專利名稱：熒光檢測方法以及熒光檢測裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光檢測方法以及熒光檢測裝置，該方法和裝置通過對(duì)在緩沖液中含 有細(xì)胞或細(xì)菌等測定對(duì)象物并流動(dòng)的流體的流動(dòng)照射激光，從而檢測測定對(duì)象物發(fā)出的熒光。
背景技術(shù)：
在醫(yī)療、生物領(lǐng)域中使用的流式細(xì)胞儀中裝有熒光檢測裝置，該裝置通過照射激 光，接收由測定對(duì)象物的熒光色素發(fā)出的熒光，以識(shí)別測定對(duì)象物的種類。具體來說，流式細(xì)胞儀通過熒光試劑對(duì)在緩沖液中含有細(xì)胞、DNA、RNA、酶、蛋白等 生物物質(zhì)而構(gòu)成測定對(duì)象物的混濁液實(shí)現(xiàn)標(biāo)記化，施加壓力以每秒IOm以內(nèi)程度的速度在 管路內(nèi)流動(dòng)的鞘液中使測定對(duì)象物流動(dòng)以形成層狀鞘液。通過對(duì)這種流動(dòng)中的測定對(duì)象物 照射激光，接受生物物質(zhì)的熒光色素發(fā)出的熒光，用該熒光作為標(biāo)記進(jìn)行識(shí)別來識(shí)別生物 物質(zhì)。在該流式細(xì)胞儀中，例如，計(jì)測細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA、酶、蛋白質(zhì)等在細(xì)胞內(nèi)相對(duì)量， 并能夠在短時(shí)間內(nèi)分析這些物質(zhì)的運(yùn)動(dòng)。另外，采用了細(xì)胞分選儀，其通過用熒光識(shí)別特定 類型的細(xì)胞或染色體，能夠在僅產(chǎn)生識(shí)別的細(xì)胞或染色體的狀態(tài)下，在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行選擇 收集。在其使用中，要求能夠在短時(shí)間內(nèi)從熒光的信息識(shí)別更多的測定對(duì)象物。在以下的專利文獻(xiàn)1中披露了熒光檢測裝置。在該熒光檢測裝置中，對(duì)從激光源 部射出的激光的強(qiáng)度進(jìn)行時(shí)間調(diào)制，并在生物物質(zhì)上照射該激光。接收此時(shí)從試劑發(fā)出的 熒光，以利用激光相對(duì)于調(diào)制信號(hào)的相位差信息計(jì)算出生物物質(zhì)發(fā)出的熒光的熒光松弛時(shí) 間。因此，能夠識(shí)別許多熒光的種類，并且，能夠以特別短的時(shí)間識(shí)別熒光信號(hào)。專利文獻(xiàn)1 特開2006-226698號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題上述專利文獻(xiàn)1的裝置雖然在生物物質(zhì)等發(fā)出的熒光的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的情況下， 能夠正確識(shí)別接收的熒光的種類，但是，其產(chǎn)生的問題為生物物質(zhì)等發(fā)出的熒光的發(fā)光區(qū) 域會(huì)受到限制，并且，在熒光強(qiáng)度較弱的情況下，不一定能夠正確地識(shí)別。例如，由于在預(yù)先測定熒光松弛時(shí)間已知的熒光色素發(fā)出的熒光的情況下，在熒 光強(qiáng)度較弱時(shí)，求得的熒光松弛時(shí)間與已知的熒光松弛時(shí)間會(huì)產(chǎn)生偏差，因此，會(huì)產(chǎn)生不能 正確識(shí)別的問題。此外，每當(dāng)生物物質(zhì)通過激光的照射位置時(shí)，均求出熒光松弛時(shí)間常數(shù)， 在以橫軸為求出的多個(gè)熒光松弛時(shí)間常數(shù)、縱軸為其頻率的頻率曲線中，以較寬的方式形 成頻率曲線的山形形狀，從而不能正確識(shí)別多個(gè)熒光。目前，大多采用的是將生物物質(zhì)中的限于極為狹小的局部區(qū)域作為熒光的發(fā)光區(qū) 域的生物物質(zhì)。在這種情況下，由于減小了生物物質(zhì)發(fā)出的熒光的發(fā)光區(qū)域，因此，熒光強(qiáng)度較弱。所以，以上述方式，熒光的正確識(shí)別會(huì)越發(fā)困難。因此，本發(fā)明的目的在于為了解決上述問題，提供了一種熒光檢測方法以及熒光 檢測裝置，該方法和裝置在通過照射激光檢測生物物質(zhì)等測定對(duì)象物發(fā)出的熒光時(shí)，與以 往相比，能夠正確計(jì)算出熒光松弛時(shí)間常數(shù)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了熒光檢測方法，在對(duì)在緩沖液中含有測定對(duì)象 物并流動(dòng)的流體的流動(dòng)，通過照射使用設(shè)定的頻率的調(diào)制信號(hào)并調(diào)制了光強(qiáng)度的激光，從 而受光裝置接收通過的測定對(duì)象物發(fā)出的熒光以檢測熒光時(shí)，其特征在于，具有第1步驟，在該步驟中，在測定對(duì)象物通過激光的照射位置時(shí)，收集上述受光裝置 接收的熒光的第1熒光信號(hào)；和第2步驟，在該步驟中，在上述測定對(duì)象物通過上述激光的 照射位置后，在激光的照射位置沒有上述測定對(duì)象物的狀態(tài)下，收集上述受光裝置接收的 熒光的第2熒光信號(hào)；和第3步驟，在該步驟中，使用上述第2熒光信號(hào)相對(duì)于上述調(diào)制信 號(hào)的第2相位差信息，調(diào)整上述第1熒光信號(hào)相對(duì)于上述調(diào)制信號(hào)的第1相位差，通過上述 調(diào)整從而求出測定對(duì)象物的發(fā)出的熒光的熒光信號(hào)相對(duì)于上述調(diào)制信號(hào)的第3相位差信 息，并從該求出的第3相位差信息中，求出測定對(duì)象物的發(fā)出的熒光的熒光松弛時(shí)間常數(shù)。此時(shí)，上述第1以及第2相位差信息優(yōu)選為由與上述調(diào)制信號(hào)同相的信號(hào)成分的 值與相對(duì)于上述調(diào)制信號(hào)存在90度相位差的信號(hào)成分的值構(gòu)成的數(shù)據(jù)。另外，上述第3相 位差信息優(yōu)選為在每個(gè)成分中從上述第1相位差信息的數(shù)據(jù)中扣除上述第2相位差信息的 數(shù)據(jù)所得的數(shù)據(jù)。另外，本發(fā)明提供了熒光檢測裝置，該裝置是通過對(duì)在緩沖液中含有測定對(duì)象物 并流動(dòng)的流體的流動(dòng)照射激光，從而檢測測定對(duì)象物發(fā)出的熒光的熒光檢測裝置，其特征 在于，具有激光光源部，其使用設(shè)定的頻率的調(diào)制信號(hào)并向上述流動(dòng)射出對(duì)光強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)制 的激光；和受光部，其是輸出通過激光的照射而發(fā)出的熒光的熒光信號(hào)；和計(jì)時(shí)檢測部，其 是檢知上述測定對(duì)象物通過激光照射位置的時(shí)間；和處理·分析部，其根據(jù)上述檢知的時(shí) 間，收集上述受光部接收的熒光的第1熒光信號(hào)，進(jìn)而，在上述測定粒子通過激光的照射位 置后的激光照射位置處沒有上述測定粒子的狀態(tài)下，收集上述受光部接收的熒光的第2熒 光信號(hào)，并使用上述第2熒光信號(hào)相對(duì)于上述調(diào)制信號(hào)的第2相位差信息，調(diào)整上述第1熒 光信號(hào)相對(duì)于上述調(diào)制信號(hào)的第1相位差，通過上述調(diào)整從而求出測定對(duì)象物發(fā)出的熒光 的熒光信號(hào)相對(duì)于上述調(diào)制信號(hào)的第3相位差信息，并從該所求出的第3相位差信息中，求 出測定對(duì)象物的發(fā)出的熒光的熒光松弛時(shí)間常數(shù)。此時(shí)，上述第1以及第2相位差信息優(yōu)選為由與上述調(diào)制信號(hào)同相的信號(hào)成分 的值與相對(duì)于上述調(diào)制信號(hào)存在90度相位差的信號(hào)成分的值構(gòu)成的數(shù)據(jù)。另外，上述處 理·分析部優(yōu)選通過在每個(gè)成分中，從上述第1相位差信息的數(shù)據(jù)中扣除上述第2相位差 信息的數(shù)據(jù)，求出上述第3相位差信息的數(shù)據(jù)。發(fā)明效果在本發(fā)明的熒光檢測方法以及熒光檢測裝置中，不僅測定對(duì)象物發(fā)出的熒光，而 且測定對(duì)象物通過激光的照射位置后的緩沖液發(fā)出的熒光均作為熒光檢測的檢測對(duì)象。其 原因在于在測定對(duì)象物的熒光比較弱的情況下，不能忽視緩沖液本身發(fā)出的熒光。在測定 對(duì)象物通過激光照射位置時(shí)所計(jì)測的熒光中，雖然除了測定對(duì)象物發(fā)出的熒光以外，還含有緩沖液本身發(fā)出的熒光，在本發(fā)明中，由于對(duì)于測定對(duì)象物通過激光的照射位置后的緩 沖液發(fā)出的熒光也進(jìn)行熒光的計(jì)測，因此，使用該計(jì)測結(jié)果，能夠準(zhǔn)確求出測定對(duì)象物發(fā)出 的熒光的相位差信息。因此，與以往相比，能夠正確、迅速計(jì)算出熒光松弛時(shí)間常數(shù)。
圖1為采用了本發(fā)明的熒光檢測裝置的流式細(xì)胞儀的概括結(jié)構(gòu)圖。 圖2為概括結(jié)構(gòu)圖，其顯示了采用本發(fā)明的熒光檢測裝置的激光源部的一個(gè)例




子。圖3為概括結(jié)構(gòu)圖，其顯示了在本發(fā)明的熒光檢測裝置中使用的受光部的一個(gè)例 子。
一個(gè)例子。
圖4為概括結(jié)構(gòu)圖，其顯示了在本發(fā)明的熒光檢測裝置中使用的控制·處理部的圖5為用于說明圖4所示的控制·處理部的IQ混合器的視圖。
圖6說明了由本發(fā)明的熒光檢測裝置進(jìn)行的熒光松弛時(shí)間常數(shù)
圖7顯示了熒光強(qiáng)度的時(shí)間變化的概括形式。
符號(hào)說明
10 流式細(xì)胞儀
12 試劑
20 信號(hào)處理裝置
22 激光光源部
22r R光源
22g G光源
22b B光源
23a1 23a2, 26b1,26b2,分光鏡
23c,26a透鏡組
24，26受光部
26c” 26c2, 26c3帶通濾波器
27a 27c光電轉(zhuǎn)換器
28控制·處理部
30管路
32回收容器
34r，34g，34b激光驅(qū)動(dòng)器
35,48,56能量分流器
40信號(hào)生成部
42信號(hào)處理部
44控制器
46發(fā)射器
50，52，54a，54b，54c，64 放大器
58a,58b,58cIQ混合器
62低頻濾波器
66A/D轉(zhuǎn)換器80
分析裝置
具體實(shí)施例方式下面，以適于采用實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的熒光檢測方法的本發(fā)明的熒光檢測裝置的流式細(xì) 胞儀為基礎(chǔ)進(jìn)行詳細(xì)說明。圖1為采用了由強(qiáng)度調(diào)制的激光形成的熒光檢測裝置的流式細(xì)胞儀10的概括結(jié) 構(gòu)圖。在以下說明的實(shí)施例中，雖然是以懸浮在緩沖液中的具有熒光色素的生物物質(zhì)M作 為測定對(duì)象物進(jìn)行說明的，但是，具備生物物質(zhì)M以外的規(guī)定的熒光色素，在緩沖液中同時(shí) 含有與生物物質(zhì)M形成生物結(jié)合的微粒以及生物物質(zhì)M，可以以生物物質(zhì)M以及微粒作為測 定對(duì)象物。流式細(xì)胞儀10具有信號(hào)處理裝置20，該裝置通過照射激光，照射試劑12，該試劑 12是懸浮在緩沖液中的發(fā)出熒光的生物物質(zhì)M構(gòu)成的，檢測出試劑12中的生物物質(zhì)M具備 的熒光色素發(fā)出的熒光的熒光信號(hào)以進(jìn)行信號(hào)處理；以及，分析裝置(計(jì)算機(jī))80，其用于 根據(jù)由信號(hào)處理裝置20獲得的處理結(jié)果進(jìn)行試劑12中的測定對(duì)象物的分析。信號(hào)處理裝置20具有激光源部22 ；和受光部24、26 ；和控制·處理部28，該控 制 處理部28含有為了用規(guī)定的調(diào)制頻率對(duì)從激光源部22發(fā)出的激光進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制而生 成調(diào)制信號(hào)的調(diào)制部，以及識(shí)別試劑12發(fā)出的熒光信號(hào)的信號(hào)處理部；和管路30，其是在 高速流形成的鞘液中使含有生物物質(zhì)M的緩沖液構(gòu)成的試劑12流動(dòng)，以形成流動(dòng)管。在管路30的出口設(shè)有回收容器32。在流式細(xì)胞儀10中也可以采用的結(jié)構(gòu)為為 了通過激光的照射在短時(shí)間內(nèi)識(shí)別并分離試劑12中的生物物質(zhì)M的細(xì)胞而配置分選儀，以 便在各個(gè)回收容器中進(jìn)行分離。激光源部22為射出波長不同的3種激光，例如λ i = 405nm, λ 2 = 533nm以及λ 3 =650nm等的激光的部分。設(shè)置透鏡組，以便使激光聚集在管路30中心規(guī)定的位置，從而 使激光在該聚集位置處形成試劑12的測定點(diǎn)。該測定點(diǎn)對(duì)應(yīng)本發(fā)明中的激光照射位置。圖2顯示了激光源部22的結(jié)構(gòu)的一個(gè)例子。激光源部22為射出具有350nm SOOnm的可視光范圍的波長并經(jīng)強(qiáng)度調(diào)制的激 光的部分。激光源部22具有R光源22r，其主要將紅色激光R作為CW(連續(xù)波)激光射出并 以規(guī)定的頻率調(diào)制該CW激光的強(qiáng)度；和G光源22g，其將綠色激光G作為CW (連續(xù)波)激光 射出并以規(guī)定的頻率調(diào)制該CW激光的強(qiáng)度；和B光源22b，其主要將藍(lán)色激光B作為CW(連 續(xù)波)激光射出并以規(guī)定的頻率調(diào)制該CW激光的強(qiáng)度。另外，激光源部22還具有分光鏡23ai，23a2，是透過特定波長范圍的激光并反射 其它波長范圍激光的分光鏡23a1; 23a2 ；和透鏡組23c，是使由激光R，G以及B構(gòu)成的激光聚 集在管路30中的測定點(diǎn)的透鏡組23c ；和激光驅(qū)動(dòng)器34r，34g以及34b，是分別驅(qū)動(dòng)R光源 22r，G光源22g以及B光源22b的激光驅(qū)動(dòng)器34r，34g以及34b ；和能量分流器35，是將供 給的信號(hào)分配給激光驅(qū)動(dòng)器34r，34g以及34b的能量分流器35。作為射出這些激光的光源，例如采用半導(dǎo)體激光。
激光例如為5 IOOmW程度的輸出。另一方面，調(diào)制激光強(qiáng)度的頻率(調(diào)制頻率) 的周期比激光松弛時(shí)間常數(shù)稍長一些，例如為10 50MHz。分光鏡23&1為透過激光R并反射激光G的分光鏡，分光鏡23a2為透過激光R和G 并反射激光B的分光鏡。通過這種結(jié)構(gòu)合成激光R，G和B，形成照射測試點(diǎn)的試樣12的照射光。R光源22r，G光源22g以及B光源22b以預(yù)定的波長帶域振蕩，以便激光R、G和 B激發(fā)熒光色素而發(fā)出特定的波長帶域的熒光。通過激光R、G和B激發(fā)的熒光色素附著在 進(jìn)行測定的生物物質(zhì)M上，在生物物質(zhì)M作為測定對(duì)象物通過管路30時(shí)，在測定點(diǎn)處受到 激光R、G和B的照射并以特定的波長發(fā)出熒光。進(jìn)而，在生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)之后，優(yōu)選 緊接在通過之后，在沒有生物物質(zhì)M的狀態(tài)下以一定時(shí)間對(duì)緩沖液照射激光，從而進(jìn)行緩 沖液發(fā)出的熒光的檢測。受光部24以夾持管路30并與激光源部22相對(duì)的方式設(shè)置，并設(shè)有光電變換器， 該光電變換器利用通過測定點(diǎn)的生物物質(zhì)M使激光向前方散射，從而輸出表示生物物質(zhì)M 通過測定點(diǎn)的檢測信號(hào)。從該受光部24輸出的信號(hào)供給至控制·處理部28，并且，在控 制·處理部28中作為獲知生物物質(zhì)M通過管路30中的測定點(diǎn)的定時(shí)的觸發(fā)信號(hào)。另外，在以生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)的時(shí)間為T，以生物物質(zhì)M的平均直徑為D，以 流過流動(dòng)管的生物物質(zhì)M的速度為V，以激光的測定點(diǎn)的輝點(diǎn)幅度為W時(shí)，時(shí)間T達(dá)到T = (D+W)/V。該時(shí)間T是已知的值。信號(hào)處理裝置20以由受光部24生成的觸發(fā)信號(hào)作為計(jì) 測開始的計(jì)時(shí)，開始熒光的檢測，并繼續(xù)進(jìn)行時(shí)間T的2倍的時(shí)間2 · T的間隔計(jì)測。所謂 計(jì)測，為在時(shí)間T期間，接收試劑12發(fā)出的熒光，以利用后面所述的控制·處理部28進(jìn)行 信號(hào)處理，并將相位差信息供給至分析裝置80。通過該計(jì)測，在生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)時(shí)， 收集受光部26接收的熒光的第1熒光信號(hào)，在生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)之后在測定點(diǎn)沒有生 物物質(zhì)M的僅有緩沖液的狀態(tài)下，能夠收集受光部26接收的熒光的第2熒光信號(hào)。另一方面，受光部26與從激光源部22射出的激光的射出方向垂直，并且，相對(duì)于 管路30中試劑12的移動(dòng)方向垂直布置，并設(shè)有光電轉(zhuǎn)換器，其用于接收由利用測定點(diǎn)照射 的試劑12發(fā)出的熒光。圖3為概括結(jié)構(gòu)圖，其顯示了受光部26的一個(gè)例子的概括的結(jié)構(gòu)。在圖3中所示的受光部26具有聚集來自試劑12中的生物物質(zhì)M的熒光信號(hào)的透 鏡組26a，和分光鏡26b1;26b2，和帶通濾波器26Cl 26c3，和光電子倍增管等的光電轉(zhuǎn)換器 27a 27c。透鏡組26a以使射入受光部26的熒光聚集在光電轉(zhuǎn)換器27a 27c的受光面上 的方式構(gòu)成。分光鏡26b1;26b2為反射具有規(guī)定范圍的波長帶域的熒光并使除此之外的熒光透 過的分光鏡。為了通過帶通濾波器26Cl 26c3進(jìn)行濾波并由光電轉(zhuǎn)換器27a 27c獲取 具有規(guī)定波長帶域的熒光，設(shè)定分光鏡26b1;26b2的反射波長帶域以及透過波長帶域。帶通濾波器26Cl 26c3為設(shè)置在各個(gè)光電轉(zhuǎn)換器27a 27c的受光面的前面并 僅透過具有規(guī)定波長帶域的熒光的濾波器。對(duì)應(yīng)熒光色素的發(fā)出的熒光的波長帶域設(shè)定透 過的熒光的波長帶域。光電轉(zhuǎn)換器27a 27c為設(shè)有例如帶有光電子倍增管的傳感器并將由光電面接收的光轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的傳感器。此處，由于接收的熒光作為相對(duì)于激光的調(diào)制信號(hào)具有相位 差信息的光信號(hào)被接收，因此，輸出的電信號(hào)形成具有相位差信息的熒光信號(hào)。該熒光信號(hào) 由增幅器增幅并被供給至控制·處理部28。如圖4所示，控制 處理部28具有信號(hào)生成部40、和信號(hào)處理部42和控制器44。 信號(hào)生成部40和控制器44形成產(chǎn)生規(guī)定頻率的調(diào)制信號(hào)的光源控制部?？刂?處理部28 對(duì)應(yīng)于本發(fā)明中的第1熒光信號(hào)以及第2熒光信號(hào)的收集部分。信號(hào)生成部40為生成以規(guī)定的頻率調(diào)制(振幅調(diào)制)激光強(qiáng)度的調(diào)制信號(hào)的部 分。具體來說，信號(hào)生成部40具有振蕩器46、能量分流器48以及放大器50，52，該信 號(hào)生成部為在將所生成的調(diào)制信號(hào)供給至激光源部22的能量分流器35的同時(shí)，將其供給 至信號(hào)處理部42的部分。將調(diào)制信號(hào)供給至信號(hào)處理部42的原因如后面所述，將從光電 轉(zhuǎn)換器27a 27c輸出的熒光信號(hào)(第1熒光信號(hào)、第2熒光信號(hào))用作用于檢波的參考 信號(hào)。另外，調(diào)制信號(hào)為具有規(guī)定頻率的正弦波信號(hào)，并以范圍10 50MHz的頻率被設(shè)定。信號(hào)處理部42為使用從光電轉(zhuǎn)換器27a 27c輸出的熒光信號(hào)，通過激光的照 射處理含有試劑12發(fā)出的熒光的相位差信息的信號(hào)的部分。信號(hào)處理部42具有放大器 54a 54c，其使從光電轉(zhuǎn)換器27a 27c輸出的熒光信號(hào)增幅；和能量分流器56，其用于 分配從信號(hào)生成部40供給各個(gè)被增幅的熒光信號(hào)的作為正弦波信號(hào)的調(diào)制信號(hào)；和IQ混 合器58a 58c，這些混合器以該調(diào)制信號(hào)作為參照信號(hào)并使其與被增幅的熒光信號(hào)合成。IQ混合器58a 58c為將從光電轉(zhuǎn)換器27a 27c供給的熒光信號(hào)，從信號(hào)生成 部40供給的調(diào)制信號(hào)作為參考信號(hào)進(jìn)行合成的裝置。具體來說，如圖5所示，各個(gè)IQ混合 器58a 58c使參考信號(hào)與熒光信號(hào)(RF信號(hào))相乘以計(jì)算出含有熒光信號(hào)的cos成分 (與參考信號(hào)同相位的信號(hào)成分)和高頻率成分的處理信號(hào)，同時(shí)，將使參考信號(hào)的相位90 度偏移的信號(hào)與熒光信號(hào)相乘，以計(jì)算出含有熒光信號(hào)的sin成分(相對(duì)于參考信號(hào)存在 90度相位差的信號(hào)成分)和高頻成分的處理信號(hào)。將含有該cos成分的處理信號(hào)以及含有 sin成分的處理信號(hào)供給至控制器44?？刂破?4以由信號(hào)生成部40生成的規(guī)定頻率的調(diào)制信號(hào)(正弦波信號(hào))的方式 實(shí)施控制，進(jìn)而，從含有利用信號(hào)處理部42求出的熒光信號(hào)的cos成分的值以及sin成分 的值的處理信號(hào)除去高頻成分，從而求出熒光信號(hào)的cos成分的值以及sin成分的值。具體地說，控制器44具有系統(tǒng)控制器60，其提供用以控制信號(hào)處理部20中各個(gè) 部分的動(dòng)作的指令，同時(shí)，管理流式細(xì)胞儀10的整個(gè)動(dòng)作；和低頻濾波器62，其用于從由信 號(hào)處理部42運(yùn)算出的cos成分和sin成分相加高頻成分所得的處理信號(hào)中除去高頻成分； 和放大器64，其使除去高頻成分的cos成分和sin成分的處理信號(hào)增幅；和A/D轉(zhuǎn)換器66， 其對(duì)被增幅的處理信號(hào)采樣。系統(tǒng)控制器60為了進(jìn)行激光的強(qiáng)度調(diào)制，規(guī)定了振蕩器46的振蕩頻率。控制器44通過低頻濾波器62進(jìn)行濾波處理并且由放大器64使除去了高頻信號(hào) 的COS成分和Sin成分的值增幅，進(jìn)而，通過用A/D轉(zhuǎn)換器66進(jìn)行采樣，從而將被數(shù)字化的 cos成分和sin成分的處理信號(hào)供給至分析裝置80。分析裝置80為求出生物物質(zhì)M發(fā)出的熒光的熒光松弛時(shí)間常數(shù)(熒光松弛時(shí)間) 并根據(jù)熒光松弛時(shí)間常數(shù)識(shí)別試劑12中生物物質(zhì)M的熒光種類的部分。使附著了規(guī)定熒光色素的微粒含在試劑12中，也可以研究生物物質(zhì)M是否進(jìn)行生物結(jié)合等的生物物質(zhì)M的 特性。另外，分析裝置80形成本發(fā)明中計(jì)算出熒光松弛時(shí)間常數(shù)的處理部并由計(jì)算機(jī) 構(gòu)成。生物物質(zhì)M發(fā)出的熒光的熒光松弛時(shí)間常數(shù)的計(jì)算是利用懸浮在緩沖液中的生 物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)時(shí)發(fā)出的熒光的第1熒光信號(hào)相對(duì)于調(diào)制信號(hào)的相位差信息，以及緊 接在生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)后緩沖液發(fā)出的熒光的第2熒光信號(hào)的相位差信息進(jìn)行的。如上所述，基于由受光部24生成的觸發(fā)信號(hào)開始計(jì)測，繼續(xù)進(jìn)行生物物質(zhì)M通過 測定點(diǎn)的時(shí)間T的2倍的時(shí)間2 · T的間隔計(jì)算。因此，從計(jì)測開始直至最初的時(shí)間T，檢 測懸浮在緩沖液中的生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)時(shí)的熒光，在時(shí)間T 時(shí)間2 · T，檢測緊接生 物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)后的緩沖液發(fā)出的熒光。因此，供給至分析裝置80的cos成分和sin 成分的處理信號(hào)含有從計(jì)算開始至最初時(shí)間T的熒光的相位差信息，即緩沖液和生物物質(zhì) M發(fā)出的熒光的相位差信息；以及，直至?xí)r間T 時(shí)間2 ·Τ的熒光的相位差信息，即緩沖液 發(fā)出的熒光的相位差信息。生物物質(zhì)M發(fā)出的熒光的熒光松弛時(shí)間常數(shù)的計(jì)算，具體地說，從控制器44供給 的上述cos成分的值和Sin成分的值形成向量成分的計(jì)測向量用作含有相位差信息的數(shù)據(jù) 進(jìn)行使用。關(guān)于該計(jì)測向量，將懸浮在緩沖液中的生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)時(shí)的第1熒光信 號(hào)的計(jì)測向量作為Pms，將在緊接生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)之后的緩沖液發(fā)出熒光時(shí)的第2熒 光信號(hào)的計(jì)測向量作為Pmb，將由生物物質(zhì)M發(fā)出的熒光的cos成分的值和sin成分的值構(gòu) 成的生物物質(zhì)M的向量作為Ps，此時(shí)，由Ps = Pms-Pmb表示該計(jì)測向量。在圖6中，顯示了計(jì) 測向量Pms，Pmb與生物物質(zhì)M的向量Ps的關(guān)系。在圖6所示的視圖中，在橫軸采用激光調(diào)制 信號(hào)的cos成分(實(shí)數(shù)部分)的值(振幅)，在縱軸采用了 sin成分(虛數(shù)部分)的值(振 幅)。S卩，本發(fā)明中的相位差信息形成由與調(diào)制信號(hào)同相的信號(hào)成分(cos成分)的值與相 對(duì)于調(diào)制信號(hào)存在90度相位差的信號(hào)成分(sin成分)的值構(gòu)成的數(shù)據(jù)。實(shí)際上，在生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)時(shí)從試劑12發(fā)出的熒光含有生物物質(zhì)M發(fā)出的 熒光和緩沖液發(fā)出的熒光。因此，在分析裝置80中，在這些熒光混合的狀態(tài)下，由受光部26 接收熒光。所以，用分析裝置80獲得的計(jì)測向量Pms含有生物物質(zhì)M發(fā)出的熒光的熒光信 號(hào)的cos成分的值和sin的值，和緩沖液發(fā)出的熒光的熒光信號(hào)的cos成分的值和sin的 值。因此，通過從計(jì)測向量Pms中扣除緊接在生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)后緩沖液發(fā)出的熒光的 熒光信號(hào)的cos成分的值和sin成分的值構(gòu)成的計(jì)測向量Pmb，能夠計(jì)算出生物物質(zhì)M發(fā)出 的熒光向量Ps。即，通過按每一成分從計(jì)測向量Pms中的cos成分的值，sin成分的值扣除 計(jì)測向量Pmb中的cos成分的值和sin成分的值，計(jì)算生物物質(zhì)M發(fā)出的熒光的向量Ps。在生物物質(zhì)M的熒光較弱的情況下，形成背景成分并在生物物質(zhì)M的熒光的熒光 信號(hào)中所含的緩沖液發(fā)出的熒光是不能忽視的。在本實(shí)施例中，在緊接生物物質(zhì)M通過測 定點(diǎn)之后的一定時(shí)期(時(shí)間T 時(shí)間2 ·Τ的時(shí)期)，例如，以與生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)的時(shí) 間T相同的時(shí)間長度，通過計(jì)算緩沖液發(fā)出的熒光，如上所述，計(jì)算出生物物質(zhì)M發(fā)出的熒 光的向量Ps。圖7為顯示試劑12發(fā)出的熒光的熒光強(qiáng)度的時(shí)間變化的圖表。圖7中的區(qū) 域R1為生物物質(zhì)M發(fā)出的熒光與緩沖液發(fā)出的熒光混合的區(qū)域。另一方面，區(qū)域R、2為僅 存在緩沖液發(fā)出的熒光的區(qū)域。這樣，將從受光部24輸出的觸發(fā)信號(hào)的生成作為計(jì)測的開始計(jì)時(shí)以進(jìn)行計(jì)測開始 時(shí)間T之間的區(qū)域R1的計(jì)測，之后立刻進(jìn)行區(qū)域R、2的計(jì)測。另 外，按每一由光電轉(zhuǎn)換器27a 27c獲得的熒光信號(hào)進(jìn)行向量Ps的計(jì)算。分析裝置80根據(jù)以此方式求出的生物物質(zhì)M發(fā)出的熒光的向量Ps求出熒光松弛 時(shí)間常數(shù)(熒光松弛時(shí)間)，熒光松弛時(shí)間常數(shù)是使用每當(dāng)生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)時(shí)供給的 計(jì)測向量Pms，Pmb計(jì)算出的。因此，在分析裝置80中，制作表示計(jì)算出的熒光松弛時(shí)間常數(shù) 的頻率的頻率圖，對(duì)熒光松弛時(shí)間常數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以求出熒光松弛時(shí)間常數(shù)的平均值 以及分散。因此，能夠識(shí)別生物物質(zhì)M發(fā)出的熒光。另外，熒光松弛時(shí)間常數(shù)的計(jì)算方法取決于熒光色素發(fā)出的熒光的熒光松弛時(shí)間 常數(shù)，例如，在1次松弛過程中表示熒光的情況下，根據(jù)以下公式計(jì)算。τ = 1/ω · tan θ s此處，θ s為計(jì)算出的向量Ps中相對(duì)于cos成分的軸的傾斜角度(參見圖6)， ω為激光的調(diào)制信號(hào)的頻率，τ為熒光松弛時(shí)間常數(shù)。熒光松弛時(shí)間常數(shù)τ為若將脈 沖照射激光時(shí)的初期熒光強(qiáng)定為Itl,則從該時(shí)刻至熒光強(qiáng)度達(dá)到Ic/ek為自然對(duì)數(shù)的底， e與2.71828)的時(shí)刻的時(shí)間。以上述方式構(gòu)成流式細(xì)胞儀10。這種流式細(xì)胞儀10的信號(hào)處理裝置20首選根據(jù)控制器44發(fā)出的指示，由發(fā)射器 46產(chǎn)生規(guī)定頻率的調(diào)制信號(hào)，該信號(hào)由放大器50增幅并被供給至激光源部22以及信號(hào)處 理部42。在這種狀態(tài)下，試劑12流過管路30，從而形成流體。流體例如在100 μ m的流動(dòng)路 徑中具有ι IOm/秒的流速。若對(duì)通過測定點(diǎn)的生物物質(zhì)M照射激光，則將在受光部24檢測生物物質(zhì)M的通過 的檢測信號(hào)作為觸發(fā)信號(hào)輸出至控制器44。在控制器44，將該檢測信號(hào)作為觸發(fā)信號(hào)，將計(jì)測開始的指示信號(hào)供給至各個(gè)部 分。由于從激光源部22射出的激光用于在測定點(diǎn)處激勵(lì)試劑12中的熒光色素，通過 該激光照射，熒光色素產(chǎn)生熒光并由受光部26接收。因?yàn)榧す庖砸?guī)定的頻率調(diào)制強(qiáng)度，因 此，熒光也與其對(duì)應(yīng)，以規(guī)定的頻率調(diào)制熒光強(qiáng)度。從由這種激光照射發(fā)出的熒光色素產(chǎn)生的熒光相對(duì)于調(diào)制了激光強(qiáng)度的調(diào)制信 號(hào)，具有相位差的信息。此時(shí)，在生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)的數(shù)μ 數(shù)10μ秒期間，以規(guī)定頻率進(jìn)行振幅調(diào) 制的激光照射在生物物質(zhì)M上。激光的調(diào)制頻率例如為10 50MHz。在生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)的計(jì)測開始 時(shí)間T的期間，進(jìn)行熒光的計(jì)測，即圖7所 示的區(qū)域R1的計(jì)測并獲得第1熒光信號(hào)，緊接在經(jīng)過時(shí)間T之后，進(jìn)而進(jìn)行時(shí)間T的間隔、 熒光差別的計(jì)測，即進(jìn)行圖7所示的區(qū)域R2的計(jì)測，從而獲得第2熒光信號(hào)。通過受光部26的光電轉(zhuǎn)換器27a 27c接收并輸出的第1，第2熒光信號(hào)由放大 器54a 54c增幅，通過IQ混合器58a 58c，與從信號(hào)生成部40供給的正弦波信號(hào)即調(diào) 制信號(hào)合成。在IQ混合器58a 58c中，生成作為正弦波信號(hào)的調(diào)制信號(hào)(參照信號(hào))與第1、 第2熒光信號(hào)相乘所得的合成信號(hào)，同時(shí)，生成使相對(duì)于作為正弦波信號(hào)的調(diào)制信號(hào)(參照信號(hào))相位偏移90度的信號(hào)與熒光信號(hào)相乘合成的信號(hào)。接著，將相對(duì)于第1熒光信號(hào)生成的2個(gè)合成信號(hào)輸送至控制器44的低頻濾波器 62，除去高頻成分，取出第1熒光信號(hào)的cos成分和sin成分。使該第1熒光信號(hào)的cos成 分和sin成分的信號(hào)增幅，對(duì)其進(jìn)行A/D轉(zhuǎn)換并將其輸送至分析裝置80。A/D轉(zhuǎn)換在從受 光部24發(fā)出的觸發(fā)信號(hào)的時(shí)刻同期進(jìn)行，并進(jìn)行取樣。同樣，將相對(duì)于第2熒光信號(hào)生成的2個(gè)合成信號(hào)輸送至控制器44的低頻濾波器 62，除去高頻成分，取出第2熒光信號(hào)的cos成分和sin成分。使該第2熒光信號(hào)的cos成 分和sin成分的信號(hào)增幅，對(duì)其進(jìn)行A/D轉(zhuǎn)換并將其輸送至分析裝置80。從光電轉(zhuǎn)換器27a 27c供給通過計(jì)測獲得的第1，第2熒光信號(hào)，在工作時(shí)間進(jìn) 行這種信號(hào)處理，并逐次對(duì)分析裝置80供給信號(hào)處理后的cos成分的值和sin成分的值。在分析裝置80中，在逐次收集所供給的cos成分的值和sin成分的值之后，求出 使用該COS成分的值和Sin成分的值計(jì)算出的區(qū)域R1的計(jì)測向量Pms的平均值與區(qū)域R2的 計(jì)測向量Pmb的平均值的差分，從而求出生物物質(zhì)M的向量Pm。在分析裝置80中，進(jìn)而，使 用該向量？111，根據(jù)公式τ = 1/ω · tan θ 3求出熒光松弛時(shí)間常數(shù)τ。這樣，在本實(shí)施例中，緊接在計(jì)測生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)時(shí)的熒光之后，也計(jì)測緩 沖液發(fā)出的熒光，并使用這些計(jì)測結(jié)果的信息計(jì)算熒光松弛時(shí)間常數(shù)。因此，能夠正確、并 有效地計(jì)算出生物物質(zhì)M的熒光的熒光松弛時(shí)間常數(shù)。還存在的方法為每當(dāng)生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)時(shí)，不進(jìn)行由緩沖液發(fā)出的熒光的 計(jì)測，并預(yù)先計(jì)測從緩沖液發(fā)出的熒光的熒光松弛時(shí)間常數(shù)以將其存儲(chǔ)保存在分析裝置80 中，根據(jù)生物物質(zhì)M通過測定點(diǎn)時(shí)的熒光的計(jì)測結(jié)果以及從在分析裝置80中存儲(chǔ)的緩沖液 發(fā)出的熒光的熒光松弛時(shí)間，運(yùn)算出生物物質(zhì)M的熒光的熒光松弛時(shí)間。可是，在一定時(shí)期存在多種、大量應(yīng)計(jì)測的試劑12，并且，在緩沖液的種類不同的 情況下，用上述方法是不能迅速應(yīng)對(duì)的。另外，在導(dǎo)入熒光蛋白液的細(xì)胞等存在于培養(yǎng)基 中，并使其稀釋以形成試劑12的情況下，由于通過稀釋的程度，在試劑12中所含的培養(yǎng)基 的量變化，緩沖液發(fā)出的熒光松弛時(shí)間也變化，因此，上述方法不能應(yīng)對(duì)。進(jìn)而，由于生物物 質(zhì)M通過其生物體活動(dòng)，緩沖液的成分也變化，緩沖液發(fā)出的熒光松弛時(shí)間也變化，因此， 上述方法不能應(yīng)對(duì)。本實(shí)施例能夠消除這種不良情況，從而能夠迅速、正確地計(jì)算出熒光松弛時(shí)間常數(shù)。在本實(shí)施例中，求出計(jì)測向量Pms以及Pmb的方法代替在信號(hào)處理部42以及控制器 44中的上述處理方法，將激光的調(diào)制信號(hào)作為輸入信號(hào)，使用頻率分析器求出將從IQ混合 器58a 58c輸出的處理信號(hào)作為應(yīng)答信號(hào)的傳遞函數(shù)的頻譜數(shù)向量，求出該頻譜數(shù)向量 中的實(shí)數(shù)部的值以及虛數(shù)部的值，以此時(shí)的DC成分的實(shí)數(shù)部的值以及虛數(shù)部的值作為計(jì) 測向量Pms，Pfflb的向量成分，求出生物物質(zhì)M發(fā)出的熒光的向量Ps = Pms-Pmb,從而也能夠計(jì) 算出熒光松弛時(shí)間常數(shù)。雖然上面對(duì)本發(fā)明的熒光檢測方法以及熒光檢測裝置進(jìn)行詳細(xì)說明，但是，本發(fā) 明不應(yīng)限定上述實(shí)施例，在不脫離本發(fā)明的主要思想的范圍下，也可以進(jìn)行各種改進(jìn)和變 化。
權(quán)利要求
熒光檢測方法，對(duì)在緩沖液中含有測定對(duì)象物并流動(dòng)的流體的流動(dòng)，照射使用設(shè)定的頻率的調(diào)制信號(hào)并調(diào)制了光強(qiáng)度的激光，通過上述照射從而受光裝置接收通過的測定對(duì)象物發(fā)出的熒光，以檢測熒光時(shí)，其特怔在于，具有第1步驟，在該步驟中，在測定對(duì)象物通過激光的照射位置時(shí)，收集上述受光裝置接收的熒光的第1熒光信號(hào)；和第2步驟，在該步驟中，在上述測定對(duì)象物通過上述激光的照射位置后，在激光的照射位置沒有上述測定對(duì)象物的狀態(tài)下，收集上述受光裝置接收的熒光的第2熒光信號(hào)；和第3步驟，在該步驟中，使用上述第2熒光信號(hào)相對(duì)于上述調(diào)制信號(hào)的第2相位差信息，調(diào)整上述第1熒光信號(hào)相對(duì)于上述調(diào)制信號(hào)的第1相位差，通過上述調(diào)整從而求出測定對(duì)象物的發(fā)出的熒光的熒光信號(hào)相對(duì)于上述調(diào)制信號(hào)的第3相位差信息，并從該求出的第3相位差信息中，求出測定對(duì)象物的發(fā)出的熒光的熒光松弛時(shí)間常數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光檢測方法，上述第1以及第2相位差信息為由與上述調(diào) 制信號(hào)同相的信號(hào)成分的值和相對(duì)于上述調(diào)制信號(hào)存在90度相位差的信號(hào)成分的值構(gòu)成 的數(shù)據(jù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光檢測方法，上述第3相位差信息為在每個(gè)成分中從上述 第1相位差信息的數(shù)據(jù)中扣除上述第2相位差信息的數(shù)據(jù)所得的數(shù)據(jù)。
4.熒光檢測裝置，該裝置是通過對(duì)在緩沖液中含有測定對(duì)象物并流動(dòng)的流體的流動(dòng)照 射激光，從而檢測測定對(duì)象物發(fā)出的熒光的熒光檢測裝置，其特征在于，具有激光光源部，其使用設(shè)定的頻率的調(diào)制信號(hào)并向上述流動(dòng)射出對(duì)光強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)制的激 光；和受光部，其輸出通過激光的照射發(fā)出的熒光的熒光信號(hào)；計(jì)時(shí)檢測部，測知上述測定對(duì)象物通過激光照射位置的時(shí)間；處理·分析部，其根據(jù)上述測知的時(shí)間，收集上述受光部接收的熒光的第1熒光信號(hào)， 進(jìn)而，在通過激光的照射位置后的激光照射位置處沒有上述測定粒子的狀態(tài)下，收集上述 受光部接收的熒光的第2熒光信號(hào)，并使用上述第2熒光信號(hào)相對(duì)于上述調(diào)制信號(hào)的第2 相位差信息，調(diào)整上述第1熒光信號(hào)相對(duì)于上述調(diào)制信號(hào)的第1相位差，通過上述調(diào)整從而 求出測定對(duì)象物發(fā)出的熒光的熒光信號(hào)相對(duì)于上述調(diào)制信號(hào)的第3相位差信息，并從該所 求出的第3相位差信息中，求出測定對(duì)象物的發(fā)出的熒光的熒光松弛時(shí)間常數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的熒光檢測裝置，上述第1以及第2相位差信息為由與上述調(diào) 制信號(hào)同相的信號(hào)成分的值和相對(duì)于上述調(diào)制信號(hào)存在90度相位差的信號(hào)成分的值構(gòu)成 的數(shù)據(jù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光檢測裝置，其特征在于上述處理·分析部通過從上述 第1相位差信息的數(shù)據(jù)中在每個(gè)成分中扣除上述第2相位差信息的數(shù)據(jù)，求出上述第3相 位差信息的數(shù)據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明提供了熒光檢測方法以及熒光檢測裝置，該方法和裝置通過在照射激光以檢測測定對(duì)象物發(fā)出的熒光時(shí)，與以往相比，能夠正確計(jì)算出熒光松弛時(shí)間常數(shù)。其中，在測定對(duì)象物通過以規(guī)定頻率的調(diào)制信號(hào)調(diào)制光強(qiáng)度的激光的照射位置時(shí)，收集受光裝置接收的熒光的第1熒光信號(hào)。進(jìn)而，在測定對(duì)象物通過激光的照射位置后，在激光的照射位置沒有測定對(duì)象物的狀態(tài)下，收集受光裝置接收的熒光的第2熒光信號(hào)。使用收集的第1熒光信號(hào)和第2熒光信號(hào)，求出測定對(duì)象物的發(fā)出的熒光的熒光信號(hào)相對(duì)于調(diào)制信號(hào)的相位差信息，并從所求出的測定對(duì)象物發(fā)出的熒光的熒光信號(hào)的相位差信息中，求出測定對(duì)象物的熒光松弛時(shí)間常數(shù)。
文檔編號(hào)G01N15/14GK101960289SQ20098010775
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2009年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月4日
發(fā)明者中田成幸, 星島一輝, 林弘能 申請(qǐng)人:三井造船株式會(huì)社