專利名稱：基于固相表面增強光散射的生物分子相互作用分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬光分析技術(shù)，具體涉及生物分子在固相表面特異性的聚集導(dǎo)致表面光散射信號增強而進行生物分子的定性和定量測定以及生物分子相互作用特性分析的分析方法，可廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸、酶、細胞與細菌、生化藥物等的高靈敏度、高選擇性的定量測定以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)(如抗原與抗體、給體與受體、蛋白質(zhì)與酶等)DNA與DNA、DNA與蛋白質(zhì)(包括酶)等之間特異性的相互作用分析。
背景技術(shù)：
光散射現(xiàn)象廣泛存在于光與粒子的作用過程中。已有研究結(jié)果表明生物大分子的識別、組裝和聚集導(dǎo)致強烈的共振光散射信號(RLS)增強，且信號增強與聚集體系(散射粒子)的濃度成正比。近年來，散射技術(shù)已應(yīng)用于生物大分子、生化藥物、表面活性劑、納米粒子和無機金屬離子的分析。然而，建立在溶液本體基礎(chǔ)上的散射分析技術(shù)，雖然靈敏度高，使用的儀器簡單，操作簡便，但存在致命的缺陷。1、選擇性不好，抗干擾能力較差。在本體溶液，所有能對光產(chǎn)生散射的物質(zhì)都會對被測物分析帶來大的干擾。2、目前采用的散射技術(shù)都是在水溶液中進行測定，而對于需要在油溶性試劑中進行的分析則不能進行，因而使其分析的范圍受到了一定的局限。3、在本體溶液中由于干擾成分多，對于進行生物分子相互作用的分析也有較大的困難。
對于類似本發(fā)明的表面等離子分析(SPR)技術(shù)，雖然它也利用生物分子之間特異性相互作用而進行分析測定，但它需要將生物分子固定在特制的金表面，且利用的是全內(nèi)反射時漸消失波的影響，通過測定反射角和反射光能量的變化來進行分析測定。其采用的原理與本發(fā)明完全不相同，而且需要昂貴的專業(yè)儀器設(shè)備(SPR儀)來完成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種基于固相表面增強光散射的生物分子相互作用分析方法，將散射技術(shù)引入到固相表面，并與高選擇性的生物分子相互作用相結(jié)合，從而構(gòu)建得到一種新的光分析方法，充分繼承散射技術(shù)的優(yōu)點，克服它僅能在本體溶液中應(yīng)用和選擇性低的局限，為生物分子的含量測定和生物分子相互作用機理的表征提供了一種簡便、快速、靈敏的技術(shù)平臺。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下基于固相表面增強光散射的生物分子相互作用分析方法，總的方法是先將生物探針分子固定在玻片表面，再利用探針與生物靶分子在玻片表面相互作用，從而引起光散射信號增強，進而實施對生物靶分子的定性和定量分析測定以及分子間相互作用特性(如親合特性、動力學特性等)分析。具體包括以下步驟1、先依據(jù)不同生物分子探針的特性，選擇合適材質(zhì)的凹玻片(如普通玻片、石英玻片等)，使用恰當?shù)幕瘜W修飾劑(如氨基硅烷化試劑、巰基硅烷化試劑、戊二醛等)，進行表面修飾處理。
2、通過共價鍵合方式固定探針分子實際操作中可分別采用物理吸附、化學鍵合、物理吸附與化學鍵合相結(jié)合、雙功能試劑交聯(lián)、納米材料(如金納米粒子)、特殊吸附蛋白(如G蛋白、A蛋白等)等進行生物分子探針在玻片表面上的固定。
3、利用生物分子之間的特異性相互作用使生物探針與生物靶分子結(jié)合。
4、在普通熒光光度計上采用同步掃描方式得到散射光譜，并通過生物分子作用前后光譜強度變化實施對生物靶分子的定性和定量測定，以及分子間作用特性的分析。在采用普通熒光光度計進行檢測時，入射光與玻片成45°角，在入射光的90°角方向?qū)嵤┥⑸湫盘柕臋z測，并采用激發(fā)和發(fā)射波長相同(即Δλ＝0)的同步掃描模式進行。
5、對生物探針進行再生，使得探針可繼續(xù)用于靶分子的檢測。
本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果1、本發(fā)明將散射技術(shù)引入到固相表面，克服了散射技術(shù)在本體溶液中使用所受到的共存物質(zhì)的干擾，分析靈敏度高，并大大提高了分析方法的選擇性。
2、克服了散射技術(shù)只能運用于水作溶劑的物質(zhì)的分析測定，拓展了散射技術(shù)的運用范圍。
2、本發(fā)明不僅能進行對生物靶分子的定性和定量測定，而且還能進行生物分子間相互作用特性(如親和性，動力學特性)分析。
3、本發(fā)明技術(shù)僅需要普通的儀器，儀器簡單，分析成本低廉。


圖1是玻片的固定結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
以下以采用本發(fā)明的分析方法對抗原抗體進行分析為例來詳細說明本發(fā)明的實現(xiàn)過程(1)選用普通凹玻片，其規(guī)格為25mm×70mm，凹面的直徑為10mm；(2)在玻片經(jīng)過濃氫氧化鈉、濃硫酸、蒸餾水充分洗凈后，用氨丙基三甲氧基硅烷試劑對玻片凹面進行硅烷化處理；(3)用5％的戊二醛作為偶聯(lián)劑，將生物分子探針----羊抗人IgG(抗體)固定在玻片凹面上；(4)在玻片凹面滴入生物靶分子----人IgG(抗原)溶液，通過探針和靶分子之間特異性的反應(yīng)(即抗原抗體的特異性反應(yīng))將靶分子吸附在玻片表面；(5)將玻片1放入基座2中，如圖1所示，再置入普通熒光光度計內(nèi)，采用同步掃描方式掃描得到散射光譜，并通過生物分子作用前后光譜強度的變化實施對生物靶分子的定性、定量測定，以及分子間作用特性的分析；(6)在玻片凹面加入0.1mol/l的脲溶液洗脫吸附在探針上的靶分子，從而再生探針，以便其再進行靶分子的檢測。
實驗結(jié)果表明，采用本發(fā)明分析方法，固定羊抗人IgG(抗體)作為探針對人IgG(抗原)靶分子進行測定時，分析的相關(guān)系數(shù)可以達到0.993，最低檢測濃度可達10ng/ml。
權(quán)利要求
1.基于固相表面增強光散射的生物分子相互作用分析方法，包括以下步驟(1)先依據(jù)不同生物分子探針的特性，對凹玻片進行預(yù)處理；(2)固定探針分子；(3)利用生物分子之間的特異性相互作用使生物探針與生物靶分子結(jié)合；(4)在普通熒光光度計上采用同步掃描方式得到散射光譜，并通過生物分子作用前后光譜強度的變化實施對生物靶分子的定性、定量測定，以及分子間作用特性的分析。(5)對生物探針進行再生，使得探針可繼續(xù)用于靶分子的檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中的預(yù)處理是采用氨基硅烷化試劑、巰基硅烷化試劑及戊二醛等化學修飾劑對玻片進行表面修飾處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)是通過共價鍵合方式固定探針分子，方式有物理吸附、化學鍵合、物理吸附與化學鍵合相結(jié)合、雙功能試劑交聯(lián)、納米材料或特殊吸附蛋白結(jié)合方式。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中采用普通熒光分光光度計檢測時，入射光與玻片成45°角，在入射光的90°角方向?qū)嵤┥⑸湫盘柕臋z測，并采用激發(fā)和發(fā)射波長相同的同步掃描模式進行。
全文摘要
本發(fā)明是一種基于生物探針分子與生物靶分子在玻片表面發(fā)生相互作用，引起光散射信號增強，進而實施對生物靶分子的定性和定量測定以及分子間相互作用特性分析的分析方法。方法過程包括對凹玻片的預(yù)處理，探針分子的固定，生物探針與生物靶分子的結(jié)合，在普通熒光光度計上采用同步掃描方式得到散射光譜，并通過生物分子作用前后光譜強度的變化實施對生物靶分子的定性、定量測定，以及分子間作用特性的分析，以及對生物探針的再生。其優(yōu)點是分析靈敏度高，選擇性非常好，使用儀器簡單，分析成本低廉，可廣泛適用于各種生物分子含量的測定及分子相互作用特性分析。
文檔編號G01N1/28GK1811384SQ20061005406
公開日2006年8月2日 申請日期2006年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月28日
發(fā)明者黃承志, 趙華文, 李原芳 申請人:西南大學