一種生物大分子微膠囊產(chǎn)品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種生物大分子微膠囊的制備方法，涉及到酵母細(xì)胞的培養(yǎng)、處理、微膠囊制備及封孔的方法，更進(jìn)一步涉及通過(guò)該方法所制備的生物微膠囊壁材和生物大分子微膠囊產(chǎn)品。
【背景技術(shù)】
[0002]微膠囊作為一項(xiàng)能夠改善功能性物質(zhì)性能的新技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。酵母細(xì)胞大小均勻，容易培養(yǎng)，價(jià)廉，其細(xì)胞壁和細(xì)胞膜構(gòu)成的雙層囊腔結(jié)構(gòu)，是包埋物質(zhì)的良好材料。法國(guó)專(zhuān)利FR2179528報(bào)道了工業(yè)用酵母經(jīng)過(guò)質(zhì)壁分離劑處理后，包埋了氯化釹、氯化鎂和洋蔥提取物；美國(guó)專(zhuān)利USA 4001480介紹了一種利用在低氮高碳源培養(yǎng)基上培養(yǎng)的脂肪含量高達(dá)40?60%的酵母細(xì)胞包埋油溶性化合物的方法；專(zhuān)利EP-0085805A1利用一種既能溶于油又能溶于水的公共溶劑，找到了一種以脂肪含量高于10%的酵母菌制備微膠囊的方法；而專(zhuān)利EP 0242135A2采用將酵母細(xì)胞放在含有囊心的濃溶液或分散液中溶脹，在室溫條件下攪拌進(jìn)行擴(kuò)散滲透的方法，提供了一種脂肪含量低于10%的酵母細(xì)胞作為微膠囊壁材而無(wú)需公共溶劑的微膠囊化方法。EP 0414282A1和0414283A1提供了一種將漂白劑和紡織柔軟劑中的芳香類(lèi)物質(zhì)包埋于酵母細(xì)胞中的方法。WO 93/11869則先用H2O2除臭后再制成了液體漂白催化劑的微膠囊。WO 94/22572公開(kāi)了一種先將待包埋物質(zhì)的溶液進(jìn)入到細(xì)胞中，然后通過(guò)物理或化學(xué)方法使待包埋物殘留其中的制備生物微膠囊的方法。2000年成立的Fluid Technologies Plc.公司專(zhuān)門(mén)生產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的酵母微膠囊，日本也開(kāi)發(fā)成功了油脂的酵母微膠囊產(chǎn)品。
[0003]專(zhuān)利號(hào)為ZL2007101375531的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利提供一種制備安全無(wú)毒性能優(yōu)良的微膠囊壁材的方法。通過(guò)對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行改性后所制備的微膠囊壁材既可用于脂溶性物質(zhì)的包埋，又能用于水溶性小分子物質(zhì)的微膠囊化。專(zhuān)利號(hào)為ZL2007101375527中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)了一種小分子抗氧化劑生物微膠囊的制備方法，不僅制備過(guò)程簡(jiǎn)便，而且在包埋過(guò)程中不會(huì)發(fā)生化學(xué)變化。
[0004]上述專(zhuān)利文獻(xiàn)均是以酵母細(xì)胞為壁材對(duì)小分子物質(zhì)進(jìn)行了成功包埋。但只有流體力學(xué)半徑(Rh)小于0.81nm(或分子量低于620Da)的物質(zhì)以及分子量低于400kDa的球形蛋白能夠自由通過(guò)酵母細(xì)胞壁，而質(zhì)膜卻限制了 Rh大于0.42nm或分子量高于IlODa的物質(zhì)的穿越?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中還未見(jiàn)利用酵母細(xì)胞來(lái)制備生物大分子如多肽蛋白類(lèi)藥物微膠囊的方法。
[0005]多肽蛋白類(lèi)藥物具有活性高、特異性強(qiáng)、毒性低等特點(diǎn)，可有效治療癌癥、自身免疫性疾病及高血壓等疑難病，但其口服生物利用度通常低于I %，其常規(guī)給藥方式均以注射為主。將多肽蛋白類(lèi)藥物制成酵母細(xì)胞微膠囊后，不僅能有效防止藥物在體內(nèi)快速降解，提高藥物的穩(wěn)定性，而且還能提高治療的有效性和安全性，降低成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的技術(shù)原理是通過(guò)化學(xué)處理將酵母細(xì)胞內(nèi)部空化后，在高溫下使酵母細(xì)胞本身的水解酶系失活，再重新懸浮在氫氧化鈉溶液中進(jìn)行振蕩處理24-48小時(shí)后，與生物大分子溶液高頻度接觸，使生物大分子通過(guò)擴(kuò)散或滲透進(jìn)入到酵母細(xì)胞中制得生物大分子酵母細(xì)胞微膠囊。進(jìn)一步采用陽(yáng)離子聚合物進(jìn)行封孔，可以得到緩釋性能更佳的生物大分子酵母細(xì)胞微膠囊產(chǎn)品。
[0007]因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種制備適于生物大分子包封的生物微膠囊壁材的方法，包括:
[0008](I)采用酵母細(xì)胞為出發(fā)菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)；
[0009](2)將所得的酵母細(xì)胞離心，洗滌后，重新懸浮在具有促進(jìn)酵母細(xì)胞自溶的化學(xué)試劑中，在40?60°C的溫度下進(jìn)行振蕩處理24?48小時(shí)后，升溫至85°C進(jìn)行滅酶處理5?20分鐘。離心、洗滌后凍干或再在20?40°C下用氫氧化鈉溶液進(jìn)一步處理24?48小時(shí)，離心、洗滌后，冷凍干燥，即得到所述的生物微膠囊壁材。其中所述的化學(xué)試劑任一選自吐溫-80或TritonX-100、溴化十六烷基三甲基銨、十二烷基硫酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、氯化鉀及氯化鈉。
[0010]應(yīng)當(dāng)指出:加入化學(xué)試劑的作用在于促進(jìn)酵母細(xì)胞自溶，如果加入高濃度的化學(xué)試劑則反應(yīng)時(shí)間更短，如果加入低濃度的化學(xué)試劑則反應(yīng)時(shí)間更長(zhǎng)。因此在合適的濃度范圍內(nèi)，加入不同濃度的化學(xué)試劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以通過(guò)控制時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)達(dá)到預(yù)期效果。
[0011]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的吐溫-80的加入重量為0.1?5% ;或
[0012]所述的TritonX-1OO的加入重量為0.1?5% ;或
[0013]所述的溴化十六烷基三甲基銨的加入重量為0.1?5% ;或
[0014]所述的十二烷基硫酸鈉的加入重量為0.1?5% ;
[0015]所述的鹽酸的加入重量為0.5?10% ;或
[0016]所述的氫氧化鈉的加入重量為0.5?10% ;或
[0017]所述的乙醇的加入重量為I?20% ;或
[0018]所述的氯化鈉的加入重量為I?20% ;或
[0019]所述的氯化鉀的加入重量為I?20%。
[0020]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，搖瓶培養(yǎng)的步驟如下:斜面種子活化4小時(shí)后接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)后再按10%的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間24小時(shí)，發(fā)酵溫度28-32°C，轉(zhuǎn)速180r/min。
[0021]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞處理的步驟如下:培養(yǎng)的酵母細(xì)胞離心、洗滌后，重新懸浮于0.1?20%的化學(xué)試劑中，在40?60°C下處理24?48小時(shí)，離心、洗滌后，冷凍干燥。
[0022]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞處理的步驟如下:培養(yǎng)的酵母細(xì)胞離心、洗滌后，重新懸浮于0.1?20 %的化學(xué)試劑中，在40?60 °C下處理24?48小時(shí)后，升溫至85 °C進(jìn)行滅酶處理5?20分鐘。離心、洗滌后，冷凍干燥。
[0023]還在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞處理的步驟如下:培養(yǎng)的酵母細(xì)胞離心、洗滌后，重新懸浮在0.1?20%的化學(xué)試劑中，在40?60°C下處理24?48小時(shí)后，升溫至85°C進(jìn)行滅酶處理5?20分鐘。離心、洗滌后，再在20?40°C下以0.1?10%的氫氧化鈉處理24?48小時(shí)，離心、洗滌后，冷凍干燥，即得到所述的生物微膠囊壁材。
[0024]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的菌株為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeHan.)，斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基為高糖培養(yǎng)基，組成為:蔗糖、酵母浸出物、無(wú)機(jī)氮源采用中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化，再補(bǔ)充必要的礦物質(zhì)。
[0025]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為YPD培養(yǎng)基，組成如下:蛋白胨20.0g、酵母提取物10.0g、葡萄糖10.0g、添水至lOOOmL，pH4_5。
[0026]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為產(chǎn)脂培養(yǎng)基，組成如下:蛋白胨3.0g、酵母提取物8.0g、鹿糖170.0g、添水至1000mL。
[0027]還在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基都為豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基，配制如下:取黃豆芽200.0g，洗凈，放入水中煮沸30min，用紗布過(guò)濾，取豆芽汁加蔗糖30.0g,添水至 100mL,調(diào)節(jié) pH = 7.2。
[0028]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供利用所制備的生物微膠囊壁材制備生物大分子酵母細(xì)胞微膠囊的方法，包括:
[0029]步驟(1)-(2)，與前述相同；
[0030](3)將凍干后的酵母細(xì)胞微膠囊壁材與生物大分子溶液在20?40°C下高頻度接觸24?48小時(shí)制備生物大分子酵母細(xì)胞微膠囊。
[0031](4)如果需要，采用高效液相色譜法測(cè)定微膠囊中生物大分子的包埋度。
[0032]其中，包埋度定義(下同):包埋度(％)=實(shí)際包埋量/微膠囊重量X 100%
[0033]高頻度接觸定義(下同):以可以實(shí)現(xiàn)溶液組分充分混和的轉(zhuǎn)速進(jìn)行振蕩的頻度。本領(lǐng)域公知的轉(zhuǎn)速50rpm/min以上或加壓2MPa以上，例如50?75rpm/min、75?200rpm/min或200rpm/min以上的振蕩頻度。
[0034]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，利用所述的壁材制備生物大分子微膠囊的步驟如下:將Ig酵母細(xì)胞壁材與I?20mL I %的生物大分子溶液在20?40°C高頻度接觸進(jìn)行包埋。24小時(shí)后取出，離心，洗滌除去表面未包埋的生物大分子，冷凍干燥。
[0035]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的生物大分子為1%牛血清白蛋白(BSA)，所述的溶液為水溶液，所加入的1% BSA的量為I?20mL。
[0036]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供對(duì)生物大分子酵母細(xì)胞微膠囊進(jìn)行封孔的方法。包括:
[0037]步驟(1)-(3)，與前述相同；
[0038](4)將酵母細(xì)胞微膠囊壁材與生物大分子溶液高頻度接觸所得微膠囊與陽(yáng)離子聚合物溶液在20?40°C下繼續(xù)高頻度接觸24?48小時(shí)進(jìn)行封孔，離心、洗滌后，冷凍干燥即得最終的生物大分子酵母細(xì)胞微膠囊產(chǎn)品。
[0039](5)如果需要，采用高效液相色譜法測(cè)定微膠囊中生物大分子的包埋度。
[0040]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，微膠囊的封孔步驟如下:在20?40°C下，待Ig酵母細(xì)胞與I?20mL I %的生物大分子溶液高頻度接觸24時(shí)完成包埋后，加入陽(yáng)離子聚合物溶液，使其最終濃度為0.1?2%，繼續(xù)高頻度接觸24小時(shí)，離心，洗滌除去多余的陽(yáng)離子聚合物，冷凍干燥。
[0041]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的陽(yáng)離子聚合物為高分子量殼聚糖，分子量為?1.5X105，脫乙酰度>90%，所述的溶液為1% HAc溶液。
[0042]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的生物大分子溶液為1% BSA水溶液，所述的陽(yáng)離子聚合物溶液為殼聚糖(分子量為?1.5 X 105，脫乙酰度>90%，浙江玉環(huán)化工廠)的1%HAc溶液。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所加入的1% BSA的量為I?20mL，所加入殼聚糖溶液的量為使其最終濃度為0.1?2%。
[0043]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供通過(guò)上述方法所制備的酵母細(xì)胞生物微膠囊壁材。
[0044]本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供通過(guò)上述方法所制備的生物大分子微膠囊產(chǎn)品。
[0045]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所制備的生物大分子微膠囊是蛋白類(lèi)生物微膠囊，其中涉及的蛋白質(zhì)為BSA，優(yōu)選I %的BSA，涉及的溶液為水溶液。
[0046]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，進(jìn)行封孔的是BSA酵母細(xì)胞微膠囊，其中涉及的陽(yáng)離子聚合物為殼聚糖，分子量為?1.5 X 105，脫乙酰度>90%，優(yōu)選0.5%的殼聚糖(浙江玉環(huán)化工廠)，涉及的溶液為I % HAc溶液。
[0047]技術(shù)效果:
[0048](I)以常見(jiàn)的酸、堿、鹽、有機(jī)溶劑和表面活性劑對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)處理，不僅能使酵母細(xì)胞內(nèi)部空化，而且能部分降解酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，從而有效增大酵母細(xì)胞孔徑，能用于生物大分子的包封，生物大分子的包埋度可以高達(dá)10.09%。
[0049](2)采用升溫對(duì)化學(xué)處理后的酵母細(xì)胞本身的水解酶系進(jìn)行滅活處理，能夠防止酵母細(xì)胞壁材對(duì)微膠囊中生物大分子的降解作用，從而保持生物大分子的穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)滅酶處理后，酵母