專利名稱：針對多重靶的pi3k相互作用分子的選擇性概況分析的制作方法
針對多重靶的PI3K相互作用分子的選擇性概況分析本發(fā)明涉及使用苯基噻唑配體1作為關(guān)于PI3K的配體，用于鑒定且表征PI3K相 互作用分子和用于純化PI3K的方法。此外，本發(fā)明涉及例如用于治療癌癥、代謝疾病或自 身免疫/炎性病癥的，包括所述相互作用分子的藥物組合物。激酶催化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖、核苷和其他細(xì)胞代謝產(chǎn)物的磷酸化，并且在真核細(xì)胞 生理學(xué)的所有方面起關(guān)鍵作用。特別地，蛋白質(zhì)激酶和脂質(zhì)激酶參與信號事件，所述信號事 件響應(yīng)細(xì)胞外介質(zhì)或刺激例如生長因子、細(xì)胞因子或趨化因子控制細(xì)胞的活化、生長、分化 和存活。一般而言，蛋白質(zhì)激酶分成2組，優(yōu)先磷酸化酪氨酸殘基的那些和優(yōu)先磷酸化絲氨 酸和/或蘇氨酸殘基的那些。不適當(dāng)?shù)馗叩鞍踪|(zhì)激酶活性涉及許多疾病，包括癌癥、代謝疾病和自身免疫/炎 性病癥。這可以通過由于酶的突變、超表達(dá)或不適當(dāng)活化的控制機(jī)制失敗直接或間接引起。 在所有這些情況下，激酶的選擇性抑制預(yù)期具有有利效應(yīng)。已成為藥物開發(fā)的近期焦點(diǎn)的一組脂質(zhì)激酶是磷酸肌醇3-激酶(PI3K)家族。 PI3K家族成員是脂質(zhì)激酶，其催化Y-磷酸從ATP到磷脂酰肌醇及其衍生物(統(tǒng)稱為磷酸 肌醇)的3'羥基的轉(zhuǎn)移。迄今為止已從哺乳動物細(xì)胞中分離出PI3K家族的8個成員(同 種型)，并且根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)和底物特異性分成3個類別(類別ΙΑ:ΡΙ3Κα、β和δ ；類別 IB :ΡΙ3Κ γ ；類另Ij II :PI3KC2 α、β 禾口 γ ；類別 III :Vps34 酵母同系物(Fruman 等人，1998. Phosphoinositide kinases. Annual Review Biochemistry 67,481-507 ；Cantley, L. C., 2002，Science 296,1655-1657)。已知哺乳動物細(xì)胞表達(dá)PI3K IA類的催化亞單位的3個同種型(ρΙΙΟα、ρ110β和 ρΙΙΟδ，同義詞“ΡΙ3Κδ”)。類別IB僅包含一個成員(催化亞單位)，其已命名為pllO γ 或PI3KY。除了其脂質(zhì)激酶活性外，PI3K γ還顯示絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶活性，如由 自磷酸化證實(shí)的。其中編碼PI3KY或δ的基因被缺失的經(jīng)遺傳處理的小鼠的研究給出關(guān)于這些激 酶的生理學(xué)功能及其作為藥物靶的潛在效用的重要信息。缺乏ΡΙ3ΚΥ或δ的小鼠是存活 的并且顯示特征性表型，暗示幾種潛在的治療適應(yīng)癥。ΡΙ3ΚΥ看起來是先天性免疫系統(tǒng)的 主要介質(zhì)。例如，ΡΙ3Κ γ缺陷巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞顯示浸潤發(fā)炎腹膜的能力受損。肥 大細(xì)胞代表在ΡΙ3ΚΥ缺陷小鼠中受累的另一種細(xì)胞類型。缺乏ΡΙ3Κδ的小鼠的表型的 特征在于淋巴細(xì)胞功能的損害，并且指向適應(yīng)性免疫應(yīng)答控制中的主導(dǎo)因素(Wetzker和 Rommel, Current Pharmaceutical Design,2004,10,1915-1922)。與廣泛表達(dá)的ΡΙ3Κα和β同種型形成對比，造血特異性同種型ΡΙ3Κ γ和δ暗 示重要的治療適應(yīng)癥。2種同種型表現(xiàn)為用于治療由過度活躍的吞噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、B和T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫/炎性疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘或過敏反應(yīng))的理想靶。 為了避免不希望有的副作用，需要高度同種型選擇性的抑制劑(Ohashi和Woodgett 2005， Nature Medicine 11，924-925)。磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶(PIKK)家族成員是涉及細(xì)胞周期進(jìn)展、DNA重組和DNA 損傷檢測的高分子量激酶。在具有毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥的患者細(xì)胞中缺陷且涉及
4細(xì)胞對損傷DNA的檢測和應(yīng)答的人ATM基因是這個家族的成員。另一個是mT0R(同義詞 FRAP)，其涉及雷帕霉素敏感途徑，導(dǎo)致Gl細(xì)胞周期進(jìn)展(Shilo，2003. Nature Reviews Cancer 3,155-168)。關(guān)于鑒定和表征PI3K抑制劑的一個先決條件是合適測定法的提供，優(yōu)選生理學(xué) 形式的蛋白質(zhì)靶。在本領(lǐng)域中，已提出幾種策略以解決這個問題。常規(guī)地，PI3K脂質(zhì)激酶家族活性可以使用經(jīng)純化的酶或重組酶在具有磷脂(原文 為phopholipid，疑為phospholipid)囊泡的基于溶液的測定法中進(jìn)行測量。通過添加酸 化的有機(jī)溶劑和通過萃取或薄層色譜法分析的后續(xù)相分離來終止反應(yīng)(Carpenter等人， 1990，J.Biol. Chem. 265，19704-19711)。本領(lǐng)域描述的另一種測定法基于從放射性標(biāo)記的ATP到固定在平板上的磷脂酰 肌醇的磷酸鹽轉(zhuǎn)移。這種測定法類型也使用重組PI3KY酶，但可以以高通量方式執(zhí)行 (Fuchikami 等人，2002，J. Biomol. Screening 7，441-450)。另外一種生物化學(xué)篩選測定法基于使用熒光團(tuán)標(biāo)記的磷酸肌醇的競爭熒光偏振 (FP)形式(Drees 等人，2003，Comb. Chem. High Throughput Screening 6，321—330)。最后，報(bào)告了基于熒光顯微鏡成像和自動化圖像分析的基于細(xì)胞的Akt-EGFP再 分布測定法。為此，用人胰島素受體和Aktl-增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)融合構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn) 染中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在用胰島素樣生長因子I(IGF-I)刺激后，PI3K被激活，并且 Aktl-EGFP蛋白質(zhì)被召募至細(xì)胞膜。用PI3K同種型選擇性抑制劑驗(yàn)證再分布測定法顯示， ΡΙ3Κα是在IGF-I刺激后在CHO宿主細(xì)胞中激活的主要同種型(Wolff等人，Comb. Chem. High Throughput Screen.9,339-350)。盡管不是所有情況下用于鑒定選擇性激酶抑制劑需要的另一個先決條件是允許 測定這些分子的靶選擇性的方法。例如，可以預(yù)期提供與特定藥物靶結(jié)合且抑制其但不與 緊密相關(guān)的靶相互作用的分子，所述緊密相關(guān)靶的抑制可以導(dǎo)致副作用。常規(guī)地，個別酶測 定法的大實(shí)驗(yàn)對象組用于評估化合物對于激酶的抑制效應(yīng)(Knight等人，2004. Bioorganic and Medicinal Chemistry 12，4749-4759 ;Knight 等人，2006，Cell 125,733-747)。最近， 在噬菌體上展示的激酶或激酶結(jié)構(gòu)域已用于評估給定化合物與大激酶組相互作用的能力 (Karaman 等人，2008. Nature Biotechnology 26，127-132)。此外，已描述了允許激酶抑 制劑針對蛋白質(zhì)組的概況分析的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法(W02006/134056 ；Bantscheff等人， 2007. Nature Biotechnology 25，1035-1044 ;Patricelly 等人，2007. Biochemistry 46， 350-358 ；Gharbi 等人，2007. Biochem. J. 404，15-21 ；W02008/015013)。由上文看來，需要提供用于鑒定且選擇性概況分析PI3K相互作用化合物的有效 方法以及用于純化PI3K的方法。為了順應(yīng)這個需要，本發(fā)明在第一個方面提供了用于鑒定PI3K相互作用化合物 的方法，其包括步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑，b)在允許苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物形成的條件下，使蛋白質(zhì)制劑與固定在固 體支持物上的苯基噻唑配體1接觸，c)使苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物與給定化合物溫育，d)測定化合物是否能夠使PI3K與經(jīng)固定的苯基噻唑配體1分離，和
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e)測定化合物是否還能夠使ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR與經(jīng)固定的苯基噻唑配 體1分離。在第二個方面，本發(fā)明涉及用于鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑，b)在允許苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物形成的條件下，使蛋白質(zhì)制劑與固定在固 體支持物上的苯基噻唑配體1接觸，c)檢測在步驟b)中形成的苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物，和d)檢測在步驟b)中是否也已形成苯基噻唑配體1與ATM、ATR、DNAPK和或mTOR 之間的復(fù)合物。在第三個方面，本發(fā)明提供了用于鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括步 驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑的2個等分試樣，b)在允許苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物形成的條件下，使一個等分試樣與固定在 固體支持物上的苯基噻唑配體1接觸，c)在允許苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物形成的條件下，使另一個等分試樣與固定 在固體支持物上的苯基噻唑配體1和給定化合物接觸，d)測定在步驟b)和c)中形成的苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的量，和e)測定在步驟b)和c)中是否也已形成苯基噻唑配體1與ATM、ATR、DNAPK和或 mTOR之間的復(fù)合物。在第四個方面，本發(fā)明涉及用于鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括步驟a)提供各自包括包含PI3K的至少一個細(xì)胞的2個等分試樣，b)使一個等分試樣與給定化合物溫育，c)收獲每個等分試樣的細(xì)胞，d)使細(xì)胞裂解，以便獲得蛋白質(zhì)制劑，e)在允許苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物形成的條件下，使蛋白質(zhì)制劑與固定在固 體支持物上的苯基噻唑配體1接觸，和f)測定在步驟e)中每個等分試樣中形成的苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的量，和g)測定在步驟e)中是否也已形成苯基噻唑配體1與ATM、ATR、DNAPK和或mTOR 之間的復(fù)合物。在本發(fā)明的背景中，已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)苯基噻唑配體1是PI3K配體和PIKK家族 其他成員WPATM、ATR、DNAPK*mTOR(FRAP))的配體。這使得苯基噻唑配體1在篩選測定 法中的使用成為可能，例如在競爭篩選測定法中以及在用于純化PI3K的方法中。苯基噻唑配體1的結(jié)構(gòu)在

圖1中給出。這種化合物是取代的噻唑 (3- (2- {2- [2- (2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N- [5- (4-氯-3-甲磺酰 基-苯基)-4_甲基-噻唑-2基]-丙酰胺)，根據(jù)圖1，其在液體溶液中具有鹽酸鹽作為陰 離子。然而，在本發(fā)明的背景中還設(shè)想了進(jìn)一步的抗衡離子。苯基噻唑配體1可以經(jīng)由伯 氨基與合適的固體支持物材料共價(jià)偶聯(lián)，并且用于分離結(jié)合蛋白質(zhì)。苯基噻唑配體1的合 成在實(shí)施例1中描述。根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)“苯基噻唑配體1”還包括這樣的化合物，其包含等 同核心但具有另一個接頭，優(yōu)選與并非環(huán)狀結(jié)構(gòu)的部分的氮偶聯(lián)，用于與固體支持物連接。一般地，接頭具有8、9或10個原子的主鏈。接頭可以包含羧基、羥基或氨基活性基團(tuán)。因此，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)“苯基噻唑配體1，，還包括這樣的化合物，其具 有相同的N-[5-(4-氯-3-甲磺?；?苯基)-4_甲基-噻唑-2基]-丙酰胺核心但包括在 N-原子處的另一個接頭，例如C1-C8烷基羰基或C1-C8烷基氨基羰基，其中任何一個任選由 下述取代鹵素、羥基、氨基、C1-C8-烷氨基、C1-C8-烷氧羰基、任選由羥基取代的C1-C8-烷 氧基、或任選由羥基或商素取代的C1-C8-烷基。此外，這個表達(dá)還包括如上所述的化合物， 其具有另一個鹵素例如溴代替4-氯殘基，或在苯環(huán)上例如由鹵素進(jìn)一步取代。此外，代替 甲磺?；?，還可能存在任選由鹵素取代的另一個基團(tuán)如羥基、羧基或C1-C8烷基。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，歸入表達(dá)“苯基噻唑配體1”的化合物選自 3- (2- {2-[2- (2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5- (4-氯-3-甲磺酰 基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺鹽酸鹽、3- (2- {2- [2- (2-氨基-乙氧基)-乙氧 基]-乙氧基}_乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺?；?苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰 胺、和具有相同的N- [5- (4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺核心的 化合物，所述化合物僅在N-原子處由C1-C8烷基羰基或C1-C8烷基氨基羰基進(jìn)一步取代， 其中任何一個任選由下述取代商素、羥基、氨基、C1-C8-烷氨基、C1-C8-烷氧羰基、任選由 羥基取代的C1-C8-烷氧基、或任選由羥基或商素取代的C1-C8-烷基。根據(jù)本發(fā)明，“PI3K”包括PI3K家族的所有成員，包括類別IA(例如ΡΙ3Κα、β和 δ )、類別IB (例如ΡΙ3Κ γ )、類別II (例如PI3KC2 α、β禾Π γ )和類別III (例如Vps34酵 母同系物)。人PI3K γ (類別IB迄今為止唯一已知的成員)的序列在圖4中給出。PI3K5 (類別IA的成員)的序列在圖5中給出。根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)“PI3K”指這個家族的人和其他蛋白質(zhì)。該表達(dá)特別包括其功 能活性衍生物、或其功能活性片段、或其同系物、或由在低嚴(yán)格條件下與編碼所述蛋白質(zhì)的 核酸雜交的核酸編碼的變體。優(yōu)選地，這些低嚴(yán)格條件包括在包含35%甲酰胺、5X SSC、 50mM Tris-HCKpH 7. 5)、5mM EDTA、0. 02% PVP、0. 02% BSA、100ug/ml 變性鮭精DNA和 10% (wt/vol)硫酸葡聚糖的緩沖液中于40°C雜交18-20小時，在由2X SSC、25mM Tris-HCl (pH 7. 4)、5mM EDTA和0. SDS組成的緩沖液中于55°C洗滌1-5小時，并且在由2X SSC、25mM Tris-HCl(pH 7. 4) 5mM EDTA和0. 1% SDS組成的緩沖液中于60V洗洚1. 5小時。根據(jù)本發(fā)明，“ATM”意指毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白質(zhì)。ATM蛋白質(zhì)是蛋 白質(zhì)的磷脂酰肌醇_3激酶家族的成員，其通過使涉及DNA修復(fù)和/或細(xì)胞周期控制的關(guān)鍵 底物磷酸化而響應(yīng) DNA 損傷(Shilo，2003. Nature Reviews Cancer 3，155-168)。根據(jù)本發(fā)明，“ATR”意指毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥和RAD3相關(guān)蛋白質(zhì)(同義詞 FRAP相關(guān)蛋白質(zhì)UFRP1)0根據(jù)本發(fā)明，“DNAPK”意指DNA依賴性蛋白質(zhì)激酶。PRKDC基因編碼核DNA依 賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶(DNA-PK)的催化亞單位。第二個組分是自身免疫抗原 Ku(152690)，其由在染色體22q上的G22P1基因編碼。單獨(dú)地，DNA-PK的催化亞單位是無 活性的，并且依賴于G22P1組分，以將其導(dǎo)向DNA且觸發(fā)其激酶活性；PRKDC必須與DNA結(jié) 合以表達(dá)其催性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，“mTOR”意指雷帕霉素的哺乳動物靶(mTOR，也稱為FRAP或RAFT1)(Tsang 等人，2007，Drug Discovery Today 12,112-124) mTOR 蛋白質(zhì)是 289kDA 的大激 酶，其出現(xiàn)在迄今為止測序的所有真核生物中。羧基末端“磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)相關(guān) 激酶”(PIKK)結(jié)構(gòu)域的序列在物種之間是高度保守的，并且顯示絲氨酸和蘇氨酸激酶活性 但無可檢測的脂質(zhì)激酶活性。根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)1111”、111 ”、“0離 1(”或“11111( ”涉及這個家族的人和其他蛋 白質(zhì)(Shilo，2003. Nature Reviews Cancer 3，155-168)。該表達(dá)特別包括其功能活性 衍生物、或其功能活性片段、或其同系物、或由在低嚴(yán)格條件下與編碼所述蛋白質(zhì)的核酸 雜交的核酸編碼的變體。優(yōu)選地，這些低嚴(yán)格條件包括在包含35%甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl (pH 7. 5)、5mM EDTA、0. 02 % PVP、0. 02 % BSAUOOug/ml 變性鮭精 DNA 禾口 10 % (wt/vol)硫酸葡聚糖的緩沖液中于40°C雜交18-20小時，在由2X SSC、25mM Tris-HCl (pH 7. 4)、5mM EDTA和0. SDS組成的緩沖液中于55°C洗滌1-5小時，并且在由2X SSC、25mM Tris-HCl (pH 7. 4) 5mM EDTA和0. SDS組成的緩沖液中于60V洗洚1. 5小時。苯基噻唑配體1是關(guān)于PI3K的所有同種型的配體(參見上文)。然而，本發(fā)明自 始至終，優(yōu)選PI3K是PI3KY或ΡΙ3Κδ，特別是其人同種型。在本發(fā)明的某些方面，首先提供了包含ΡΙ3Κ的蛋白質(zhì)制劑。本發(fā)明的方法可以用 任何蛋白質(zhì)制劑作為原材料執(zhí)行，只要ΡΙ3Κ溶解于制劑中。例子包括幾種蛋白質(zhì)的液體混 合物、細(xì)胞裂解物、包含在原始細(xì)胞或幾種細(xì)胞裂解物的組合中存在的并非所有蛋白質(zhì)的 部分細(xì)胞裂解物，特別是在其中并非每一種目的靶蛋白質(zhì)都存在于每一種細(xì)胞裂解物中的 情況下。術(shù)語“蛋白質(zhì)制劑”還包括溶解的純化蛋白質(zhì)。ΡΙ3Κ蛋白質(zhì)種類在目的蛋白質(zhì)制劑中的存在可以在用抗體探測的蛋白質(zhì)印跡 上進(jìn)行檢測，所述抗體特異性針對ΡΙ3Κ。在ΡΙ3Κ是特異性同種型(例如ΡΙ3ΚΥ和/或 ΡΙ3Κ5)的情況下，所述同種型的存在可以通過同種型特異性抗體進(jìn)行測定。此類抗體 是本領(lǐng)域已知的(Sasaki 等人，2000，Nature 406，897-902 ;Deora 等人，1998，J. Biol. Chem. 273,29923-29928)。備選地，還可以使用質(zhì)譜法(MS)(參見下文)。ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR蛋白質(zhì)在目的蛋白質(zhì)制劑中的存在可以在用抗體探 測的蛋白質(zhì)印跡上進(jìn)行檢測，所述抗體對于所述蛋白質(zhì)特異。通過首先分離細(xì)胞的細(xì)胞器(例如核、線粒體、核糖體、高爾基體等)，并且隨后 制備衍生自這些細(xì)胞器的蛋白質(zhì)制劑，可以獲得細(xì)胞裂解物或部分細(xì)胞裂解物。用于分 離細(xì)胞的細(xì)胞器的方法是本領(lǐng)域已知的(第4. 2章Purification of Organelles from Mammalian Cells in"Current Protocols in Protein Science，，，編輯John. E. Coligan， Ben M. Dunn, Hidde L.Ploegh, David W.Speicher, Paul T. Wingfield ；Wiley, ISBN 0-471-14098-8)。此外，通過細(xì)胞提取物的分餾，從而富集特定類型的蛋白質(zhì)例如細(xì)胞質(zhì)或膜蛋白 質(zhì)，可以制備蛋白質(zhì)制劑(第 4. 3 章 Subcellular Fractionation of Tissue Culture Cells in，，Current Protocols in Protein Science，，,編輯John. E. Coligan, Ben M.Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield；Wiley, ISBN :0-471-14098_8)。此外，可以使用來自體液的蛋白質(zhì)制劑(例如血液、腦脊髓液、腹膜液和尿)。例如，可以使用衍生自模型生物體例如線蟲(C. elegans)的限定發(fā)育期或成體期 的整個胚胎裂解物。此外，整個器官例如從小鼠中解剖的心臟可以是蛋白質(zhì)制劑的來源。這
8些器官也可以在體外進(jìn)行灌注，以便獲得蛋白質(zhì)制劑。此外，蛋白質(zhì)制劑可以是包含已重組產(chǎn)生的PI3K的制劑。用于在原核和真核細(xì)胞 中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法是廣泛建立的(第5章Production of Recombinant Proteins in，，Current Protocols in Protein Science，，,編輯John. E. Coligan,Ben M. Dunn,Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield ；Wiley,1995，ISBN :0-471-14098_8)。在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)制劑的提供包括收獲包含PI3K 的至少一個細(xì)胞且使細(xì)胞裂解的步驟。用于這個用途的合適細(xì)胞是表達(dá)PI3K家族成員的那些細(xì)胞或組織。PI3K家族的 成員在大多數(shù)細(xì)胞和組織中表達(dá)。PI3K γ在造血系統(tǒng)的細(xì)胞(例如粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大 細(xì)胞和血小板)中優(yōu)先表達(dá)，而且在心肌細(xì)胞、血管平滑肌和血管上皮細(xì)胞中表達(dá)。PI3K5 在淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞中以顯著表達(dá)進(jìn)行遍在表達(dá)。因此，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，從外周血中分離的細(xì)胞代表合適的生物材料。用 于分離和培養(yǎng)得自外周血的人淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞亞群(PBLs)的操作是廣泛已知的(W. E Biddison,第 2. 2 $ "Preparation and culture of human lymphocytes" in Current Protocols in Cell Biology, 1998, John Wiley & Sons, Inc.)。例如,密度梯度離心是用 于使淋巴細(xì)胞與其他血細(xì)胞群體(例如紅細(xì)胞和粒細(xì)胞)分離的方法。人淋巴細(xì)胞亞群可 以經(jīng)由其特異性細(xì)胞表面受體進(jìn)行分離，所述細(xì)胞表面受體可以由單克隆抗體識別。物理 分離方法涉及這些抗體試劑與磁珠的偶聯(lián)，所述磁珠允許富集由這些抗體結(jié)合的細(xì)胞(陽 性選擇)。通過加入針對T細(xì)胞受體或共受體例如CD-3的抗體以起始T細(xì)胞受體信號和 PI3K的后續(xù)磷酸化，可以進(jìn)一步培養(yǎng)且刺激經(jīng)分離的淋巴細(xì)胞(Houtman等人，2005，The Journal of Immunology 175 (4)，2449-2458)。作為原代人細(xì)胞的備選物，可以使用經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞系(例如M0LT-4細(xì)胞或大鼠 嗜堿細(xì)胞性白血病(RBL-2H3)細(xì)胞)。通過經(jīng)由多價(jià)抗原交聯(lián)關(guān)于IgE的高親和力受體 (Fe ε RI)以誘導(dǎo) ΡΙ3Κ 的激活，可以刺激 RBL-2H3 (Kato 等人，2006，J. Immunol. 177(1) 147-154)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞是細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的部分，并且用于從細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 中收獲細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的(同上的文獻(xiàn))。細(xì)胞的選擇將主要依賴于PI3K的表達(dá)，因?yàn)楸仨毚_保蛋白質(zhì)主要存在于選擇的 細(xì)胞中。為了測定給定細(xì)胞是否是用于本發(fā)明的方法的合適起始系統(tǒng)，方法如蛋白質(zhì)印跡、 基于PCR的核酸檢測方法、RNA印跡和DNA微陣列方法(“DNA芯片)可能是合適的，以便 測定目的給定蛋白質(zhì)是否存在于細(xì)胞中。細(xì)胞的選擇還可以受研究目的影響。如果需要分析關(guān)于給定藥物的體內(nèi)功效，那 么可以選擇其中發(fā)生所需療效的細(xì)胞或組織(例如粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞)。相比之下，為了闡 明介導(dǎo)不希望有的副作用的蛋白質(zhì)靶，可以分析其中觀察到副作用的細(xì)胞或組織(例如心 肌細(xì)胞、血管平滑肌或上皮細(xì)胞)。此外，在本發(fā)明內(nèi)設(shè)想包含PI3K的細(xì)胞可以例如通過活組織檢查得自生物體。相 對應(yīng)方法是本領(lǐng)域已知的。例如，活組織檢查是用于獲得小量組織的診斷操作，其隨后可以 用顯微鏡或用生物化學(xué)方法進(jìn)行檢查?；罱M織檢查對于診斷、分類和分級疾病是重要的，對 于評估和監(jiān)控藥物治療也是重要的。
在本發(fā)明內(nèi)包括的是，通過至少一個細(xì)胞的收獲，同時執(zhí)行裂解。然而，同樣優(yōu)選 首先收獲細(xì)胞并且隨后分開裂解。用于細(xì)胞裂解的方法是本領(lǐng)域已知的(Karwa和Mitra SampIe preparation for the extraction,isolation,and purification of Nuclei Acids ；"SampIe Preparation Techniques in Analytical Chemistry"ψ8 Wiley 2003, Somenath Mitra, 出版ISBN =0471328456 ；在線ISBN 0471457817)。通過勻漿器(例如，波特(Potter)勻漿 器)、超聲磨碎機(jī)、酶促裂解、去污劑(例如NP-40、Triton X-100、CHAPS、SDS)、滲透休克、 反復(fù)凍融或這些方法的組合，可以達(dá)到不同細(xì)胞類型和組織的裂解。根據(jù)本發(fā)明的方法，在允許苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物形成的條件下，使包含 PI3K的蛋白質(zhì)制劑與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體1接觸。在本發(fā)明中，術(shù)語“苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物”指示其中苯基噻唑配體1例如 通過共價(jià)或最優(yōu)選地通過非共價(jià)結(jié)合與PI3K相互作用的復(fù)合物。相同定義還應(yīng)用于苯基 噻唑配體1與ATM、ATR、DNAPK或mTOR之間的復(fù)合物。技術(shù)人員應(yīng)了解可以應(yīng)用何種條件，以便使得苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的形 成成為可能。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語“在允許復(fù)合物形成的條件下”包括在其下此類形成優(yōu)選 此類結(jié)合是可能的所有條件。這包括具有在固定相上的固體支持物且將裂解物傾倒在其上 的可能性。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，還包括固體支持物是顆粒形式且與細(xì)胞裂解物相混
I=I O在非共價(jià)結(jié)合的背景中，苯基噻唑配體1和PI3K之間的結(jié)合例如經(jīng)由鹽橋、氫鍵、 疏水性相互作用或其組合。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物形成的步驟在基本生理?xiàng)l 件下執(zhí)行。蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的物理狀況在Petty，1998 (Howard R. Petty，第1章，Unit 1.5 in Juan S. Bonifacino, Mary Dasso, Joe B. Harford, Jennifer Lippincott-Schwartz, and Kenneth M. Yamada(編輯)Current Protocols in Cell Biology Copyright 2003 John Wiley & Sons, Inc.保留所有權(quán)利。DOI 10. 1002/0471143030. cb0101s00 在線公布 日期2001年5月印刷出版日期1998年10月)中描述。在基本生理?xiàng)l件下的接觸具有下述優(yōu)點(diǎn)配體、細(xì)胞制劑(即待表征的激酶)和任 選地化合物之間的相互作用盡可能多地反映自然條件?！盎旧?xiàng)l件”尤其是存在于原 始、未加工的樣品材料中的那些條件。它們包括生理學(xué)蛋白質(zhì)濃度、pH、鹽濃度、緩沖容量和 所涉及蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。術(shù)語“基本生理?xiàng)l件”不需要與樣品由其衍生的原始活生物 體中的那些等同的條件，而是基本上細(xì)胞樣的條件或接近于細(xì)胞條件的條件。當(dāng)然，本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，由于將最終導(dǎo)致較少細(xì)胞樣條件的實(shí)驗(yàn)設(shè)置可能出現(xiàn)特定限制。例如， 當(dāng)從活生物體中獲得且加工樣品時，最終必需的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜斷裂可能要求與生物體中 發(fā)現(xiàn)的生理?xiàng)l件不等同的條件。用于實(shí)踐本發(fā)明的方法的生理?xiàng)l件的合適變異對于本領(lǐng)域 技術(shù)人員是顯而易見的，并且由如本文所使用的術(shù)語“基本生理?xiàng)l件”包括。總之，應(yīng)當(dāng)理 解術(shù)語“基本生理?xiàng)l件”指接近于如例如在天然細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的生理?xiàng)l件的條件，但不一定要 求這些條件是等同的。例如，“基本生理?xiàng)l件”可以包括50-200mM NaCl或KC1、pH 6. 5-8. 5、20_37°C和0. OOl-IOmM 二價(jià)陽離子(例如 Mg++、Ca++)；更優(yōu)選約 150m NaCl 或 KCl、pH7. 2 至 7. 6、5mM 二價(jià)陽離子，并且通常包括0.01-1.0%非特異性蛋白質(zhì)(例如BSA)。通?？梢源嬖诜请x子 型去污劑(Tween、NP-40、Triton-XlOO)，通常以約 0. 001 至 2%、一般 0. 05-0. 2% (體積 /體積)。關(guān)于一般指導(dǎo)，可以應(yīng)用下述緩沖水性條件10-250mM NaCl、5_50mM Tris HC1、 PH5-8，伴隨一種或多種二價(jià)陽離子和/或金屬螯合劑和/或非離子型去污劑的任選添加。優(yōu)選地，“基本生理?xiàng)l件”意指6. 5至7. 5、優(yōu)選7. 0至7. 5的pH，和/或10至50mM、 優(yōu)選25至50mM的緩沖濃度，和/或120至170mM、優(yōu)選150mM的單價(jià)鹽(例如Na或K)濃 度。二價(jià)鹽(例如Mg或Ca)可以進(jìn)一步以1至5mM、優(yōu)選1至2mM的濃度存在，其中更優(yōu)選 地緩沖劑選自Tris-HCl或HEPES。在本發(fā)明的背景中，苯基噻唑配體1固定在固體支持物上。本發(fā)明自始至終，術(shù)語 “固體支持物”指能夠在其表面上固定小分子配體的每一種不溶解的支持物。根據(jù)一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，固體支持物選自瓊脂糖、經(jīng)修飾的瓊脂糖、瓊脂 糖珠(例如NHS活化的瓊脂糖)、乳膠、纖維素和鐵磁性或亞鐵磁性顆粒。苯基噻唑配體1可以與固體支持物共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)。非共價(jià)結(jié)合包括經(jīng)由與鏈 霉親和素基質(zhì)結(jié)合的生物素親和配體的結(jié)合。優(yōu)選地，苯基噻唑配體1與固體支持物共價(jià)偶聯(lián)。在偶聯(lián)前，基質(zhì)可以包含活性基團(tuán)例如NHS、碳化二亞胺等，以使得與苯基噻唑配 體1的偶聯(lián)反應(yīng)成為可能。苯基噻唑配體1可以通過直接偶聯(lián)(例如使用官能團(tuán)例如氨基、 巰基、羧基、羥基、醛和酮基團(tuán))和通過間接偶聯(lián)(例如經(jīng)由生物素、與苯基噻唑配體1共價(jià) 附著的生物素和生物素與鏈霉親和素(其與固體支持物直接結(jié)合)的非共價(jià)結(jié)合)與固體 支持物偶聯(lián)。與固體支持物材料的連接可以涉及可切割和不可切割接頭。切割可以通過酶促切 割或用合適的化學(xué)方法處理來達(dá)到。用于使苯基噻唑配體1與固體支持物材料結(jié)合的優(yōu)選結(jié)合界面是具有C-原子主 鏈的接頭。一般地接頭具有8、9或10個原子的主鏈。接頭可以包含羧基或氨基活性基團(tuán)。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在本發(fā)明的方法的個別步驟之間，洗滌步驟可能是必需的。此 類洗滌是本領(lǐng)域技術(shù)人員知識的部分。洗滌作用于從固體支持物中去除細(xì)胞裂解物的非結(jié) 合組分。非特異性(例如簡單離子)結(jié)合相互作用可以通過加入低水平的去污劑或通過適 度調(diào)整至洗滌緩沖液中的鹽濃度降到最低。根據(jù)本發(fā)明的鑒定方法，讀出系統(tǒng)是PI3K的檢測或測定(本發(fā)明的第一個方面)、 苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的檢測(本發(fā)明的第二個方面)、或苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合 物的量的測定(本發(fā)明的第二個、第三個和第四個方面)。本發(fā)明自始至終，用于測定或檢測PI3K、檢測苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物、或測 定苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的量的相同讀出系統(tǒng)可以用于檢測ATM、ATR、DNAPK或mTOR， 或檢測或測定苯基噻唑配體1與所述蛋白質(zhì)之間的復(fù)合物的量。這暗示在其中使用對于 PI3K特異的試劑(例如抗體)的情況下，必須使用對于ATM、ATR、DNAPK或mTOR特異的抗 體代替。因此，下文給出的實(shí)施方案和說明也應(yīng)用于檢測ATM、ATR、DNAPK或mTOR，或檢測 復(fù)合物，或測定苯基噻唑配體1與所述蛋白質(zhì)之間的復(fù)合物的量。在根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的方法中，經(jīng)分離的PI3K的檢測或測定優(yōu)選指示化
11合物能夠使PI3K與經(jīng)固定的苯基噻唑配體1分離的事實(shí)。這種能力指示分別的化合物與 PI3K相互作用，優(yōu)選結(jié)合至PI3K，這指示其治療潛力。在根據(jù)本發(fā)明的第二個方面的方法的一個實(shí)施方案中，檢測出在本發(fā)明的方法過 程中形成的苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物。此類復(fù)合物形成的事實(shí)優(yōu)選指示化合物不完全 抑制復(fù)合物的形成。另一方面，如果未形成復(fù)合物，那么推測化合物是與PI3K的強(qiáng)相互作 用物，這指示其治療潛力。根據(jù)本發(fā)明的第二個、第三個和第四個方面的方法，測定在方法的過程中形成的 苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的量。一般而言，在分別化合物的存在下形成越少的復(fù)合物， 分別化合物與PI3K的相互作用越強(qiáng)，這指示其治療潛力。根據(jù)本發(fā)明的第二個方面苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的檢測可以通過使用針對 PI3K的經(jīng)標(biāo)記的抗體和合適的讀出系統(tǒng)來進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的第二個方面的一個優(yōu)選實(shí)施方案，苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物通 過測定其量進(jìn)行檢測。在本發(fā)明的第二個、第三個和第四個方面的過程中，優(yōu)選PI3K與經(jīng)固定的苯基噻 唑配體1分離，以便測定苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的量。根據(jù)本發(fā)明，分離意味著破壞苯基噻唑配體1與PI3K之間的相互作用的每一個動 作。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，這包括從經(jīng)固定的苯基噻唑配體1中洗脫P(yáng)I3K。洗脫可以通過如下文詳細(xì)描述的使用非特異性試劑來達(dá)到(離子強(qiáng)度、PH值、去 污劑)。此外，可以測試目的化合物是否可以從苯基噻唑配體1中特異性洗脫P(yáng)I3K。此類 PI3K相互作用化合物在下述部分中進(jìn)一步描述。用于破壞相互作用的此類非特異性方法原則上是本領(lǐng)域已知的，并且依賴于配體 酶相互作用的性質(zhì)。原則上，離子強(qiáng)度的改變、PH值、溫度或與去污劑溫育是使靶酶與經(jīng) 固定的配體解離的合適方法。洗脫緩沖液的應(yīng)用可以通過極端PH值(高或低pH;例如通 過使用0. IM檸檬酸鹽，pH2-3降低pH)，改變離子強(qiáng)度(例如使用NaI、KI、MgCl2或KCl 的高鹽濃度)，破壞疏水性相互作用的極性還原劑(例如二噁烷或乙二醇)，或變性劑(離 液鹽或去污劑例如十二烷基硫酸鈉，SDS ；Review =Subramanian Α.，2002，Immunoaffinty chromatography)來解離結(jié)合配偶體。在某些情況下，固體支持物已優(yōu)選與所釋放的材料分離。關(guān)于這點(diǎn)的個別方法依 賴于固體支持物的性質(zhì)，并且是本領(lǐng)域已知的。如果固體材料包含在柱內(nèi)，那么所釋放的材 料可以作為柱流出物(flowthrough)進(jìn)行收集。在支持物材料與裂解物組分相混合的情況 下(所謂的批操作)，另外的分離步驟例如溫和離心可能是必需的，并且所釋放的材料作為 上清液進(jìn)行收集。備選地，磁珠可以用作固體支持物，從而使得珠可以通過使用磁性裝置從 樣品中消除。在根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的方法的步驟d)中，測定PI3K是否已與經(jīng)固定的苯 基噻唑配體1分離。這可以包括PI3K的檢測或PI3K量的測定。因此，至少在本發(fā)明的所有鑒定方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用用于檢測經(jīng)分離的 PI3K或用于測定其量的方法。此類方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括物理化學(xué)方法例如蛋白 質(zhì)測序(例如Edmarm降解)、通過質(zhì)譜法的分析或采用針對PI3K的抗體的免疫檢測方法。本發(fā)明自始至終，如果使用抗體以便檢測PI3K或以便測定其量(例如經(jīng)由ELISA)，那么技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，如果待檢測PI3K的特定同種型，或待測定PI3K的特定同 種型的量，那么可以使用同種型特異性抗體。如上所述，此類抗體是本領(lǐng)域已知的。此外， 技術(shù)人員知道用于產(chǎn)生抗體的方法。優(yōu)選地，檢測PI3K、ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR，或通過質(zhì)譜法或免疫檢測方法測 定所述蛋白質(zhì)的量。在下文中，這將通過提及PI3K更詳細(xì)地說明，但下文描述的實(shí)施方案 和說明也應(yīng)用于ATM、ATR、DNAPK或mTOR。用質(zhì)譜分析(質(zhì)譜法)鑒定蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域已知的(Shevchenko等人，1996， Analytical Chemistry 68 850-858 ；Mann 等 人，2001, Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry, Annual Review of Biochemistry 70,437-473),并且 在實(shí)施例部分進(jìn)一步舉例說明。優(yōu)選地，質(zhì)譜分析以定量方式執(zhí)行，例如通過使用iTRAQ技術(shù)(關(guān)于相對和絕 對定量的等壓標(biāo)記物)或cICAT(可切割的同位素編碼的親和標(biāo)記物)(Wu等人，2006. J.Proteome Res. 5,651-658)。根據(jù)本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，通過鑒定PI3K的蛋白分型 (proteotypic)肽來執(zhí)行通過質(zhì)譜法(MS)的表征。想法是PI3K用蛋白酶進(jìn)行消化，并且所 得到的肽通過MS進(jìn)行測定。因此，關(guān)于來自相同來源蛋白質(zhì)的肽的肽頻率相差很大程度， “一般”促成這種蛋白質(zhì)鑒定的最通常觀察到的肽被稱為“蛋白分型肽”。因此，如本文所使 用的，蛋白分型肽是獨(dú)特地鑒定特定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)同種型的在實(shí)驗(yàn)上可良好觀察的肽。根據(jù)一個優(yōu)選實(shí)施方案，通過使在實(shí)踐本發(fā)明的方法的過程中獲得的蛋白分型肽 與已知蛋白分型肽相比較來執(zhí)行表征。因?yàn)楫?dāng)使用通過蛋白酶消化制備的片段用于鑒定MS 中的蛋白質(zhì)時，通常對于給定酶觀察到相同蛋白分型肽，所以可以使對于給定樣品獲得的 蛋白分型肽與對于給定酶類別的酶已知的蛋白分型肽相比較，并且從而鑒定樣品中存在的 酶。作為質(zhì)譜分析的備選方法，可以檢測經(jīng)洗脫的PI3K(包括共洗脫的結(jié)合配偶體或 支架蛋白質(zhì))，或通過使用針對ΡΙ3Κ的特異性抗體(或針對ΡΙ3Κ的同種型，參見上文)可 以測定其量。此外，在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，一旦共洗脫的結(jié)合配偶體的特性已通過質(zhì)譜分 析進(jìn)行確認(rèn)，每個結(jié)合配偶體就可以用針對這種蛋白質(zhì)的特異性抗體進(jìn)行檢測。合適的基于抗體的測定法包括但不限于蛋白質(zhì)印跡、ELISA測定法、夾心ELISA 測定法和抗體陣列或其組合。此類測定法的建立是本領(lǐng)域已知的(Short Protocols in Molecular Biology.第 4 版中的第 11 章，Immunology，第 11-1 至 11-30 頁，由 F. Μ· Ausubel 等人編輯，Wiley, New York, 1999)。這些測定法不僅可以以檢測且定量目的PI3K相互作用蛋白質(zhì)的方法進(jìn)行配置 (例如，PI3K復(fù)合物的催化或調(diào)節(jié)亞單位)，還可以分析翻譯后修飾模式例如磷酸化或遍在 蛋白修飾。此外，本發(fā)明的鑒定方法涉及化合物的使用，所述化合物就其成為PI3K相互作用 化合物的能力進(jìn)行測試。原則上，根據(jù)本發(fā)明，此類化合物可以是能夠與PI3K相互作用的每一種分子，例 如通過抑制其與苯基噻唑配體1的結(jié)合。優(yōu)選地，化合物對PI3K具有作用，例如刺激或抑制作用。優(yōu)選地，所述化合物選自合成或天然存在的化學(xué)化合物或有機(jī)合成藥物，更優(yōu)選 小分子、有機(jī)藥物或天然小分子化合物。優(yōu)選地，所述化合物從包含此類化合物的文庫開始 進(jìn)行鑒定。隨后，在本發(fā)明的過程中，篩選此類文庫。此類小分子優(yōu)選不是蛋白質(zhì)或核酸。優(yōu)選地，小分子顯示出小于lOOODa、更優(yōu)選小 于750Da、最優(yōu)選小于500Da的分子量。根據(jù)本發(fā)明的“文庫”涉及以分類方式提供的(眾多)不同化學(xué)實(shí)體的(主要是大 的)集合，所述分類方式使得不同個別實(shí)體的快速功能分析(篩選)成為可能，并且同時提 供形成文庫的個別實(shí)體的快速鑒定。例子是在表面上的管或孔或斑點(diǎn)的集合，其包含可以 以高通量形式與一種或多種限定的潛在相互作用配偶體一起加入反應(yīng)內(nèi)的化學(xué)化合物。在 鑒定2種配偶體的所需“正”相互作用后，由于文庫構(gòu)建，可以容易地鑒定分別化合物。合 成和天然來源的文庫可以進(jìn)行購買或通過技術(shù)人員進(jìn)行設(shè)計(jì)。文庫構(gòu)建的例子在例如 Breinbauer R,Manger M, Scheck M, Waldmann H. Natural product guided compound library development. Curr Med Chem. 2002Dec ；9(23) 2129-45中提供，其中描述了用于設(shè)計(jì)組合文庫的生物學(xué)驗(yàn)證初始點(diǎn)的自然產(chǎn)物，因?yàn)樗鼈?具有經(jīng)證明的生物學(xué)關(guān)聯(lián)性記錄。根據(jù)關(guān)于由結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)獲得的蛋白質(zhì)的 結(jié)構(gòu)域體系結(jié)構(gòu)，可以解釋自然產(chǎn)物在藥物化學(xué)和化學(xué)生物學(xué)中的專門作用。為了實(shí)現(xiàn)在 結(jié)構(gòu)域家族內(nèi)個別結(jié)合袋的特定需求，可能必須通過化學(xué)變異最佳化自然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。固相 化學(xué)被說成變成用于這個最佳化過程的有效工具，并且這個領(lǐng)域中的近期進(jìn)展在這個綜述 文章中突出顯示。其他相關(guān)參考文獻(xiàn)包括Edwards PJ,Morrell Al. Solid-phasecompound library synthesis in drug design and development.Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 Jul ；5 (4) 594-605. ；Merlot C, Domine D, Church DJ.Fragment analysis in small molecule discovery. Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 May ；5 (3) 391-9. Review ；Goodnow RA Jr. Current practices in generation of small molecule new leads. J Cell Biochem Supp 1. 2001 ；Suppl 37:13-21 ；這描述了在許多藥物公司中的目前 藥物開發(fā)過程需要大的和增長中的高品質(zhì)先導(dǎo)物(lead)結(jié)構(gòu)集合用于在高通量篩選測定 法中使用。具有多樣結(jié)構(gòu)和“藥物樣”性質(zhì)的小分子的集合在過去已通過幾種方法獲得通 過先前內(nèi)部先導(dǎo)物最佳化努力的檔案，通過從化合物賣主購買，和通過在公司合并后的分 開集合的聯(lián)合。盡管高通量/組合化學(xué)被描述為新先導(dǎo)物產(chǎn)生的過程中的主要組分，但用 于文庫成員的合成和后續(xù)設(shè)計(jì)的文庫設(shè)計(jì)的選擇已進(jìn)化為激發(fā)和重要的新水平。針對多重 生物學(xué)靶篩選多重小分子化合物文庫設(shè)計(jì)的潛在利益提供了開發(fā)新先導(dǎo)物結(jié)構(gòu)的重要機(jī)石。在本發(fā)明的第二個和第三個方面的一個優(yōu)選實(shí)施方案，包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑 首先與化合物溫育，并且隨后與經(jīng)固定的苯基噻唑配體1溫育。然而，化合物和經(jīng)固定的苯 基噻唑配體1(共溫育)與包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑的同時溫育同樣是優(yōu)選的(競爭結(jié)合測 定法)。 在與化合物的溫育首先的情況下，在4°C至37 °C、更優(yōu)選4°C至25 °C、最優(yōu)選4°C 下，PI3K優(yōu)選首先與化合物溫育10至60分鐘、更優(yōu)選30至45分鐘。優(yōu)選地化合物以ΙμΜ 至ImM、優(yōu)選地10至100 μ M的濃度使用。第二個步驟，與經(jīng)固定的配體接觸，優(yōu)選在4°C下
在同時溫育的情況下，在4°C至37°C、更優(yōu)選4°C至25°C、最優(yōu)選4°C下，PI3K優(yōu)選 與化合物和苯基噻唑配體1 一起同時溫育30至120分鐘、更優(yōu)選60至120分鐘。優(yōu)選地， 化合物以1 μ M至ImM、優(yōu)選地10至100 μ M的濃度使用。此外，本發(fā)明的第二個方面的步驟a)至c)可以用幾種蛋白質(zhì)制劑執(zhí)行，以便測試 不同化合物。這個實(shí)施方案在中等或高通量篩選中特別有利(參見下文)。在根據(jù)第三個或第四個方面的本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，使步驟C) 中形成的苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的量與步驟b)中形成的量相比較。在根據(jù)第三個或第四個方面的本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，與步驟b) 中相比較，在步驟c)中形成減少量的苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物指示PI3K是化合物的 靶。這起因于下述事實(shí)在本發(fā)明的這種方法的步驟c)中，化合物與配體競爭結(jié)合PI3K。 如果在與化合物溫育的等分試樣中存在較少的PI3K，那么這優(yōu)選意味著化合物已與抑制劑 競爭與酶相互作用，并且因此是蛋白質(zhì)的直接靶，并且反之亦然。優(yōu)選地，本發(fā)明的鑒定方法作為中等或高通量篩選執(zhí)行。根據(jù)本發(fā)明鑒定的相互作用化合物可以通過測定它對PI3K例如對其激酶活性 是否具有作用進(jìn)行進(jìn)一步表征(Carpenter 等人，1990，J. Biol. Chem. 265，19704-19711)。 此類測定法是本領(lǐng)域已知的，也以允許中等至高通量篩選的形式(Fuchikami等人，2002， J. Biomol. Screening 7,441-450)。此外，根據(jù)本發(fā)明鑒定的相互作用化合物可以通過測定它對ATM、ATR、DNAPK或 mTOR例如對其激酶活性是否具有作用進(jìn)行進(jìn)一步表征(Knight等人，2004. Bioorganic and Medicinal Chemistry 12，4749-4759 ;Knight 等人，2006，Cell 125,733-747)。簡言之，PI3K脂質(zhì)激酶活性可以使用利用磷脂囊泡的基于溶液的測定法進(jìn)行測 量。通過添加酸化的有機(jī)溶劑和通過萃取或薄層色譜法分析的后續(xù)相分離來終止反應(yīng) (Carpenter 等人，1990，J. Biol. Chem. 265，19704-19711)。備選地，可以使用熒光偏振測定法形式。簡言之，使PI3K與合適的磷酸肌醇底物 溫育。在反應(yīng)完成后，使反應(yīng)產(chǎn)物與特定的磷酸肌醇檢測蛋白質(zhì)和熒光磷酸肌醇探針相混 合。隨著與磷酸肌醇檢測蛋白質(zhì)結(jié)合的探針由反應(yīng)產(chǎn)物替換，偏振(mP)值減少。熒光探針 的偏振程度與PI3K反應(yīng)的產(chǎn)物量成反比(Drees等人，2003，Comb. Chem. High Throughput Screening 6,321-330)。對于PI3K蛋白質(zhì)激酶活性的測定，可以使用具有合適的肽底物的熒光偏振測定 法。簡言之，熒光素標(biāo)記的肽底物可以與PI3K(例如PI3K δ )、ATP和抗磷酸絲氨酸抗體溫 育。隨著反應(yīng)進(jìn)展，磷酸化的肽與抗磷酸絲氨酸抗體結(jié)合，導(dǎo)致偏振信號的增加。抑制激酶 的化合物導(dǎo)致低偏振信號。根據(jù)本發(fā)明鑒定的化合物可以進(jìn)一步進(jìn)行最佳化(先導(dǎo)物最佳化)。由于在這些 先導(dǎo)物產(chǎn)生文庫中編碼的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(SAR)信息，通常加速此類化合物的這種后續(xù)最 佳化。由于高通量化學(xué)(HTC)方法用于后續(xù)合成的容易適用性，通常促進(jìn)先導(dǎo)物最佳化。此類文庫和先導(dǎo)物最佳化的一個例子是對于ΡΙ3Κ γ的描述(Pomel等人，2006， J. Med. Chem. 49，3857-3871)。本發(fā)明的方法包括這樣的方法步驟其中測定化合物是否還能夠使ATM、ATR、
15DNAPK和/或mTOR與經(jīng)固定的苯基噻唑配體1分離(本發(fā)明的第一個方面)，或是否也已 形成苯基噻唑配體1與ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR之間的復(fù)合物。如上所述，這些步驟可 以基本上如上文對于PI3K所述來執(zhí)行，其中需要時，使用試劑例如對于給定激酶特異的抗 體。在這些方法步驟后的原理是可以測定經(jīng)鑒定的PI3K相互作用化合物的特異性。 在本發(fā)明的背景中，優(yōu)選鑒定對于PI3K特異的PI3K相互作用化合物，即其與ATM、ATR、 DNAPK和/或mTOR在較少程度上結(jié)合，或更加優(yōu)選，不與這些蛋白質(zhì)中的一種或全部結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于制備藥物組合物的方法，其包括步驟a)如上所述鑒定PI3K相互作用化合物，和b)將相互作用化合物配制成藥物組合物。因此，本發(fā)明提供了用于制備藥物組合物的方法，其可以以有效量施用于受試者。 在一個優(yōu)選方面，治療劑是基本上純化的。待治療的受試者優(yōu)選是動物，包括但不限于動物 例如牛、豬、馬、雞、貓、犬等，并且優(yōu)選是哺乳動物，并且最優(yōu)選人。在一個特別實(shí)施方案中， 非人哺乳動物是受試者。根據(jù)本發(fā)明鑒定的化合物用于預(yù)防或治療其中PI3K起作用的疾病，例如癌癥(例 如乳腺癌、結(jié)腸癌或卵巢癌)、代謝病癥(例如糖尿病或肥胖)或自身免疫/炎性病癥(例 如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、哮喘或過敏反應(yīng))。因此，本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法鑒定的化合物在制備用于治療上述疾病中 的一種或多種的藥物中的用途。此外，本發(fā)明涉及包括所述化合物的藥物組合物。一般而言，本發(fā)明的藥物組合物包括治療有效量的治療劑和藥學(xué)上可接受的載 體。在一個特別實(shí)施方案中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”意指由聯(lián)邦管理機(jī)構(gòu)或州政府批準(zhǔn) 或在美國藥典或其他一般公認(rèn)的藥典中列出用于在動物且更特別地在人中使用。術(shù)語“載 體”指治療劑與之一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類藥學(xué)載體可以是無菌液 體，例如水和油，包括石油、動物、蔬菜或合成起源的那些，包括但不限于花生油、大豆油、礦 物油、芝麻油等。當(dāng)藥物組合物經(jīng)口施用時，水是優(yōu)選載體。當(dāng)藥物組合物靜脈內(nèi)施用時， 鹽水和含水右旋糖是優(yōu)選載體。鹽水溶液和含水右旋糖和甘油溶液優(yōu)選用作用于可注射溶 液的液體載體。合適的藥學(xué)賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻、面粉、白 堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇 等。需要時，組合物還可以包含微量濕潤劑或乳化劑、或PH緩沖劑。這些組合物可以采取 溶液、懸浮液、乳狀液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、持續(xù)釋放制劑等的形式。組合物可以用常規(guī) 粘合劑和載體例如甘油三酯配制為栓劑。經(jīng)口制劑可以包括標(biāo)準(zhǔn)載體例如藥學(xué)級別的甘露 醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適藥學(xué)載體的例子由E.W.Martin 在"Remington' s Pharmaceutical Sciences"中描述。此類組合物將包含治療有效量 的優(yōu)選以純化形式的治療劑，連同合適量的載體，以便提供用于適當(dāng)施用于患者的形式。制 劑應(yīng)適合施用方式。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，依照常規(guī)操作，組合物配制為適合于靜脈內(nèi)施用于人類 的藥物組合物。一般地，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是在無菌等滲水緩沖液中的溶液。需要 時，組合物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑例如利多卡因，以減輕注射部位處的疼痛。一般 地，成分分開供應(yīng)或以單位劑型混合在一起，例如，作為在指示活性劑的量的密封容器例如安瓿或囊(原文為sachette，疑為sachet)中的干燥凍干粉末或無水濃縮物。當(dāng)組合物待 通過輸注施用時，它可以用包含無菌藥學(xué)級別的水或鹽水的輸液瓶調(diào)配。當(dāng)組合物通過注 射施用時，可以提供注射用無菌水或鹽水的安瓿，從而使得成分可以在施用前進(jìn)行混合。本發(fā)明的治療劑可以配制為中性或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括由游離羧基 形成的那些，例如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，由游離胺基形成的那些， 例如衍生自異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的那些，以及衍生自氫氧化 鈉、鉀、銨、鈣和鐵等的那些。在治療特定病癥或病狀中有效的本發(fā)明的治療劑的量將依賴于病癥或病狀的性 質(zhì)，并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)進(jìn)行測定。此外，可以任選采用體外測定法，以幫助鑒定最 佳劑量范圍。在制劑中待采用的精確劑量還將依賴于施用途徑、和疾病或病癥的嚴(yán)重度， 并且應(yīng)根據(jù)從業(yè)者的判斷和每個患者的情況來決定。然而，用于靜脈內(nèi)施用的合適劑量范 圍一般是約20-500微克活性化合物/千克體重。用于鼻內(nèi)施用的合適劑量范圍一般是約 0. 01pg/kg體重至lmg/kg體重。有效劑量可以從衍生自體外或動物模型測試系統(tǒng)的劑量應(yīng) 答曲線進(jìn)行推斷。一般而言，栓劑可以包含0. 5重量％至10重量％的活性成分；經(jīng)口制劑 優(yōu)選包含10%至95%的活性成分。各種遞送系統(tǒng)是已知的，并且可以用于施用本發(fā)明的治療劑，例如在脂質(zhì)體、微粒 和微膠囊中封裝能夠表達(dá)治療劑的重組細(xì)胞的使用，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的使用(例如 Wu和Wu，1987，J. Biol. Chem. 262 =4429-4432)；治療核酸作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體的部 分的構(gòu)建等。引入的方法包括但不限于真皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜上 和經(jīng)口途徑。化合物可以通過任何方便的途徑進(jìn)行施用，例如通過輸注、通過彈丸注射、通 過經(jīng)過上皮或皮膚粘膜襯里(例如、口腔、直腸和腸粘膜等)吸收，并且可以連同其他生物 學(xué)活性劑一起施用。施用可以是全身或局部的。此外，可能希望通過任何合適的途徑包括 心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射，將本發(fā)明的藥物組合物引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)；通過例如與貯器(例如 Ommaya貯器)附著的心室內(nèi)導(dǎo)管可以促進(jìn)心室內(nèi)注射。還可以采用肺施用，例如通過使用 吸入器或噴霧器，和用霧化試劑配制。在一個特別實(shí)施方案中，可能希望將本發(fā)明的藥物組合物局部施用于需要治療的 區(qū)域。這可以例如通過但不限于在手術(shù)過程中的局部輸注、局部應(yīng)用例如在手術(shù)后與創(chuàng)傷 輔料結(jié)合、通過注射、借助于導(dǎo)管、借助于栓劑、或借助于埋植劑，所述埋植劑是多孔、非多 孔或凝膠狀材料，包括膜例如sialastic膜或纖維。在一個實(shí)施方案中，施用可以是通過在 惡性瘤或贅生或贅生前組織的部位(或先前部位)處的直接注射。在另一個實(shí)施方案中，治療劑可以在囊泡特別是脂質(zhì)體中進(jìn)行遞送(Langer， 1990，Science 249:1527-1533)。在另外一個實(shí)施方案中，治療劑可以經(jīng)由控制釋放系統(tǒng)進(jìn)行遞送。在一個實(shí)施方 案中，可以使用泵(Langer，同上)。在另外一個實(shí)施方案中，控制釋放系統(tǒng)可以放置在治療 靶即腦的附近，從而僅需要全身劑量的一部分。在本發(fā)明的背景中，已發(fā)現(xiàn)苯基噻唑配體1是關(guān)于ATM、ATR、DNAPK和mTOR的配 體。因此，本發(fā)明還涉及用于鑒定與ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR相互作用的化合物的方 法。這些方法如上文在PI3K相互作用化合物鑒定的背景中所述來執(zhí)行。此外，在本發(fā)明內(nèi) 設(shè)想用于鑒定ATM、ATR、DNAPK或mTOR相互作用化合物的這些方法可以包含或不包含下述步驟測定給定化合物是否還能夠與如本發(fā)明中限定的其他PIKK激酶相互作用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于純化ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR的方法，其包括步驟a)提供包含所述蛋白質(zhì)中的一種或多種的蛋白質(zhì)制劑，b)在允許苯基噻唑配體1-蛋白質(zhì)復(fù)合物形成的條件下，使蛋白質(zhì)制劑與固定在 固體支持物上的苯基噻唑配體1接觸，和c)使蛋白質(zhì)與經(jīng)固定的苯基噻唑配體1分離。如上所述，已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)苯基噻唑配體1是識別這些蛋白質(zhì)的配體。這使得 用于這些蛋白質(zhì)的有效純化方法成為可能。如上文對于本發(fā)明的鑒定方法限定的實(shí)施方案也應(yīng)用于本發(fā)明的純化方法。優(yōu)選地，所述純化如上所述使用同種型特異性抗體來執(zhí)行。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的純化方法在步驟C)后進(jìn)一步包括鑒定能夠與 ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR結(jié)合的蛋白質(zhì)。當(dāng)在基本生理?xiàng)l件下執(zhí)行復(fù)合物的形成時，這 是特別有利的，因?yàn)殡S后有可能保存酶的自然條件，所述自然條件包括結(jié)合配偶體的存在、 酶亞單位或翻譯后修飾，這隨后可以借助于質(zhì)譜法(MS)進(jìn)行鑒定。因此，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的純化方法在步驟C)后進(jìn)一步包括測定給 定蛋白質(zhì)是否例如通過遍在蛋白修飾進(jìn)行進(jìn)一步翻譯后修飾。本發(fā)明進(jìn)一步涉及苯基噻唑配體1用于鑒定ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR相互作 用化合物和用于純化PI3K的用途。如上限定的實(shí)施方案也應(yīng)用于本發(fā)明的用途。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，不僅苯基噻唑配體1，而且另外一種配體可以用于 鑒定相互作用化合物，即如圖16中所示的苯替嗎啉-色原(phenylmorpholin-chromen)配 體(8-(4-氨基甲基-苯基)-2-嗎啉-4-基-色原(chromen)-4-酮)或其衍生物，例如這 樣的化合物，其包含等同核心但具有另一個接頭，優(yōu)選與并非環(huán)狀結(jié)構(gòu)的部分的氮偶聯(lián)，用 于與固體支持物連接。因此，在本發(fā)明的這些實(shí)施方案沖，固定2種配體。在這個背景中， 在使用珠的情況下，包括固定在相同珠上的2種配體，或一種配體固定在一種珠上，并且另 一種配體固定在另一種珠上。在這個背景中，一般地接頭具有8、9或10個原子的主鏈。接 頭可以包含羧基、羥基或氨基活性基團(tuán)。本發(fā)明通過下述附圖和實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步舉例說明，所述附圖和實(shí)施例不視為關(guān) 于由本申請的權(quán)利要求賦予的保護(hù)范圍的限制。附圖簡述圖1 苯基噻唑配體1的合成和結(jié)構(gòu)。苯基噻唑配體1如實(shí)施例1中所述進(jìn)行合成。圖2 用經(jīng)固定的苯基噻唑配體1的藥物牽出(pulldown)實(shí)驗(yàn)和PI3K蛋白質(zhì)的 蛋白質(zhì)印跡檢測。作為生物材料，使用由M0LT-4細(xì)胞制備的細(xì)胞裂解物。藥物牽出實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例2 中所述進(jìn)行，使用包含50mg蛋白質(zhì)的裂解物樣品。經(jīng)捕獲的蛋白質(zhì)用包含DMSO的緩沖液 (泳道1)、100 μ M游離苯基噻唑配體1或SDS樣品緩沖液(泳道3)進(jìn)行洗脫。經(jīng)洗脫的樣 品在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離，并且轉(zhuǎn)移至膜。印跡首先與針對ΡΙ3Κ γ (圖2Α)和 ΡΙ3Κ5 (圖2Β)的特異性抗體溫育。由用于檢測的熒光染料標(biāo)記的第二檢測抗體與Odyssey 紅外成像系統(tǒng)一起使用。
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泳道1 :DMS0洗脫對照；泳道2 用100 μ M游離苯基噻唑配體1洗脫；泳道3: SDS洗脫。圖3 用于蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析的用經(jīng)固定的苯基噻唑配體1的藥物牽出實(shí)驗(yàn)。顯示了在用考馬斯亮藍(lán)染色后的蛋白質(zhì)凝膠。所指示的凝膠區(qū)域作為凝膠切片切 掉，并且對蛋白質(zhì)實(shí)施通過質(zhì)譜法的分析。藥物牽出實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例2中所述進(jìn)行，使用包含50mg蛋白質(zhì)的M0LT-4細(xì)胞裂 解物樣品。用SDS樣品緩沖液洗脫與經(jīng)固定的苯基噻唑配體1結(jié)合的蛋白質(zhì)，并且通過 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分離。圖4 :ΡΙ3Κγ鑒定的肽。通過人ΡΙ3Κδ序列的質(zhì)譜分析鑒定的肽以粗體且加下劃線顯示。圖5 :ΡΙ3Κδ鑒定的肽。通過人ΡΙ3ΚΥ序列的質(zhì)譜分析鑒定的肽以粗體且加下劃線顯示。圖6 用于鑒定ΡΙ3Κ γ相互作用化合物的洗脫測定法。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例3中所述進(jìn)行。ΡΙ3ΚΥ蛋白質(zhì)通過經(jīng)固定的苯基噻唑配體1從 M0LT-4細(xì)胞裂解物中捕獲，并且如所示的通過化合物洗脫。將洗脫物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素 膜，并且用Odyssey紅外成像系統(tǒng)檢測PI3K γ。第一抗體抗ΡΙ3Κ y (Jena Bioscience ABD-026S ；小鼠抗體)。第二抗體抗小鼠 IRDye800 (Rockland，610-732-124)。顯示 了累積 強(qiáng)度(累積 kilopixel/mm2)。用于洗脫的化合物化合物1 (LY294002) ； IC50 > 100 μ M ；化合物 2 (AS-605240) JC50 = 26ηΜ ；化合物 3 (AS-604850) ； IC50 = 1. 7μΜ,圖7 用于鑒定ΡΙ3ΚΥ相互作用化合物的競爭結(jié)合測定法。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例4中所述進(jìn)行。將以所示濃度的測試化合物和親和基質(zhì)加入M0LT-4 細(xì)胞裂解物中，并且通過在親和基質(zhì)上經(jīng)固定的苯基噻唑配體1捕獲不與測試化合物相互 作用的ΡΙ3ΚΥ蛋白質(zhì)。使親和基質(zhì)與裂解物分離，并且用SDS樣品緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白 質(zhì)，并且將洗脫物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用Odyssey紅外成像系統(tǒng)測定ΡΙ3Κ γ的量。7A 用抗體探測的斑點(diǎn)印跡，和用Odyssey紅外成像系統(tǒng)檢測的信號。第 一抗體抗PI3K y (Jena Bioscience ABD-026S ；小鼠抗體)。第二抗體抗小鼠 IRDye800(Rockland，610-732-124)。7B:競爭結(jié)合曲線。針對化合物濃度標(biāo)繪相對Odyssey單位(累積強(qiáng)度；累積 kilopixel/mm2)，并且計(jì)算一半最大結(jié)合競爭(IC)值?；衔? (LY294002) =IC50 > 30 μ M ； 化合物 2 (AS-605240) JC50 = 4. 6 μ M ；化合物 3 (AS-604850) JC50 = 176ηΜ。圖8 通過將化合物加入細(xì)胞裂解物中(裂解物測定法)或通過使化合物與活的 RAW264. 7細(xì)胞溫育(細(xì)胞測定法)的化合物概況分析。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例5中所述進(jìn)行?；衔镆?0 μ M的濃度在2種測定法中使用，并且 ΡΙ3Κ δ的量用Odyssey紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行定量。圖9 使用質(zhì)譜法定量的PI3K抑制劑的選擇性概況分析。實(shí)驗(yàn)在如實(shí)施例6中所述作為在Ramos細(xì)胞裂解物中的Kinobeads競爭結(jié)合測定 法執(zhí)行。基于定量質(zhì)譜法，顯示了關(guān)于個別靶的IC5tl值(μΜ)的概況分析。
A 化合物 CZC00015097B 化合物 CZC00018052C 化合物 CZC00019091圖10 化合物CZC18052的劑量應(yīng)答曲線?；衔镉眉っ傅亩嗦访庖邫z測在競爭結(jié)合測定法中進(jìn)行測試，如實(shí)施例7中所 述。在單個測定法中，測量了化合物對于ΡΙ3Κα、ΡΙ3Κβ、ΡΙ3Κγ、ΡΙ3Κδ和DNAPK的結(jié)合 親和力。簡言之，使Molt-4和Jurkat細(xì)胞裂解物的1 1混合物與親和基質(zhì)(具有經(jīng)固定 的苯基噻唑配體1的珠和具有苯替嗎啉-色原配體的珠1 1混合物)和化合物CZC18052 溫育。洗滌珠，并且洗脫結(jié)合的激酶。將洗脫物的等分試樣點(diǎn)在5個不同的硝酸纖維素膜 上，其各自與分別的靶抗體溫育且隨后與熒光第二抗體溫育。使用紅外掃描儀定量熒光信 號?；衔镲@示對于下述激酶范圍的有效結(jié)合PI3K α (IC50 = 0. 027 μ Μ)、ΡΙ3Κ β (IC50 = 0. 034 μ Μ)、ΡΙ3Κ γ (IC50 = 0· 43 μ Μ)、 ΡΙ3Κ δ (IC50 = 0· 14 μ Μ)禾口 DNAPK (IC50 = 0. 038 μ Μ)。圖11 關(guān)于化合物CZC19950的劑量應(yīng)答曲線。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例7中所述進(jìn)行?；衔镲@示與下述激酶的結(jié)合PI3Kci (IC5tl > 7 μ Μ)、ΡΙ3Κ β (IC50 = 1· 7 μ Μ)、ΡΙ3Κ γ (IC50 = 0· 17 μ Μ)、ΡΙ3Κ δ (IC50 > 3 μ Μ)和 DNAPKdC50 > 6 μ Μ)。化合物 CZC19950 顯示僅與 ΡΙ3Κ γ 的有效結(jié)合(IC50 = 0· 17 μ Μ)。圖12 用于蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析的用經(jīng)固定的苯基噻唑配體1的藥物牽出實(shí)驗(yàn)。顯示了在用考馬斯亮藍(lán)染色后的蛋白質(zhì)凝膠。所指示的凝膠區(qū)域作為凝膠切片切 掉，并且對蛋白質(zhì)實(shí)施通過質(zhì)譜法的分析。藥物牽出實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例2中所述進(jìn)行，使用包含 50mg蛋白質(zhì)的Jurkat和Ramos細(xì)胞裂解物樣品的1 1混合物。用SDS樣品緩沖液洗脫 與經(jīng)固定的苯基噻唑配體1結(jié)合的蛋白質(zhì)，并且通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 進(jìn)行分離。在這個實(shí)驗(yàn)中鑒定了下述蛋白質(zhì)DNA-PK、ATM和mTOR。圖13 在用經(jīng)固定的苯基噻唑配體1的藥物牽出后，通過DNA-PK的質(zhì)譜法鑒定的 肽。經(jīng)鑒定的肽是加下劃線的。圖14 在用經(jīng)固定的苯基噻唑配體1的藥物牽出后，通過ATM的質(zhì)譜法鑒定的肽。圖15 在用經(jīng)固定的苯基噻唑配體1的藥物牽出后，通過mTOR的質(zhì)譜法鑒定的 肽。圖16 苯替嗎啉-色原配體(8-(4_氨基甲基-苯基)-2_嗎啉-4-基-色原-4-酮) 的合成和結(jié)構(gòu)。配體如實(shí)施例8中所述進(jìn)行合成。顯示了配體的結(jié)構(gòu)[G]。圖17:用于蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析的用經(jīng)固定的苯替嗎啉-色原配體的藥物牽出實(shí)驗(yàn)。顯示了在用考馬斯亮藍(lán)染色后的蛋白質(zhì)凝膠。所指示的凝膠區(qū)域作為凝膠切片切 掉，并且對蛋白質(zhì)實(shí)施通過質(zhì)譜法的分析。藥物牽出實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例2中所述進(jìn)行，使用包含 50mg蛋白質(zhì)的HeLa和K-562細(xì)胞裂解物樣品的1 1混合物。用SDS樣品緩沖液洗脫與 苯替嗎啉-色原配體結(jié)合的蛋白質(zhì)，并且通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行 分離。圖18 在用經(jīng)固定的苯替嗎啉_色原配體從HeLa-K562裂解物混合物中的藥物牽 出后，通過人ATR的質(zhì)譜法鑒定的肽。
圖19 在用經(jīng)固定的苯替嗎啉_色原配體從HeLa-K562裂解物混合物中的藥物牽 出后，通過人ATM的質(zhì)譜法鑒定的肽。圖20 在用經(jīng)固定的苯替嗎啉_色原配體從HeLa-K562裂解物混合物中的藥物牽 出后，通過人mTOR的質(zhì)譜法鑒定的肽。實(shí)施例1 親和基質(zhì)的制備這個實(shí)施例舉例說明了用于從細(xì)胞裂解物親和捕獲PI3K激酶的親和基質(zhì)的制 備。捕獲配體使用氨基官能團(tuán)共價(jià)通過共價(jià)連接固定在固體支持物上。這種親和基質(zhì)在實(shí) 施例2、實(shí)施例3和實(shí)施例4中使用。苯基噻唑配體1(3-(2-{2-[2-(2_氨基-乙氧基)_乙氧基]-乙氧基}_乙氧 基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺?；?苯基)-4_甲基-噻唑-2基]-丙酰胺鹽酸鹽)的合成步驟1-3 根據(jù)TO 2003/072557中描述的操作制備1_溴_1_(4-氯-3-甲磺酰 基-苯基)-丙-2-酮步驟4 5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)_4_甲基-噻唑_2_基胺使1-溴-l-(4-氯-3-甲磺?；?苯基)_丙-2-酮(480mg 1. 5mmol)和硫脲 (114mg 1. 5mmol)在乙醇(12ml)中相組合，并且加熱至70°C 2小時。允許反應(yīng)混合物 冷卻至室溫，并且通過過濾收集固體產(chǎn)物，并且在真空下干燥，以得到作為灰白色固體的 5- (4-氯-3-甲磺?；?苯基)-4-甲基-噻唑-2-基胺(375mg)。1H NMR (400MHz DMS0_d6) 5 9.4 (br s, 2H)，8. 0 (d, 1H)，7. 9 (d, 1H)，7. 8 (dd, 1H)，3. 4 (s，3H)，2. 3 (s，3H)。步驟5 (2-{2-[2-(2-{2 [5-(4-氯-3-甲磺?；?苯基)_4_甲基-噻唑_2_基氨 基甲酰]-乙氧基}“乙氧基)“乙氧基]“乙氧基} _乙基)_氨基甲酸叔丁酯使3-(2-{2-[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)_乙氧基]_乙氧基}_乙氧 基)_ 丙酸(690mg 1. 9mmol)、EDAC(403mg 2. Immo 1)、HOBT(284mg2. Immo 1)、NMM(420uL 3. 8mmol)和5- (4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基胺(520mg 1. 7mmol)在二 甲基甲酰胺(16ml)中相組合，并且在室溫下攪拌過夜。在減壓下去除溶劑，并且使殘基溶 解于二氯甲烷(150ml)中，用IM HCl水溶液(50ml)和飽和含水碳酸氫鈉(50ml)洗滌，干燥 (硫酸鎂)，過濾并且蒸發(fā)。通過使用50g 1ST硅快速藥筒用0-2%甲醇/ 二氯甲烷洗脫的快 速色譜法純化殘?jiān)?，以得到作為油?2- {2-[2- (2- {2 [5- (4-氯-3-甲磺?；?苯基)_4_甲 基-噻唑-2-基氨基甲酰]_乙氧基}_乙氧基)_乙氧基]-乙氧基}_乙基)_氨基甲酸 叔丁酯(存在 1. Ig 殘留溶劑)1H NMR (400MHz CDC13) 10. 3 (br s，1H)，8. 2 (s，1H)，7. 6 (m， 2H), 7. 2 (br s, 1H) ,3. 9(t, 2H) 3. 8-3. 5 (br m, 14H)，3. 3 (br m, 5H) ,2. 8(t, 2H) ,2. 4(s, 3H)， 1. 4(s，9H)。步驟6 3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)_乙氧基]-乙氧基}_乙氧 基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺?；?苯基)-4_甲基-噻唑-2基]-丙酰胺鹽酸鹽使(2-{2-[2-(2-{2 [5-(4-氯-3-甲磺?；?苯基)-4-甲基-噻唑-2-基氨基甲 酰]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-氨基甲酸叔丁酯(1. Og 1. 5mmol) 溶解于二氯甲烷(IOml)中，并且用HCl (4ml在二噁烷中的4M溶液)處理。使反應(yīng)在 室溫下攪拌3小時。使溶劑蒸發(fā)，并且使殘?jiān)谡婵障赂稍铮缘玫阶鳛辄S色粘稠油的 3- (2- {2- [2- (2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N- [5- (4-氯-3-甲磺酰 基-苯基)-4_甲基-噻唑-2基]-丙酰胺鹽酸鹽(存在830mg殘留溶劑)力NMR (400MHzCDC13)8. 4(br s,3H) ,8. 2(s, 1H), 7. 7 (br d, 1H), 7. 6 (br d, 1Η) 3. 9 (br m, 4Η), 3. 8-3. 6 (br m, 12Η)，3· 3 (s，3Η)，3. 3 (br m, 2Η)，3. 1 (br m, 2Η) ,2. 6(s, 3H)。NMR 譜在 Bruker dpx400 上獲得。表1:使用的縮寫
權(quán)利要求
用于鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑，b)在允許苯基噻唑配體1 PI3K復(fù)合物形成的條件下，使所述蛋白質(zhì)制劑與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體1接觸，c)使所述苯基噻唑配體1 PI3K復(fù)合物與給定化合物溫育，d)測定所述化合物是否能夠使PI3K與所述經(jīng)固定的苯基噻唑配體1分離，和e)測定所述化合物是否還能夠使ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR與所述經(jīng)固定的苯基噻唑配體1分離。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟d)包括檢測經(jīng)分離的PI3K或測定經(jīng)分離的PI3K的量， 和/或步驟e)包括檢測經(jīng)分離的ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR或測定經(jīng)分離的ATM、ATR、 DNAPK禾口 /或mTOR的量。
3.權(quán)利要求2的方法，其中通過質(zhì)譜法或免疫檢測方法檢測經(jīng)分離的PI3K、ATM、ATR、 DNAPK和/或mTOR，或測定經(jīng)分離的PI3K、ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR的量，優(yōu)選用針對 PI3K、ATM、ATR、DNAPK 禾口 / 或 mTOR 的抗體。
4.用于鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑，b)在允許苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物形成的條件下，使所述蛋白質(zhì)制劑與固定在固 體支持物上的苯基噻唑配體1接觸，c)檢測在步驟b)中形成的所述苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物，和d)檢測在步驟b)中是否也已形成苯基噻唑配體1與ATM、ATR、DNAPK和或mTOR之間 的復(fù)合物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中在步驟c)中所述檢測通過測定苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合 物的量來進(jìn)行，和/或其中在步驟d)中測定苯基噻唑配體1與ATM、ATR、DNAPK和或mTOR 之間的復(fù)合物的量。
6.權(quán)利要求4或5中任一項(xiàng)的方法，其中步驟a)至c)用幾種蛋白質(zhì)制劑執(zhí)行，以便測 試不同化合物。
7.用于鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑的2個等分試樣，b)在允許苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物形成的條件下，使一個等分試樣與固定在固體 支持物上的所述苯基噻唑配體1接觸，c)在允許苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物形成的條件下，使另一個等分試樣與固定在固 體支持物上的所述苯基噻唑配體1以及與給定化合物接觸，d)測定在步驟b)和c)中形成的所述苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的量，和e)測定在步驟b)和c)中是否也已形成苯基噻唑配體1與ATM、ATR、DNAPK和或mTOR 之間的復(fù)合物。
8.用于鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括步驟a)提供各自包括包含PI3K的至少一個細(xì)胞的2個等分試樣，b)使一個等分試樣與給定化合物溫育，c)收獲每個等分試樣的細(xì)胞，d)使所述細(xì)胞裂解，以便獲得蛋白質(zhì)制劑，e)在允許苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物形成的條件下，使所述蛋白質(zhì)制劑與固定在固 體支持物上的所述苯基噻唑配體1接觸，和f)測定在步驟e)中每個等分試樣中形成的所述苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的量，和g)測定在步驟e)中是否也已形成苯基噻唑配體1與ATM、ATR、DNAPK和或mTOR之間 的復(fù)合物。
9.權(quán)利要求7或8中任一項(xiàng)的方法，其中和未與所述化合物溫育的等分試樣相比較，在 與所述化合物溫育的等分試樣中形成減少量的所述苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物指示PI3K 是所述化合物的靶。
10.權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)的方法，其中通過使PI3K與所述經(jīng)固定的苯基噻唑配體 1分離和隨后檢測經(jīng)分離的PI3K或隨后測定經(jīng)分離的PI3K的量，測定所述苯基噻唑配體 1-PI3K復(fù)合物的量。
11.權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的方法，其中通過使所述蛋白質(zhì)與所述經(jīng)固定的苯基噻唑 配體1分離和隨后檢測經(jīng)分離的ATM、ATR、DNAPK和或mTOR或隨后測定經(jīng)分離的ATM、ATR、 DNAPK和或mTOR的量，執(zhí)行是否也已形成苯基噻唑配體1與ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR 之間的復(fù)合物的所述測定。
12.權(quán)利要求10或11中任一項(xiàng)的方法，其中通過質(zhì)譜法或免疫檢測方法檢測所述蛋白 質(zhì)，或測定所述蛋白質(zhì)的量，優(yōu)選用針對所述蛋白質(zhì)的抗體。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其作為中等或高通量篩選執(zhí)行。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物選自合成化合物或有機(jī)合成藥 物，更優(yōu)選小分子有機(jī)藥物和天然小分子化合物。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述PI3K相互作用化合物是PI3K抑制劑。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述固體支持物選自瓊脂糖、經(jīng)修飾的瓊脂 糖、瓊脂糖珠(例如NHS活化的瓊脂糖)、乳膠、纖維素和鐵磁性或亞鐵磁性顆粒。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述苯基噻唑配體1與所述固體支持物共價(jià) 偶聯(lián)。
18.用于制備藥物組合物的方法，其包括步驟a)根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)鑒定PI3K相互作用化合物，和b)將所述相互作用化合物配制成藥物組合物。
19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述PI3K是PI3KY和/或ΡΙ3Κδ。
20.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白質(zhì)制劑的提供包括收獲包含ΡΙ3Κ的 至少一個細(xì)胞且使所述細(xì)胞裂解的步驟。
21.權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的方法，其中所述苯基噻唑配體1-ΡΙ3Κ復(fù)合物形成的步驟 在基本生理?xiàng)l件下執(zhí)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及其中通過使包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑與苯基噻唑配體1溫育來鑒定PI3K相互作用化合物的方法。
文檔編號G01N33/573GK101965408SQ200980107743
公開日2011年2月2日 申請日期2009年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月4日
發(fā)明者A·坎斯菲爾德, G·博加米尼摩爾, G·紐鮑爾 申請人:塞爾卓姆股份公司