列上的探針特異性相互作用的分子，就可以進(jìn)行靶和探針之間相互作用的檢測。
在本發(fā)明的方法中，具體來說這可以通過焦距選擇性檢測方法來保證，例如通過共聚焦技術(shù)或通過樣品底物中、基于深度選擇性照明、由于例如總反射引起的激發(fā)光的逐漸消失解偶聯(lián)(TIFR)，或者使用基于波導(dǎo)的方法。在為了增加靈敏度進(jìn)一步排除由存在于液體中、即未雜交的熒光分子引起的背景信號的情況下，這樣的焦點(diǎn)選擇性方法將是特別優(yōu)選的。使用熒光標(biāo)記的靶分子，通過使用象總內(nèi)部反射熒光顯微術(shù)(TIRF)或共聚焦熒光顯微術(shù)這樣的方法，可以將特異性相互作用信號與背景熒光區(qū)分開來。
這種例子是基于CCD的檢測器，它在暗視野中通過入射光或透射光執(zhí)行熒光團(tuán)的激發(fā)，以辨別光學(xué)效應(yīng)如散射和反射(參見例如C.E.Hooper等，在生命科學(xué)中使用增強(qiáng)式CCD相機(jī)進(jìn)行定量光子成像，Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence(1990)，p.337-344)。其它替代的能夠用于本發(fā)明的方法的熒光檢測系統(tǒng)是例如在WO 00/12759、WO 00/25113和WO 96/27025中描述的白燈裝置，例如在US 5,324,633、US 6,027,880、US 5,585,639和WO 00/12759中描述的共聚焦系統(tǒng)，例如在US 5,760,950中描述的基于共聚焦成像中的Nipkow盤的共聚焦激發(fā)系統(tǒng)，例如在WO 98/57151中描述的基于結(jié)構(gòu)化激發(fā)分布的系統(tǒng)，例如在WO 99/27140中描述的使用微型光學(xué)元件的大規(guī)模集成熒光檢測系統(tǒng)，以及例如在WO 00/12759中描述的激光掃描系統(tǒng)。使用這種常規(guī)熒光檢測系統(tǒng)的熒光檢測方法的總的進(jìn)展在例如US 5,324,633中有描述。
在WO 2004/087951中描述的裝置，其中的反應(yīng)室通過微隙形成，特別適合于執(zhí)行本發(fā)明的檢測方法，無需替換反應(yīng)室中的溶液和/或不從反應(yīng)室中移出溶液。WO 2004/087951的相關(guān)內(nèi)容在此明確地引用。
在本發(fā)明的這個方面的另一個實(shí)施方案中，反應(yīng)室中溶液的替換和/或除去的步驟被避免，這是通過檢測陣列表面上的質(zhì)量變化來進(jìn)行檢測的，例如在WO 03/004699中描述的那樣。WO 03/004699的相關(guān)內(nèi)容在此明確地引用。
在本發(fā)明的這個方面的另一個實(shí)施方案中，反應(yīng)室中溶液的替換和/或除去的步驟被避免，這是通過檢測聲學(xué)表面波來進(jìn)行檢測的，例如在Z.Guttenberg等，Lab Chip.2005；5(3)308-17中描述的那樣。
在本發(fā)明的這個方面的另一個實(shí)施方案中，反應(yīng)室中溶液的替換和/或除去的步驟被避免，這是通過陣列表面的電極的電化學(xué)檢測來進(jìn)行檢測的，例如通過測量氧化還原電勢的改變(參見例如X.Zhu等，LabChip.2004；4(6)581-7)或cyclic voltometry(參見例如J.Liu等，AnalChem.2005；77(9)2756-2761；J.Wang，Anal Chem.2003；75(15)3941-5)。
在本發(fā)明的這個方面的另一個實(shí)施方案中，反應(yīng)室中溶液的替換和/或除去的步驟被避免，這是通過陣列表面的電極的電檢測來進(jìn)行檢測的，例如通過阻抗測量(另外參見S.M.Radke等，Biosens Bioelectron.2005；20(8)1662-7)。
在本發(fā)明的這個方面的另一個實(shí)施方案中，反應(yīng)室中溶液的替換和/或除去的步驟被避免，這是通過使用具有FRET探針(FRET，熒光共振能量轉(zhuǎn)移)的微陣列來進(jìn)行的。這種FRET探針的使用是基于熒光淬滅劑對的形成，從而使只有當(dāng)靶分子與表面上的互補(bǔ)探針結(jié)合時才產(chǎn)生熒光信號。FRET探針的使用在例如B.Liu等，PNAS 2005，102，3，589-593；K.Usui等，Mol Divers.2004；8(3)209-18；J.A.Cruz-Aguado等，Anal Chem.2004；76(14)4182-8和J.Szollosi等，J Biotechnol.2002；82(3)251-66中有描述。
在本發(fā)明的這個方面的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，反應(yīng)室中溶液的替換和/或除去的步驟被避免，這是通過使用下面詳細(xì)描述的用于定性和/或定量檢測探針和靶分子之間分子相互作用的本發(fā)明裝置來實(shí)現(xiàn)的，其中該裝置包含a)具有底材的微陣列，其上探針分子被固定在陣列元件上，其中微陣列被安排在裝置的第一個表面上；以及b)反應(yīng)室，在上面排列了微陣列的第一個表面和第二個表面之間形成，
其中微陣列和第二個表面之間的距離是可變的。
本發(fā)明的另一個目標(biāo)涉及使用上述的FRET探針分子，和/或從下列的組中選擇的檢測方法上述的總內(nèi)部反射熒光顯微術(shù)(TIRF)，上述的共聚焦熒光顯微術(shù)，上述的檢測質(zhì)量改變的方法，上述的檢測聲學(xué)表面波的方法，上述的電化學(xué)和/或電學(xué)檢測方法，以避免在將含有靶分子的樣品注入反應(yīng)室期間或之后、以及在定性和/或定量檢測探針和靶分子之間的分子相互作用的方法中檢測之前或期間替換反應(yīng)室中的溶液和/或從反應(yīng)室中除去溶液，具體來說包含下列步驟a)將含有靶分子的樣品溶液注入含有微陣列的反應(yīng)室中，其中微陣列含有底材，其上探針分子被固定在陣列元件上b)檢測靶分子和固定在底材上的探針分子之間的相互作用。
本發(fā)明的另一個目的具體來說是用于定性和/或定量檢測探針和靶分子之間的分子相互作用的裝置，包含a)具有底材的微陣列，其上探針分子被固定在陣列元件上，其中微陣列被安排在裝置的第一個表面上；以及b)反應(yīng)室，在上面排列了微陣列的第一個表面和第二個表面之間形成，其中微陣列和第二個表面之間的距離是可變的。
在探針分子和靶分子之間完成相互作用后，由樣品溶液中存在的、不與探針分子相互作用的標(biāo)記的分子引起了不希望的背景。具體來說，在探針和/或靶分子是核酸和/或核酸類似物的情況下，該背景是由存在于樣品溶液中不與探針分子雜交的標(biāo)記的引物和/或標(biāo)記的核酸引起的。
已知除去干擾的背景信號的可能性是在相互作用完成之后用未標(biāo)記的、例如無熒光的溶液替代樣品溶液。但是，由于溶蝕、溶液的老化以及不滲透性問題，這種改變一般來說是浪費(fèi)的并容易受到干擾。
本發(fā)明的裝置的基本特征是微陣列和第二表面之間的距離是可變的。微陣列和第二表面之間的距離的可變性意味著本發(fā)明的裝置的反應(yīng)室是可壓縮的。具體來說，微陣列和第二表面之間的距離的變化方式使得微陣列可以均勻地和/或可逆地放置在第二表面上，或可以將其活性一面、即其上固定了核酸探針的一面壓在該表面上。
因此，可壓縮的反應(yīng)室允許在進(jìn)行檢測之前通過減小微陣列和檢測平面之間的距離來替換含有不與探針分子相互作用、因而構(gòu)成不希望的背景的標(biāo)記分子的樣品溶液。通過這種方式，有可能在檢測之前不用非標(biāo)記的溶液替換樣品溶液，就能夠使用任何光學(xué)檢測系統(tǒng)檢測探針和靶分子之間的相互作用。例如，通過本發(fā)明的裝置，不用非標(biāo)記的溶液替換樣品溶液，使用DNA芯片的簡單熒光顯微成像技術(shù)檢測相互作用信號，特別是弱的熒光液體，是可能的。
具體來說，通過下面描述的本發(fā)明的裝置的實(shí)施方案，最終可以確保不再需要光學(xué)檢測系統(tǒng)的聚焦。因此，本發(fā)明的裝置允許例如使用不具有自動對焦功能的簡單的熒光顯微鏡裝置作為讀取裝置，用來檢測靶和探針之間的雜交，而不需要液體操作步驟，具體來說例如清洗步驟來除去不與陣列結(jié)合的靶分子，例如未雜交的靶核酸，這與迄今為止用于檢測核酸的熒光光學(xué)檢測系統(tǒng)相反。
盡管通過本發(fā)明的裝置進(jìn)行多功能樣品處理和分析是可行的，仍提供了用于檢測和任選擴(kuò)增樣品中的靶分子的成本效率非常高的系統(tǒng)。本發(fā)明的裝置、特別是與光學(xué)檢測系統(tǒng)相連后，更加耐用，以至于它們也適合于移動使用。
通過適當(dāng)?shù)剡x擇芯片、處理方案和分析的化合物，本發(fā)明的裝置可以被用于大多數(shù)不同類型的基因分析，例如誘因診斷、病菌診斷和分型。因此，在本發(fā)明的裝置中，可以使用很少的設(shè)備執(zhí)行完全的遺傳分析，它也能夠作為一次性倉使用。因此，本發(fā)明的裝置允許執(zhí)行在位的檢測方法，例如在獻(xiàn)血過程中。測量結(jié)果可以快速獲得，優(yōu)選在0.5到2小時之內(nèi)。所有可以使用本發(fā)明的裝置操作的步驟，例如純化、處理、擴(kuò)增核酸和實(shí)際的雜交都可以自動執(zhí)行。操作者只需要熟悉樣品的撤回、樣品在本發(fā)明的裝置中的注入，以及注意分析結(jié)果。
在優(yōu)選情況下，微陣列和第二表面之間的距離在大約0到大約1mm的范圍內(nèi)變化。微陣列和第二表面之間距離的進(jìn)一步優(yōu)選的下限是大約0.1μm，大約1μm，和大約10μm。微陣列和第二表面之間距離的進(jìn)一步優(yōu)選的上限為大約0.01mm、大約0.5mm、大約1mm，最優(yōu)選的是大約0.3mm。令人吃驚的是，如果底材表面和第二表面之間的距離大約為零或接近零，探針和陣列表面上的靶之間的相互作用甚至不受影響。
在優(yōu)選情況下，本發(fā)明的裝置還含有檢測系統(tǒng)。此時，在優(yōu)選情況下檢測系統(tǒng)是光學(xué)系統(tǒng)。適合于本發(fā)明的范圍的系統(tǒng)的例子是基于熒光、光吸收、共振轉(zhuǎn)移等的檢測系統(tǒng)。在優(yōu)選情況下，光學(xué)檢測系統(tǒng)是熒光光學(xué)系統(tǒng)。在特別優(yōu)選的情況下，熒光光學(xué)系統(tǒng)是不具有自動對焦的熒光顯微鏡，例如具有固定焦距的熒光顯微鏡。
在另一個實(shí)施方案中，檢測系統(tǒng)與至少一個調(diào)距橫板相連，它位于第二表面之上，可以調(diào)整檢測系統(tǒng)和第二表面之間的距離。如果微陣列和第二表面之間的距離大約為零，該調(diào)距橫板也確定了芯片表面與檢測裝置的光學(xué)系統(tǒng)之間的距離。因此，保持光學(xué)檢測裝置和微陣列表面之間的距離變化在很小的范圍內(nèi)是可能的。這種變化只包含第二表面，一般為玻璃表面的厚度變化，第二表面的偏斜，芯片和檢測平面之間或調(diào)距橫板和檢測平面之間的壓制表面上可能的污染物引起的層的厚度。這使得重新對焦使光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)入焦點(diǎn)成為不必需，極大地簡化了裝置的操作，并/或使得昂貴的自動對焦裝備成為不必需。
在另一個實(shí)施方案中，為第一和第二表面之間形成的反應(yīng)空間提供了側(cè)面限制的補(bǔ)償區(qū)域，當(dāng)微陣列和第二表面之間的距離減小時，它能夠保持反應(yīng)室中的體積基本上恒定。
在優(yōu)選情況下，在第一和第二表面之間形成的反應(yīng)空間在側(cè)面進(jìn)一步受到彈性密封墊的限制。特別優(yōu)選情況下，彈性密封墊由硅橡膠制成。
為了確保探針和靶分子之間相互作用的檢測，具體來說，第二表面由透光的材料，優(yōu)選為玻璃制成。
在本發(fā)明的裝置的另一個實(shí)施方案中，第一表面，至少在其位于微陣列之下的區(qū)域中，被開發(fā)成能夠相對于第二表面指導(dǎo)微陣列，使得微陣列與第二表面之間的距離是可變的。
此時，第一表面，至少在其位于微陣列之下的區(qū)域中，可被開發(fā)成能夠朝向第二表面指導(dǎo)微陣列，以便微陣列和第二表面之間的距離可以被減小，和/或能夠背向第二表面指導(dǎo)微陣列，以便微陣列和第二表面之間的距離可以被增加。
在本實(shí)施方案中，在優(yōu)選情況下第一表面，至少在其位于微陣列之下的區(qū)域中，可以被彈性變形。在特別優(yōu)選情況下，第一表面由彈性合成材料例如彈性膜制成。
另外優(yōu)選的是第一表面由兩個重疊的層形成，兩個重疊的層的外層至少在位于微陣列之下的區(qū)域具有凹口。在本實(shí)施方案中，優(yōu)選情況下兩個重疊的層的內(nèi)層由彈性密封墊或密封膜形成，它們通常也限制了反應(yīng)空間的側(cè)面(參見圖6)。密封膜可以被導(dǎo)向第二表面。密封膜封閉了外層上的凹口，它通常對應(yīng)于室體的較低的一面。在反應(yīng)室進(jìn)行PCR的過程中，由于PCR中普遍存在的高溫產(chǎn)生了內(nèi)部壓力，盡管密封膜相對不穩(wěn)定，仍然使反應(yīng)室產(chǎn)生壓力抗性。因此本實(shí)施方案對應(yīng)于自關(guān)閉的閥。為了確保密封膜的彈性，優(yōu)選情況下膜被提供有補(bǔ)償褶(參見圖6)。
還可以提供裝置，該裝置包含至少一種工具，通過該工具可以相對于第二表面指導(dǎo)微陣列。在下文中，該工具將被稱為指導(dǎo)第一表面的工具。該指導(dǎo)第一表面的工具優(yōu)選選自桿、針、挺桿和螺釘。
此時，裝置可以包含至少一種指導(dǎo)第一表面的工具，通過該工具可以將微陣列導(dǎo)向第二表面，使得微陣列和第二表面之間的距離可以被減小，和/或能夠背向第二表面指導(dǎo)微陣列，使得微陣列和第二表面之間的距離可以被增加。
在特別優(yōu)選的情況下，可以通過在第一表面上由工具施加壓力和/或牽引來相對于第二表面指導(dǎo)微陣列。
此時，上述安置在第二表面上的調(diào)距橫板可以用作指導(dǎo)第一平面的工具的支架。
在優(yōu)選情況下，可以通過指導(dǎo)第一表面的工具引起第一表面的震動，特別是以10到30Hz的頻率震動，特別優(yōu)選的是以大約20Hz的頻率震動。以這種方式，可以除去芯片上存在的可能干擾檢測的泡，和/或通過指導(dǎo)第一表面的工具的震動引起的充分混合增加相互作用的速度，例如雜交速度。
在優(yōu)選情況下，也可以相對于第一表面指導(dǎo)第二表面，使得微陣列和第二表面之間的距離可變。
此時，可以相對于第一表面指導(dǎo)第二表面，使得微陣列和第二表面之間的距離可以被減小，和/或使得微陣列和第二表面之間的距離可以被增加。
具體來說，這可以確保通過調(diào)距橫板在第二表面上施加壓力和/或牽引使第二表面可以相對于第一表面進(jìn)行引導(dǎo)，使得微陣列和第二表面之間的距離可變。
在本發(fā)明的裝置的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一表面和第二表面都可以被指導(dǎo)，以便微陣列和第二表面之間的距離可變。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的裝置被開發(fā)成已經(jīng)在原始狀態(tài)下的固定在第一表面上的微陣列在優(yōu)選情況下均勻地安置在第二表面上以形成檢測平面。可以對第一表面進(jìn)行指導(dǎo)以便微陣列和第二表面之間的距離增加。此時，第一表面優(yōu)選由彈性材料制成。
在本發(fā)明的裝置的另一個實(shí)施方案中，第一表面被開發(fā)成圍繞旋轉(zhuǎn)軸的可旋轉(zhuǎn)的方式。旋轉(zhuǎn)軸將第一表面分成兩面。在本實(shí)施方案中，微陣列被安排在第一表面的第一個側(cè)面部分上。在優(yōu)選情況下，用于旋轉(zhuǎn)運(yùn)動的旋轉(zhuǎn)軸通過第一表面的中心，即在優(yōu)選情況下兩個側(cè)面部分是相等大小的。在優(yōu)選情況下第一表面由彈性材料制成。
在可旋轉(zhuǎn)的第一表面的第一個位置，第一表面被排列得基本上平行于第二表面。在第一位置上，微陣列的表面與第二表面基本上平坦地接觸，即其上固定有探針分子的底材表面基本上不被樣品溶液弄濕。在該第一位置上，在第一表面的第二個側(cè)面部分和第二表面之間形成了一個空間，它在后面也被稱為處理室。該處理室可以作為處理樣品溶液的室。
在可旋轉(zhuǎn)的第一表面的第二個位置，第一表面被排列得相對于第二表面成180°以外的角度。在該第二個位置上，微陣列的表面不與第二表面接觸，即固定在微陣列底材上的探針分子可以自由接近樣品溶液中存在的靶分子，因此能夠與后者相互作用。在第二個位置中，處理室被壓縮。
可旋轉(zhuǎn)的第一表面在優(yōu)選情況下可以通過在第一表面的第一個側(cè)面部分上施加牽引力來旋轉(zhuǎn)，和/或通過在第一表面的第二個側(cè)面部分上施加壓力來旋轉(zhuǎn)。壓力和/或牽引力可以通過上述的用于指導(dǎo)第一表面的工具來施加。
芯片或底材或第一表面在優(yōu)選情況下可以由硅、陶瓷材料如氧化鋁陶瓷、浮法硼硅玻璃(borofloat)、石英玻璃、單晶CaF2、藍(lán)寶石、黃玉、PMMA、聚碳酸酯和/或聚苯乙烯構(gòu)成。對材料的選擇也依賴于裝置或芯片所使用的目的而進(jìn)行。如果例如芯片被用于表征PCR產(chǎn)物，只有那些能夠抗拒95℃溫度的材料可以使用。
在優(yōu)選情況下，芯片通過核酸分子，具體來說通過DNA或RNA分子而官能化。但是，它們也可以通過肽和/或蛋白例如抗體、受體分子、藥物活性肽和/或激素、碳水化合物和/或該生物聚合物的混合聚合物而官能化。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，分子探針通過聚合物接頭例如改性的硅烷層固定在底材表面上。這樣的聚合物接頭可以用于底材表面的衍生制備，因此可以用于分子探針的固定化。在探針共價結(jié)合的情況下，可以使用已經(jīng)用反應(yīng)性官能團(tuán)例如環(huán)氧化物或醛類進(jìn)行官能化或改性的聚合物如硅烷。此外，本領(lǐng)域的專業(yè)人員也熟悉通過異硫氰酸酯、琥珀酰亞胺和酰亞胺酯對表面進(jìn)行活化。最后，通常相應(yīng)地衍生出氨基官能化的表面。此外，加入偶聯(lián)試劑例如二環(huán)己基碳二亞胺能夠確保分子探針相應(yīng)的固定化。
反應(yīng)室的室體在優(yōu)選情況下由例如玻璃、合成材料、和/或金屬例如高等級鋼、鋁和黃銅這樣的材料構(gòu)成。為了生產(chǎn)室體，可以使用例如適合于注模法的合成材料。尤其是例如macrolon、尼龍、PMMA和特氟隆這樣的合成材料是可能的。在具體的實(shí)施方案中，優(yōu)選的是導(dǎo)電的合成材料例如含有5％到30％碳纖維的聚酰胺，含有5％到30％碳纖維的聚碳酸酯，含有2％到20％不銹鋼纖維的聚酰胺，以及含有5％到40％、特別是20％到30％碳纖維的PPS。可以選擇和/或可以加上的是，第一和第二表面之間的反應(yīng)空間可以通過隔片關(guān)閉，該隔片允許例如利用注射器填充反應(yīng)空間。在優(yōu)選實(shí)施方案中，室體由透光的材料例如玻璃、PMMA、聚碳酸酯、聚苯乙烯和/或黃玉構(gòu)成。此時，材料的選擇將根據(jù)裝置的使用目的進(jìn)行調(diào)整。例如當(dāng)選擇材料時需要考慮到裝置將要暴露到的溫度。如果，例如裝置將要用于執(zhí)行PCR，只有那些在如95℃的溫度下能夠較長時間保持穩(wěn)定的材料可以使用。
具體來說，室體被開發(fā)成能夠使微陣列用其活性面，即其上固定有核酸探針的陣列面均勻地和/或可逆地壓向第二表面。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的裝置含有從下列的組中選擇的模塊優(yōu)選由合成材料制成的室體，密封反應(yīng)室的隔板或密封墊，DNA芯片，和/或第二個透光的表面，優(yōu)選為玻璃窗格，其中第二表面也可任選同時用作芯片(參見圖2和圖3)。在本實(shí)施方案中，室體和密封墊被開發(fā)成具有彈性，以便DNA芯片可以以其活性面均勻和可逆地壓向玻璃蓋。由此，位于DNA芯片和檢測表面之間的標(biāo)記的分析液體被完全置換(參見圖5和圖6)。通過這種方式可以進(jìn)行高靈敏度的熒光檢測例如計算機(jī)成像的熒光顯微術(shù)，而不受樣品溶液的背景熒光的損害。
在優(yōu)選情況下，室體的第二表面由透明的材料如玻璃和/或透光的合成材料如PMMA、聚碳酸酯、聚苯乙烯或丙烯酸樹脂構(gòu)成。
在優(yōu)選情況下，反應(yīng)室在第二表面和微陣列之間以具有可變厚度的微隙的形式形成。通過在芯片和檢測平面之間形成微隙，可以利用毛細(xì)作用力安全地填充反應(yīng)室。該毛細(xì)作用力也發(fā)生在反應(yīng)室無壓縮的狀態(tài)中；但是它們可以通過壓縮反應(yīng)室來增加。在特別優(yōu)選的情況下，微隙的厚度在大約0m到大約100m的范圍內(nèi)。
從能夠壓縮反應(yīng)空間從而減小微陣列和檢測平面之間的縫隙的寬度的可能性，帶來了在反應(yīng)室中操作液體的其它可能性。因此，在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，提供了幾個小室代替一個單一的室，其中該小室之間的分區(qū)不達(dá)到第二表面的高度，以便在反應(yīng)室未壓縮的狀態(tài)下小室之間能夠產(chǎn)生流體聯(lián)系。通過壓縮反應(yīng)室可以將小室分開。因此通過壓縮，小室之間的分區(qū)可以像閥門一樣操作。
該通過閥門分開的小室的具體實(shí)施方案是將本發(fā)明的裝置的反應(yīng)空間進(jìn)一步分成不同的PCR室。在每個室中呈現(xiàn)單獨(dú)的引物。開始時，小室被同時充滿被分析物。然后將反應(yīng)空間壓縮。此后，反應(yīng)空間經(jīng)歷PCR的溫度循環(huán)。因?yàn)槊總€小室充滿不同的引物，在每個室中發(fā)生不同的擴(kuò)增反應(yīng)。室之間的交換不會發(fā)生。
在PCR進(jìn)行之后發(fā)生雜交。此時，每個小室可以含有單獨(dú)的芯片區(qū)域或單獨(dú)的芯片。但是，也可能通過增加微陣列與第二表面之間的距離促進(jìn)小室之間的流體聯(lián)系，以便被擴(kuò)增的不同物質(zhì)混合并以這種方式與芯片表面雜交。
具有被閥門分開的小室的實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)是增加了PCR的多重性，即一個樣品進(jìn)行獨(dú)立的PCR的數(shù)量，在一步反應(yīng)中由于生物化學(xué)的原因受到限制。因此，將PCR的數(shù)量調(diào)整到芯片表面上可能的探針數(shù)量是可能的。
因此，在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，反應(yīng)室包含了至少兩個小室，其中在第一個未壓縮狀態(tài)中小室是有流體聯(lián)系的，在第二個壓縮的狀態(tài)中在小室之間沒有流體聯(lián)系。
在特別優(yōu)選情況下，每個小室被指派到微陣列的確定區(qū)域。
具體來說，小室可以通過用孔洞裝備微陣列和/或第二表面來形成，所述孔洞用作小室之間的壁。
在特別優(yōu)選情況下，小室之間的壁由彈性密封墊形成。
當(dāng)然，具有用閥門分開的小室的處理單元的實(shí)施方案可以任意地與任何前述的壓縮原理相結(jié)合。
在本發(fā)明的裝置的另一個實(shí)施方案中，第一表面由部分可變形的彈性材料例如彈性膜制成。在只有一部分反應(yīng)空間可以被壓縮的情況下，可以產(chǎn)生芯片被導(dǎo)向第二表面的小室、不能彼此分開的小室以及不能被改變的小室。因此，能夠例如在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時將鹽泵入雜交室的簡單的泵系統(tǒng)可以在反應(yīng)空間中使用。這對于例如最適化PCR緩沖液的化學(xué)雜交條件來說可能是有利的，其中PCR緩沖液僅僅為了執(zhí)行PCR而最適化。
當(dāng)將反應(yīng)室分成幾個小室時，優(yōu)選使用幾種工具進(jìn)行攪拌。通常情況下，攪拌的工具與指導(dǎo)第一表面的工具相同。因此，單獨(dú)的室可以被特異性地攪拌。這可能適合于例如執(zhí)行分離的擴(kuò)增空間和/或雜交空間。
當(dāng)然，本發(fā)明的裝置的這個具有幾種攪拌工具的實(shí)施方案也可以任意地與任何前述的壓縮原理相結(jié)合。
上述選自室體、側(cè)面限制反應(yīng)空間的密封墊、微陣列和檢測平面的本發(fā)明的裝置的元件或模塊形成了本發(fā)明的裝置的所謂的處理單元。在處理單元中，可以進(jìn)行PCR、雜交反應(yīng)、檢測和/或評估。在探針和靶是例如待檢測的抗體和蛋白的情況下也是同樣，由此不需要執(zhí)行PCR。但是，下面的解釋是專門針對使用核酸靶和探針的檢測技術(shù)而做的。然而，對于本領(lǐng)域的專業(yè)人員來說，如何對下面描述的單元進(jìn)行修飾以使它們適合于其它的應(yīng)用是很清楚的。
在優(yōu)選情況下，本發(fā)明的裝置的處理單元以模塊的方式構(gòu)建。這意味著處理單元可以包含模塊的任意組合。在分析過程中也可以交換模塊。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的裝置還包含溫度控制和/或調(diào)節(jié)單元以控制和/或調(diào)節(jié)反應(yīng)室中的溫度。這樣的用于控制和/或調(diào)節(jié)反應(yīng)室中的溫度的溫度控制和/或調(diào)節(jié)單元具體來說包含加熱和/或制冷元件或溫度組塊。此時，加熱和/或制冷元件或溫度組塊可以被安排成與第一表面和/或第二表面相接觸。通過與第一和第二表面都接觸，可以確保特別有效的溫度控制和調(diào)節(jié)。
在本實(shí)施方案中，微陣列的底材或第一表面和/或第二表面與加熱和/或制冷元件或溫度組塊相連接，在優(yōu)選情況下它們應(yīng)該由具有良好的導(dǎo)熱性質(zhì)的材料制成。這種導(dǎo)熱材料提供了顯著的優(yōu)點(diǎn)，確保在反應(yīng)空間的整個表面上有著均勻的溫度分布，從而允許在整個反應(yīng)室中均勻地執(zhí)行溫度依賴性的反應(yīng)例如PCR，并得到高的產(chǎn)率，并且可以高準(zhǔn)確地控制或調(diào)節(jié)。
因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，微陣列的底材或第一表面或第二表面由具有良好導(dǎo)熱性的材料制成，其具有的熱傳導(dǎo)率優(yōu)選在15到500Wm-1K-1的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選在50到300Wm-1K-1的范圍內(nèi)，最優(yōu)選在100到200Wm-1K-1的范圍內(nèi)，其中的材料通常是不透光的。適合的導(dǎo)熱材料的例子是硅，陶瓷材料如氧化鋁陶瓷，和/或金屬如高級別鋼、鋁、銅或黃銅。
如果本發(fā)明的裝置的微陣列底材或第一表面或第二表面基本上由陶瓷材料構(gòu)成，優(yōu)選使用氧化鋁陶瓷。這樣的氧化鋁陶瓷的例子是Kyocera公司(Neuss，Germany)生產(chǎn)的陶瓷A-473、A-476和A-493。
在優(yōu)選情況下，微陣列底材或第一表面或第二表面裝備有任選小型化的溫度傳感器和/或電極，或者在其背面，即背離反應(yīng)室的一面具有加熱器裝置，以便可能通過誘導(dǎo)的電滲透流對樣品液體進(jìn)行回火和混合。
溫度傳感器可以被開發(fā)成例如鎳-鉻薄膜阻抗溫度傳感器。
電極可以被開發(fā)成例如金-鈦電極，特別是四極。
加熱和/或制冷元件在優(yōu)選情況下可以被選擇，以便可能在反應(yīng)室中對液體進(jìn)行快速加熱和冷卻。此時快速加熱和冷卻被理解為是指可以通過加熱和/或制冷元件介導(dǎo)范圍在0.2K/s到30K/s之間、優(yōu)選0.5K/s到15K/s之間、特別優(yōu)選2K/s到15K/s之間、最優(yōu)選8K/s到12K/s之間或大約10K/s的溫度變化。在優(yōu)選情況下，加熱和/或制冷元件也可以介導(dǎo)1K/s到10K/s之間的溫度變化。
加熱和/或制冷元件例如阻抗加熱器可以被開發(fā)成例如鎳-鉻薄膜阻抗加熱器。
對于溫度傳感器、加熱和/或制冷元件或增加溫度的工具和電極的進(jìn)一步詳細(xì)規(guī)格和大小，可以參考國際專利申請WO 01/02094的內(nèi)容。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，反應(yīng)室的回火通過使用由導(dǎo)電材料構(gòu)成的室體來確保。這樣的導(dǎo)電材料在優(yōu)選情況下是導(dǎo)電的合成材料，例如任選含有5％到30％碳纖維的聚酰胺、任選含有5％到30％碳纖維的聚碳酸酯、和/或任選含有2％到20％不銹鋼纖維的聚酰胺。優(yōu)選情況下，含有5％到40％、特別優(yōu)選是20％到30％碳纖維的PPS(聚苯硫醚)被用作導(dǎo)電合成材料。另外在優(yōu)選情況下室體被開發(fā)成具有膨脹和變細(xì)的部分。室體中的這種膨脹和變細(xì)的部分允許對反應(yīng)室或相應(yīng)的表面進(jìn)行特定的加熱。此外，使用這種體積的導(dǎo)體的優(yōu)點(diǎn)是，即使是使用的材料任選具有較低的導(dǎo)熱性，也可以確保室體或相應(yīng)的表面被均勻地回火，因?yàn)闊岜会尫诺矫總€體積元件中。
偶聯(lián)和導(dǎo)出熱到反應(yīng)空間中可以通過不同的方式進(jìn)行。尤其是可以考慮通過外部微波輻射、內(nèi)部或外部阻抗加熱、內(nèi)部感應(yīng)線圈或表面、水制冷和加熱、摩擦、光照、特別是用紅外光照、空氣冷卻和/或加熱、摩擦、溫度發(fā)射器和珀耳帖元件帶入熱量。
反應(yīng)空間中溫度的測量可以以不同的方式進(jìn)行，例如通過集成阻抗傳感器、半導(dǎo)體傳感器、光波指導(dǎo)的傳感器、多色染料、多色液晶、外部高溫計例如所有類型的IR輻射和/或溫度傳感器，它們被整合在指導(dǎo)微陣列的工具中。
反應(yīng)室中溫度的測量還可以通過下面的方式來進(jìn)行，通過在室體中整合溫度傳感器，例如通過在室體的生產(chǎn)加工過程中注入，通過使用高溫計、IR傳感器和/或溫差電堆進(jìn)行非接觸性測量，通過用例如整合在裝置中的熱傳感器并與室體或室的適當(dāng)表面或適當(dāng)體積相接觸進(jìn)行接觸測量，通過測量檢測平面的折射指數(shù)的溫度依賴性變化，通過測定例如溶液中、探針陣列上或室密封墊中特定分子的顏色的溫度依賴性變化，和/或通過測量所用溶液的pH值的溫度依賴性變化，所述pH值的變化可以通過測量pH敏感的指示劑的顏色變化，例如通過測量其吸收值。
此外，由于加熱器電阻的急速增加，可以實(shí)現(xiàn)對溫度的自動限制，其中相應(yīng)的閾值溫度優(yōu)選在95℃到110℃的范圍內(nèi)。當(dāng)達(dá)到閾值溫度時，加熱器的電阻急速增加，從而實(shí)際上沒有電流流過，因而實(shí)際上不再有熱放出。具體來說，聚合物例如導(dǎo)電的聚酰胺可以用于這樣的加熱器，它的電阻在閾值溫度下由于聚合物基體的改變或相的改變而增加。
在一個實(shí)施方案中，溫度控制和調(diào)節(jié)單元被集成在第一表面和/或第二表面中。在該實(shí)施方案中，具體來說處理單元裝配有加熱器(參見圖4)，它用于執(zhí)行PCR和雜交中的溫度改變。
在優(yōu)選情況下，處理單元具有低的熱容量，以便在低的電力需求下可以實(shí)現(xiàn)最大的溫度改變速度，例如至少5K/s。為了確保處理單元快速冷卻，另一個優(yōu)選實(shí)施方案打算提供制冷系統(tǒng)，例如空氣冷卻系統(tǒng)。
在優(yōu)選情況下，處理單元的冷卻可以通過持續(xù)地將處理單元周圍的空間回火到降低的溫度、從而被動地冷卻倉來實(shí)現(xiàn)。這使得主動地冷卻反應(yīng)倉成為不必需。
在另一個實(shí)施方案中，溫度控制和調(diào)節(jié)單元可以包含溫度組塊，其中每個被預(yù)熱到確定的溫度。在該實(shí)施方案中，具體來說處理單元沒有集成加熱器。由于省略了集成加熱系統(tǒng)，可以提供更合算的處理單元。
由于溫度組塊與本發(fā)明的裝置的第一表面和/或第二表面接觸，在優(yōu)選情況下確保溫度控制和調(diào)節(jié)單元的溫度組塊之間的熱轉(zhuǎn)移。在優(yōu)選情況下，溫度組塊可以被排列成線型或排列在旋轉(zhuǎn)盤上，并且以這種方式集成在例如檢測裝置中。圖7顯示了具有幾個溫度組塊的旋轉(zhuǎn)盤，每個溫度組塊被調(diào)整到確定的溫度。通過交換處理單元下方的溫度組塊，處理單元被帶到溫度組塊所限定的特定溫度下。在優(yōu)選情況下，溫度組塊的生產(chǎn)使得它們比處理單元具有明顯高的熱容量，以便在該實(shí)施方案中也可以實(shí)現(xiàn)最大的溫度改變速度，例如至少5K/s。在優(yōu)選情況下，溫度組塊僅僅是溫度調(diào)節(jié)型的而不是加熱或制冷型的，以便在這種情況下對能量的需求也是最小的。在本實(shí)施方案中，可以省略對處理單元的制冷或加熱。
在另一個實(shí)施方案中，溫度控制和調(diào)節(jié)單元被集成在用于指導(dǎo)第一表面的工具中和/或用于攪拌的工具中和/或調(diào)距橫板中。在本實(shí)施方案中，熱轉(zhuǎn)移是通過將工具和/或調(diào)距橫板與第一表面和/或第二表面相接觸來進(jìn)行的。
在優(yōu)選情況下，裝置另外包含再加工單元，用于樣品溶液的純化和/或再濃縮，和/或控制反應(yīng)室中流體的裝載和卸載。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，流體被理解為是指液體和氣體。此外，分析溶液可以在再加工單元中重新緩沖。最后，再加工單元也可以用于提供必需的分析化學(xué)物質(zhì)。流體容器與反應(yīng)室的連接可以按照例如國際專利申請WO 01/02094中的描述來開發(fā)。
在本實(shí)施方案中，在特別優(yōu)選情況下，反應(yīng)室和再加工單元通過兩個套管相連，其中套管的安排方式使得第一個套管確保流體從再加工單元注入到反應(yīng)室中，而第二個套管確保被注入的流體從反應(yīng)室中趕出的空氣排出。注入到再加工單元中的樣品因此可以通過套管達(dá)到處理單元的反應(yīng)室中。為此，套管被安排的方式使得它們通過套管導(dǎo)管到達(dá)反應(yīng)室。
再加工單元可以被開發(fā)成與處理單元分開。在用樣品溶液以及任選其它反應(yīng)液體填充反應(yīng)室后，再加工單元可以與處理單元分開，優(yōu)選情況下使其脫離，也可以丟棄它。
下面將描述用于填充反應(yīng)室的集成或非集成單元的實(shí)施方案，這些單元在下面也被稱為填充單元或再加工單元。
通常，通過適當(dāng)?shù)墓ぞ呃缥軐⒎磻?yīng)溶液帶入填充單元的特定開口。液體運(yùn)輸?shù)窖b置中是通過用吸管施加壓力、或通過另外的壓力產(chǎn)生工具例如注射器或自動單元例如自動處理機(jī)的功能元件來進(jìn)行的。
在優(yōu)選情況下，填充單元被開發(fā)成以工效學(xué)適合的方式手動操作。此外，在優(yōu)選情況下，它在外部具有其它容易接近的開口以補(bǔ)加反應(yīng)物質(zhì)。
在優(yōu)選情況下，填充單元還含有適合的流體界面以穿透室體的密封墊。為此使用了特定的套管，它由例如高級別鋼或聚合物構(gòu)成，通常具有0.05mm到2mm的直徑。在優(yōu)選情況下，安排了至少一個或以上的套管，特別優(yōu)選情況下安排兩個，其中一個可以用于填充反應(yīng)液體，另一個用于反應(yīng)空間的通氣并用于取出剩余的流體。這樣的套管可以以固定或可互換的方式與填充單元相連，其中在優(yōu)選情況下進(jìn)行一個不能被操作者分離開的連接，用于操作一次性的填充物。
填充單元也可以含有覆蓋套管的單元，以便在系統(tǒng)分離后可以避免任何可能的操作者造成的損傷或環(huán)境的污染。
在優(yōu)選情況下，填充單元還包含了適合的機(jī)械界面以與反應(yīng)倉滑動配合接觸。該界面可以被開發(fā)成例如特定的咬合的形式。以這種方式，可以確保在優(yōu)選的位點(diǎn)穿過室體的密封墊。
當(dāng)在相應(yīng)的自動處理器中處理反應(yīng)倉時，需要進(jìn)行適合的機(jī)械測量，這允許在裝置中進(jìn)行調(diào)整和精確定位。具體來說這應(yīng)用于液體的替換和/或進(jìn)料的定位，以及為反應(yīng)倉的定位，以用于在反應(yīng)室中進(jìn)行反應(yīng)后檢測信號。
裝置或填充單元還可以包含集成的廢物容器，用來容納剩余物或趕出的氣體或液體介質(zhì)，例如保護(hù)性氣體填充物或緩沖液。廢物容器可以用例如另外的氣體、液體或固體介質(zhì)填充，它們可逆或不可逆地結(jié)合液體或氣體物質(zhì)，例如纖維素、過濾材料、硅膠。此外，廢物容器可以具有通氣口，或可以表現(xiàn)出負(fù)壓以改善整個單元的填充行為。
此外，廢物容器也可以被開發(fā)成分離的模塊。在這種情況下，填充單元被裝備有相應(yīng)的流體界面，它們對應(yīng)于商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，例如LuerLock，并且通向外部。這樣的界面可以與連續(xù)系統(tǒng)具有形式或力的聯(lián)系。
在第一個具體的實(shí)施方案中，填充是通過具有集成的廢物容器的可分離的填充單元來進(jìn)行的。具體來說，填充單元用于反應(yīng)室的非重復(fù)填充。填充單元被開發(fā)成例如將它插到或暫時連接到倉上，將樣品注入到反應(yīng)空間中，在填充完成之后，再將填充單元與倉分離并丟棄。在該第一個具體的實(shí)施方案中，填充單元還包含有集成的廢物容器，可以如前所述被開發(fā)成。該實(shí)施方案的一個例子被顯示在圖22中。通過模塊式填充單元填充反應(yīng)倉的步驟顯示在圖23中。
在第二個具體的實(shí)施方案中，填充通過集成的填充單元進(jìn)行。此時，填充單元是反應(yīng)倉的一個集成元件，因而不能與后者分開；填充單元和倉的丟棄是同時進(jìn)行的。此時，在優(yōu)選情況下填充單元被用于反應(yīng)室的非重復(fù)填充，并可能用于其它的內(nèi)部流體處理步驟。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選情況下填充單元還包含技術(shù)裝置，用于執(zhí)行套管在系統(tǒng)中的優(yōu)選位置，特別用于防止在將套管插入室體的密封墊的過程中由于疏忽造成的刺穿。然而，也可以設(shè)想套管在該優(yōu)選位置刺穿室體的密封墊。該技術(shù)裝置可以通過例如設(shè)置彈簧、彈性元件、或用于進(jìn)行捕獲的凹口和隆起處來實(shí)現(xiàn)。在本實(shí)施方案中，填充元件還包含填充和廢物通道，其中含有相應(yīng)的流體界面，所述界面也可以對應(yīng)于商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，例如LuerLock，并通向外部。這樣的界面可以與連續(xù)系統(tǒng)具有主動的或非主動的連鎖，用于注入和/或除去氣體和/或液體介質(zhì)。該實(shí)施方案的一個例子顯示在圖24中。具有集成的填充單元的反應(yīng)倉的填充步驟顯示在圖25中。
在第三個具體的實(shí)施方案中，填充通過具有集成的廢物容器的集成的填充單元來進(jìn)行。在該實(shí)施方案中，填充單元是反應(yīng)倉的一個集成元件，因此不能與后者分開；填充單元和倉同時被丟棄。此時，填充單元優(yōu)選用于反應(yīng)室的非重復(fù)填充，并可能用于其它的內(nèi)部流體處理步驟。在本實(shí)施方案中，填充單元還優(yōu)選包含技術(shù)裝置，用于執(zhí)行套管在系統(tǒng)中的優(yōu)選位置，優(yōu)選用于防止在將套管插入室體的密封墊的過程中由于疏忽造成的刺穿。然而，也可以設(shè)想套管在該優(yōu)選位置刺穿室體的密封墊。該技術(shù)裝置可以通過例如設(shè)置彈簧、彈性元件、或用于進(jìn)行捕獲的凹口和隆起處來實(shí)現(xiàn)。在本實(shí)施方案中，填充元件還包含集成的廢物容器，可以按照上面的描述開發(fā)。該實(shí)施方案的一個例子顯示在圖26中。具有集成的填充單元和集成的廢物容器的反應(yīng)倉的填充步驟可以通過例如在圖23和25中描述的步驟的組合來進(jìn)行。
下面將描述安排套管以便在壓縮步驟中維持壓力平衡的具體的實(shí)施方案。用于反應(yīng)倉的填充工具的套管可以被安排成例如這樣的方式，使得在非壓縮狀態(tài)下填充和反應(yīng)空間壓縮過程中轉(zhuǎn)移多余的反應(yīng)溶液都是可能的。在優(yōu)選情況下，這可以通過適當(dāng)改變密封墊和套管排列的結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)，其中套管優(yōu)選刺穿反應(yīng)室中的補(bǔ)償區(qū)域。如果多余的體積不能通過特定的密封墊設(shè)計被吸收，這種排列結(jié)構(gòu)是特別適合的。圖27中舉例顯示了一種帶有未改變形式的密封墊的可能的垂直套管排列結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的裝置還可以含有與檢測系統(tǒng)相連、用于控制試驗(yàn)步驟和/或用于處理由檢測系統(tǒng)記錄的信號的單元。控制和/或處理單元可以是微控制器或工業(yè)計算機(jī)。這種檢測單元和處理單元的偶聯(lián)，確保了反應(yīng)結(jié)果轉(zhuǎn)化為分析結(jié)果，允許將本發(fā)明的裝置作為手持裝置使用在例如醫(yī)學(xué)診斷中。
此外，在優(yōu)選情況下，本發(fā)明的裝置還具有用于外部計算機(jī)的界面。這尤其允許將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移到外部存儲器中。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，裝置裝備有編碼，優(yōu)選為數(shù)據(jù)矩陣和/或條形碼，包含了關(guān)于物質(zhì)文庫和/或擴(kuò)增和/或檢測反應(yīng)的執(zhí)行情況的信息。通過這樣的個人識別數(shù)字，讀取或檢測裝置可以自動識別哪個試驗(yàn)已經(jīng)被進(jìn)行。為此，在生產(chǎn)本發(fā)明的裝置時，含有關(guān)于物質(zhì)文庫、檢測反應(yīng)的執(zhí)行等信息的數(shù)據(jù)記錄被儲存在數(shù)據(jù)庫中。因此，具體來說，數(shù)據(jù)記錄可以含有關(guān)于探針在陣列上布局的信息，以及關(guān)于如何以最有利的方式進(jìn)行評估的信息。數(shù)據(jù)記錄或數(shù)據(jù)矩陣還可以含有關(guān)于PCR的溫度-時間模式的信息，該P(yáng)CR任選用于擴(kuò)增靶分子。如此獲得的數(shù)據(jù)記錄在優(yōu)選情況下是數(shù)字，以數(shù)據(jù)矩陣的形式連接到支架上。通過記錄在數(shù)據(jù)矩陣中的數(shù)字，在讀出物質(zhì)文庫時可以任選地訪問成套的數(shù)據(jù)記錄。最后，數(shù)據(jù)矩陣可以被溫度控制或調(diào)節(jié)單元和其它控制器，例如用于反應(yīng)室通過流體容器的填充和卸載的控制器所讀取，因此可以確保擴(kuò)增和檢測反應(yīng)自動地進(jìn)行。
編碼，例如數(shù)據(jù)矩陣，不必須含有全部的信息。它也可以簡單地含有一個識別或進(jìn)入號碼，然后可以通過該號碼從計算機(jī)或數(shù)據(jù)載體中下載必需的信息。
本發(fā)明的裝置可以非常容易地制造。圖3中顯示了處理單元可以由僅僅4個獨(dú)立的元件構(gòu)成，它們彼此之間簡單地適合。圖10和11顯示的實(shí)施方案由于本發(fā)明的結(jié)構(gòu)也可以容易地制造，盡管它們由幾個元件組成。對每個元件的大小的幾何耐受性可以是非常大的，例如1/10到2/10mm，以便例如密封墊和室體的大規(guī)模注?？梢砸苑浅：纤愕姆绞竭M(jìn)行。低耐受性通過將芯片壓向檢測平面而便利化，因此距離檢測顯微鏡的光徑基本上不受處理單元的元件的影響。僅有的幾個具有低耐受性的幾何數(shù)量是芯片的x、y位置和檢測平面的厚度。但是芯片的z位置的變化只發(fā)揮次要作用。盡管它們的技術(shù)需求低，光學(xué)系統(tǒng)例如熒光檢測顯微鏡的聚焦裝置并不需要。這些性質(zhì)清楚地表明了本發(fā)明的裝置對于移動在位使用的適合性。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了定性和/或定量檢測探針和靶分子之間的分子相互作用的方法，包括下面的步驟a按照前面的描述將含有靶分子的樣品、優(yōu)選為樣品溶液注入本發(fā)明裝置的反應(yīng)室中；以及b檢測靶分子和固定在底材上的探針分子之間的相互作用。
本發(fā)明的方法允許在反應(yīng)室中定性和/或定量檢測探針和靶分子之間的分子相互作用，而不需要在相互作用完成之后和檢測之前替換樣品或反應(yīng)液體以除去干擾的背景。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，探針和靶分子之間的相互作用的檢測通常如下進(jìn)行在將探針或探針群以預(yù)定的方式以微陣列的形式固定到特定的基體上之后或提供微陣列之后，將靶與探針在溶液中接觸，并在預(yù)定的條件下保溫。通過保溫，在探針和靶之間發(fā)生了特異性相互作用或雜交。此時形成的鍵比靶分子與不特異性針對該靶分子的探針形成的鍵明顯穩(wěn)定得多。
靶及其探針之間的特異性相互作用的檢測可以通過多種方法進(jìn)行，這一般依賴于在靶分子與微陣列相互作用之前、之中或之后插入到靶分子中的標(biāo)記物的類型。一般情況下，這樣的標(biāo)記物是熒光基團(tuán)，以便可以通過熒光光學(xué)方法讀出特異性的靶/探針相互作用，這種方法與其它常規(guī)的檢測方法特別是質(zhì)量敏感的方法相比具有較高的局部分辨率，并且工作量小(參見例如A.Marshall，J.Hodgson，DNA芯片可能性的陣列，Nature Biotechnology 1998，16，27-31；G.Ramsay，DNA芯片技術(shù)狀態(tài)，Nature Biotechnology 1998，16，40-44)。
根據(jù)固定在微陣列上的物質(zhì)文庫和靶分子的化學(xué)本質(zhì)，核酸與核酸之間、蛋白與蛋白之間以及核酸與蛋白之間的相互作用可以通過這種試驗(yàn)原理來檢測(調(diào)查報告參見F.Lottspeich，H.Zorbas，1998，Bioanalytik，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg/Berlin，Germany)。
此處，抗體文庫、受體文庫、肽文庫和核酸文庫都被當(dāng)作物質(zhì)文庫，可以被固定在微陣列或芯片上。
到目前為止核酸文庫扮演了最重要的角色。它們是微陣列，其上固定了脫氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。
在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，微陣列與第二表面之間的距離保持在這樣一個位置，它允許在步驟b)的檢測之前進(jìn)行樣品溶液的處理和/或靶分子與固定在底材上的探針分子之間的相互作用，例如被檢測的核酸的擴(kuò)增和/或被檢測的核酸與固定在底材上的核酸探針之間的雜交。
優(yōu)選情況下步驟b)中微陣列和第二表面之間的距離可以改變，優(yōu)選減小。即在優(yōu)選情況下檢測在微陣列與檢測平面之間距離減小的情況下進(jìn)行。特別優(yōu)選情況下，微陣列與檢測平面之間的距離在檢測過程中大約為零。
在一個實(shí)施方案中，微陣列被導(dǎo)向第二表面以減小微陣列和第二表面之間的距離。優(yōu)選情況下，這是通過利用至少一種指導(dǎo)第一表面的工具施加壓力以推動第一表面來確保的，所述工具例如挺桿、桿、針和螺釘，其中工具產(chǎn)生的壓力作用點(diǎn)具體來說位于微陣列下方。
將微陣列壓向第二表面或檢測平面可能是容易的，因?yàn)榈谝槐砻嬷辽僭谖㈥嚵邢路降膮^(qū)域中是可以彈性變形的。此外，第一表面也可以被開發(fā)成具有兩個重疊的層，其中兩個重疊的層的外層至少在位于微陣列之下的區(qū)域具有凹口，而兩個重疊的層的內(nèi)層由彈性密封墊形成。然后通過指導(dǎo)第一表面的工具在內(nèi)層靠近凹口的位置施加壓力。
但是，指導(dǎo)第一表面的工具例如針、桿、挺桿和/或螺釘不能僅僅用于對第一表面施加壓力。在泡將在DNA芯片上形成這種可能干擾檢測的情況下，可以通過指導(dǎo)第一表面的工具進(jìn)行攪拌以除去這些泡，例如對第一表面施加大約20Hz的震動頻率，特別是以彈性膜的形式。
此外，常見的一個問題是芯片表面上的相互作用例如雜交花費(fèi)非常長的時間。除了其它原因之外，這是由于相互作用或雜交的速度是由擴(kuò)散作用決定的事實(shí)。在優(yōu)選情況下，可以通過指導(dǎo)第一表面的工具進(jìn)行攪拌以增加相互作用或雜交的速度，例如對第一表面施加大約20Hz的震動頻率，特別是以彈性膜的形式，因?yàn)閿嚢杌蛘饎訉?dǎo)致反應(yīng)室中的混合。
在另一個實(shí)施方案中，第二表面被導(dǎo)向第一表面以減小微陣列與第二表面之間的距離。具體來說，通過利用調(diào)距橫板在第二表面上施加壓力將第二表面導(dǎo)向第一表面，這可以被確保。
在另一個實(shí)施方案中，第一表面被導(dǎo)向第二表面，第二表面被導(dǎo)向第一表面，以減小微陣列與第二表面之間的距離。
下面將描述相對第二表面指導(dǎo)第一表面或相對第一表面指導(dǎo)第二表面的其它實(shí)施方案。該實(shí)施方案不僅適合于相對第二表面或檢測表面定位第一表面或探針陣列，而且還可以具體來說用于相對于檢測表面移動探針陣列。通過這樣的運(yùn)動，可以實(shí)現(xiàn)例如反應(yīng)室中溶液的攪拌。
在一個實(shí)施方案中，通過磁場將探針陣列相對于檢測表面移動或在室中移動。探針陣列和/或第二表面可以，例如含有磁性材料或含有其上添加了磁性材料的元件，和/或固定在完全或部分由磁性材料構(gòu)成的支架上。在優(yōu)選情況下還可以通過移動磁體被動地移動探針陣列和/或第二表面，該磁體安置在相應(yīng)的表面之下并且例如通過磁場與該表面相聯(lián)。
在另一個實(shí)施方案中，探針陣列通過重力沖擊相對于檢測平面移動和/或定位。
在另一個實(shí)施方案中，探針陣列通過反應(yīng)室中產(chǎn)生的液流相對于檢測平面移動和/或定位。為此，裝置可以被開發(fā)成例如這樣的方式，在探針陣列被液流包圍的情況下，在反應(yīng)室的一側(cè)產(chǎn)生負(fù)壓，而在另一側(cè)產(chǎn)生正壓，這樣就導(dǎo)致探針陣列在反應(yīng)室中運(yùn)動。這樣的液流可以例如通過由反應(yīng)室中局部的溫差引起的熱對流來產(chǎn)生。
在另一個實(shí)施方案中，探針陣列通過電場沖擊相對于檢測平面移動和/或定位。
在另一個實(shí)施方案中，通過局部過熱在探針陣列下產(chǎn)生氣泡，由此將芯片在反應(yīng)室中移動或?qū)驒z測平面。
通過在檢測前減小微陣列與第二表面之間的距離，在優(yōu)選情況下樣品溶液幾乎完全從微陣列與檢測平面之間的區(qū)域中除去。因此，由不與陣列表面結(jié)合的標(biāo)記的分子，例如標(biāo)記的引物和/或標(biāo)記的靶核酸引起的背景信號被減小了。
因此，在步驟b)的檢測中，微陣列與第二表面之間的距離優(yōu)選通過這樣的方式改變，使得微陣列與第二表面之間的樣品溶液基本上被除去。然后微陣列基本上位于檢測平面中，干擾的背景幾乎被避免了。
在另一個替代實(shí)施方案中，微陣列平坦地放置在在裝置的原始狀態(tài)下已經(jīng)形成檢測平面的第二表面上，并且不僅通過將第一表面導(dǎo)向第二表面和/或?qū)⒌诙砻鎸?dǎo)向第一表面而被帶入檢測平面。在該實(shí)施方案中，在處理步驟中微陣列不被樣品溶液潤濕。為了進(jìn)行相互作用反應(yīng)例如雜交，優(yōu)選由彈性材料制成的第一表面例如彈性膜被導(dǎo)離檢測表面。因此芯片表面移離檢測表面并被樣品溶液潤濕。相互作用例如雜交可以發(fā)生。為了進(jìn)行檢測和進(jìn)一步處理，例如以彈性膜形式的第一表面被再次釋放，由此跳回至其最初被調(diào)整的位置，這可以通過指導(dǎo)第一表面的工具例如針、桿、螺釘和/或挺桿施加壓力來加速。因此，微陣列可以被再次壓向檢測平面，檢測可以在沒有背景的情況下進(jìn)行。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，使用了上述的本發(fā)明的裝置，其第一表面被開發(fā)成可以圍繞旋轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)的方式。
在第一個位置，也被稱為起始位置中，安置在第一個側(cè)面部分上的微陣列的表面基本上均勻地放置在第二表面上，即其上固定有探針分子的底材表面基本上不被樣品溶液潤濕。優(yōu)選情況下，在第一個位置，在第一表面的第二個側(cè)面部分與第二表面之間形成的空間，處理室中進(jìn)行反應(yīng)溶液的處理，即具體來說是純化、重新濃縮、清洗和漂洗和/或擴(kuò)增步驟。
然后，將可旋轉(zhuǎn)的第一表面帶到第二個位置，其中第一表面被排列成相對于第二表面呈180°以外的角度，優(yōu)選為45°的角度。優(yōu)選情況下，這通過使用前述的指導(dǎo)第一表面的工具在第一表面的第一個側(cè)面部分上施加牽引力和/或在第一表面的第二個側(cè)面部分施加壓力來進(jìn)行。通過將第一表面導(dǎo)向第二個位置，微陣列被導(dǎo)離第二表面，樣品溶液滲入微陣列和第二表面之間形成的空洞。固定在微陣列的底材上的探針分子可以讓樣品溶液中存在的靶分子自由接近，從而使探針和靶分子之間的相互作用可以發(fā)生。在本發(fā)明的方法的本實(shí)施方案中，在第一表面上施加壓力和/或牽引力的優(yōu)點(diǎn)在于，通過這種方式可以移動樣品溶液，從而可以加速相互作用反應(yīng)。
為了進(jìn)行檢測以及任選其它處理，可旋轉(zhuǎn)的第一表面被導(dǎo)離第一個位置，這可以通過例如在第一表面的第一個側(cè)面部分施加壓力和/或在第一表面的第二個側(cè)面部分施加牽引力，或在第一表面是彈性設(shè)計的情況下，通過釋放第一個側(cè)面部分來進(jìn)行。此時，微陣列又基本上平坦地放置在第二表面上，以便第二表面和微陣列之間的樣品溶液在該位置上被基本上替換，可以產(chǎn)生基本上無背景的檢測。
被檢測的靶可以存在于任何種類的樣品中，優(yōu)選在生物樣品中。
優(yōu)選情況下，靶在通過本發(fā)明方法檢測和定量之前被分離、純化、復(fù)制和/或擴(kuò)增。
本發(fā)明的方法還允許在反應(yīng)室中擴(kuò)增和定性和/或定量檢測核酸，其中分子相互作用或雜交的檢測可以在完成不需要替換樣品或反應(yīng)液體的循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)之后進(jìn)行。本發(fā)明的方法也確保了擴(kuò)增中雜交事件的循環(huán)檢測，也就是說即使是在循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)期間也可以檢測雜交。最后，在本發(fā)明的方法的幫助下，擴(kuò)增產(chǎn)物可以在擴(kuò)增反應(yīng)過程中和擴(kuò)增反應(yīng)完成后被定量。
通常擴(kuò)增是通過常規(guī)的PCR方法或通過平行地實(shí)行通過PCR對待分析的靶分子進(jìn)行擴(kuò)增并通過上述的靶分子與物質(zhì)文庫支持物的雜交的方法來進(jìn)行的。
在另一個實(shí)施方案中，擴(kuò)增在兩步方法中(也參見WO 97/45559)以多重PCR的形式進(jìn)行。在第一步中，通過使用融合引物進(jìn)行多重PCR，該引物的3’-末端是基因特異性的，5’-末端代表通用的區(qū)域。后者在用于多重反應(yīng)的所有正向和反向引物中都是相同的。在第一個階段中，引物的量是有限的。此時，所有的多重產(chǎn)物可以被擴(kuò)增直到達(dá)到一致的摩爾量，只要對所有產(chǎn)物來說循環(huán)的次數(shù)足夠達(dá)到引物的限制就行。在第二個階段中，使用了與融合引物的5’-區(qū)域一致的通用引物。擴(kuò)增被進(jìn)行直到獲得所需的DNA量。
在本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，檢測在循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)期間和/或循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)完成之后進(jìn)行。在優(yōu)選情況下，檢測在擴(kuò)增反應(yīng)過程的每個擴(kuò)增循環(huán)中進(jìn)行。另外，檢測也可以在每兩個循環(huán)中或每三個循環(huán)中或任意間隔中進(jìn)行。
在進(jìn)行線性擴(kuò)增反應(yīng)，其中靶的量隨著每一步以某個量增加，或在進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)，例如PCR，其中DNA靶的量隨著每一步相乘增加時，在處理單元中，芯片可以在每個擴(kuò)增步驟之后被壓向檢測平面，從而進(jìn)行檢測。因此，有可能對擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行在線監(jiān)測。具體來說在非線性擴(kuò)增反應(yīng)中，因此可能確定DNA靶量的起始濃度。
通過這種方式，擴(kuò)增步驟的數(shù)量也可以被在線最適化。只要DNA靶的量達(dá)到特定的濃度，擴(kuò)增就可以中止。如果起始靶濃度低，循環(huán)步驟的次數(shù)就被增加以便能夠確保進(jìn)行產(chǎn)物的分析。在需要減少反應(yīng)時間的陽性對照的情況下，分析處理可以在非常早就中止。
執(zhí)行擴(kuò)增反應(yīng)所需的化學(xué)物質(zhì)，例如聚合酶、緩沖液、氯化鎂、標(biāo)記的引物、具體來說是熒光標(biāo)記的引物、dNTPs等，可以被提供到反應(yīng)室中，例如以冷凍干燥的形式。
優(yōu)選情況下，循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)是PCR。在PCR中，通常每個PCR循環(huán)使用三個溫度。優(yōu)選情況下，雜交的核酸在最高的溫度即變性溫度下從微陣列上解離。變性溫度的優(yōu)選值是95℃。因此可以在該變性溫度下測定雜交信號，作為在相應(yīng)的PCR循環(huán)中被檢測的核酸的零值或參照值。
PCR循環(huán)中下一個溫度是退火溫度，為例如大約60℃，在此溫度下，有利于被檢測的核酸和固定在微陣列的底材上的核酸之間的雜交。因此，在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，存在于PCR循環(huán)中的靶核酸的檢測在退火溫度下進(jìn)行。
為了增加本發(fā)明的方法的靈敏度，將溫度降低到退火溫度以下，以便檢測優(yōu)選在低于擴(kuò)增循環(huán)的退火溫度的溫度下進(jìn)行，可能是有利的。例如，檢測可以在25℃到50℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選在30℃到45℃的溫度范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的方法的另一個替代實(shí)施方案中，被檢測的核酸和固定在微陣列底材上的核酸之間的雜交首先在低溫下進(jìn)行，以便隨后升高雜交溫度。這樣的實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)在于，與在高于50℃的溫度下進(jìn)行雜交相比雜交時間縮短了，而不損失相互作用中的特異性。
如果從等于或低于退火溫度下測定到的測量值中減去在變性溫度下測定到的零值或?qū)φ罩?，可以獲得無干擾的測量結(jié)果，其中的波動和漂移被消除了。
通常被檢測的靶分子帶有可檢測的標(biāo)記。在本發(fā)明的方法中，檢測優(yōu)選通過用至少一種在步驟b)中檢測的標(biāo)記物標(biāo)記被結(jié)合的靶來進(jìn)行。
正如上面已經(jīng)提到的那樣，與靶或探針偶聯(lián)的標(biāo)記物優(yōu)選是可檢測的單元或通過錨定基團(tuán)與靶或探針偶聯(lián)的可檢測單元。對于檢測或標(biāo)記的可能性，本發(fā)明的方法是相當(dāng)靈活的。因此，本發(fā)明的方法可以與多種物理、化學(xué)或生物化學(xué)的檢測方法相容。唯一的先決條件是被檢測的單元或結(jié)構(gòu)可以直接偶聯(lián)或經(jīng)由能夠與寡核苷酸偶聯(lián)的錨定基團(tuán)連接到探針或靶上，例如寡核苷酸上。
標(biāo)記物的檢測可以基于熒光、磁性、電荷、質(zhì)量、親和性、酶活性、反應(yīng)性、金標(biāo)記等。因此，標(biāo)記物可以是例如基于使用熒光團(tuán)標(biāo)記的結(jié)構(gòu)或成分。在熒光檢測的情況下，標(biāo)記物可以是能夠在分析過程中或之后與靶或探針偶聯(lián)的任意染料。例如Cy染料(AmershamPharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)、Alexa染料、德克薩斯紅、熒光素、若丹明(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)、類鑭族元素釤、鐿和銪(EG&G，Wallac，F(xiàn)reiburg，Germany)。
在特別優(yōu)選情況下，該可檢測的標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物。正如上面已經(jīng)提到的那樣，在本發(fā)明的方法中使用本發(fā)明的裝置確保了利用不帶自動聚焦的熒光顯微鏡、例如具有固定焦距的熒光顯微鏡，檢測熒光標(biāo)記物。
除了熒光標(biāo)記物之外，在本發(fā)明的范圍內(nèi)發(fā)光標(biāo)記物、金屬標(biāo)記物、酶標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物和/或聚合物標(biāo)記物也可以用作標(biāo)記和/或檢測單元，與靶或探針偶聯(lián)。
同樣地，可以通過與標(biāo)記的報告分子雜交(三明治雜交)來檢測的核酸可以用作標(biāo)記物(標(biāo)簽)。各種分子生物學(xué)檢測反應(yīng)例如引物延伸、連接和RCA被用來檢測標(biāo)簽。
在本發(fā)明的方法的替代實(shí)施方案中，可檢測的單元通過錨定基團(tuán)與靶或探針偶聯(lián)。優(yōu)選使用的錨定基團(tuán)是生物素、地高辛配基等。在后續(xù)的反應(yīng)中，錨定基團(tuán)通過特異性結(jié)合成分例如鏈親和素偶聯(lián)物或抗體偶聯(lián)物被轉(zhuǎn)換，而這些偶聯(lián)物是可以檢測的或能夠觸發(fā)可檢測的反應(yīng)。通過使用錨定基團(tuán)，錨定基團(tuán)被轉(zhuǎn)化為可檢測的單元可以在加入含有靶的樣品之前、期間或之后進(jìn)行，或者也可以在切割探針中可以被選擇性切割的鍵之前、期間或之后進(jìn)行。這些探針中可以被選擇性切割的鍵是例如在國際專利申請WO 03/018838中描述的那些，其相關(guān)的內(nèi)容在此被明確地引用。
根據(jù)本發(fā)明，標(biāo)記也可以通過標(biāo)記的分子與探針分子的相互作用來進(jìn)行。例如，標(biāo)記可以通過用如上述標(biāo)記的寡核苷酸與寡核苷酸探針或寡核苷酸靶進(jìn)行雜交來進(jìn)行。
其它適合于本發(fā)明的范圍的標(biāo)記方法和檢測系統(tǒng)在例如Lottspeich和Zorbas，Bioanalytik，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Berlin，Germany 1998，23.3和23.4章節(jié)中有描述。
在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用了檢測方法，其結(jié)果產(chǎn)生了含有特定溶解性產(chǎn)物的加成物，從而導(dǎo)致沉淀。為了進(jìn)行標(biāo)記，使用的具體底物或離析物可以被轉(zhuǎn)化為幾乎不溶的通常被染色的產(chǎn)物。在這種標(biāo)記反應(yīng)中，可以使用催化底物轉(zhuǎn)化為幾乎不溶的產(chǎn)物的酶。適合于在陣列元件上產(chǎn)生沉淀的反應(yīng)以及檢測沉淀的可能反應(yīng)在例如國際專利申請WO 00/72018和國際專利申請WO 02/02810中有描述，其相關(guān)的內(nèi)容在此明確地引用。
在本發(fā)明的方法的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，被結(jié)合的靶配備上標(biāo)記物，催化可溶的底物或離析物反應(yīng)形成陣列元件上幾乎不溶的沉淀，其中探針/靶相互作用已經(jīng)發(fā)生，或作為晶核將可溶的底物或離析物轉(zhuǎn)化為陣列元件上幾乎不溶的沉淀，其中探針/靶相互作用已經(jīng)發(fā)生。
通過這種方式，使用本發(fā)明的方法允許同時定性和定量分析各種探針/靶相互作用，其中可以使用單個大小小于等于1000μm、優(yōu)選小于等于100μm、特別優(yōu)選小于等于50μm的陣列元件。
酶法標(biāo)記物已經(jīng)知道被使用在基于微量滴定板的免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫學(xué)測試中(參見E. Lidell和I.Weeks，抗體技術(shù)，BIOS ScientificPublishers Limited，1995)。因此，例如，酶催化底物轉(zhuǎn)化為幾乎不溶的通常被染色的產(chǎn)物。
特別優(yōu)選情況下，導(dǎo)致沉淀在陣列元件上形成的反應(yīng)是酶催化的可溶的底物或離析物轉(zhuǎn)化為幾乎不溶的產(chǎn)物。在具體的實(shí)施方案中，導(dǎo)致沉淀在陣列元件上形成的反應(yīng)是由過氧化物酶催化的3，3′，5，5′-四甲聯(lián)苯胺的氧化。
優(yōu)選情況下，辣根過氧化物酶被用于催化3，3′，5，5′-四甲聯(lián)苯胺的氧化。但是，本領(lǐng)域的專業(yè)人員將會知道其它的過氧化物酶也可用于3，3′，5，5′-四甲聯(lián)苯胺的氧化。
據(jù)信3，3′，5，5′-四甲聯(lián)苯胺在過氧化物酶的催化作用下在第一步反應(yīng)中被氧化形成藍(lán)色的自由基正離子(參見例如Gallati和Pracht，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.1985，23，8，454)。這種藍(lán)色的自由基正離子通過聚陰離子，例如硫酸葡聚糖以復(fù)合物的形式沉淀。通過過氧化物酶催化3，3′，5，5′-四甲聯(lián)苯胺氧化的沉淀反應(yīng)在例如EP 0 456 782中有描述。
不求全部，下面的表1提供了可能適合于在靶和探針發(fā)生相互作用的陣列上引起沉淀的幾種反應(yīng)的調(diào)查報告。
表1
具體來說，通過不溶性沉淀檢測探針/靶相互作用在WO 02/02810中有描述。
下面描述的本發(fā)明的實(shí)施方案可以用于克服在檢測固相支持物上的分子相互作用中通?？赡軒淼拈g題，例如防止檢測平面和探針陣列之間可能形成的牛頓環(huán)。
牛頓環(huán)現(xiàn)象基本上是由照明的類型、用于檢測的光的波長、檢測平面與探針陣列之間的距離和位于反應(yīng)室中的溶液的折射指數(shù)所確定的。這樣的牛頓環(huán)可以通過例如改變用于檢測的光的波長、使用與檢測平面和/或探針陣列具有相同或相似折射指數(shù)的溶液、和/或在檢測平面和探針陣列之間使用浸液來防止。
此外，牛頓環(huán)還可以通過在芯片和/或檢測平面朝向芯片的一面上施用調(diào)距橫板來防止。
此外，牛頓環(huán)還可以通過在粗糙的支持物表面上施加探針陣列來防止。
此外，牛頓環(huán)還可以通過在吸光的表面上施加探針陣列來防止。
此外還可能永久性地改變接觸壓力，由此相對于檢測平面指導(dǎo)芯片。因此，芯片和檢測平面之間縫隙的厚度，也就是牛頓環(huán)的位置被改變。通過將被檢測的熒光信號對時間積分，以這種方式防止了點(diǎn)的測量值彼此之間的失真。
另一種特別優(yōu)選的防止牛頓環(huán)的可能方法是從不同的方向使用幾個光源進(jìn)行照明，從而激發(fā)被結(jié)合的靶的熒光團(tuán)。
由被替換的液體中未結(jié)合的靶的熒光團(tuán)引起的背景熒光，可以導(dǎo)致被檢測信號的失真。在優(yōu)選情況下這可以通過使用遮光物來防止，遮光物被固定在例如檢測表面或芯片上、和/或芯片周圍或成像光學(xué)裝置中，它被開發(fā)成只有探針陣列的表面被照射或成像。
在使用相應(yīng)的光源例如激光時，由于光的相干性可能導(dǎo)致照明的不均勻性。這種不均勻性可以通過使用波導(dǎo)和/或組合濾光片和/或不同波長的光來減小或防止。同樣地，也可以考慮移動光源以消除這種效應(yīng)。
通過在探針陣列的支持物上使用有機(jī)的或無機(jī)的、在選定的波長范圍內(nèi)沒有熒光的光吸收層，由探針支持物和/或位于其后的元件引起的熒光背景信號可以被減小或防止。在優(yōu)選情況下，黑色的鉻層被用作防護(hù)層。
在所有上述的本發(fā)明的方法的實(shí)施方案中，不需要對被分析的材料進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。從細(xì)菌、血液或其它細(xì)胞提取的樣品材料中，特定的部分可以在PCR(聚合酶鏈反應(yīng))的幫助下被擴(kuò)增并與支持物雜交，特別是在存在本發(fā)明的裝置或物質(zhì)文庫支持物的情況下，如同在DE 102 53 966中描述的那樣。這意味著勞動量的大量減少。
因此，本發(fā)明的方法特別適合于平行進(jìn)行通過PCR對被分析的靶分子進(jìn)行擴(kuò)增和通過靶分子與物質(zhì)文庫支持物的雜交進(jìn)行檢測。此時，被檢測的核酸首先通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，其中在開始時向反應(yīng)中優(yōu)選加入至少一種競爭物，抑制由PCR擴(kuò)增的兩條模板鏈中的一條的形成。具體來說，向PCR中加入同用于模板的PCR擴(kuò)增的一條引物競爭與模板的結(jié)合、并且不能通過酶法延伸的DNA分子。通過PCR擴(kuò)增的單鏈核酸分子然后通過與互補(bǔ)的探針雜交來進(jìn)行檢測。此外，被檢測的核酸也可以首先通過PCR擴(kuò)增成單鏈過剩的形式，然后通過與互補(bǔ)探針雜交來進(jìn)行檢測，其中在開始時向PCR反應(yīng)中加入競爭物，該競爭物是DNA分子或核酸類似物分子，它能夠與模板的兩條鏈中的一條雜交，但不與通過探針雜交檢測的區(qū)域雜交，并且不能通過酶法延伸。
每個能夠優(yōu)選引起PCR反應(yīng)中存在的兩條模板鏈中的僅僅一條鏈的擴(kuò)增的分子，都可以用作PCR反應(yīng)中的競爭物。因此，在本發(fā)明中，競爭物可以是蛋白、肽、DNA配體、嵌入劑、核酸或其類似物。優(yōu)選情況下，使用能夠序列特異地結(jié)合單鏈核酸并且具有前述特定性質(zhì)的蛋白或肽作為競爭物。特別優(yōu)選情況下，核酸分子和核酸類似物分子被用作二級結(jié)構(gòu)阻斷物。
在擴(kuò)增過程中通過在開始時向PCR中加入競爭物，基本上可以抑制兩條模板鏈中的一條的形成。“基本上抑制”意味著對PCR來說一條單鏈過剩，另一條模板鏈產(chǎn)生的量足以允許通過雜交有效地檢測被擴(kuò)增的鏈。因此，擴(kuò)增不遵循2n(其中n＝循環(huán)數(shù))形式的指數(shù)動力學(xué)，而是減弱成＜2n形式的擴(kuò)增動力學(xué)。
通過PCR獲得的過剩單鏈與非擴(kuò)增鏈相比倍數(shù)為1.1到1000，優(yōu)選倍數(shù)為1.1到300、更優(yōu)選倍數(shù)為1.1到100、特別優(yōu)選倍數(shù)為1.5到100、特別優(yōu)選倍數(shù)為1.5到50、特別優(yōu)選倍數(shù)為1.5到20、以及最優(yōu)選倍數(shù)為1.5到10。
一般來說，競爭物的功能是選擇性地與兩條模板鏈中的一條結(jié)合，從而抑制相應(yīng)的互補(bǔ)鏈的擴(kuò)增。因此，競爭物可以是對PCR中擴(kuò)增的兩條模板鏈中的一條具有特異性的單鏈DNA或RNA結(jié)合蛋白。它們也可以是僅僅與被擴(kuò)增的兩條模板鏈中的一條的特定區(qū)域序列特異性結(jié)合的適體(aptamer)。
優(yōu)選使用核酸或核酸類似物作為競爭物。通常情況下，核酸或核酸類似物通過與用于PCR的引物之一競爭引物結(jié)合位點(diǎn)、或者由于序列互補(bǔ)性能夠與被檢測的模板鏈的區(qū)域雜交，從而發(fā)揮PCR的競爭物的作用。該區(qū)域不是探針檢測的區(qū)域。這樣的核酸競爭物是不可以用酶法延伸的。
核酸類似物可以是例如所謂的肽核酸(PNA)。但是，核酸類似物也可以是核苷酸彼此之間通過硫代磷酸酯鍵而不是磷酸酯鍵連接的核酸分子。它們也可以是其中天然存在的糖組分核糖或脫氧核糖已經(jīng)被其它可選的糖例如阿拉伯糖或海藻糖等取代的核酸類似物。此外，核酸衍生物可以是“鎖核酸”(LNA)。其它常規(guī)核酸類似物為本領(lǐng)域的專業(yè)人員所熟知。
DNA或RNA分子，特別優(yōu)選是DNA或RNA寡核苷酸或其類似物，被優(yōu)選用作競爭物。
對PCR反應(yīng)中兩條模板鏈中的一條的擴(kuò)增的抑制作用是基于不同的機(jī)制，這依賴于用作競爭物的核酸分子或核酸類似物的序列。對于使用DNA分子的實(shí)施例將在下面討論。
例如，如果使用DNA分子作為競爭物，它可以具有與用于PCR的引物之一的序列至少部分一致的序列，以便在嚴(yán)緊條件下DNA競爭物分子與相應(yīng)的模板鏈之間的特異性雜交有可能進(jìn)行。因?yàn)橐罁?jù)本發(fā)明，在這種情況下用于競爭的DNA分子不能通過DNA聚合酶延伸，在PCR反應(yīng)中DNA分子與各自引物競爭與模板的結(jié)合。根據(jù)DNA競爭物分子與引物的比率，由引物定義的模板鏈的擴(kuò)增因此可以被抑制，以至于該模板鏈的生產(chǎn)被顯著地減少。此時，按照指數(shù)動力學(xué)進(jìn)行的PCR高于根據(jù)競爭物的用量所預(yù)計的。通過這種方式，多余的單鏈出現(xiàn)，其量足以通過雜交有效地檢測被擴(kuò)增的靶分子。
在本實(shí)施例中，用作競爭物的核酸分子或核酸類似物必須是不能通過酶法延伸的?！安荒芡ㄟ^酶法延伸”意味著用于擴(kuò)增的DNA或RNA聚合酶不能使用核酸競爭物作為引物，即不能從競爭物所定義的序列的3’端合成相應(yīng)的模板的相反鏈。
除了上述的可能方法之外，DNA競爭物分子也可以具有與被檢測的模板鏈的區(qū)域互補(bǔ)的序列，該區(qū)域不是引物序列之一所尋址的區(qū)域，并且不能通過酶法延伸。在PCR中，DNA競爭物分子然后將與該模板鏈雜交，并相應(yīng)地阻斷該鏈的擴(kuò)增。
本領(lǐng)域的專業(yè)人員知道，DNA競爭物分子，或者總的來說核酸競爭物分子的序列可以被相應(yīng)地選擇。如果核酸競爭物分子的序列不與用于PCR的引物之一的序列基本一致，而是與被檢測的模板鏈的另一個區(qū)域互補(bǔ)，則該序列將被選擇以便它不位于模板序列被雜交時的探針?biāo)鶛z測的區(qū)域內(nèi)。這是必需的，因?yàn)樵赑CR和雜交反應(yīng)之間不必進(jìn)行處理反應(yīng)。如果位于被檢測的區(qū)域內(nèi)的核酸分子被用作競爭物，它將與單鏈靶分子競爭與探針的結(jié)合。
這樣的競爭物優(yōu)選在探針檢測的模板序列附近雜交。此處，根據(jù)本發(fā)明，關(guān)于位置的術(shù)語“附近”被理解為與描述二級結(jié)構(gòu)阻斷物時所給出的意義相同。但是，本發(fā)明的競爭物也可以在被檢測的序列的最近點(diǎn)雜交，即距離被檢測的靶序列剛好一個核苷酸。
如果不能通過酶法延伸的核酸或核酸類似物被用作競爭分子，必須對它們的序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行選擇，以便它們不能被DNA或RNA聚合酶酶法延伸。優(yōu)選情況下，核酸競爭物的3’末端被設(shè)計成不與模板互補(bǔ)，和/或者在其3’末端有3-羥基基團(tuán)之外的取代基。
如果核酸競爭物的3’末端不與模板互補(bǔ)，不論核酸競爭物是與模板的引物結(jié)合位點(diǎn)之一結(jié)合，還是與通過PCR擴(kuò)增的模板的序列之一結(jié)合，由于在其3’末端缺少堿基互補(bǔ)性，核酸競爭物都不能被常規(guī)的DNA聚合酶延伸。這種類型的不能被DNA聚合酶延伸的核酸競爭物為本領(lǐng)域的專業(yè)人員所熟知。在優(yōu)選情況下核酸競爭物在其3’末端最后4個堿基、特別優(yōu)選最后3個堿基、特別優(yōu)選最后2個堿基、最優(yōu)選最后一個堿基上與其靶序列沒有互補(bǔ)性。在所提到的位置上，這種競爭物也可以具有不允許雜交的非天然堿基。
不能通過酶法延伸的核酸競爭物也可以與它們的靶序列具有100％的互補(bǔ)性，如果它們在骨架中或3’末端上進(jìn)行了修飾以至于不能通過酶法延伸的話。
如果核酸競爭物在其3’末端具有羥基基團(tuán)之外的基團(tuán)，這些取代基優(yōu)選為磷酸基團(tuán)、氫原子(雙脫氧核苷酸)、生物素基團(tuán)或氨基基團(tuán)。這些基團(tuán)不能被常規(guī)的聚合酶延伸。
在這種方法中特別優(yōu)選的是使用同用于PCR的兩條引物之一競爭與模板的結(jié)合、并且在化學(xué)合成中在其3’末端裝備有氨基連接的DNA分子作為競爭物。這樣的競爭物可以與它們的靶序列具有100％的互補(bǔ)性。
但是，核酸類似物競爭物例如PNAs在其3’末端不必具有封閉的3’羥基基團(tuán)或非互補(bǔ)性堿基，理由是它們的骨架被肽鍵所修飾而不被DNA聚合酶識別，因此不能被延伸。其它對磷酸基團(tuán)進(jìn)行的不能被DNA聚合酶識別的修飾，為本領(lǐng)域的專業(yè)人員所熟知。在它們之中，尤其重要的是具有骨架修飾的核酸，例如2’-5’酰胺鍵(Chan等(1999)J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，315-320)、硫鍵(Kawai等(1993)NucleicAcids Res.，1(6)，1473-1479)、LNA(Sorensen等.(2002)J.Am.Chem.Soc.，124(10)，2164-2176)和TNA(Schoning等(2000)Science，290(5495)，1347-1351)。
與模板的不同區(qū)域(例如尤其是引物結(jié)合位點(diǎn))雜交的幾種競爭物也可以同時使用在PCR中。如果競爭物具有二級結(jié)構(gòu)阻斷物的性質(zhì)，雜交的效率也可以額外被提高。
在另一個實(shí)施方案中，DNA競爭物分子也可以具有與引物之一互補(bǔ)的序列。根據(jù)反義DNA競爭物分子和引物的比率，也可以例如在PCR反應(yīng)中使用反義DNA競爭物分子來滴定引物，以便它不再與相應(yīng)的模板鏈雜交，因此，只有被另一條引物限定的模板鏈可以被擴(kuò)增。本領(lǐng)域的專業(yè)人員將會認(rèn)識到，在本發(fā)明的本實(shí)施方案中，核酸競爭物可以但不必須通過酶法延伸。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如果談到核酸競爭物，它將包括核酸類似物競爭物，除非從相應(yīng)的上下文中可以看出不同的意義。核酸競爭物可以可逆地或不可逆地與模板的相應(yīng)鏈結(jié)合。鍵可以通過共價或非共價相互作用來發(fā)生。
在優(yōu)選情況下，核酸競爭物的結(jié)合通過非共價相互作用發(fā)生，并且是可逆的。在特別優(yōu)選情況下，與模板的結(jié)合通過形成Watson-Crick堿基對發(fā)生。
核酸競爭物的序列通常適應(yīng)于被檢測的模板鏈的序列。在反義引物的情況下，盡管它們適應(yīng)于被滴定的引物序列，但該引物序列反過來仍由模板序列限定。
核酸的PCR擴(kuò)增是一種標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室方法，其各種不同可能的改變和發(fā)展對本領(lǐng)域的專業(yè)人員來說都是熟悉的。原則上PCR的特征是，雙鏈核酸模板，通常是雙鏈DNA分子，首先在95℃進(jìn)行5分鐘的熱變性，通過熱變性兩條鏈相互分開。在冷卻到所謂的“退火”溫度(由具有較低熔點(diǎn)溫度的引物限定)后，反應(yīng)溶液中存在的正向和反向引物積聚在各自模板鏈上與它們自己的序列互補(bǔ)的那些區(qū)域上。此處，引物的“退火”溫度適應(yīng)于引物的長度和堿基組成。它可以在理論條件的基礎(chǔ)上計算出來。關(guān)于“退火”溫度的計算的信息可以在例如Sambrook等(同上)的文獻(xiàn)中找到。
引物的退火一般在40℃到75℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選在45℃到72℃之間，特別優(yōu)選在50℃到72℃之間，然后進(jìn)行延伸步驟，在該步驟中脫氧核糖核苷酸在反應(yīng)溶液中DNA聚合酶活性的作用下與引物的3’-末端連接。此處，插入的dNTPs的身份依賴于與引物雜交的模板鏈的序列。當(dāng)使用正常熱穩(wěn)定的DNA聚合酶時，延伸步驟通常在68℃到72℃之間進(jìn)行。
在對稱的PCR中，通過不斷地重復(fù)所述的引物的變性、退火和延伸的循環(huán)。由引物序列確定的靶的核酸區(qū)域得到指數(shù)擴(kuò)增。至于PCR的緩沖液條件，可以使用的DNA聚合酶，雙鏈DNA模板的產(chǎn)生，引物的設(shè)計，退火溫度的選擇和對經(jīng)典PCR的修改，本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員有大量的文獻(xiàn)資料任他處理。
本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員也熟知例如單鏈RNA如mRNA可以被用作模板。通常情況下，它先通過反轉(zhuǎn)錄被轉(zhuǎn)錄成雙鏈的cDNA。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定的DNA依賴性的聚合酶被用作聚合酶。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用熱穩(wěn)定的DNA依賴性的DNA聚合酶，選自Taq-DNA聚合酶(Eppendorf，Hamburg，Germany和Qiagen，Hilden，Germany)、Pfu-DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)、Tth-DNA聚合酶(Biozym Epicenter Technol.，Madison，USA)、Vent-DNA聚合酶、DeepVent-DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，USA)、Expand-DNA聚合酶(Roche，Mannheim，Germany)。
通過特定的或進(jìn)化的改變從天然存在的聚合酶最適化得到的聚合酶的使用也是優(yōu)選的。當(dāng)在存在物質(zhì)文庫支持物的情況下進(jìn)行PCR時，特別優(yōu)選的是使用Eppendorf(Germany)公司的Taq聚合酶和Clontech(Palo Alto，CA，USA)公司的優(yōu)勢cDNA聚合酶混合物。
本發(fā)明的另一方面涉及使用本發(fā)明的裝置進(jìn)行基于微陣列的測試。
下面將描述本發(fā)明的裝置或本發(fā)明的方法的特定實(shí)施方案。
圖5中顯示了第一表面，在這里是優(yōu)選集成了加熱裝置的彈性膜，在針或挺桿的作用下變形，從而將芯片推向檢測平面。此外，檢測平面被第二表面上的調(diào)距橫板推進(jìn)反應(yīng)室中，從而從上方接近DNA芯片，直到DNA芯片和檢測平面之間的液體幾乎完全被脫位。密封反應(yīng)室的彈性密封墊由于檢測平面導(dǎo)向芯片而被壓縮。被脫位的流體使密封墊變形，從而將空氣壓縮在空氣補(bǔ)償室中。
但是，處理單元也可以被開發(fā)成或者只有第一表面，例如彈性膜形式的第一表面變形，或者只是將檢測平面推進(jìn)室中。
圖6中描繪了壓縮處理單元的另一個技術(shù)實(shí)施方案。反應(yīng)室被密封膜所包圍，密封膜上在側(cè)面和檢測平面的對面固定了DNA芯片。在DNA芯片的高度上，密封膜封閉室體底面的孔。該孔比DNA芯片略小。當(dāng)在反應(yīng)室中進(jìn)行PCR時，孔被由與PCR相關(guān)的升高的溫度而形成的內(nèi)部壓力緊密地密封。因此，盡管密封膜是易變的，但反應(yīng)室是耐壓的(自封閉閥的原理)。為了進(jìn)行檢測，針或挺桿通過底面的孔被推入。密封膜被升高，DNA芯片被壓向檢測平面。為了確保密封膜具有所需的彈性，可以給膜提供補(bǔ)償褶。在本實(shí)施方案中，壓力補(bǔ)償室也被脫位的液體壓縮。
下面的實(shí)施例是用來說明本發(fā)明，不應(yīng)被限制性地解釋。
實(shí)施例實(shí)施例1具有集成加熱器的反應(yīng)倉的結(jié)構(gòu)在圖8和圖9中描述了沒有集成加熱器的處理單元和將DNA芯片導(dǎo)向檢測平面的裝置的實(shí)施方案。顯示的裝置中的DNA芯片可以通過常規(guī)的熒光顯微鏡讀出(例如Axioskop，Zeiss，Jena，Germany)。
實(shí)施例2具有硅加熱底材的反應(yīng)倉的結(jié)構(gòu)圖10和11中顯示的本發(fā)明的裝置的處理單元的變體是一個微型化的反應(yīng)倉，含有集成的探針陣列(DNA芯片)、用于調(diào)節(jié)反應(yīng)室中不同溫度的集成了溫度傳感器的硅加熱底材(“加熱底材”)、以及任選具有EPROM的線路板，該線路板用于與加熱底材進(jìn)行電氣接觸。每個元件被包埋在兩個由合成材料制成的殼中。整個單元是空間封閉的系統(tǒng)，所有需要的反應(yīng)(例如PCR)都可以在其中以溫度控制的方式進(jìn)行。
首先將線路板插入到下層殼中提供的桿中(使EPROM面朝下)。在線路板的上側(cè)，安排了三個電接觸墊，它確保了與隨后插入的加熱底材的電氣連接，而加熱底材又反過來支撐接觸墊。該加熱底材大小為8mm×6mm，厚度大約為0.6mm。加熱底材確保在所進(jìn)行的檢測的范圍內(nèi)不同溫度(例如40℃到95℃)的準(zhǔn)確調(diào)節(jié)。此時，反應(yīng)室中的溫度可以通過集成在加熱底材中的傳感器來測量，或者也可以通過直接測量加熱底材表面溫度的外部測量單元來測量。在后一種情況下，加熱底材中集成的傳感器可以被省略。用于加熱和/或溫度測量的集成元件可以是例如二極管或晶體管。硅加熱底材面朝反應(yīng)空間的表面不含有任何電氣系統(tǒng)，并用SiO2鈍化層包被。
下一個元件是彈性密封墊，它從側(cè)面限制了反應(yīng)空間。
在反應(yīng)空間中心，DNA芯片被連接成使探針陣列面朝檢測平面。在插入玻璃表面形式的檢測平面后，該表面仍然從下層殼突出0.2mm。然后通過使用定位針指導(dǎo)加入上層殼，將玻璃表面壓在密封墊上，從而確保反應(yīng)室得到最佳的密封。
隨后可以用反應(yīng)溶液填充反應(yīng)室。此處應(yīng)該注意的是只有含有芯片的內(nèi)部空間被填充，外層室不用填充。所需的液體通過提供的套管導(dǎo)管用套管注入反應(yīng)空間中。
然后，通過硅加熱底材控制的生物化學(xué)反應(yīng)，例如PCR和/或雜交，可以在反應(yīng)室中進(jìn)行。
為了檢測中間的結(jié)果或最終的結(jié)果，檢測平面從上方通過檢測單元的調(diào)距橫板壓向DNA芯片，直到檢測平面與探針陣列之間的距離大約為零。此時，周圍的液體脫位進(jìn)入外室中，在此將局部空氣壓縮。該過程是可逆的，可以在例如每個PCR循環(huán)之后進(jìn)行。
由于其緊湊的設(shè)計和內(nèi)置帶有EPROM的線路板以及集成的加熱底材，本發(fā)明的裝置的變體特別適合于移動使用。
實(shí)施例3檢測通過脫位被分析物引起的背景信號的降低所有在本實(shí)施例中描述的熒光測量都是通過熒光顯微鏡(Zeiss，Jena，Germany)進(jìn)行的。使用白色光源用入射光進(jìn)行激發(fā)，濾光片被設(shè)置為適合于花菁3。信號通過CCD像機(jī)(PCO-Sensicam，Kehlheim，Germany)記錄。在下面，縫隙的厚度代表微陣列與檢測平面之間的距離。
a)根據(jù)縫隙的厚度測量被分析物的熒光信號具有確定的通道深度(5m、10m、28m)的通道殼由Sylgard鑄造。通道的寬度為125μm。玻璃芯片被安置在不一樣深的通道上。然后用200nM Cy-3標(biāo)記的寡核苷酸的2×SSC+0.2％SDS的溶液填充通道，并使用1.5秒的曝光時間測量信號。
在圖12中描述了測量的結(jié)果。隨著通道深度的增加信號線性地增加?？梢杂嬎愠鲋钡幕貧w線(方程1)(方程1)F(x)＝6.2468x+50.016
在獲得的回歸方程(方程1)的幫助下，DNA芯片和檢測平面之間的層厚度現(xiàn)在可以通過背景熒光信號確定。
這可以通過將兩個在其上側(cè)具有結(jié)構(gòu)標(biāo)記(圖14中的十字交叉、數(shù)字和數(shù)據(jù)矩陣)、可以被聚焦的玻璃表面(芯片)進(jìn)行堆積來檢查。芯片堆積的方式使得結(jié)構(gòu)標(biāo)記被定向?yàn)楸舜讼鄬?，僅僅通過薄液體層分開。200nM Cy-3標(biāo)記的寡核苷酸的2×SSC+0.2％SDS的溶液被用作液體。在裝備有標(biāo)尺的顯微鏡的聚焦裝置的幫助下，標(biāo)記之間的距離，因此也就是液體薄膜的層厚度可以被直接確定。背景的強(qiáng)度使用0.75秒的曝光時間時是158灰度值。在熒光顯微鏡下測量的縫隙的厚度是40μm。假設(shè)測量的灰度值相對于曝光時間呈線性(參見圖13)，使用方程1獲得的縫隙的厚度是42.6μm。因此與獲得的液體層的厚度值匹配得很好。
b)通過壓縮處理單元減少或消除背景熒光的實(shí)驗(yàn)在該實(shí)驗(yàn)中，被測量的雜交信號依賴于通過挺桿施加的壓力造成的熒光被分析物的替代。實(shí)驗(yàn)設(shè)置的草圖見圖15。通過推壓挺桿，硅片(3.15×3.15mm)被壓向探針芯片(DNA芯片)，在該過程中位于兩個平面之間的液體被脫位。
為了進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用雜交溶液填充反應(yīng)室，這是用于PCR雜交條件的模型系統(tǒng)。雜交溶液中含有與探針陣列互補(bǔ)的Cy3標(biāo)記的寡核苷酸(在2×SSC+0.2％SDS中的終濃度為2nM)。此外，雜交溶液含有同樣的Cy3標(biāo)記的寡核苷酸，該寡核苷酸不與探針陣列雜交，因此只對溶液中的熒光背景信號有貢獻(xiàn)，不對點(diǎn)的特異性信號有貢獻(xiàn)。
雜交進(jìn)行10分鐘。為了隨后讀出雜交信號，選擇固定的曝光時間為1.5秒。在實(shí)驗(yàn)設(shè)置中，挺桿在每次記錄后被推近探針陣列(檢測平面)，以便填充了雜交溶液的陣列和第二表面之間的縫隙被減小。
圖16顯示了使用縫隙厚度為10m的雜交信號的記錄。圖17中描繪了點(diǎn)上測量到的背景信號和雜交信號的結(jié)果。按照預(yù)期，兩種信號都對縫隙的厚度呈線性。因此，通過背景校正的點(diǎn)信號不隨縫隙的厚度變化。
當(dāng)灰度值達(dá)到255時，測量儀器過載，即縫隙的厚度為大約17μm時，只有通過減少曝光時間才可能測量點(diǎn)強(qiáng)度。因此，測量靈敏度降低了。
因此，通過降低縫隙的厚度，動力學(xué)測量范圍被增加。通過點(diǎn)信號的背景調(diào)整(差值形成)，縫隙的厚度可以在相當(dāng)寬的范圍內(nèi)變化而不影響測量和測量結(jié)果。使用厚度非常大的縫隙(＞20m)時，由于檢測器的過載，測量受到嚴(yán)重?fù)p害。
c)一步反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增、雜交和檢測兩個具有圖15的結(jié)構(gòu)的處理單元被安裝和編號。
準(zhǔn)備兩個相同的具有下列組成的反應(yīng)設(shè)置反應(yīng)設(shè)置20mM dNTPs..........................................................0.5μl1M乙酸鉀(Kaac)........................................................3μl25mM乙酸鎂Eppendorf...................................................5μlClontech C-DNA PCR緩沖液..............................................5μlEppendorf Taq聚合酶...................................................3μl10μM引物CMV_DP_Cy3...................................................1μlCy3_5‘TGAGGCTGGGAARCTGACA3‘10μM引物CMV_UP_NH2................................................0.66μl5‘GGGYGAGGAYAACGAAATC3_NH210μM引物CMV_UP....................................................0.33μl5‘GGGYGAGGAYAACGAAATC3‘
10μM引物Entero_DP_Cy3....................................1μlCy3_5‘CCCTGAATGCGGCTAAT3‘10μM引物Entero_UP_NH2.................................0.66μl5‘ATTGTCACCATAAGCAGCC3‘_NH210μM引物Entero_UP.....................................0.33μl5‘ATTGTCACCATAAGCAGCC3‘.....................................
10μM引物HSV1_DP_Cy3......................................1μlCy3_5‘CTCGTAAAATGGCCCCTCC3‘10μM引物HSV1_UP_NH2...................................0.66μl5‘CGGCCGTGTGACACTATCG3‘_NH2.................................
10μM引物HSV1_UP.......................................0.33μl5‘CGGCCGTGTGACACTATCG........................................
10μM引物HSV2_UP_Cy3......................................1μlCy3_5‘CGCTCTCGTAAATGCTTCCCT3‘...............................
10μM引物HSV2_DP_NH2....................................0.66μl5‘TCTACCCACAACAGACCCACG3‘_NH210μM引物HSV2_DP........................................0.33μl5‘TCTACCCACAACAGACCCACG3‘10μM引物VZV_DP_Cy3........................................1μlCy3_5‘TCGCGTGCTGCGGC10μM引物VZV_UP_NH2.....................................0.66μl5‘CGGCATGGCCCGTCTAT3‘_NH210μM引物VZV_UP.........................................0.33μl5‘CGGCATGGCCCGTCTAT模板CMV...................................................1μlPCR級水................................................22.5μl共計.....................................................50μl處理單元每個用50μl反應(yīng)設(shè)置填充，并按照下面的溫度-時間模式進(jìn)行。
1變性....................................................95℃時間.....................................................300s2變性....................................................95℃時間......................................................10s3退火/延伸...............................................60℃時間......................................................20s重復(fù)步驟2到3.............................................35次4變性....................................................95℃時間.....................................................300s5雜交....................................................40℃時間....................................................3600s然后對兩個處理單元進(jìn)行不同的處理。在第一種情況下(處理單元1)，背景熒光通過替換被分析物而降低。這是通過推動挺桿向上朝向檢測平面來確保的，以便填充了反應(yīng)溶液的縫隙被盡可能減小。
在第二種情況下(處理單元2)，被分析物被非熒光溶液替換。溶液的替換使用2×SSC溶液進(jìn)行，波動率為300μl/分鐘，漂洗體積900μl。本過程符合技術(shù)狀態(tài)。
然后，對兩種減小背景熒光的策略進(jìn)行比較。為此，兩個處理單元的雜交信號在上述的熒光顯微鏡照相機(jī)設(shè)置的幫助下被檢測。
曝光時間是5秒(參見圖18和圖19)。點(diǎn)強(qiáng)度的比較使用具有物質(zhì)CMV_S_21-3(5‘-NH2TGTTGGGCAACCACCGCACTG-3′)的點(diǎn)進(jìn)行。探針的位置指示在圖18和19中。
圖20中概述了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過在處理單元2中漂洗反應(yīng)室，與處理單元1中的替換相比，雜交信號被減少了。據(jù)推測探針的滲出對此負(fù)責(zé)。
因此，按照本發(fā)明的方法，替換被分析物的方法將優(yōu)于替換溶液。
為了獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的量和完整性的檢測，另取每種反應(yīng)溶液5μl在2％瓊脂糖凝膠上分析。結(jié)果(用UV透射儀檢測溴化乙錠染色的凝膠)可以在圖21中看見。
實(shí)施例4處理和檢測本發(fā)明的反應(yīng)倉的裝置本實(shí)施例中的處理和檢測本發(fā)明的反應(yīng)倉的裝置顯示在圖28中。
本發(fā)明的用于執(zhí)行基于微陣列的測試的帶有反應(yīng)倉的裝置通常由幾個部件組成，它們可以整合在一個裝置中，也可以從幾個部分裝置模塊式地裝配。此時，裝置可以通過集成的計算機(jī)或通過外部計算機(jī)的界面激活。裝置的結(jié)構(gòu)顯示在圖28中。
示例性的步驟如下進(jìn)行反應(yīng)倉的流體界面被操作者手動設(shè)置到填充位置，此時套管穿透室體的密封墊。然后，操作者通過標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室吸管將反應(yīng)混合物注入反應(yīng)室中。兩個步驟也可以被相應(yīng)開發(fā)的裝置取代。然后將流體界面再次設(shè)置到起始位置，其中該步驟也可以通過相應(yīng)開發(fā)的裝置執(zhí)行。
然后將反應(yīng)倉插入裝置。安排在裝置中的數(shù)據(jù)矩陣讀取器識別隸屬于反應(yīng)倉的一對一的數(shù)據(jù)矩陣，并且通過用戶傳送的數(shù)據(jù)記錄，為反應(yīng)倉和在控制計算機(jī)中進(jìn)行的測試裝載數(shù)據(jù)特征。該計算機(jī)然后控制單個處理步驟，其中可以包含例如擴(kuò)增和雜交。通過集成的壓力機(jī)件，反應(yīng)室中的微隙被減小以進(jìn)行本發(fā)明的檢測。
檢測可以使用常規(guī)的熒光-光學(xué)成像或非成像系統(tǒng)進(jìn)行。然后將獲得的數(shù)據(jù)傳送到控制計算機(jī)，該計算機(jī)對數(shù)據(jù)進(jìn)行評估，并將它們呈現(xiàn)或儲存在內(nèi)部或外部界面上。
然后操作者可以從裝置中取出反應(yīng)倉并丟棄。
實(shí)施例5由導(dǎo)電合成材料制成的反應(yīng)倉準(zhǔn)備圖29中描述的反應(yīng)倉。
反應(yīng)倉的下層殼(1)由形成反應(yīng)室基部的導(dǎo)電合成材料(導(dǎo)體2，RKT，Germany)制成。箔PT-100溫度傳感器在適當(dāng)粘合劑例如Loctite401(Loctite，Germany)的幫助下被固定到室基部的下面。下層殼與密封墊(3)和覆蓋玻璃(4)一起形成了本發(fā)明的反應(yīng)倉的反應(yīng)室。
反應(yīng)倉還含有帶螺紋的鉆孔(2)(用于插入螺釘進(jìn)行電接觸)，由例如丙烯酸樹脂制成的反應(yīng)倉的上層殼(5)，用于附著上層殼的鉆孔(6)和上層殼中的檢測窗(7)。
制備標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)混合物30.5μl去離子水5μl 10×PCR緩沖液(例如10×cDNA PCR反應(yīng)緩沖液，Clontech，Germany)5μl乙酸鎂，25mM(例如Eppendorf，Germany)0.5μl dNTP，各20mM1μl 16sfD1(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，10mM1μl 16sRa(5’-TACCGTCACCATAAGGCTTCGTCCCTA-3’)，10mM3μl Taq DNA聚合酶(例如Genaxxon，Germany)1μl模板通過胰島素注射器(Becton Dickinson，Germany)將反應(yīng)室用反應(yīng)混合物填充。為了在填充過程中通氣，將第二個套管穿透室體的密封墊。填充后，通氣套管和胰島素注射器被專業(yè)性丟棄。
然后通過兩個用于該目的的螺釘將反應(yīng)室與調(diào)節(jié)單元(CLONDIAG chip technologies GmbH，Germany)相連。同樣地，將溫度傳感器在下層殼的下面連接到該調(diào)節(jié)單元上。該調(diào)節(jié)單元能夠按照預(yù)定的程序調(diào)節(jié)下層殼中的具體溫度。
通過這種方式，執(zhí)行下面的PCR程序5min 95℃，30×(30s 95℃，30s 62℃，50s 72℃)。
圖30顯示了用熱成像像機(jī)在95℃溫度下記錄的反應(yīng)倉的圖像。
在完成程序后，通過胰島素注射器將反應(yīng)產(chǎn)物從反應(yīng)室中除去。類似地，將套管穿透室體的密封墊，用于在清空反應(yīng)室過程中通氣。
現(xiàn)在通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物。為此，5μl反應(yīng)溶液與適當(dāng)?shù)木彌_液(例如5μl 250mM溴酚藍(lán)的50％甘油)一起施加在2％瓊脂糖凝膠的槽中，然后進(jìn)行電泳。結(jié)果顯示在圖31中。
正如可以清楚地看見的那樣，在所有情況下可以獲得正確大小的、與陽性對照具有相當(dāng)?shù)牧康臄U(kuò)增產(chǎn)物。


圖1含有讀出裝置和處理單元的本發(fā)明的裝置的調(diào)查。
圖2本發(fā)明的處理單元的視圖。
圖3本發(fā)明的處理單元的分解視圖，包含檢測平面、密封墊、DNA芯片和室體。室體具有可逆變形的彈性膜。
圖4在彈性膜中由注模合成材料包圍的具有加熱彎管的室體的視圖。
圖5讀取裝置中本發(fā)明的處理單元的狀態(tài)視圖A)PCR期間，B)檢測前，以及C)檢測期間。
圖6本發(fā)明的具有膜密封墊、補(bǔ)償褶和下側(cè)孔的處理單元的功能狀態(tài)視圖。在A)中可以看見正常位置的處理單元。在B)中可以看見壓縮形式的處理單元，其中DNA芯片和檢測平面之間的熒光溶液被置換。
圖7旋轉(zhuǎn)盤的視圖，其上安裝了4個溫度模塊。溫度模塊每個被恒溫到一個溫度。通過旋轉(zhuǎn)盤和/或處理單元，可以改變反應(yīng)室中的溫度。
圖8銑制和螺栓的處理單元的例子的視圖。
圖9用于本發(fā)明的處理單元的壓縮或軋紋裝置的例子的視圖，該處理單元用于在常規(guī)的熒光顯微鏡下檢測雜交信號。
圖10本發(fā)明的處理單元的視圖，該處理單元具有線路板，用于與加熱器和溫度傳感器進(jìn)行電氣連接。加熱器被開發(fā)成半導(dǎo)體元件。
圖11
圖10中顯示的處理單元的分解視圖。
圖12用于確定填充了熒光團(tuán)的縫隙的寬度的直回歸線圖。
圖13在測量區(qū)域內(nèi)熒光信號隨曝光時間的增加而線性增加圖。
圖14兩個疊置的芯片的熒光記錄，它們之間的縫隙用200nM Cy3熒光團(tuán)填充。曝光時間0.75秒時背景強(qiáng)度是158灰度值。用熒光顯微鏡測量的縫隙厚度是40.00μm。假設(shè)測量的灰度值相對于曝光時間呈線性(參見圖13)，使用方程1獲得的縫隙的厚度是42.6μm。因此獲得的層的厚度值匹配得很好。
圖15不用漂洗檢測DNA陣列的實(shí)驗(yàn)設(shè)置圖。
圖16其上壓有芯片的陣列的熒光記錄。通過白邊，可以看見被置換的樣品溶液的背景輻射。
圖17當(dāng)縫隙的厚度減小時信號和背景的絕對強(qiáng)度下降。兩個值的差在整個測量區(qū)域是恒定的。
圖18通過置換背景熒光檢測探針信號。在左邊可以看見未置換的液體。
圖19通過漂洗進(jìn)行背景調(diào)節(jié)的DNA陣列的探針信號的檢測。
圖20實(shí)驗(yàn)比較被分析物的置換和替代的測量結(jié)果概述。
圖21通過凝膠電泳對處理單元中的PCR的參比分析。
圖22用于以反應(yīng)物質(zhì)或緩沖液填充反應(yīng)倉的可分離的填充單元的概略圖。其中使用了下面的參考號數(shù)
1填充單元1.1機(jī)械界面填充單元-倉2 倉2.1機(jī)械界面?zhèn)}-填充單元2.2密封墊2.3反應(yīng)室2.4反應(yīng)室中用于套管的優(yōu)選開口3 填充通道3.1帶有樣品添加工具的流體和機(jī)械界面3.2填充套管4 帶有廢物容器的廢物通道4.1通氣孔4.2廢物套管圖23通過模塊式填充單元填充反應(yīng)倉的過程圖。
圖24用于以反應(yīng)物質(zhì)或緩沖液在優(yōu)選的位置上不穿透室體的密封墊填充反應(yīng)倉的集成的填充單元的概略圖。其中使用了下面的參考號數(shù)1填充單元-倉1.1機(jī)械界面?zhèn)}-填充單元2 反應(yīng)倉2.1機(jī)械界面?zhèn)}-填充單元2.2密封墊2.3反應(yīng)空間2.4倉殼中用于套管的優(yōu)選開口3 填充通道3.1帶有樣品進(jìn)料工具的流體和機(jī)械界面3.2填充套管4 帶有廢物容器的廢物通道4.1帶有樣品扣除單元的流體和機(jī)械界面
4.2廢物套管5 優(yōu)選位置的設(shè)備，此處是彈簧圖25填充具有集成填充單元的反應(yīng)倉的步驟圖。
圖26用于以反應(yīng)物質(zhì)或緩沖液在優(yōu)選的位置上不穿透室體的密封墊填充反應(yīng)倉的帶有集成廢物容器的集成的填充單元的概略圖。除了圖24中使用的參考號數(shù)之外，還使用了下面的參考號數(shù)4 帶有廢物容器的廢物通道4.1通氣孔圖27a)當(dāng)將多余的液體扣除廢物容器或通道時填充反應(yīng)空間b)當(dāng)減小反應(yīng)空間進(jìn)行檢測時扣除多余的液體此處使用了下面的參考號數(shù)1 反應(yīng)室2 密封墊3 壓力機(jī)件4 流體界面4.1扣除套管4.2進(jìn)料套管圖28實(shí)施例4中處理和檢測本發(fā)明的反應(yīng)倉的裝置。此處使用了下面的參考號數(shù)1 反應(yīng)倉1.1帶有微陣列的反應(yīng)室1.2流體系統(tǒng)界面1.3室體的密封墊1.4用于加熱系統(tǒng)，也可任選用于溫度傳感器的電氣連接1.5芯片1.6用于實(shí)現(xiàn)優(yōu)選位置和指導(dǎo)套管的位置保證系統(tǒng)
1.7套管2 壓力機(jī)件3 鑒定系統(tǒng)，例如條形碼或數(shù)據(jù)矩陣3.1鑒定光學(xué)元件，例如條形碼或數(shù)據(jù)矩陣讀取器4 檢測光學(xué)元件5 流體連接管圖29實(shí)施例5中的反應(yīng)倉。
圖30用熱成像像機(jī)在95℃的溫度下記錄的實(shí)施例5中的反應(yīng)倉的記錄。
圖31通過瓊脂糖凝膠電泳對實(shí)施例5中的反應(yīng)產(chǎn)物的分析。其中參考號碼表示1，5來自熱循環(huán)儀的陽性對照2-4來自倉的反應(yīng)產(chǎn)物6100bp標(biāo)準(zhǔn)
權(quán)利要求
1.用于定性和/或定量檢測探針分子和靶分子之間的相互作用的裝置，包含a.底材上的微陣列，其上探針分子被固定在陣列元件上，該微陣列被放置在裝置的第一表面上；以及b.在包含其上放置了的微陣列的第一表面與第二表面之間形成的反應(yīng)室，該微陣列與第二表面之間的距離是可變的。
2.權(quán)利要求1中的裝置，其中該微陣列與第二表面之間的距離在大約0到大約1mm的范圍內(nèi)變化。
3.權(quán)利要求1或2中的裝置，其中裝置還包含溫度控制單元和/或溫度調(diào)節(jié)單元，用于控制和/或調(diào)節(jié)反應(yīng)室中的溫度。
4.權(quán)利要求3中的裝置，其中的溫度控制和調(diào)節(jié)單元集成在第一表面中。
5.權(quán)利要求3中的裝置，其中的溫度控制和調(diào)節(jié)單元包含溫度模塊，分別被預(yù)熱到確定的溫度。
6.權(quán)利要求5中的裝置，其中該溫度模塊被線性排列或排列在旋轉(zhuǎn)盤上。
7.上述權(quán)利要求任何一個中的裝置，其中的裝置包含檢測系統(tǒng)。
8.權(quán)利要求7中的裝置，其中的檢測系統(tǒng)是光學(xué)系統(tǒng)，優(yōu)選為熒光光學(xué)系統(tǒng)。
9.權(quán)利要求8中的裝置，其中該熒光光學(xué)系統(tǒng)是不帶自動聚焦的熒光顯微鏡。
10.權(quán)利要求7到9任何一個中的裝置，其中該檢測系統(tǒng)與調(diào)距橫板相連，當(dāng)該調(diào)距橫板位于第二表面上時，用于調(diào)整檢測系統(tǒng)和第二表面之間的空間。
11.上述權(quán)利要求任何一個中的裝置，其中為第一和第二表面之間形成的反應(yīng)室提供側(cè)面限制補(bǔ)償區(qū)，該補(bǔ)償區(qū)在該微陣列與第二表面之間的空間減小時，使反應(yīng)室中的體積保持基本恒定。
12.上述權(quán)利要求任何一個中的裝置，其中的第二表面由透明的材料、優(yōu)選為玻璃制成。
13.上述權(quán)利要求任何一個中的裝置，其中在第一和第二表面之間形成的該反應(yīng)室的側(cè)面被彈性密封墊限定。
14.上述權(quán)利要求任何一個中的裝置，其中第一表面至少在該微陣列下方的區(qū)域中被構(gòu)建成可以相對于第二表面指導(dǎo)該微陣列，以便可以改變該微陣列與第二表面之間的距離。
15.權(quán)利要求14中的裝置，其中的第一表面至少在該微陣列下方的區(qū)域中可以彈性變形。
16.權(quán)利要求15中的裝置，其中的第一表面由彈性塑料制成。
17.權(quán)利要求12到14任何一個中的裝置，其中第一表面由兩個重疊的層形成，兩個重疊的層的外層至少在該微陣列下方的區(qū)域中具有凹口。
18.權(quán)利要求17中的裝置，其中兩個重疊的層的內(nèi)層由彈性密封墊形成。
19.權(quán)利要求14到18任何一個中的裝置，其中該裝置至少包含一種工具，通過該工具可以相對于第二表面指導(dǎo)該微陣列。
20.權(quán)利要求19中的裝置，其中可以相對于第二表面指導(dǎo)該微陣列的工具是通過壓縮和/或拉伸作用于第一表面。
21.權(quán)利要求19或20中的裝置，其中第一表面可以通過該工具設(shè)定成振動。
22.上述權(quán)利要求任何一個中的裝置，其中可以相對于第一表面指導(dǎo)第二表面，以便該微陣列與第二表面之間的距離可變。
23.權(quán)利要求10到22任何一個中的裝置，其中可以通過該調(diào)距橫板施加壓縮力和/或拉伸力作用于第二表面上，以相對于第一表面指導(dǎo)第二表面，使得該微陣列與第二表面之間的距離可變。
24.上述權(quán)利要求任何一個中的裝置，其中第一表面和第二表面可以被指導(dǎo)，以便該微陣列與第二表面之間的距離可變。
25.上述權(quán)利要求任何一個中的裝置，其中的反應(yīng)室是室載體與該微陣列之間的微隙。
26.權(quán)利要求25中的裝置，其中該微隙的厚度在大約0μm到大約100μm的范圍內(nèi)。
27.上述權(quán)利要求任何一個中的裝置，其中該反應(yīng)室包含至少兩個小室，在第一個非壓縮狀態(tài)下該小室彼此之間以流體連接，而在第二個壓縮的狀態(tài)下小室之間不存在流體連接。
28.權(quán)利要求27中的裝置，其中每個小室被分配給該微陣列中的確定區(qū)域。
29.權(quán)利要求27或28中的裝置，其中在該微陣列和/或第二表面上被提供有空洞，用作該小室之間的壁。
30.權(quán)利要求27到29任何一個中的裝置，其中該小室之間的該壁由彈性密封墊形成。
31.上述權(quán)利要求任何一個中的裝置，其中該裝置還包含裝載單元和/或再處理單元用于探針溶液的純化和/或重新濃縮，和/或控制反應(yīng)室中流體的裝載和/或卸載。
32.權(quán)利要求31中的裝置，其中該反應(yīng)室和裝載單元和/或再處理單元彼此之間通過兩個套管相連，所述套管的安排使得第一個套管確保流體從裝載單元和/或再處理單元注入反應(yīng)室，而第二個套管確?？諝鈴姆磻?yīng)室中被補(bǔ)充的液體趕出。
33.上述權(quán)利要求任何一個中的裝置，其中該裝置含有與檢測系統(tǒng)相關(guān)的單元，用于處理通過該檢測系統(tǒng)收到的信號。
34.上述權(quán)利要求任何一個中的裝置，其中該裝置還具有用于外部計算機(jī)的界面。
35.上述權(quán)利要求任何一個中的裝置，其中該裝置被提供有編碼，優(yōu)選為數(shù)據(jù)矩陣或條形碼，包含關(guān)于物質(zhì)文庫和/或執(zhí)行擴(kuò)增反應(yīng)和/或檢測反應(yīng)的信息。
36.上述權(quán)利要求任何一個中的裝置，其中探針分子和/或靶分子是從下面的組中選擇的生物聚合物核酸、肽、蛋白、抗原、抗體、碳水化合物和/或其類似物，和/或上述生物聚合物的共聚物。
37.權(quán)利要求36中的裝置，其中的探針分子和/或靶分子是核酸和/或核酸類似物。
38.上述權(quán)利要求任何一個中的裝置，其中的裝置含有由導(dǎo)電材料制成的室體。
39.權(quán)利要求38中的裝置，其中的導(dǎo)電材料是導(dǎo)電塑料。
40.權(quán)利要求39中的裝置，其中的導(dǎo)電塑料從下面的組中選擇含有5％到30％碳纖維的聚酰胺、含有5％到30％碳纖維的聚碳酸酯、含有2％到20％不銹鋼纖維的聚酰胺以及含有5％到40％碳纖維的PPS。
41.定性和/或定量檢測探針和靶分子之間的分子相互作用的方法，包括下面的步驟a)將含有靶分子的探針溶液導(dǎo)入權(quán)利要求1到40任何一個中的裝置的反應(yīng)室中；b)檢測靶分子和固定在該底材上的探針分子之間的相互作用。
42.權(quán)利要求41中的方法，其中在檢測前將該微陣列與第二表面之間的距離固定在一個位置，使得靶分子和固定在該底材上的探針分子之間能夠相互作用。
43.權(quán)利要求41或42中的方法，其中在步驟b)中該微陣列與第二表面之間的距離被改變，優(yōu)選被減小。
44.權(quán)利要求43中的方法，其中在步驟b)中該微陣列與第二表面之間的距離被改變，以便該微陣列與第二表面之間的探針溶液被基本上除去。
45.權(quán)利要求41到44任何一個中的方法，其中的靶分子被提供有可檢測的標(biāo)記物。
46.權(quán)利要求45中的方法，其中該可檢測標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物。
47.權(quán)利要求46中的方法，其中該熒光標(biāo)記物的檢測通過使用不帶自動聚焦的熒光顯微鏡來實(shí)現(xiàn)。
48.權(quán)利要求47中的方法，其中該熒光標(biāo)記物的檢測通過使用包含固定焦距的熒光顯微鏡來實(shí)現(xiàn)。
49.權(quán)利要求41到48任何一個中的方法，其中該探針分子和/或靶分子是核酸和/或核酸類似物。
50.權(quán)利要求49中的方法，其中該靶分子在反應(yīng)室中通過循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)來擴(kuò)增。
51.權(quán)利要求50中的方法，其中在循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)過程中檢測是在一個或幾個循環(huán)之后和/或循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)完成之后進(jìn)行的。
52.權(quán)利要求1到40任何一個中的裝置的應(yīng)用，用于進(jìn)行基于微陣列的測試。
53.定性和/或定量檢測探針與靶分子之間的分子相互作用的方法，包含下列步驟a)將含有靶分子的探針溶液導(dǎo)入含有微陣列的反應(yīng)室中，該微陣列包含底材，其上探針分子被固定在陣列元件上；b)檢測靶分子和固定在該底材上的探針分子之間的相互作用，其中在將含有靶分子的探針導(dǎo)入反應(yīng)室與檢測之間，避免了替換反應(yīng)室中的溶液和/或從反應(yīng)室中移出溶液。
54.權(quán)利要求53中的方法，其中的方法進(jìn)一步按照權(quán)利要求41到51中描述的任何一個方法進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測靶和探針分子之間的特異性相互作用的裝置和方法。具體來說，本發(fā)明涉及用于定性和/或定量檢測探針和靶分子之間的分子相互作用的裝置，包含a)位于底材上的微陣列，其上探針分子被固定在陣列元件，該微陣列被放置在裝置的第一個表面上；以及b)在包含其上安置了的微陣列的第一個表面和第二個表面之間形成的反應(yīng)室，該微陣列與第二個表面之間的距離是可變的。
文檔編號C12Q1/68GK1981188SQ200580014351
公開日2007年6月13日 申請日期2005年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月6日
發(fā)明者亞歷山大·德沃拉克, 托馬斯·埃林格爾, 尤金·埃曼特勞特, 托爾斯滕·舒爾茨, 托馬斯·烏爾里希, 托馬斯·凱澤 申請人:科隆迪亞戈芯片技術(shù)有限公司