專利名稱：分子相互作用的檢測(cè)的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2003年12月4日的待批美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)流水號(hào)60/527,209的優(yōu)先權(quán)，該文獻(xiàn)的全文被收作本文參考。
政府資助的聲明本發(fā)明是在位于Lawrence Berkeley National Laboratory、由美國(guó)能源部按照合同編號(hào)DE-AC03-76SF00098資助的研究中完成的。美國(guó)政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于分析感興趣的分析物和感興趣的配體之間的結(jié)合相互作用的組合物和方法，更具體地講，本發(fā)明涉及通過(guò)觀察溶液中膠體顆粒的總體行為的變化來(lái)檢測(cè)分析物和配體的相互作用。
相關(guān)技術(shù)的說(shuō)明大部分生物分子與其他生物分子相互作用，以便完成它們的體內(nèi)功能。例如，細(xì)胞過(guò)程通常涉及以多亞基復(fù)合物形式結(jié)合在一起的蛋白。另外，多種類型的生物分子之間的相互作用導(dǎo)致了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的多樣性，如細(xì)胞骨骼和細(xì)胞膜。另外，可以通過(guò)特定物質(zhì)在生物樣品中的存在來(lái)診斷很多病原體、疾病和生理學(xué)上重要的狀態(tài)。因此，一般需要檢測(cè)分析物和感興趣的配體之間的結(jié)合的靈敏、低成本的方法。
某些配體天然存在于細(xì)胞膜中。由于這種原因，業(yè)已對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行了充分研究，以便確定所述配體與它們的體內(nèi)功能之間的聯(lián)系。例如，很多已知的治療藥物靶定生物分子，如存在于細(xì)胞膜表面上的受體。研究細(xì)胞膜表面上的生物化學(xué)反應(yīng)的重大挑戰(zhàn)是在體外分析中難于模仿天然流體膜環(huán)境。一種方法涉及用脂膜對(duì)固體基質(zhì)如二氧化硅或某些聚合物進(jìn)行包被，以便模仿體內(nèi)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)(Sackmann，E.，Science 27143-48(1996)；Groves，J.T.，Curr.Op.Drug Disc.& Dev.，5606-612(2002))。采用這種技術(shù)，將細(xì)胞膜牢固地俘獲在靠近固體界面的地方，不過(guò)，還保留了它們的天然流動(dòng)性和生物學(xué)功能(Grakoui等，Science 285221-227(1999))。
漂浮在受到支撐的表面如二氧化硅上的脂膜業(yè)已被用于研究多種具有治療價(jià)值的膜蛋白，包括G蛋白偶聯(lián)受體(Fang等，J.Am.Chem.Soc.，1242394-2395(2002))。不過(guò)，對(duì)這種膜表面上的分子相互作用的檢測(cè)通常需要精細(xì)的技術(shù)，如表面等離子共振(surfaceplasmon resonance，SPR)(例如，Hoffinan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9711215-11220(2000))或全內(nèi)反射(total internalreflection，TIR)顯微術(shù)(Yang等，Anal.Chem.，73165-169(2001))。以上技術(shù)通常必須使用熒光標(biāo)記。
發(fā)明概述本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于檢測(cè)分析物和配體之間的結(jié)合事件的方法和組合物，包括觀察膠體顆粒群的總體行為。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于檢測(cè)并且表征分析物和配體之間的結(jié)合的方法，可用于檢測(cè)所述結(jié)合的膠體顆粒和制備所述膠體顆粒的方法。其他實(shí)施方案包括用于檢測(cè)和表征分子結(jié)合相互作用的試劑盒。
在一種實(shí)施方案中，感興趣的配體與膠體顆粒的表面直接或間接地結(jié)合，以便形成改性膠體群。所述改性膠體隨后在允許它們?cè)谒芤褐蝎@得平衡或接近平衡分布的條件下溫育。所述膠體優(yōu)選表現(xiàn)出自由的側(cè)向擴(kuò)散，并且，所述系統(tǒng)優(yōu)選表現(xiàn)出遍歷性流體(ergodicfluid)的特征。在某些實(shí)施方案中，所述改性的膠體在重力作用下沉降到下面的基質(zhì)上，并且形成二維膠體。膠體顆粒的分布優(yōu)選通過(guò)直接光學(xué)成像測(cè)定，并與計(jì)算機(jī)輔助的分析相結(jié)合。
為了檢測(cè)感興趣的分析物是否與所述改性膠體結(jié)合，將分析物添加到膠體溶液中。所述分析物能夠以它的游離形式添加，或者可以與其他材料或結(jié)構(gòu)如活細(xì)胞結(jié)合。可以通過(guò)觀察在添加分析物時(shí)所述改性膠體顆粒在平衡或接近平衡時(shí)的分布的改變檢測(cè)結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合誘導(dǎo)了顆粒從凝聚相(condensed phase)向分散相(dispersed phase)的相轉(zhuǎn)變。在其他實(shí)施方案中，添加分析物導(dǎo)致了從分散相到凝聚相的相轉(zhuǎn)變。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合可以通過(guò)在沒(méi)有顆粒發(fā)生特定相轉(zhuǎn)變的條件下所述膠體顆粒分布的改變來(lái)測(cè)定。
所述膠體顆粒分布可以通過(guò)直接光學(xué)成像觀察。相轉(zhuǎn)變還可以通過(guò)肉眼或測(cè)定顆粒在溶液中的空間分布的裝置檢測(cè)。在某些實(shí)施方案中，相轉(zhuǎn)變是通過(guò)對(duì)顆粒配對(duì)分布函數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析進(jìn)行測(cè)定的，使得能夠?qū)τ泻蜎](méi)有分析物的條件下改性膠體的分布進(jìn)行定量比較。在其他實(shí)施方案中，將不同的統(tǒng)計(jì)分析用于表述膠體相行為的差異。
所述膠體顆粒可以具有任何大小和/或組成。在某些實(shí)施方案中，所述膠體顆粒是與有孔或無(wú)孔材料如二氧化硅制成的大體上為球形的膠體顆粒。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述膠體顆粒是用脂膜層衍生化的。所述脂層可以是雙層，單層，或其他結(jié)構(gòu)。所述脂膜層可以用對(duì)分析物特異的配體摻雜或衍生化，以便制備改性的顆粒。一方面，使用衍生化的顆粒，其具有外部摻雜的脂膜層，并在摻雜的脂層和顆粒表面之間有水層。在一種實(shí)施方案中，所述脂膜是用細(xì)胞表面蛋白或膜結(jié)合配體摻雜的。在該實(shí)施方案中，分析物通過(guò)配體與所述膜的結(jié)合導(dǎo)致了顆粒發(fā)生從凝聚群體到分散群體的相轉(zhuǎn)變。
本發(fā)明的實(shí)施方案可用于鑒定和表征配體和分析物之間的結(jié)合相互作用。例如，在一種實(shí)施方案中，膜衍生化的膠體顆粒被用于研究在脂雙層環(huán)境中分析物與細(xì)胞表面分子之間的相互作用。在另一種實(shí)施方案中，所述改性膠體群被用作診斷工具，以檢測(cè)與疾病、病原體、藥物或各種生理學(xué)狀態(tài)相關(guān)的分析物的存在情況。例如，可以通過(guò)檢測(cè)與它們的脂配體的結(jié)合來(lái)診斷靶向膜的細(xì)菌毒素(例如，肉毒桿菌毒素，霍亂毒素，炭疽毒素，破傷風(fēng)毒素)和病毒。
通過(guò)結(jié)合附圖來(lái)閱讀以下詳細(xì)說(shuō)明，可以更完整地理解本發(fā)明的上述和其他目的和特征。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1a是膜衍生化的二氧化硅顆粒的示意圖。圖1b表示在光致退色之后熒光恢復(fù)(fluorescence recovery after photobleaching，F(xiàn)RAP)實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)情況的三張照片，所述實(shí)驗(yàn)是對(duì)包被顆粒表面作為流體膜的脂膜進(jìn)行的。所述照片表示在退色之前的完全照明(左)，在退色期間的曝光(中)，和在退色之后1分鐘的完全照明(右)。圖1c表示相同的熒光恢復(fù)，但是使用的是非流體膜。
圖2表示膜衍生化顆粒的流動(dòng)性(mobility)。圖2a是表示膜衍生化顆粒的二維布朗軌道的照片，所述顆粒業(yè)已在重力作用下沉降到裝有水的培養(yǎng)皿的底部。圖2b是一組四張照片，這些照片表示膠體的凝聚相圖像的時(shí)序，表明單個(gè)顆粒流動(dòng)進(jìn)入和離開(kāi)凝聚的微晶。所述時(shí)序選擇為t＝0，t＝90秒，t＝180秒，和t＝270秒。
圖3表示蛋白結(jié)合激發(fā)的膠體相轉(zhuǎn)變。圖3a是表示圖像時(shí)序的一組四張照片，示出了從凝聚膠體相向分散膠體相的轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變是通過(guò)添加蛋白啟動(dòng)的。照片是在以下時(shí)間拍攝的t＝0，t＝30秒，t＝60秒和t＝240秒。圖3b是圖3a所示時(shí)序的三維照片g(r)。
圖4表示一系列三維曲線圖，圖解說(shuō)明蛋白結(jié)合分析的結(jié)果。圖4a是在與20μg/ml抗-Texas Red兔單克隆IgG抗體培養(yǎng)之后針對(duì)顆粒分散體測(cè)定的g(r)函數(shù)的曲線圖(面積分?jǐn)?shù)φ＝0.15)，所述顆粒是被流體膜(90％DMOPC，大約9％DMPS)衍生化的，所述流體膜含有Texas Red-DPPE配體(N-(Texas Red磺酰)-1，2-雙十六烷酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)的不同摩爾分?jǐn)?shù)(x)。圖4b是直徑為6.8μm的顆粒(φ＝0.25)的一系列相同分散體的g(r)曲線圖，所述顆粒是用含有神經(jīng)節(jié)苷脂GT1B(三唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂)的膜衍生化的，該顆粒業(yè)已與各種濃度的破傷風(fēng)毒素(TT)進(jìn)行過(guò)培養(yǎng)。TT與膜表面GTIB的結(jié)合誘導(dǎo)了從凝聚相向分散相的轉(zhuǎn)變，正如通過(guò)g(r)曲線檢測(cè)到的，以及通過(guò)直接觀察膠體確定的(插入的圖像)。圖4c是表示與圖4b類似的一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果的曲線圖，所不同的是用0.5％單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)取代了GT1B?；魜y毒素B-亞基(CTB)與GMI膜表面的結(jié)合誘導(dǎo)了所述轉(zhuǎn)變。CTB與GT1B膠體或TT與GM1膠體一起培養(yǎng)未產(chǎn)生影響。
圖5是在平面受支撐膜上進(jìn)行的平行系列實(shí)驗(yàn)的線狀圖。所述圖示出了CTB-GM1(圖5a)和TT-GT1B(圖5b)結(jié)合的有效解離常數(shù)經(jīng)測(cè)定分別為大約60和大約41nM。圖5c表示在將CTB添加到用不含GM1和GT1B的膜衍生化的珠中時(shí)缺乏結(jié)合。圖5d表示用含有GM1-的膜衍生化的珠能檢測(cè)到CTB——它的天然配體——的結(jié)合，但是檢測(cè)不到α-銀環(huán)蛇毒素(BT)或TT的結(jié)合。圖5e表示用含有GT1B-的膜衍生化的珠能檢測(cè)到TT——它的天然配體——的結(jié)合，但是檢測(cè)不到CTB或BT的結(jié)合。
圖6a是微球體在溶液中的照片。帶陰影的顆粒是覆蓋有流體脂雙層膜(組成96％ DMOPC，3％ DMPS，1％ Texas Red^DPPE)的直徑為6.8mm的二氧化硅微球體。白顏色的顆粒是無(wú)孔的由流體脂雙層膜(組成98％ DMOPC，2％ DOEPC，1％1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1，3-苯并二唑-4-基，或NBD-PE)覆蓋的直徑為6.8mm的二氧化硅微球體。圖6b表示典型的異質(zhì)配對(duì)相關(guān)函數(shù)的曲線圖，示出了樣品中陰影和白色顆粒對(duì)的相對(duì)密度。
圖7a是表示通過(guò)直接光學(xué)成像觀察到的衍生化膠體顆粒的示意圖。
圖7b是最近鄰相互作用的直觀圖，它對(duì)應(yīng)于在均質(zhì)膠體顆粒的g(r)圖上的不同峰。
圖8A是三個(gè)圖像的照片，表示在CTB與膜相關(guān)GM1結(jié)合時(shí)膜包被的二氧化硅微珠的各種聚集狀態(tài)，用1nM(左)，50nM(中)，和1000nM(右)CTB進(jìn)行溫育。
圖8B是表示0.5mol％GM1膜-包被的珠與升高濃度的CTB溫育后徑向分布函數(shù)的一系列曲線圖。
圖8C是表示通過(guò)膠體分析(虛線)和常規(guī)熒光讀數(shù)(實(shí)線)獲得的平衡結(jié)合曲線之間比較的線性圖。
圖9A是表示針對(duì)用人類紅細(xì)胞膜衍生化的平均直徑為6.8μm的珠的分散體測(cè)定的g(r)曲線圖(面積分?jǐn)?shù)φ＝0.15)(左)。相應(yīng)的圖像表示代表性的分布(右)。
圖9B是表示針對(duì)用人類紅細(xì)胞膜衍生化的并且與過(guò)量的抗-BandIII小鼠單克隆抗體溫育的平均直徑為6.8μm的珠分散體測(cè)定的g(r)曲線圖(面積分?jǐn)?shù)φ＝0.15)(左)。相應(yīng)的圖像表示代表性的分布(右)。
詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施方案涉及對(duì)檢測(cè)配體和分析物之間的結(jié)合的分析法。正如下文所討論的，在所述分析法中，首先將膠體群與配體結(jié)合，以便形成改性膠體群。然后使所述改性膠體一起在接近或處在相轉(zhuǎn)變狀態(tài)的條件下一起溫育。在上述條件下，所述改性膠體大部分處在凝聚相，但是接近向分散相的轉(zhuǎn)變。膠體混合物狀態(tài)的相對(duì)微小的擾動(dòng)可能導(dǎo)致所述改性膠體轉(zhuǎn)變成主要為分散相。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，添加能與結(jié)合配體結(jié)合的分析物能夠?qū)е滤龈男阅z體從主要為凝聚相向主要為分散相的相轉(zhuǎn)變。利用這一發(fā)現(xiàn)，可以開(kāi)發(fā)出通過(guò)在分析物處理之后測(cè)定改性膠體群的相而檢測(cè)任何分析物與配體的結(jié)合的靈敏分析方法。
應(yīng)當(dāng)指出的是，本發(fā)明的實(shí)施方案不局限于從凝聚相到分散相的相轉(zhuǎn)變。實(shí)際上，分析物與配體的結(jié)合可以通過(guò)測(cè)定從分散相到凝聚相的相轉(zhuǎn)變進(jìn)行檢測(cè)。
膠體體系的行為是通過(guò)顆粒之間的配對(duì)相互作用勢(shì)能(pairinteraction potential)驅(qū)動(dòng)的。對(duì)于膜衍生化的二氧化硅顆粒來(lái)說(shuō)，所述配對(duì)勢(shì)能是由膜-膜相互作用決定的。脂膜衍生化的二氧化硅顆粒的二維分散體表現(xiàn)出膠體相轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變是通過(guò)所述膜表面相互作用的細(xì)節(jié)控制的。所述總體相行為起著協(xié)同倍增器的作用，它能夠由所述膜表面上的少量的分子事件產(chǎn)生便于檢測(cè)的反應(yīng)。
應(yīng)當(dāng)理解的是，所述分析法不需要采用標(biāo)記技術(shù)對(duì)膠體、分析物或配體進(jìn)行標(biāo)記。微球體的相轉(zhuǎn)變可以進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)，如使用顯微鏡。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案能提供這樣的優(yōu)點(diǎn)，即不需要對(duì)任何成分進(jìn)行染色或標(biāo)記來(lái)檢測(cè)分析物-配體結(jié)合事件。
不過(guò)，應(yīng)當(dāng)理解的是，所述分析法不局限于未標(biāo)記過(guò)的成分。在某些場(chǎng)合下，對(duì)膠體、配體或分析物進(jìn)行標(biāo)記可能是有利的。例如，在一種實(shí)施方案中，對(duì)微球體的異質(zhì)混合物進(jìn)行標(biāo)記，然后在用分析物處理之后通過(guò)測(cè)定標(biāo)記的位置來(lái)檢測(cè)它們的分散形式。在另一種實(shí)施方案中，所述膠體顆粒的異質(zhì)性可以通過(guò)單個(gè)顆粒大小的顯著差異進(jìn)行分辨。
另外，所述相轉(zhuǎn)變優(yōu)選是動(dòng)態(tài)相轉(zhuǎn)變。在本文中，動(dòng)態(tài)相轉(zhuǎn)變是這樣一種轉(zhuǎn)變，其中，實(shí)際上整個(gè)群體從一種相轉(zhuǎn)變成另一種相。另外，所述群體的組成部分還能夠動(dòng)態(tài)移動(dòng)。例如，膠體群體的動(dòng)態(tài)相轉(zhuǎn)變是這樣一種轉(zhuǎn)變，其中，實(shí)際上整個(gè)膠體群的相發(fā)生改變，例如從凝膠相轉(zhuǎn)變成分散相。不過(guò)，所述群體中的膠體顆粒還與多種其他膠體顆粒動(dòng)態(tài)結(jié)合。從宏觀上看，所述膠體群可能會(huì)或者不會(huì)從一種相轉(zhuǎn)變成另一種相。不過(guò)，所述膠體改變相的自由度確實(shí)存在。不過(guò)，在顆粒水平上，每一特定膠體顆粒與任意數(shù)量的其他顆粒配對(duì)和不配對(duì)任意次數(shù)。因此，所述顆粒決非是不可逆轉(zhuǎn)的彼此結(jié)合的。這一點(diǎn)與諸如凝集的檢測(cè)方法不同，它們并不是動(dòng)態(tài)相轉(zhuǎn)變的代表。這是因?yàn)槟锏慕M成部分在轉(zhuǎn)變狀態(tài)之后彼此不會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)相互作用；在凝集過(guò)程中，所述成分保持以固定的構(gòu)象相互結(jié)合。
正如下面所討論的，本發(fā)明的實(shí)施方案還包括檢測(cè)分析物存在情況的方法，其中在與分析物接觸之后通過(guò)對(duì)顆粒群的總體行為進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。通過(guò)直接光學(xué)成像，觀察到了多種接近平衡的相，并且發(fā)現(xiàn)，分析物以低至10-4單層的密度與顆粒表面結(jié)合即可引起相轉(zhuǎn)變。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使得能夠?qū)Σ煌南到y(tǒng)進(jìn)行定量比較，并發(fā)現(xiàn)微小的轉(zhuǎn)變前效應(yīng)和顯著的轉(zhuǎn)變后行為。在某些實(shí)施方案中，顆粒分布是通過(guò)計(jì)算顆粒配對(duì)分布函數(shù)測(cè)定的，不過(guò)，可以使用其他分析法，包括、但不局限于高次相關(guān)函數(shù)。已發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)處在或接近平衡的相轉(zhuǎn)變的顆粒表面上的結(jié)合事件能對(duì)顆粒的隨機(jī)分布產(chǎn)生可識(shí)別的標(biāo)記作用，這種作用可以通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析解釋和計(jì)算，正如在下文更詳細(xì)地披露的。
在整篇說(shuō)明書(shū)和附圖中使用了以下縮略語(yǔ)FRAP-光致退色之后熒光恢復(fù)(fluorescence recovery afterphotobleaching)；g(r)-配對(duì)分布函數(shù)(pair distribution function)；DMOPC-1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿；DMPS-1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-[磷酸-L-絲氨酸]；DOEPC-1，2-二油?；?sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿；NBD-PE-1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1，3-苯并二唑-4-基；Texas Red-DPPE-N-(Texas Red磺?；?-1，2-雙十六烷?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；GT1B-三唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂；GM1-單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂；TT-破傷風(fēng)毒素；CTB-霍亂毒素B-亞基；和BT-α-銀環(huán)蛇毒素顆粒組成正如所公知的，膠體顆粒能自我組裝成各種有序相。膠體顆粒的總體行為在很大程度上是由顆粒之間的配對(duì)相互作用勢(shì)能決定的，后者又是由顆粒的表面化學(xué)所控制。因此，所述膠體顆粒的特征在決定所述分析法的靈敏度和其他方面是重要的。
術(shù)語(yǔ)″膠體″和″膠體顆?！逶谶@里可以互換使用，并且被定義為表示小到足以在溶液中表現(xiàn)出總體行為的微型顆粒。所述膠體顆粒的直徑可以為大約10nm-50μm，優(yōu)選大約1μm-6.8μm，更優(yōu)選大約5μm-6.8μm。所述顆?？梢跃哂腥魏涡螤?，不過(guò)優(yōu)選基本上是球形的。在一種實(shí)施方案中，所述膠體顆粒是微球體。
在某些實(shí)施方案中，膠體顆粒是惰性的，從而裸露的顆粒在分析法的條件下彼此之間不會(huì)顯著地相互影響。在其他實(shí)施方案中，所述裸露的顆粒彼此之間可能產(chǎn)生吸引力或排斥力。顆粒還可以由各種材料組成，包括有孔和無(wú)孔形式的材料，如二氧化硅和含有二氧化硅的化合物，聚合物，如聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯類，聚丙烯酸酯類，聯(lián)乙炔類，烯烴類，噻吩類，聚噻吩類，糖聚噻吩類，酰亞胺類，丙烯酰胺類，丙烯酸酯類，甲基丙烯酰胺類，甲基丙烯酸酯類，乙烯醚，蘋(píng)果酸酐，聚氨酯類，烯丙胺類，硅氧烷類，苯胺類，吡咯類，和乙烯吡啶和其他水凝膠聚合材料，微凝膠和水凝膠，金或其他金屬，Group II-VI材料，Group III-V材料，分支的和無(wú)分支的組合物(例如樹(shù)狀聚合物(demdrimer))，其他無(wú)機(jī)和有機(jī)金屬和乙炔材料。
膠體顆?？梢杂枚喾N物質(zhì)衍生化，從而為調(diào)節(jié)它們的表面的化學(xué)和生物學(xué)組成、由此調(diào)節(jié)它們?cè)谌芤褐械谋憩F(xiàn)提供了精確方法。在一種實(shí)施方案中，用脂層對(duì)顆粒進(jìn)行包被。所述脂層可以是雙層，單層或其他結(jié)構(gòu)?？梢詫?duì)脂膜的化學(xué)組成進(jìn)行調(diào)整，以便調(diào)節(jié)配對(duì)相互作用勢(shì)能，并因此調(diào)節(jié)顆粒處在相轉(zhuǎn)變狀態(tài)的點(diǎn)。在本文中，術(shù)語(yǔ)″相轉(zhuǎn)變狀態(tài)″表示膠體顆粒懸浮液的狀態(tài)，其中，膠體處在將從分散相轉(zhuǎn)變成凝聚相的狀態(tài)，或者相反。實(shí)際的″相轉(zhuǎn)變″表示膠體懸浮液從一種相轉(zhuǎn)變成另一種相。
在各種實(shí)施方案中，當(dāng)所述脂層具有凈中性或凈負(fù)電荷時(shí)，所述脂包被的顆粒進(jìn)入凝聚相。類似地，在其他實(shí)施方案中，當(dāng)所述脂層具有凈正電荷時(shí)，所述脂包被的顆粒進(jìn)入分散相。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述脂層由帶中性和帶負(fù)電荷的脂類的混合物組成，其中有大約10％的脂類是帶負(fù)電荷的。不過(guò)，所述分析法可以用具有任何表面電荷組成的顆粒進(jìn)行。
脂膜可以通過(guò)大體上與用于在單片基質(zhì)上形成被支撐膜相同的囊泡融合方法裝配在二氧化硅顆粒上(Bayerl等，Biophys.J.，58357-362(1990)；Buranda等，Langmuir，191654-1663(2003))。還可以使用任何其他合適的方法，如由Tanaka等，J.Am.Chem.Soc.，126；3257-3260(2004)中披露的方法。所述脂層可以用純化的成分重建，以便在所述顆粒上形成薄膜，或者可以使用從活的細(xì)胞上剝離的膜。所述脂層優(yōu)選是連續(xù)的，并且優(yōu)選保持側(cè)向流動(dòng)性。在一種實(shí)施方案中，所述脂層的擴(kuò)散系數(shù)為大約1-5μm2/s。
圖1a是膜衍生化二氧化硅顆粒的示意圖。如圖所示，二氧化硅(SiO2)顆粒與大約1nm的水層和寬度為大約5nm的脂雙層結(jié)合。圖1b表示三張照片，詳細(xì)示出了在光致退色之后熒光恢復(fù)(FRAP)實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)是在包被顆粒表面作為流體膜的脂質(zhì)膜上進(jìn)行的。所述照片表示在退色之前的完全照明(左)，在退色期間的曝光方式(中)，和在退色之后完全照明1分鐘(右)。圖1c表示相同的熒光恢復(fù)，但是使用的是非流體膜。
所述脂層通?？梢园ㄉ飳W(xué)或合成膜的任何成分，包括，但不局限于，脂類，膽固醇，固醇，麥角固醇，聚乙二醇，蛋白，肽，或任何其他分子，如脂肪酸，三?；视停视土字?，鞘脂類(例如鞘磷脂，腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂)，固醇，膽固醇，表面活性劑，聚山梨酸酯，辛苯聚糖(octoxynol)，十二烷基硫酸鈉，兩性離子型去污劑，癸基葡糖苷，脫氧膽酸鹽(酯)，丁二炔衍生物，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰膽堿，磷脂酰甘油，磷脂酸，磷脂酰甲醇，心磷脂，神經(jīng)酰胺，溶血磷脂酰膽堿，D-erythrosphingosine，鞘磷脂，十二烷基磷脂酰膽堿，N-生物素基磷脂酰乙醇胺，以及其他合成的或天然的細(xì)胞膜成分，這些成分能夠與膜或諸如脂質(zhì)體和薄膜的膜裝配體結(jié)合。
在一種實(shí)施方案中，所述膜包括中性和帶負(fù)電荷的或帶正電荷的脂單體，更優(yōu)選中性和帶負(fù)電荷的脂。合適的脂類包括，但不局限于，磷酸絲氨酸，二棕櫚酰磷脂酸，1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DMOPC)，1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-3-[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)(DMPS)，和1，2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)，二硬脂酰磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，1，2-二油酰基-3-二甲銨-丙烷，1，2-二油?；?3-三甲銨-丙烷，二甲基雙十八烷基溴化銨，1，2-二油?；?sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿，N-(7-硝基苯-2--1，3-重氮-4-基)-1，2-雙十六烷?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺銨鹽，和N-1，2-雙十六烷?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺三乙銨鹽，L-a-磷脂酰膽堿(卵PC)，膽固醇，N-二硝基苯基氨基己?；字Ｒ掖及?DNP-Cap PE)，神經(jīng)酰胺(天然和合成制劑)，N-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯并二唑-4-基)氨基]十二烷酰]-鞘氨醇-1-磷酸膽堿(C12-NBD鞘磷脂)，1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(Cap生物素基)，1-棕櫚酰(D31)-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸肌醇(和其他磷酸肌醇提取物)，以及各種長(zhǎng)度的聚乙二醇。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述膠體顆粒是用脂膜衍生化的二氧化硅顆粒，所述脂膜包含1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DMOPC)，1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)(DMPS)，和1，2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)，并且，所述膜被對(duì)分析物專一的配體所摻雜。在與分析物結(jié)合時(shí)，會(huì)發(fā)生聚合物主鏈的破壞，導(dǎo)致從凝聚相到分散相的可檢測(cè)相轉(zhuǎn)變。
在其他實(shí)施方案中，所述顆?？梢杂梅侵惥酆衔镅苌蛘咄耆蛇@種聚合物組成，所述聚合物例如是Discher等，Science 297967-973(2002)中公開(kāi)的那些，或任何其他足以獲得需要的配對(duì)相互作用勢(shì)能的材料。
已發(fā)現(xiàn)懸浮液中的顆粒顯示自由的側(cè)向擴(kuò)散，并且所述系統(tǒng)的表現(xiàn)如同遍歷流體(ergodic fluid)。在圖2a中示出了稀釋的顆?；旌衔锏牟祭受壽E。顆粒擴(kuò)散系數(shù)基本上與膜的組成無(wú)關(guān)；對(duì)于直徑5μm的顆粒來(lái)說(shuō)，測(cè)定的結(jié)果為0.079-0.086μm2/s。
以上值為根據(jù)Stokes-Einstein關(guān)系預(yù)測(cè)的純粘滯曳力的大約80％，表明曳力在下層基質(zhì)上的作用較小。根據(jù)顆粒表面上的膜之間的相互作用的強(qiáng)度，觀察到了膠體的分散(氣體)或凝聚(液體或晶體)相。顆粒移動(dòng)性局限于凝聚相，而發(fā)現(xiàn)顆粒沒(méi)有不可逆轉(zhuǎn)的結(jié)合(圖2b)。單個(gè)顆粒在凝聚相和分散相中的移動(dòng)性決定了系統(tǒng)平衡速度。如圖2b所示，顆粒凝聚在凝聚的微晶上并且從它上面蒸發(fā)出來(lái)的時(shí)間量程與我們的實(shí)驗(yàn)相比是快速的(分別為幾分鐘和超過(guò)半小時(shí))。另外，所述相的總體形態(tài)學(xué)和定量配對(duì)分布函數(shù)保持恒定，盡管單個(gè)顆粒發(fā)生了相互交換。以上發(fā)現(xiàn)表明，該系統(tǒng)是接近平衡的，至少在若干顆粒直徑的長(zhǎng)度規(guī)模上是這樣。
對(duì)脂膜的化學(xué)組成進(jìn)行調(diào)節(jié)，以便調(diào)控配對(duì)相互作用勢(shì)能，并且如下文所述。如圖2b所示，無(wú)論包被膜是凈中性的或帶負(fù)電荷的，都形成了凝聚相。相反，由帶凈正電荷的膜產(chǎn)生了分散相。多種相的出現(xiàn)表明了配對(duì)相互作用能量使得該系統(tǒng)接近相轉(zhuǎn)變。因此，膜表面上的微小擾動(dòng)誘導(dǎo)了膠體宏觀組構(gòu)的顯著變化。
配體在本文中，配體包括離子、分子或分子團(tuán)，它們可與其他化學(xué)實(shí)體結(jié)合，形成較大的復(fù)合體。配體可以包括多種材料，包括下文披露為潛在分析物的那些。優(yōu)選的是，配體對(duì)于要檢測(cè)的分析物具有特異親和力。合適的配體包括、但不局限于碳水化合物、核酸、生物素、鏈霉抗生物素蛋白、細(xì)胞因子、肽、蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶、受體、通道蛋白、抗體、小分子藥物、大的聚合藥物、生色團(tuán)、抗原、螯合化合物、磷酸鹽和反應(yīng)性基團(tuán)、分子識(shí)別復(fù)合物、離子基團(tuán)、可聚合的基團(tuán)、二硝基苯酚、接頭基團(tuán)、電子供體或受體基團(tuán)、疏水基、親水基、有機(jī)或無(wú)機(jī)分子或者與受體結(jié)合的任何分子。另外，多個(gè)配體可以與單一膠體結(jié)合?？梢允褂玫呐潴w的多樣性使得能夠檢測(cè)并且表征與多種分析物的結(jié)合。
配體能夠直接或間接地與所述膠體顆粒的表面結(jié)合。在本文中，當(dāng)兩個(gè)分子以任何方式彼此結(jié)合時(shí)，這兩個(gè)分子就是″結(jié)合的″。例如，如果兩個(gè)分子是非共價(jià)連接的，它們就是結(jié)合的。在另一種實(shí)施方案中，如果兩個(gè)分子是共價(jià)連接的，它們就是結(jié)合的。在某些實(shí)施方案中，配體分散在膠體顆粒外表面上的脂層中。這種類型的脂膜摻雜(doping)可以參見(jiàn)Salafsky等，Biochemistry，3514773-14781(1996)，和Groves等，Biophys.J.，712716-2723(1996)，這兩篇文獻(xiàn)都以全文形式收作本文參考。在某些實(shí)施方案中，將配體直接摻入到所述膜上，而在其他實(shí)施方案中，它們與所述膜間接地結(jié)合，例如通過(guò)摻入到所述膜中的糖基磷脂酰肌醇(GPI)接頭連接，而在另一些實(shí)施方案中，是天然地出現(xiàn)在所述膜中的，天然膜提取物就是如此。所述配體能夠以大約10-2-10-6摩爾濃度，更優(yōu)選大約10-2-10-4摩爾濃度的濃度插入所述脂層，或者以典型的體內(nèi)濃度存在于天然脂膜中。在其他實(shí)施方案中，配體是與顆粒的表面直接共價(jià)偶聯(lián)的。例如，配體諸如抗體或抗體結(jié)合片段可以直接地與二氧化硅、苯乙烯、磁性或半導(dǎo)體納米晶體顆粒偶聯(lián)?？贵w片段的非限定性例子包括Fab片段、Fab2片段和單鏈抗體。
分析物在本文中，分析物是接受分析的任何物質(zhì)或化學(xué)成分。分析物可以包括無(wú)限種類的物質(zhì)，它們優(yōu)選與所述配體結(jié)合。分析物的例子包括毒素、激素、酶、凝集素、蛋白、信號(hào)分子、無(wú)機(jī)或有機(jī)分子、污染物、抗體、病毒、細(xì)菌或其他病原生物、或者獨(dú)特位或其他細(xì)胞表面標(biāo)記。
在某些實(shí)施方案中，所述分析物可以包括多種物質(zhì)，這些物質(zhì)的存在指示了致病有機(jī)體，包括、但不局限于唾液酸，其用于檢測(cè)HIV，衣原體，腦膜炎奈瑟氏球菌，豬鏈球菌，沙門氏菌屬，腮腺炎，新城疫(newcastle)，和各種病毒，包括呼腸孤病毒，仙臺(tái)病毒，和粘液病毒；9-OAC唾液酸，其用于檢測(cè)冠狀病毒，腦脊髓炎病毒，和輪狀病毒；非-唾液酸糖蛋白，其用于檢測(cè)巨細(xì)胞病毒和麻疹病毒；用于雜交和鑒定炭疽的存在的肽序列，CD4，血管活性腸肽，和肽T，其用于檢測(cè)HIV；表皮生長(zhǎng)因子，其用于檢測(cè)牛痘；乙酰膽堿受體，其用于檢測(cè)狂犬病；CD3補(bǔ)體受體，其用于檢測(cè)EB病毒；β-腎上腺素能受體，其用于檢測(cè)呼腸孤病毒；ICAM-1，N-CAM，和髓磷脂-相關(guān)糖蛋白MAb，其用于檢測(cè)鼻病毒；脊髓灰質(zhì)炎病毒受體，其用于檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體，其用于檢測(cè)皰疹病毒；寡聚甘露糖，其用于檢測(cè)大腸桿菌；神經(jīng)節(jié)苷脂GM1，其用于檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏球菌；和抗體，其用于檢測(cè)多種病原體(例如，淋病奈瑟氏球菌，V.vulnificus，V.parahaeniolyticus，V cholerae，和V.alginolyticus)。
所述分析物還可以包括上文作為潛在配體披露的任何物質(zhì)。
檢測(cè)分析法檢測(cè)分析法被用于確定分析物是否業(yè)已與配體結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，所述分析包括以下步驟將具有感興趣的配體的顆粒添加到溶液中，以便形成膠體懸浮液。然后讓所述顆粒達(dá)到平衡或接近平衡分布，以便所述顆粒處在或接近相轉(zhuǎn)變狀態(tài)。然后在所述相檢測(cè)顆粒彼此之間的相互分布，以便可以與添加分析物之后的顆粒分布進(jìn)行比較。然后將分析物添加到膠體懸浮液中，并且讓膠體顆粒重建平衡或接近平衡的分布。然后再次測(cè)定顆粒的彼此相對(duì)分布，以便確定分析物是否業(yè)已與配體結(jié)合。如果所述顆粒分布表明它們業(yè)已從一種相轉(zhuǎn)變成另一種相，例如從主要為凝聚相轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕獮榉稚⑾?，就可以確定分析物業(yè)已與配體結(jié)合。
在其他實(shí)施方案中，所述分析法包括以下步驟將具有感興趣的配體的膠體顆粒添加到溶液中，以便形成膠體；讓所述述膠體顆粒達(dá)到平衡或接近平衡分布；檢測(cè)顆粒彼此的相對(duì)分布；分離所述膠體顆粒；將分離的顆粒添加到有可能含有與配體結(jié)合的分析物的第二種溶液中；讓所述膠體顆粒重建平衡或接近平衡的分布；并且檢測(cè)顆粒彼此的相對(duì)分布，以便確定分析物是否存在于所述樣品中。
所述分析法的其他實(shí)施方案可以包括以下步驟將具有感興趣的配體的膠體顆粒添加到溶液中，以便形成膠體；讓所述膠體顆粒達(dá)到[動(dòng)態(tài)]平衡或接近平衡分布；檢測(cè)顆粒彼此的相對(duì)分布；分離所述膠體顆粒；將分離的膠體顆粒添加到有可能含有與配體結(jié)合的分析物的環(huán)境中；從所述環(huán)境中分離所述膠體顆粒；將所述膠體顆粒添加到溶液中；讓所述膠體顆粒重建平衡或接近平衡的分布；并且檢測(cè)顆粒彼此的相對(duì)分布，以便確定在所述樣品中是否存在分析物?？傮w相行為被用作協(xié)同倍增器，它由膜表面上的少量的分子事件產(chǎn)生便于檢測(cè)的反應(yīng)。
在一種實(shí)施方案中，通過(guò)觀察從凝聚相到分散相的轉(zhuǎn)變檢測(cè)分析物結(jié)合。為了實(shí)現(xiàn)在結(jié)合時(shí)從凝聚相到分散相的轉(zhuǎn)變，分析條件如顆粒的大小和表面組成以及分析溶液的組成可使得在缺少分析物的條件下由于顆粒之間的引力(例如，范德華相互作用)由顆粒形成凝聚相。如果添加到溶液中的分析物與顆粒-相關(guān)的配體結(jié)合，則它與顆粒表面的相互作用可能增加兩個(gè)顆粒之間的最緊密的接近位置，并相應(yīng)降低它們之間的引力的總強(qiáng)度(參見(jiàn)，Wong and Groves，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9914147(2002))。這樣，分析物的結(jié)合可能影響所述膠體顆粒的聚合、分布和行為，從而可以通過(guò)測(cè)定顆粒的分布來(lái)檢測(cè)結(jié)合。通過(guò)對(duì)顆粒配對(duì)分布函數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，能夠?qū)Σ煌南到y(tǒng)進(jìn)行定量比較，并且能夠揭示微小的分析物-配體相互作用。另外，結(jié)合事件能夠?qū)︻w粒的隨機(jī)分布產(chǎn)生可識(shí)別的標(biāo)記效應(yīng)，這種效應(yīng)可以與顆粒相互作用關(guān)聯(lián)起來(lái)。
還應(yīng)當(dāng)理解的是，分析物的檢測(cè)不是二元事件。例如，與配體結(jié)合的強(qiáng)或弱可以通過(guò)本分析方法精確地確定(參見(jiàn)圖8A-8C)。通過(guò)測(cè)定膠體顆粒從凝聚狀態(tài)轉(zhuǎn)變到分散狀態(tài)的程度，人們能夠估算分析物和配體之間的結(jié)合量。從凝聚狀態(tài)到分散狀態(tài)轉(zhuǎn)變的膠體數(shù)量較大表明了較強(qiáng)的配體結(jié)合，而從凝聚狀態(tài)到分散狀態(tài)轉(zhuǎn)變的膠體數(shù)量較小則表明了所述配體與分析物的結(jié)合更弱。
圖8A-8C表示利用膜衍生化的膠體測(cè)定結(jié)合親和力。CTB與被膜包被的具有膜結(jié)合型GM1的二氧化硅微珠的結(jié)合在多種CTB濃度下測(cè)定。徑向分布函數(shù)的曲線使得能夠在所使用的蛋白濃度范圍內(nèi)對(duì)膠體分布進(jìn)行定量比較。將通過(guò)膠體分析法獲得的平衡結(jié)合曲線和用常規(guī)熒光方法獲得的結(jié)合曲線進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)來(lái)自通過(guò)膠體分析法獲得的膠體配對(duì)分布函數(shù)結(jié)果與通過(guò)熒光測(cè)定的結(jié)合蛋白濃度成比例。因此，膠體分析法提供了對(duì)結(jié)合親和力的無(wú)標(biāo)記分析，可將這種方法用于精確地測(cè)定多種相互作用的平衡解離常數(shù)。
在一種實(shí)施方案中，在缺少分析物的條件下，顆粒之間的引力使系統(tǒng)接近相轉(zhuǎn)變。在某些實(shí)施方案中，可以對(duì)所述分析法進(jìn)行校正，以便通過(guò)觀察響應(yīng)于分析溶液的離子強(qiáng)度、溫度或其他影響顆粒-顆粒引力之間親和力的變量的改變而發(fā)生的相轉(zhuǎn)變來(lái)確認(rèn)該系統(tǒng)接近相轉(zhuǎn)變閾值。當(dāng)該系統(tǒng)接近相轉(zhuǎn)變狀態(tài)的閾值時(shí)，所述分析法通常更靈敏，使得配體和分析物之間的結(jié)合的微小擾動(dòng)能夠啟動(dòng)便于檢測(cè)的相轉(zhuǎn)變。不過(guò)，本發(fā)明的某些實(shí)施方案在有或沒(méi)有分析物的條件下檢測(cè)無(wú)顆粒群處于或接近相轉(zhuǎn)變時(shí)的結(jié)合。
為了觀察顆粒，通常由于重力作用使它們處在或接近平衡狀態(tài)。所述顆粒能夠沉降在大體上的平面上，以便形成″二維膠體″，它是一層膠體顆粒，通常位于基質(zhì)的表面上(圖7a)。這種二維膠體有利于觀察顆粒并且進(jìn)行成像，并且有利于對(duì)它們?cè)谒霰砻嫔系姆植歼M(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。優(yōu)選將所述膠體顆粒以這樣的濃度使用，當(dāng)所述顆粒排列在孔或平板的底部時(shí)，顆粒所占的面積占顆粒之間或周圍的空間面積的大約0.1-0.5，或更優(yōu)選0.15-0.25。更多的顆粒傾向于使得所述分析法更靈敏。將顆粒運(yùn)動(dòng)性保持在和接近平衡相，并且顆粒運(yùn)動(dòng)程度決定了系統(tǒng)平衡的速度。在某些實(shí)施方案中，平衡的時(shí)間量程少于幾分鐘。在其他實(shí)施方案中，該量程少于大約30分鐘。
所述分析法通常不需要施加外部力，而僅僅依賴于膠體顆粒群體的熱力學(xué)行為。在有或沒(méi)有分析物的條件下，當(dāng)該系統(tǒng)處在或接近平衡時(shí)，所述膠體溶液優(yōu)選表現(xiàn)出遍歷流體的特征。單個(gè)顆粒隨時(shí)間遷移進(jìn)入群體，進(jìn)入孤立的狀態(tài)，然后返回群體。所述膠體顆粒能夠在懸浮液中自由地四處移動(dòng)并且改變相對(duì)位置。這一特性使得能夠檢測(cè)動(dòng)力學(xué)，可逆轉(zhuǎn)的和/或′弱的′結(jié)合相互作用，因?yàn)樗龇治龇ú恍枰纬伸o態(tài)復(fù)合物。這一點(diǎn)與現(xiàn)有技術(shù)如共沉淀、親和層析、以及需要形成穩(wěn)定的復(fù)合物以檢測(cè)結(jié)合的技術(shù)不同。單個(gè)顆粒的運(yùn)動(dòng)性不受蛋白結(jié)合的影響，因此接觸特定的感興趣的分析物，在合適的同源配體業(yè)已摻入到所述膠體膜上時(shí)能夠誘導(dǎo)相轉(zhuǎn)變。
其他實(shí)施方案可以利用顆粒的異質(zhì)混合物以檢查復(fù)雜的相互作用。可以對(duì)顆粒進(jìn)行標(biāo)記，以便它們可以單獨(dú)地識(shí)別。所述標(biāo)記包括、但不局限于摻雜到顆粒材料中的熒光分子、摻雜到脂層中的熒光分子、摻雜到顆粒材料中的半導(dǎo)體納米晶體等。還可以按照大小區(qū)分顆粒。例如，某些實(shí)施方案利用大小不均勻的顆粒，每一種顆粒具有不同的特性，例如通過(guò)對(duì)顆粒表面或材料進(jìn)行改性，或通過(guò)修飾顆粒大小本身(例如改變可供相互作用的表面積)。可以將多種粒度用于該分析法中。在一種實(shí)施方案中，使用直徑為大約3-7μm的顆粒，并且，直徑的大約50％的波動(dòng)能夠引起相行為方面的可檢測(cè)的差異。在該實(shí)施方案中，粒度的可檢測(cè)的差異為鑒定和追蹤特定顆粒行為提供了一條途徑。在各種實(shí)施方案中，追蹤具有特定特性的顆粒的行為可用于檢測(cè)復(fù)雜的分子間相互作用。例如，非均一組成和功能的強(qiáng)烈相互作用顆?？捎米鳂?gòu)件，用于組裝成復(fù)雜的、多功能的納米級(jí)結(jié)構(gòu)，用于分析更復(fù)雜的系統(tǒng)。膠體顆粒還可以利用諸如熒光標(biāo)記、半導(dǎo)體納米晶體、納米級(jí)檢測(cè)裝置，或定制的納米晶體或分子之類的材料進(jìn)行內(nèi)在功能化。
在其他實(shí)施方案中，顆粒可以與活的細(xì)胞混合。在上述實(shí)施方案中，細(xì)胞表面蛋白或其他分子被用作分析物，它們?cè)谂潴w結(jié)合時(shí)可導(dǎo)致顆粒分布的可檢測(cè)的變化。這使得能夠檢測(cè)細(xì)胞激活和增殖事件(例如，紅細(xì)胞形成玫瑰花結(jié))，細(xì)胞相互作用，細(xì)胞倍增，和其他生理學(xué)上相關(guān)的事件。
膠體顆粒可以分散到多種不同的環(huán)境中，用于檢測(cè)感興趣的分析物的存在，如人體，存在劇毒物或腐蝕性物質(zhì)的區(qū)域。所述顆粒還可用于高真空環(huán)境。在這些實(shí)施方案中，使結(jié)合事件發(fā)生，并且隨后收集所述顆粒，使之處于可以進(jìn)行該分析法的條件下。由于只有經(jīng)歷了結(jié)合事件的有限數(shù)量的顆粒必須收集，故所述顆?？梢苑稚⒃谥T如流動(dòng)的水體中的環(huán)境中，例如河流或活的有機(jī)體。在某些實(shí)施方案中，接觸分析物樣品的“傳感器”顆粒可以通過(guò)多個(gè)沒(méi)有接觸分析物樣品的背景顆粒發(fā)生運(yùn)動(dòng)。這使得檢測(cè)步驟能夠以少量的接觸樣品的顆粒，通過(guò)觀察“傳感器”顆粒的相行為與背景顆粒的關(guān)系來(lái)進(jìn)行。
膠體分析法的實(shí)施使得自動(dòng)化液體處理和成像系統(tǒng)能促進(jìn)高通量分析。例如，自動(dòng)化流體處理系統(tǒng)可用于在一個(gè)或多個(gè)測(cè)試孔中實(shí)施分析法的各步驟。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述分析是在Corning COSTAR3997聚苯乙烯平板或在相當(dāng)?shù)母咄科桨迳线M(jìn)行的。自動(dòng)化流體處理使得能夠在多種條件下同時(shí)進(jìn)行多種分析，實(shí)現(xiàn)樣品的均一的和可重復(fù)的處理?？梢詫?duì)流體處理裝置進(jìn)行編程，以便控制分析條件，如溫度和培養(yǎng)時(shí)間，將樣品添加到測(cè)試孔中及從孔中取出，以及實(shí)施所述分析法的檢測(cè)步驟等。機(jī)械流體處理裝置可以通過(guò)商業(yè)渠道獲得，例如從Tecan AG購(gòu)買。
在某些實(shí)施方案中，所述分析法的檢測(cè)步驟可以通過(guò)測(cè)定已知與相轉(zhuǎn)變相關(guān)的變量進(jìn)行，優(yōu)選的是所述變量比所述膠體顆粒的分布更易于測(cè)定。例如，可以將分光光度計(jì)、掃描平板讀數(shù)儀或成像或計(jì)算光散射的類似裝置用于測(cè)定添加分析物之前和之后的顆粒群體的光學(xué)密度，并且將特定的讀數(shù)與相轉(zhuǎn)變的發(fā)生或未發(fā)生相關(guān)聯(lián)。然后能夠以高通量方式進(jìn)行其他分析，其中，分析物與配體的結(jié)合是通過(guò)對(duì)所述平板進(jìn)行掃描以便確定是否獲得了表明存在或不存在相轉(zhuǎn)變的標(biāo)志性光密度讀數(shù)進(jìn)行檢測(cè)的。
可以改變的本發(fā)明的其他方面包括用于本分析法的材料的水化、包被和電荷。
檢測(cè)顆粒群的分布可以用配對(duì)相關(guān)性表示，并且相轉(zhuǎn)變可以通過(guò)分析它們的函數(shù)進(jìn)行作圖。最低群體數(shù)為2，優(yōu)選至少10，更優(yōu)選1000。
圖3表示通過(guò)在t＝0秒添加分析物蛋白誘導(dǎo)的從凝聚相到分散相的相轉(zhuǎn)變的時(shí)序(圖3a左上部圖片)。在將一滴含有分析物的溶液添加到孔頂部的數(shù)秒鐘內(nèi)，凝聚相的一致性的破壞是可分辨的(圖3a右上部圖片)。大約經(jīng)過(guò)1分鐘，所述膠體達(dá)到了可測(cè)定的分散的分布(圖3a下部圖片)。單個(gè)顆粒的運(yùn)動(dòng)性不受蛋白結(jié)合的影響，因此只有當(dāng)合適的同源配體業(yè)已被摻入到膠體膜中時(shí)，對(duì)特定感興趣的分析物的接觸才誘導(dǎo)了相轉(zhuǎn)變。與膜表面結(jié)合的分析物的物理存在增加了兩個(gè)膜之間的最接近的位置，并因此減少了顆粒之間的范德華引力的累計(jì)強(qiáng)度，使得能夠發(fā)生相轉(zhuǎn)變。
膠體相的定量分析是通過(guò)對(duì)配對(duì)分布函數(shù)g(r)的提取進(jìn)行的。顆粒位置是根據(jù)寬視野(～1mm)圖像測(cè)定的，通過(guò)目標(biāo)定位算法達(dá)到大約16nm的精度。大顆粒群的寬視野圖像應(yīng)當(dāng)用高分辨率照相機(jī)拍攝，如電荷耦合器件照相機(jī)，并且利用成像軟件如METAMORPH(Universal Imaging Corporation，Cranberry Township，PA)進(jìn)行分析。采用這種軟件，利用強(qiáng)度可以非常精確地找到顆粒的中心，因?yàn)樗鲱w粒是球形的透明物體。針對(duì)每一個(gè)圖像計(jì)算每一顆粒中心的X，Y坐標(biāo)，以便計(jì)算每一顆粒中心和它的最鄰近顆粒的中心之間的距離，與第二鄰近的和第三鄰近的顆粒之間的距離等(圖7b)。
對(duì)于空間尺寸X×Y的有限的矩形窗口來(lái)說(shuō)，g(r)可以根據(jù)以下公式計(jì)算g(r)=η(r)X2Y2N(N-1)δr[πXYr-2(X+Y)r2+r3]]]>(公式1)其中η(r)是間隔距離為r±δr/2的顆粒對(duì)的數(shù)量(對(duì)于本文所提供的數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō)，δr＝40nm)，r是所使用的顆粒的半徑，而N是顆粒的總數(shù)目。
進(jìn)行有效分析的g(r)的迭代次數(shù)取決于N，即要分析的顆粒對(duì)的數(shù)目。如果N＝1，為了令人滿意地計(jì)算g(r)，需要很長(zhǎng)的時(shí)間，以便獲得足夠的數(shù)據(jù)顯示該特定顆粒組成的具體g(r)曲線。因此，N優(yōu)選為至少10，優(yōu)選1000或更大，以便在幾秒鐘時(shí)間內(nèi)獲得足夠的數(shù)據(jù)。
凝聚相g(r)在t＝0時(shí)的曲線上表征為在一種顆粒直徑(r0)的最鄰近間隔距離處的大峰，以及在r＝√3r0和2r0處相當(dāng)于六邊形微晶上次最近鄰的次級(jí)峰。g(r)的獨(dú)立測(cè)定值是高度一致的。用獨(dú)立的膠體制劑測(cè)定的r0峰幅度的標(biāo)準(zhǔn)誤差一般小于5％。包括隨機(jī)分布并且相當(dāng)平直的g(r)函數(shù)的分散相可以通過(guò)肉眼與凝聚相區(qū)分。(參見(jiàn)30，60和240秒的時(shí)間的曲線)。g(r)的定量測(cè)定還能區(qū)分多種中間分布。盡管這種分布是暫時(shí)的，中等級(jí)別的程度同樣出現(xiàn)在接近平衡分布中，相當(dāng)于結(jié)合在膜表面上的蛋白質(zhì)的不同用量。
膠體相的定量分析還可以通過(guò)提取無(wú)限系列的分布進(jìn)行。當(dāng)膠體顆粒類型的數(shù)量大于1時(shí)使用這種方法。
為了對(duì)樣品進(jìn)行定量比較，提取g(r)上的第一個(gè)峰，該峰出現(xiàn)在特定顆粒直徑下(5μm)。相應(yīng)的有效相互作用能量為Ei。然后作為kBT能量的近似值計(jì)算Ei，并且通過(guò)利用g(r)曲線上第一個(gè)峰的高度的自然對(duì)數(shù)計(jì)算，將它代入具有已知函數(shù)或表達(dá)的曲線中，或者求曲線下面積的積分。這樣能夠精確地比較包括顆粒的等面積分?jǐn)?shù)()的樣品，并且Ei在低的覆蓋密度下會(huì)合成純的配對(duì)相互作用能量。盡管Ei需要平衡，以便具有有單位的能量，但這不是進(jìn)行有效比較所必須的。只要每一種膠體系統(tǒng)是在最初的不相關(guān)的狀態(tài)下形成的，以特定時(shí)間間隔進(jìn)行的非-平衡分布測(cè)定還可用于定量比較。
盡管Ei的計(jì)算可能是有用的，對(duì)于在本文中的分析物的檢測(cè)來(lái)說(shuō)它可能是不必要的。定量的g(r)曲線在檢測(cè)分析物并且與要分析的顆粒結(jié)合時(shí)，表現(xiàn)出第一個(gè)峰的非常獨(dú)特的缺失。
在平衡狀態(tài)下，g(r)與平均力的潛力w(r)物理相關(guān)g(r)=e-w(r)/kBT]]>(公式2)在稀釋系統(tǒng)中，w(r)相當(dāng)于配對(duì)相互作用勢(shì)能，因此提供了對(duì)相互作用能量的直接度量。在更濃縮的系統(tǒng)中，w(f)由于相鄰的顆粒而起作用?？梢哉归_(kāi)w(r)，以便利用Ornstein-Zemike積分方程式和適當(dāng)?shù)慕厝〗浦?，如Percus-Yevick方程，獲得實(shí)際的配對(duì)勢(shì)能。
g(r)的獨(dú)立測(cè)定值是高度一致的。利用相同的原材料根據(jù)獨(dú)立的膠體制劑測(cè)定的Ei值的標(biāo)準(zhǔn)誤差一般小于0.1kBT。
g(r)的精確測(cè)定值為利用不同膜組成之間的相互作用的微小不同提供了一條途徑。隨著膜上的凈靜電荷逐漸從負(fù)調(diào)整到正，檢查從凝聚相到分散相的轉(zhuǎn)變。
有若干種力，包括范德華、空間水合和靜電影響了膜之間的相互作用勢(shì)能。業(yè)已利用表面力裝置(SFA)研究了支撐在分子平面云母表面上的脂膜之間的力。在類似所述膠體實(shí)驗(yàn)的條件下，云母支撐的膜的黏性相互作用力在大約0.5-1nm的最小間距下為大約10-22J/nm2。這一結(jié)果總體上與在Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek(DLVO)理論的預(yù)測(cè)吻合，只有最小間隔距離不同，該距離主要是由排斥性空間水合力決定的。利用線性化Derjaguin近似方法計(jì)算膜衍生化顆粒之間的DLVO相互作用勢(shì)能，以便計(jì)算兩個(gè)球體之間的靜電相互作用和非延遲范德華力，所使用的Hamaker常數(shù)＝7×10-21J。所述范德華引力較強(qiáng)(在1nm的最小間隔距離下為350kBT)，并且通過(guò)靜電排斥平衡，它在強(qiáng)度≥14mV的表面電位(1nm的最小間距)很快變得顯著。DLVO相互作用的大的總體幅度表明了范德華力之間的精確平衡是不可能的，并且靜電力可能導(dǎo)致在實(shí)驗(yàn)中觀察到的一致性的較弱粘附力。
對(duì)所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一種解釋可以根據(jù)本發(fā)明的膠體顆粒不是分子平面這一事實(shí)進(jìn)行解釋。在兩個(gè)顆粒彼此接近時(shí)，相對(duì)較大表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的區(qū)域經(jīng)歷更短的相互作用距離。粗糙表面之間的接觸幾何學(xué)的細(xì)節(jié)對(duì)各種顆粒間的力產(chǎn)生了不同的影響，這取決于它們所起作用的特定長(zhǎng)度規(guī)模。例如，預(yù)計(jì)納米長(zhǎng)度范圍的表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)靜電相互作用具有很小的影響，因?yàn)樵谏鲜鰧?shí)驗(yàn)中具有長(zhǎng)的Debye長(zhǎng)度(＞100nm)。相反，較短范圍范德華相互作用強(qiáng)烈受到納米級(jí)表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的調(diào)控大部分附著能量來(lái)自緊密接觸的表面的小部分面積。同樣短范圍的空間水合力將決定兩個(gè)顆粒之間的最小的間隔距離，這同樣取決于所述緊密接觸部位。因此，大的表面區(qū)域由于表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)而被排除經(jīng)歷短范圍的相互作用力。
與膜表面結(jié)合的分析物形成了拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并且改變了有效的粗糙度。這表明了分析物結(jié)合誘導(dǎo)的膠體相轉(zhuǎn)變的可能機(jī)制，其中，少數(shù)蛋白在膜表面上的存在改變了兩個(gè)顆粒之間的最接近的位置，并因此調(diào)節(jié)了范德華引力的累計(jì)強(qiáng)度。這種通過(guò)調(diào)整膜組成控制相互作用能量的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?duì)于基于這種類型的膠體相轉(zhuǎn)變的分析系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和優(yōu)化來(lái)說(shuō)具有實(shí)用價(jià)值。
由于檢測(cè)的可量測(cè)性和低的成本，分析物的檢測(cè)分析法可以用高通量方式進(jìn)行。編寫(xiě)軟件程序，以便使g(r)的計(jì)算自動(dòng)化。該程序輸入包括每一幅圖像中每一個(gè)顆粒的X，Y坐標(biāo)位置的文本文件。該軟件還利用了這樣的參數(shù)，如每一幅圖像的像素分辨度，顆粒大小，圖像窗口大小，以及所需要的g(r)的分辨度。g(r)能夠以高的和低的分辨度分析，不過(guò)，優(yōu)選以較高的分辨度分辨g(r)，如0.04的分辨度，因?yàn)檫@種分辨度具有可接受的信噪比。如果分辨度較低，如為0.01或更小的分辨度，就有可能存在太大的噪音。該程序計(jì)算并且輸出g(r)曲線。實(shí)驗(yàn)通常在φ≈0.15-0.25的顆粒面積分?jǐn)?shù)下進(jìn)行，相當(dāng)于每幅圖像大約7000個(gè)獨(dú)立的顆粒，其中，φ是由顆粒覆蓋的窗口的面積，與顆粒之間和周圍的空的空間相反。一般地，對(duì)大約5-10個(gè)獨(dú)立的圖像加以平均，以便由＞108的測(cè)定的配對(duì)距離得到g(r)。
可以自動(dòng)化計(jì)算視野區(qū)域的成像，只要照片是一致性地拍攝的即可，唯一的限制是自動(dòng)化照相機(jī)的速度，軟件和硬件?？梢韵喈?dāng)快地制造g(r)曲線，只要在足夠的時(shí)間內(nèi)對(duì)足夠數(shù)量的顆粒進(jìn)行成像即可。
還可以理解的是，所述分析法可以只使用諸如分光光度計(jì)或掃描平板讀數(shù)儀的裝置進(jìn)行，這些儀器能夠成像或者計(jì)算所有波長(zhǎng)和光譜的光散射，以便能夠進(jìn)行高通量檢測(cè)。在相轉(zhuǎn)變之前和在每一相轉(zhuǎn)變時(shí)測(cè)定特定顆粒群的光學(xué)密度，以便獲得標(biāo)志性光學(xué)密度讀數(shù)。在添加并且使分析物與衍生化顆粒結(jié)合時(shí)，可以對(duì)所述平板進(jìn)行掃描，以便確定是否業(yè)已誘導(dǎo)了相轉(zhuǎn)變。
影響檢測(cè)分析法的其他因素包括水合層，包被物，和進(jìn)行分析的材料的電荷。目前可以理解的是，所述檢測(cè)分析法優(yōu)選在ComingCOSTAR 96-孔3997聚苯乙烯平板或者相當(dāng)?shù)母咛幚砹科桨迳线M(jìn)行。所述分析法還可以在96-，384-或1536-孔平板上進(jìn)行。
所述技術(shù)的應(yīng)用本文所披露的膠體顆粒提供了在任何特定溶液中檢測(cè)分析物的靈敏的低成本方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)與配體的結(jié)合事件來(lái)檢測(cè)病原生物、疾病、毒素、污染物、激素、信號(hào)分子、抗體、癌癥或醫(yī)學(xué)狀態(tài)的存在。在某些實(shí)施方案中，采用了多種配體以檢測(cè)多種病原生物，包括、但不局限于唾液酸，其用于檢測(cè)HIV，衣原體，腦膜炎奈瑟氏球菌，豬鏈球菌，沙門氏菌屬，腮腺炎，新城疫(newcastle)，和各種病毒，包括呼腸孤病毒，仙臺(tái)病毒，和粘液病毒；以及9-OAC唾液酸，其用于檢測(cè)冠狀病毒，腦脊髓炎病毒，和輪狀病毒；非-唾液酸糖蛋白，其用于檢測(cè)巨細(xì)胞病毒和麻疹病毒；能夠雜交并鑒定炭疽的存在的肽序列，CD4，血管活性腸肽，和肽T，其用于檢測(cè)HIV；表皮生長(zhǎng)因子，其用于檢測(cè)牛痘；乙酰膽堿受體，其用于檢測(cè)狂犬??；Cd3補(bǔ)體受體，其用于檢測(cè)EB病毒；β-腎上腺素能受體，其用于檢測(cè)呼腸孤病毒；ICAM-1，N-CAM，和髓磷脂-相關(guān)的糖蛋白MAb，其用于檢測(cè)鼻病毒；脊髓灰質(zhì)炎病毒受體，其用于檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體，其用于檢測(cè)皰疹病毒；寡聚甘露糖，其用于檢測(cè)大腸桿菌；神經(jīng)節(jié)苷脂GM1，其用于檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏球菌；和抗體，其用于檢測(cè)多種病原體(例如，淋病奈瑟氏球菌，V.vulnificus，V.parahaemolyticus，V.cholerae，和V.alginolyticus)。
本文所披露的膜衍生化的膠體系統(tǒng)具有應(yīng)用于與細(xì)胞膜表面上的化學(xué)事件相關(guān)的多種問(wèn)題的潛力。這些應(yīng)用包括利用多種細(xì)胞表面蛋白對(duì)配體相互作用進(jìn)行作圖，用于檢測(cè)靶向膜的細(xì)菌毒素(例如肉毒毒素，霍亂毒素，炭疽毒素，破傷風(fēng)毒素)和病毒。應(yīng)當(dāng)理解的是，利用天然生物學(xué)膜對(duì)膠體進(jìn)行包衣，可以用于對(duì)多種分析物進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)利用天然膜，所述分析法可以檢測(cè)分析物與只存在于天然膜中的配體的結(jié)合。正如所公知的，多種類型的膜結(jié)合配體在體外是不容易表達(dá)的，因此，利用天然膜提供了很多優(yōu)點(diǎn)。
膜衍生化顆?？梢越M合成非均質(zhì)混合物或者與活的細(xì)胞(例如形成玫瑰花結(jié))組合，使得本文所披露的方法可用于分析膜間受體-配體相互作用。通過(guò)膠體分析法的實(shí)施可應(yīng)用于自動(dòng)化液體處理和成像系統(tǒng)。對(duì)空間分布函數(shù)的詳細(xì)分析，如本文所披露的配對(duì)分布研究，能夠表征微弱的相互作用，包括不會(huì)產(chǎn)生質(zhì)上可識(shí)別影響的作用。與此同時(shí)，在膠體顆粒上應(yīng)用包被膜，提供了化學(xué)官能性的大量成分，它在非生物學(xué)環(huán)境下可顯示是有價(jià)值的。預(yù)計(jì)在本研究中用脂膜說(shuō)明的一般原理可以擴(kuò)展到其他材料，如最近開(kāi)發(fā)的聚合物小泡。
顆粒的非均質(zhì)混合物可用于檢查膜和/或膜結(jié)合配體之間的相互作用，或者作為倍增方式。在這種實(shí)施方式中，所述顆粒可以通過(guò)標(biāo)記物分別識(shí)別?？梢允褂玫臉?biāo)記包括、但不局限于摻雜到顆粒材料中的熒光分子，摻雜到膜中的熒光分子，摻雜到顆粒材料中的半導(dǎo)體納米晶體等?？梢詫⒎蔷|(zhì)組成和官能性的強(qiáng)相互作用顆粒用作構(gòu)件，用于組裝成復(fù)雜的、多功能的納米級(jí)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可用于分析更復(fù)雜的系統(tǒng)。
顆粒能夠與活的細(xì)胞混合，通過(guò)產(chǎn)生便于觀察的、可控制的、保留了細(xì)胞樣特性的界面，從而定量觀察細(xì)胞激活和增殖(例如，細(xì)胞玫瑰花結(jié)形成)，或檢查細(xì)胞相互作用和倍增。
顆粒還可以用諸如熒光標(biāo)記、半導(dǎo)體納米晶體、納米級(jí)檢測(cè)裝置，或定制的納米晶體或分子之類的材料進(jìn)行內(nèi)部官能化。
膠體顆?？梢苑稚⒌蕉喾N不同環(huán)境中，如人體內(nèi)，存在劇毒物或腐蝕性物質(zhì)的區(qū)域，或高真空環(huán)境，以便檢測(cè)例如污染物的存在。使結(jié)合事件發(fā)生，然后收集顆粒，再使之處于能夠進(jìn)行分析的條件之下。由于顆粒沉淀，并且只有業(yè)已經(jīng)歷了結(jié)合事件的有限數(shù)量的顆粒必須收集，所述顆粒能夠均勻分散在諸如流動(dòng)水體之類的環(huán)境中，例如河流中。例如，將顆粒在接觸河流之后的可觀察的行為和分布與注入河流之前的顆粒進(jìn)行比較。
在檢測(cè)條件下接觸介質(zhì)的“傳感器”顆?？梢酝ㄟ^(guò)沒(méi)有接觸所述介質(zhì)的多個(gè)背景顆粒發(fā)生移動(dòng)。有關(guān)所述顆粒行為的相數(shù)據(jù)可以通過(guò)觀察相對(duì)較少的“傳感器”顆粒的軌跡得出，而不用察看在有限部位觀察很多顆粒的整體空間數(shù)字。
實(shí)施例1利用被神經(jīng)節(jié)苷脂摻雜的膜衍生化的二氧化硅顆粒進(jìn)行檢測(cè)分析法的方法和材料材料脂類是從Avanti Polar Lipids獲得的。將1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DMOPC)，1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)(DMPS)，和1，2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)放入氯仿中，并且在-20℃下保存長(zhǎng)達(dá)兩周時(shí)間。單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂GM1，牛銨鹽(GMI)是以粉末形式從Matreya公司獲得的，將其溶解在2∶1氯仿/甲醇中達(dá)到1mg/mL的濃度，在-20℃下保存。三唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂GT1B，牛腦(GT1B)是以粉末形式從Sigma獲得的，將其溶解在2∶1氯仿/甲醇中達(dá)到1mg/mL的濃度，在-20℃下保存。熒光探針N-(Texas Red磺酰)-1，2-雙十六烷酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，三乙銨鹽(Texas RedDPPE)是以粉末形式從Molecular Probes公司獲得的，并且在使用之前溶解在氯仿中。FITC標(biāo)記的霍亂毒素亞基B(CTB)是從Sigma公司購(gòu)買的，溶解在0.2xPBS中，使?jié)舛冗_(dá)到0.5mg/mL，并且在4℃下保存。未標(biāo)記過(guò)的α-銀環(huán)蛇毒素(BT)是從Sigma公司購(gòu)買的，溶解在0.2xPBS中，使?jié)舛冗_(dá)到0.5mg/mL，并且在4℃下保存。熒光素標(biāo)記的破傷風(fēng)毒素c-片段(TT)是從Calbiochem購(gòu)買的，用無(wú)菌水重溶，使?jié)舛葹?.1mg/mL TT和10mM磷酸鈉緩沖液，在4℃下保存。胎牛血清(FCS)是從Sigma公司購(gòu)買的，用無(wú)菌水重溶，并且在4℃下保存。未標(biāo)記過(guò)的兔IgG級(jí)份抗體抗-Texas Red是從Molecular Probes公司購(gòu)買的，濃度為1mg/mL，并且在4℃下保存。平均直徑為5μm的二氧化硅玻璃微球體是從Bangs實(shí)驗(yàn)室獲得的，并且在4℃下在DI H2O下保存。
受支撐的膜受支撐的雙層是通過(guò)將小的單層囊泡融合在(SUV)干凈的玻璃微球體上形成的。將溶解在氯仿中的脂溶液蒸發(fā)到小的圓底燒瓶中，并且在4℃下在18.2MΩ-cm的水中水合1小時(shí)，達(dá)到大約3.3mg/mL。在冰水浴中對(duì)所述脂類進(jìn)行探針-超聲波處理至澄清，并且在4℃下，以160,000g的速度超速離心2小時(shí)。將上清液在4℃下保存達(dá)一周。通過(guò)在250℃下在濃硝酸中煮沸，然后進(jìn)行充分漂洗，制備玻璃表面用于沉積。通過(guò)使等量(100μL)的擴(kuò)散溶液(1∶1SUV/PBS)和顆粒溶液一起在1.5mL離心管中混合，讓雙層在顆粒表面上進(jìn)行自我組裝。通過(guò)脈沖離心使顆粒沉淀并且除去上清液，除去多余的囊泡。然后將1mL的18.2MΩ-cm的水添加到沉淀的顆粒中，并且對(duì)整個(gè)混合物進(jìn)行渦旋攪拌，使之再懸浮。
膠體形成膠體是通過(guò)將顆粒懸浮液稀釋到理想濃度，并且用吸液管將200-300μL的上清液轉(zhuǎn)移到Costar number 3997 96-孔平板上形成的。讓96-孔平板保持靜止15分鐘時(shí)間，以便使顆粒均勻沉降到每一個(gè)孔的底部。
成像將受支撐的雙層包被的顆粒稀釋到工作濃度，并且沉降到Corning 96-孔細(xì)胞培養(yǎng)族上進(jìn)行觀察。在室溫下用Nikon TE-300倒置熒光顯微鏡(Nikon，Japan)觀察顆粒，該顯微鏡上裝有水銀弧光燈，用于發(fā)出熒光，和100W的鹵素?zé)?，用于亮視野照明。用RoperScientific CoolSnap HQ電荷耦合器件照相機(jī)(Roper ScientificCoolSnap HQ，USA)記錄圖像。用SIMPLE PCI(Compix Inc.，CranberryTownship，PA)獲取圖像，并且用METAMORPH(Universal ImagingCorporation，Cranberry Township，PA)進(jìn)行分析。
數(shù)據(jù)分析為了獲得上面所述的公式(1)，將配對(duì)分布函數(shù)表示為g(r)＝n(r)/p(r)，其中n(r)＝2η(r)/(N(N-1)δr)是具有間隔距離r的顆粒對(duì)的實(shí)際相對(duì)密度，p(r)＝2(πXYr-2(X+Y)r2+r3)/(X2Y2)是在空間尺寸為X×Y的有限矩形窗口中發(fā)現(xiàn)具有間隔距離r的顆粒對(duì)的總體概率密度。為了獲得p(r)的這種表達(dá)，我們解除了線性積分p(r)＝∫Qp(rx)p(ry)dq，其中，p(rx)＝2(X-rx)/X2和p(ry)＝2(Y-ry)/Y2是發(fā)現(xiàn)具有間隔矢量r分別為rx和ry的絕對(duì)投射的顆粒對(duì)的概率密度，而Q是圓的全部正象限。
在平衡狀態(tài)下，g(r)與平均力w(r)的勢(shì)能在物理上相關(guān)g(r)=e-w(r)/kBT]]>。在稀釋系統(tǒng)中，w(r)與配對(duì)相互作用勢(shì)能等同，并因此提供了對(duì)相互作用能量的直接衡量。在更集中的系統(tǒng)中，w(r)包括了由于相鄰的顆粒而產(chǎn)生的影響。為了對(duì)樣品進(jìn)行定量比較，我們提取了g(r)上的第一個(gè)峰，該峰出現(xiàn)在顆粒直徑上，并且計(jì)算相應(yīng)的有效相互作用能量Ei。這樣可以精確地比較包括顆粒的相等面積分?jǐn)?shù)(φ)的樣品，并且Ei與低覆蓋密度的純配對(duì)相互作用能量會(huì)合。盡管對(duì)于Ei來(lái)說(shuō)需要平衡以便具有有意義的能量單位，但這對(duì)于有效比較來(lái)說(shuō)并非必需。只要每一種膠體系統(tǒng)是以最初不相關(guān)的相形成的，在特定時(shí)間間隔的非平衡分布測(cè)定值也可用于定量比較。g(r)的獨(dú)立測(cè)定值是高度一致的。從用相同的原始材料獲得的獨(dú)立膠體制劑測(cè)定的Ei值中的標(biāo)準(zhǔn)誤差通常小于0.1kBT。
實(shí)施例2利用被神經(jīng)節(jié)苷脂摻雜的膜衍生化的二氧化硅顆粒進(jìn)行檢測(cè)分析對(duì)膜衍生化的二氧化硅顆粒進(jìn)行分散，放置在水中，其中，它們?cè)谥亓ψ饔孟鲁两档降撞康幕|(zhì)上，形成二維膠體。所述膠體表現(xiàn)出自由的側(cè)向擴(kuò)散，并且該系統(tǒng)的表現(xiàn)如同遍歷流體。在圖2a中示出了稀釋顆粒集合的布朗軌跡。顆粒擴(kuò)散系數(shù)大體上與膜的組成無(wú)關(guān)；對(duì)于直徑為5μm的顆粒來(lái)說(shuō)，測(cè)量值為0.079-0.086μm2/s。以上值為通過(guò)Stokes-Einstein關(guān)系對(duì)純的粘滯曳力所預(yù)測(cè)值的大約80％，表明了所述曳力對(duì)下部基質(zhì)的小的影響。根據(jù)顆粒表面上的膜之間的相互作用的強(qiáng)度，觀察到了膠體的分散(氣體)或凝聚(液體或晶體)相。顆粒運(yùn)動(dòng)性局限于凝聚相(圖2b)。在凝聚相和分散相中單個(gè)顆粒的運(yùn)動(dòng)性決定了系統(tǒng)平衡的速度。圖2b中所見(jiàn)的顆粒濃縮到凝聚的微晶上并且從它上面蒸發(fā)的時(shí)間量程與我們的實(shí)驗(yàn)相比很快(分別為幾分鐘和超過(guò)半小時(shí))。另外，所述相的總體形態(tài)和定量配對(duì)分布函數(shù)保持恒定，盡管單個(gè)的顆粒相互轉(zhuǎn)變。以上發(fā)現(xiàn)暗示了該系統(tǒng)是接近平衡的，至少在若干顆粒直徑的長(zhǎng)度規(guī)模上是這樣的。
對(duì)脂膜的化學(xué)組成進(jìn)行調(diào)節(jié)，以便調(diào)控配對(duì)相互作用勢(shì)能，如下文所述。如圖2b所示無(wú)論包被膜是凈中性或帶負(fù)電荷的，都形成了凝聚相。相反，由帶凈正電荷的膜產(chǎn)生了分散相。多種相的出現(xiàn)表明了配對(duì)相互作用能量使系統(tǒng)接近相轉(zhuǎn)變。這樣，預(yù)計(jì)膜表面上的小的擾動(dòng)能夠誘導(dǎo)膠體宏觀組構(gòu)的顯著改變。通過(guò)檢查與膜結(jié)合的配體相結(jié)合的蛋白的作用，我們觀察到了這一預(yù)測(cè)。
研究了若干蛋白系統(tǒng)抗體結(jié)合膜表面抗原和細(xì)菌毒素——霍亂毒素(CTB)和破傷風(fēng)毒素(TT)與它們的相應(yīng)配體——單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂GM1和三唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂GT1B結(jié)合。被9％磷脂酰絲氨酸/91％DMOPC膜包被的顆粒是按實(shí)施例2所述方法制備的。
由此制備的顆粒形成了凝聚相，它是由短壽命的微晶組成的，將它用于所有的膜表面配體研究。在所有情形下，與膜表面的蛋白結(jié)合誘導(dǎo)了從凝聚相到分散相的轉(zhuǎn)變。圖3表示通過(guò)在t＝0秒時(shí)添加蛋白誘導(dǎo)的相轉(zhuǎn)變的時(shí)序。以上實(shí)驗(yàn)是用大約300μl的溶液在96-孔平板的大約5mm圓形孔中進(jìn)行的。在將一滴蛋白溶液添加到孔頂部的30秒內(nèi)，可以觀察到凝聚相的均勻的破壞。在60秒內(nèi)，所述膠體達(dá)到了分散的分布。單個(gè)顆粒的運(yùn)動(dòng)性不受蛋白結(jié)合的影響。只有在將合適的同源配體摻入到膠體膜中時(shí)，接觸感興趣的特定蛋白才誘導(dǎo)了從凝聚相到分散相的相轉(zhuǎn)變。與膜表面結(jié)合的蛋白的物理存在增加了兩種膜之間的最近的位置，并相應(yīng)降低了顆粒之間的范德華引力累計(jì)強(qiáng)度。
實(shí)施例3利用衍生化的膠體顆粒檢測(cè)霍亂毒素和破傷風(fēng)毒素在一定范圍的蛋白和配體濃度下進(jìn)行接近平衡的膠體分布測(cè)定，以便探究相轉(zhuǎn)變作為膜表面上蛋白結(jié)合的讀數(shù)的用途。利用單克隆IgG抗體進(jìn)行抗體研究，該抗體能結(jié)合熒光膜探針Texas Red-DPPE。
通過(guò)將20μg/mL的抗體溶液與1mL的顆粒溶液在黑暗條件下在室溫下培養(yǎng)45分鐘，每隔5分鐘進(jìn)行輕柔的渦旋攪拌，將抗-TexasRed兔IgG級(jí)份抗體結(jié)合在含有Texas Red的膜上。還通過(guò)將抗體溶液直接添加到96-孔平板上的膠體中，將抗體結(jié)合在含有TexasRed的膜上。通過(guò)將各種濃度的毒素與顆粒溶液在黑暗條件下，在室溫下進(jìn)行連續(xù)的柔和混合溫育50分鐘，將細(xì)菌毒素(CTB，TT，BT)結(jié)合在膜(包括GM1，GT1B，或不含神經(jīng)節(jié)苷脂)的膜上。
對(duì)于配體表面濃度≥10-4單層來(lái)說(shuō)，與20μg/ml抗-Texas Red抗體一起培養(yǎng)的樣品表現(xiàn)出從凝聚相到分散相的明確轉(zhuǎn)變(圖4a)。這相當(dāng)于在接觸區(qū)內(nèi)的每一個(gè)膜上有大約10個(gè)配體分子，其中，膜間距離＜10nm(5μm的顆粒)。為了進(jìn)行細(xì)菌毒素結(jié)合研究，以恒定的0.5％濃度將神經(jīng)節(jié)苷脂配體GT1B或GMI摻入膜內(nèi)。與TT溫育在含有GTIB的膠體中誘導(dǎo)了分散相的形成，而在GM1膠體中沒(méi)有產(chǎn)生影響(圖4b)。類似地，接觸CTB在GM1膠體中誘導(dǎo)了分散相的轉(zhuǎn)變，而對(duì)GT1B膠體沒(méi)有產(chǎn)生任何影響(圖4c)。接觸銀環(huán)蛇毒素(1μM)在任何膠體中都沒(méi)有產(chǎn)生影響。在測(cè)定的g(r)中r0峰的幅度與結(jié)合蛋白的表面濃度一致。
圖4圖解說(shuō)明了來(lái)自一組膜組合物的結(jié)果，其中完全離子化的電荷密度為每個(gè)膜小葉-1.43×104-7.15×104e/μm2；由于不完全的離子化，預(yù)計(jì)實(shí)際表面電荷密度略低。在用中性膜衍生化的顆粒中觀察到了最強(qiáng)的相互作用。這一結(jié)果與在中性表面之間預(yù)期的靜電排斥最小化吻合。遠(yuǎn)離中性，對(duì)于帶正電荷的膜來(lái)說(shuō)Ei迅速降低，而當(dāng)膜帶負(fù)電荷時(shí)，只觀察到了微弱的、但是一致的降低。用于蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)中的DMPS膜(在完全離子化時(shí)為-1.43×105e/μm2)表現(xiàn)出的Ei類似于中性膜的Ei(大約2kBT，參見(jiàn)圖3)。
CTB-GM1和TT-GT1B結(jié)合是通過(guò)將平面受支撐膜(通過(guò)將SUV′s沉積在玻璃蓋玻片上形成)和各種濃度的CTB和TT一起溫育、并且監(jiān)測(cè)來(lái)自FITC標(biāo)記(來(lái)自CTB)或熒光素標(biāo)記(來(lái)自TT)的熒光進(jìn)行表征的。結(jié)果表明，CTB能結(jié)合本文所研究的89％DMOPC/9％DMPS/1％GM1/1％Texas Red DPPE膜，有效解離常數(shù)為大約41nM(參見(jiàn)圖5a)。由于CTB-GM1結(jié)合不是一價(jià)的，這一結(jié)果只是結(jié)合親和力的近似值。結(jié)果表明，TT能結(jié)合本文所研究的89％DMOPC/9％DMPS/1％GTIB/1％Texas Red DPPE膜，有效解離常數(shù)為大約60nM(參見(jiàn)圖5B)。
通過(guò)將FCS(0.1％)和CTB(濃度為100nM)與含有4mg/mL的有機(jī)和無(wú)機(jī)成分的河水樣品混合，進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。用0.2μm的過(guò)濾器過(guò)濾混合物，并且與1mL的顆粒溶液在黑暗中在室溫下培養(yǎng)50分鐘，連續(xù)地柔和混合。在制備膠體之前通過(guò)用18.2MΩ-cm的水漂洗所述混合物除去多余的可溶性成分。
支持性的表1和圖5b，5c，5d和5e包括設(shè)計(jì)成測(cè)試這種膠體檢測(cè)方法的選擇性的一系列實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
表1若干實(shí)驗(yàn)的Ei值 在表1中小于大約1(用黑體表示)的Ei值表示強(qiáng)的正信號(hào)(毒素檢測(cè))。測(cè)試了用包含GM1(圖5d)，GT1B(圖5e)或無(wú)神經(jīng)節(jié)苷脂(圖5c)的膜衍生化的顆粒對(duì)CTB，TT和BT的結(jié)合親和力。所得到的膠體分布是以有效相互作用能量Ei形式評(píng)估的。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有任何類型的毒素的條件下，用三種類型的膜中任意一種衍生化的顆粒的Ei值超過(guò)大約2。該值表示凝聚相，并且被認(rèn)為是負(fù)信號(hào)。在存在毒素和它的特異性靶(GM-CTB，GTIB-TT)的條件下，所述膠體的Ei值小于大約1。該值表示膠體處在分散相，并且被認(rèn)為是正信號(hào)。另外，在存在不正確的或不存在的目標(biāo)的條件下，明確表現(xiàn)出對(duì)毒素的特異性。針對(duì)以下系統(tǒng)獲得了負(fù)信號(hào)GMI-TT，GT1B-CTB，CTB和TT(沒(méi)有靶)，和BT(具有所有三種膜類型)。
在圖5c中提供了上述所有數(shù)據(jù)的g(r)圖。通過(guò)在存在含有GM的膜的條件下溫育0.1％胎牛血清(FCS)證實(shí)了對(duì)多種潛在目標(biāo)的不敏感性。所得到的膠體分布的Ei值大于大約2，表示負(fù)信號(hào)。注意到當(dāng)存在CTB并且與含有GM1的膜衍生化的顆粒結(jié)合時(shí)，發(fā)現(xiàn)g(r)圖上的第一個(gè)峰不存在。并且，當(dāng)要檢測(cè)的毒素是破傷風(fēng)毒素時(shí)，對(duì)于用含有GT1B-的膜衍生化的顆粒來(lái)說(shuō)，明顯缺少g(r)曲線上的峰。因此，g(r)曲線能夠定量顯示業(yè)已檢測(cè)并且與衍生化的顆粒相結(jié)合的溶液中的毒素。
例4
用膠體顆粒的非均一混合物檢測(cè)按照實(shí)施例1制備兩種類型的膠體顆粒。一種類型看上去是暗色的，而另一種看上去是白色的。參見(jiàn)圖6，膠體具有以下組成暗色顆粒是直徑為6.8μm的二氧化硅微球體，它是用流體脂雙層膜(組成96％DMOPC，3％DMPS，1％Texas RedDPPE)覆蓋的。白色顆粒是直徑為6.8μm的無(wú)孔二氧化硅微球體，用流體脂雙層膜(組成98％DMOPC，2％DOEPC，1％1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1，3-苯并二唑-4-基，或NBD-PE)覆蓋。顆粒定位分析與實(shí)施例2所進(jìn)行的和披露的方法相同。
對(duì)膠體的非均一混合物的研究是通過(guò)將不同膠體的稀釋溶液按需要的比例混合在一起進(jìn)行的。然后對(duì)所得到的非均一膠體溶液進(jìn)行充分地渦旋攪拌，并且用吸液管轉(zhuǎn)移到96孔平板的孔中，以便形成膠體，正如上文所披露的。
測(cè)定膠體顆粒非均一混合物的g(r)的分析是按照下文所述方法進(jìn)行的。對(duì)于圖6a所示的二元膠體來(lái)說(shuō)，非均一顆粒的整個(gè)系統(tǒng)的φ＝0.2。圖6b中的曲線表示非均一g(r)曲線的特有特征。
首先，評(píng)估四種′非均一顆?！淝樾蔚膎(r)，具有間隔距離r的顆粒配對(duì)實(shí)際相對(duì)密度所有顆粒的n(r)nALL(r)=2ηALL(r)(NS+NW)(NS+NW-1)δr]]>ηALL(r)是具有間隔距離為 的所有顆粒配對(duì)的數(shù)量，而NS和NW分別是暗色和白色顆粒的總數(shù)。由于NS+NW＝N，nALL(r)類似于原始的′均一顆?！鋘(r)。
暗色顆粒的n(r)nS(r)=2ηS(r)NS(NS-1)δr]]>ηS(r)是間隔距離為 的暗色-暗色顆粒配對(duì)的數(shù)量。如果不考慮白色顆粒，在這里我們可以這樣做，則NS＝N，并且nS(r)同樣類似于原始′均勻顆粒′n(r)。
白色顆粒的n(r)通過(guò)S→W的取代，nW(r)類似于上述nS(r)。
暗色顆粒與白色顆粒(非均一配對(duì)相關(guān)函數(shù))的n(r)nSW(r)=ηSW(r)NSNWδr]]>ηSW(r)是間隔距離為 的非均一配對(duì)顆粒的數(shù)量。nSW(r)公式是唯一實(shí)際上不同于′均一顆?！鋘(r)公式的。
四種情形的g(r)我們利用了原始的通用定義公式g(r)=n(r)p(r),]]>其中，p(r)是以間隔距離為r發(fā)現(xiàn)顆粒配對(duì)的可能的密度。而n(r)在四種討論過(guò)的′非均一顆?！淝樾沃惺遣煌?，p(r)相對(duì)原始的′均一顆?！鋚(r)而言保持不變，并且為p(r)=2X2Y2[πXYr-2(X+Y)r2+r3].]]>綜合以上公式，我們得出了以下公式
gALL(r)=ηALL(r)X2Y2(NS+NW)(NS+NW-1)δr[πXYr-2(X+Y)r2+r3]]]>gS(r)=ηS(r)X2Y2NS(NS-1)δr[πXYr-2(X+Y)r2+r3]]]>gw(r)=ηW(r)X2Y2NW(NW-1)δr[πXYr-2(X+Y)r2+r3]]]>gSW(r)=ηSW(r)X2Y22NSNWδr[πXYr-2(X+Y)r2+r3]]]>由于p(r)在所有情形下都相同，四種g(r)函數(shù)之間的關(guān)系直接來(lái)自它們相應(yīng)的n(r)部分的比較。
在圖6A的照片中示出的暗色和白色顆粒配對(duì)的相對(duì)密度的曲線圖如圖6B所示。在非均一g(r)的這種特定示意圖中的第一個(gè)峰是非常陡而且高的，并且確切出現(xiàn)在一個(gè)珠直徑處，表明了存在彼此接觸的暗色和白色顆粒。隨后是函數(shù)值的急劇下降，表明了絕對(duì)沒(méi)有暗色和白色顆粒相互作用的不利能量區(qū)域。隨后是其他的峰，這些峰表示間隔距離為r的暗色和白色顆粒配對(duì)的相對(duì)密度?？梢钥闯?，改變膠體所在溶液的離子強(qiáng)度，能夠改變其中非均一g(r)顯示兩種顆粒相互作用的不利概率的區(qū)域?qū)挾?。這種效果可用于使膠體顆粒的非均一混合物更接近或者更遠(yuǎn)離相轉(zhuǎn)變點(diǎn)，因此使得相行為的差異更靈敏。
實(shí)施例5利用膠體顆粒進(jìn)行檢測(cè)通過(guò)將FCS(0.1％)和霍亂毒素(CTB)(濃度為100nM)混合在含有大約4mg/mL的有機(jī)和無(wú)機(jī)成分的河水樣品中，進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。用0.2μm的過(guò)濾器過(guò)濾混合物，并且與1mL的顆粒溶液在黑暗中在室溫下溫育50分鐘，連續(xù)進(jìn)行柔和混合。在形成膠體之前通過(guò)用18.2MW-cm水漂洗所述混合物而除去多余的可溶性成分。
在用實(shí)施例2所述統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行分析時(shí)，觀察到了來(lái)自檢測(cè)霍亂毒素的系統(tǒng)的正信號(hào)。
另一種方法是將具有霍亂毒素配體的顆粒分散到河水中，溫育足夠的時(shí)間(例如大約50分鐘)，從河水中收集并且分離所述顆粒，然后進(jìn)行上述分析。
實(shí)施例6用于計(jì)算配對(duì)分布函數(shù)的其他方法將計(jì)算g(r)的其他方法用于提高計(jì)算效率。當(dāng)在視野中觀察典型的膠體分布時(shí)，很多顆粒配對(duì)間隔超過(guò)40μm。由于配對(duì)分布早在40μm之前就變得恒定，計(jì)算這種配對(duì)距離并且將它們整合到柱狀圖中是浪費(fèi)的。由于要計(jì)算的配對(duì)距離的數(shù)量與圖像中顆粒的數(shù)量N2成比例(104-105)，沒(méi)有必要的配對(duì)距離將會(huì)顯著降低計(jì)算速度。由于所述顆粒在某種程度上是堅(jiān)硬的球體，能確保特定珠的第n近的鄰居距離中心珠超過(guò)40μm。對(duì)于6.84μm的珠來(lái)說(shuō)，第7近的鄰居太遠(yuǎn)了，但是，第6近的鄰居仍然處在范圍內(nèi)。因此，如果能夠找到只計(jì)算第6近以及更近鄰居配對(duì)的配對(duì)距離的方法的話，就可以使要計(jì)算的配對(duì)距離數(shù)量最小化，而與g(r)的最初40μm無(wú)關(guān)。
為了標(biāo)記相關(guān)的配對(duì)，使用了N×N矩陣。如果珠i和珠j是第6近或更近的鄰居，就應(yīng)當(dāng)有1，表示應(yīng)當(dāng)計(jì)算它們的配對(duì)距離，并且將其整合到柱狀圖中。如果它們是更高級(jí)別的最近鄰居(較遠(yuǎn)的近鄰)，就應(yīng)當(dāng)是0。上述方法等同于用1填充該矩陣。通常，少于8％的顆粒配對(duì)與40μm的g(r)相關(guān)。
為了獲得這種矩陣，計(jì)算了第一級(jí)最近鄰居配對(duì)的矩陣。為了方便起見(jiàn)，將第一級(jí)最近鄰居矩陣稱作G。該矩陣G是網(wǎng)絡(luò)的數(shù)學(xué)表達(dá)式，它是通過(guò)劃出連接最近鄰居珠的中心的線段獲得的。如果存在連接珠i和珠j的線段，則在G的小室(i，j)中的值為1。因此，G具有直接的幾何含義(它告訴你如何連接各點(diǎn))。利用被稱作DelaunayTriangulation的方法可以很快地計(jì)算出最近鄰居網(wǎng)絡(luò)。對(duì)于應(yīng)用計(jì)算幾何學(xué)來(lái)說(shuō)該方法是很重要的。
在圖論中，矩陣G還具有其他含義。G可以在網(wǎng)絡(luò)上操作，以便提供包括高級(jí)最近鄰居配對(duì)的更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。因此，G2是第2和以下級(jí)別最近鄰居的網(wǎng)絡(luò)。G6是第6和以下級(jí)別最近鄰居的網(wǎng)絡(luò)。因此，計(jì)算方法如下提供描述每一珠的位置的一組(x，y)配對(duì)1)利用Delaunay triangularion計(jì)算G2)計(jì)算G63)對(duì)于G的上部三角部分中的每一個(gè)1來(lái)說(shuō)a)計(jì)算配對(duì)距離b)將所述配對(duì)距離整合到柱狀圖中4)對(duì)柱狀圖進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
例7利用天然細(xì)胞膜進(jìn)行蛋白檢測(cè)膜結(jié)合蛋白的檢測(cè)是利用″粗制″膜提取物進(jìn)行的，該提取物是從天然細(xì)胞中直接獲得的，以便對(duì)顆粒進(jìn)行包被。具體地講，用直接由人類紅細(xì)胞的天然細(xì)胞膜制備的囊泡對(duì)平均直徑為6.8mm的二氧化硅微珠進(jìn)行包被。天然細(xì)胞膜是從活細(xì)胞中獲得的膜。隨后證實(shí)，抗體與存在于紅細(xì)胞膜中的天然膜結(jié)合型細(xì)胞內(nèi)蛋白Band III的結(jié)合足以激發(fā)相轉(zhuǎn)變。
利用Kaufmann等(Kaufmann，S.&Tanaka，M.Cell Adhesiononto Highly Curved SurfacesOne-Step Immobilization of HumanErythrocyte Membranes on silica Beads.Chem Phys Chem 4，699-704(2003))的方法制備紅細(xì)胞血影。將所得到的細(xì)胞隨后在冰水浴中在5mM Tris緩沖液，pH 8.0的條件下以25W的功率進(jìn)行探頭超聲波處理90秒(進(jìn)行5秒脈沖，間隔1秒鐘)，以便產(chǎn)生小的單層囊泡(SUV′s)。在4℃下以160,000g的速度對(duì)緩沖液中的SUV超速離心2小時(shí)。上清液在4℃下，在5mM Tris緩沖液，pH 8.0中保存長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)。通過(guò)將等量的(100mL)分散溶液(1∶1 SUV/1X Tris緩沖鹽溶液，pH 7.4)和微珠懸浮液(存在于去離子水中的10％固體)一起在1.5mL離心管中混合，在微珠表面上自我組裝雙層。通過(guò)脈沖離心并且取出上清液而除去多余的囊泡。然后將1mL的5mM Tris緩沖液，pH 8.0添加到所述微珠中，并且對(duì)整體混合物進(jìn)行渦旋攪拌，以便使微珠重新懸浮。
在進(jìn)行抗體染色之前，在BSA(15mg/mL)中溫育微珠1小時(shí)，以便防止抗體的非專一性吸附。然后在生理學(xué)緩沖液中利用單克隆小鼠IgG抗體鑒定細(xì)胞內(nèi)Band III結(jié)構(gòu)域。然后通過(guò)Texas Red-標(biāo)記的多克隆山羊抗-小鼠抗體檢測(cè)結(jié)合型小鼠IgG。每一種抗體的溫育時(shí)間是30分鐘。用18.2MΩ-cm水充分漂洗微珠，稀釋到可接受的工作濃度，澆鑄到96孔平板中，并且使之通過(guò)重力沉降。在室溫下用NikonTE-300倒置熒光顯微鏡觀察所述微珠，顯微鏡上裝有水銀弧光燈用于產(chǎn)生熒光，以及100W鹵素?zé)粲糜诹翀?chǎng)照明。用Roper ScientificCoolSnap HQ電荷耦合器件照相機(jī)記錄圖像。
該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與上述實(shí)施例2中進(jìn)行的抗體分析法的結(jié)果類似。在這里，抗體的結(jié)合足以導(dǎo)致膠體發(fā)生從凝聚相到分散相的相轉(zhuǎn)變。
應(yīng)當(dāng)理解的是，可以對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)，以便進(jìn)行蛋白組分析，這樣的分析方法與現(xiàn)有的方法(ELISA等)類似，但是更簡(jiǎn)單，因?yàn)椴恍枰?jí)抗體或復(fù)雜的光學(xué)檢測(cè)設(shè)備。諸如HEK和CHO細(xì)胞等在遺傳學(xué)上充分表征過(guò)的模型細(xì)胞系可以用于轉(zhuǎn)化，以便展示任意數(shù)量的膜結(jié)合/相關(guān)分析物。另外，還可以使用表現(xiàn)出天然存在的分析物的天然細(xì)胞，并且在對(duì)模型細(xì)胞進(jìn)行工程改造不可行或不合適的情況下，它可能更合適(難以進(jìn)行工程表達(dá)的蛋白，發(fā)現(xiàn)以高濃度天然存在于天然細(xì)胞中的那些蛋白等)。
以上書(shū)面說(shuō)明被認(rèn)為足以使得本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。以上說(shuō)明和實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明了本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案，并且說(shuō)明了發(fā)明人所理解的最佳方式。不過(guò)，可以理解的是，無(wú)論在本文中上述說(shuō)明看上去如何詳細(xì)，本發(fā)明能夠以多種方式實(shí)施，并且本發(fā)明應(yīng)當(dāng)按照所附權(quán)利要求書(shū)和任何等同方案進(jìn)行理解。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)樣品中的分析物的方法，包括提供膠體顆粒懸浮液，其中，所述顆粒與和所述分析物結(jié)合的配體相結(jié)合，并且其中所述膠體顆粒接近動(dòng)態(tài)相轉(zhuǎn)變狀態(tài)；讓所述懸浮液與所述樣品接觸；和測(cè)定所述膠體顆粒是否從第一種相轉(zhuǎn)變成第二種相，其中，所述轉(zhuǎn)變是在所述樣品中存在所述分析物的指示。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述膠體顆粒包括脂層。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述脂層包括脂雙層。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述脂雙層包括天然細(xì)胞膜。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述脂雙層包含人工細(xì)胞膜。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述膠體顆粒是與所述配體共價(jià)連接的。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述配體是與所述膠體顆粒非共價(jià)連接的。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述配體散布在所述膠體顆粒上的脂層中。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述膠體顆粒具有凈負(fù)電荷或凈中性電荷。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述分析物選自下列組中蛋白質(zhì)，核酸，抗體，抗原，受體，病毒，和細(xì)菌。
11.權(quán)利要求1的方法，其中，測(cè)定所述膠體顆粒是否從第一種相轉(zhuǎn)變成第二種相包括測(cè)定所述懸浮液中所述膠體顆粒中心之間的距離。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述膠體顆粒的大小為1μm-10μm。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一種相是凝聚相，而所述第二種相是分散相。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一種相是分散相，而所述第二種相是凝聚相。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述膠體顆粒懸浮液包含第一群體的膠體顆粒和第二群體的膠體顆粒。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述第一群體包含的膠體顆粒比所述第二群體中包含的膠體顆粒更大。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述第一群體包含的膠體顆粒的標(biāo)記方式與所述第二群體中的膠體顆粒的標(biāo)記方式不同。
18.一種用于檢測(cè)分析物與配體的結(jié)合的分析系統(tǒng)，其中包含膠體顆粒懸浮液，其中所述膠體顆粒接近動(dòng)態(tài)相轉(zhuǎn)變狀態(tài)；與所述顆粒結(jié)合并且對(duì)所述分析物特異的配體；和被設(shè)計(jì)成用于測(cè)定在與所述分析物接觸時(shí)所述膠體顆粒是否從第一種相轉(zhuǎn)變成第二種相的設(shè)備，其中所述轉(zhuǎn)變是所述分析物與所述配體相結(jié)合的指示。
19.權(quán)利要求18的分析系統(tǒng)，其中所述膠體顆粒懸浮液包含第一群體的膠體顆粒和第二群體的膠體顆粒。
20.權(quán)利要求19的分析系統(tǒng)，其中所述第一群體包含的膠體顆粒比所述第二群體中的膠體顆粒更大。
21.權(quán)利要求19的分析系統(tǒng)，其中所述第一群體包含的膠體顆粒的標(biāo)記方式與所述第二群體中所述膠體顆粒的標(biāo)記方式不同。
22.權(quán)利要求18的分析系統(tǒng)，其中所述膠體顆粒包含脂層。
23.權(quán)利要求22的分析系統(tǒng)，其中所述脂層包含天然細(xì)胞膜。
24.權(quán)利要求18的分析系統(tǒng)，其中所述膠體顆粒是與所述配體共價(jià)連接的。
25.權(quán)利要求18的分析系統(tǒng)，其中所述配體是與所述膠體顆粒非共價(jià)連接的。
26.權(quán)利要求18的分析系統(tǒng)，其中所述第一種相是凝聚相，而所述第二種相是分散相。
27.權(quán)利要求18的分析系統(tǒng)，其中所述第一種相是分散相，而所述第二種相是凝聚相。
28.一種用于檢測(cè)分析物與配體的結(jié)合的分析系統(tǒng)，其中包含膠體顆粒懸浮液，其中所述顆粒被脂層所包被，并且其中所述顆粒接近動(dòng)態(tài)相轉(zhuǎn)變狀態(tài)；與所述脂層結(jié)合的配體，其中所述配體特異于所述分析物；和用于測(cè)定當(dāng)接觸所述分析物時(shí)所述膠體顆粒是否從第一種相轉(zhuǎn)變成第二種相的設(shè)備，其中所述轉(zhuǎn)變是所述分析物與所述配體相結(jié)合的指示。
29.權(quán)利要求28的分析系統(tǒng)，其中所述用于檢測(cè)的設(shè)備包括顯微鏡。
30.權(quán)利要求28的分析系統(tǒng)，其中，所述用于檢測(cè)的設(shè)備包括熒光檢測(cè)儀。
31.權(quán)利要求28的分析系統(tǒng)，其中所述脂層包含天然細(xì)胞膜。
32.權(quán)利要求28的分析系統(tǒng)，其中所述配體是與所述脂層非共價(jià)連接的。
全文摘要
本發(fā)明披露了用于測(cè)定配體和分析物之間的相互作用的方法和分析法。所述分析法可以包括與感興趣的配體結(jié)合的膠體顆粒懸浮液。所述膠體顆粒在所述懸浮液中維持在從凝聚相到分散相的相轉(zhuǎn)變狀態(tài)或接近相轉(zhuǎn)變狀態(tài)。然后將要檢測(cè)的分析物添加到所述懸浮液中。如果分析物與所述配體結(jié)合的話，就會(huì)發(fā)生表明所述結(jié)合成功的相轉(zhuǎn)變。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101052695SQ200480040747
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2004年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月4日
發(fā)明者J·T·格羅夫斯, M·M·巴克施, M·亞洛斯 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)