用于分析生物大分子復合物的方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種確定生物大分子復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的方法。特別地，該方法能夠在適當波長下基于作為溫度函數(shù)的熒光變化來確定所述復合物的最大穩(wěn)定性，其中所述熒光變化反映出生物大分子復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的狀態(tài)。所述方法以作為溫度的函數(shù)的二態(tài)或多態(tài)的解疊熒光曲線的確定為基礎，根據(jù)多態(tài)的解疊模型來擬合所述曲線。此外，提供用于確定生物大分子復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的計算機程序、計算機程序存儲介質以及設備和系統(tǒng)。
【專利說明】用于分析生物大分子復合物的方法及其用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種確定生物大分子復合物(macromoleCUIar complexes)的組成(assembly)、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的方法。特別地，該方法能夠在適當波長下基于作為溫度函數(shù)的熒光變化來確定所述復合物的最大穩(wěn)定性，其中所述熒光變化反映出生物大分子復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的狀態(tài)。所述方法以作為溫度的函數(shù)的二態(tài)或多態(tài)的解疊突光曲線(unfolding fluorescence curves)的確定為基礎，根據(jù)多態(tài)的解疊模型來擬合所述曲線。此外，還提供用于確定生物大分子復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的計算機程序、計算機程序存儲介質以及設備和系統(tǒng)。
【背景技術】
[0002]大分子復合物，例如生物大分子復合物是不同或相同部分的超分子組成。例如生物大分子復合物是相同的或不同的生物分子，甚至是不同類型的生物分子的組成。這類生物分子包括蛋白質、核酸、脂質和糖。通常，該大分子復合物在存在于天然環(huán)境中的特定條件下形成，例如活生物體。所述大分子復合物對活生物體的生存至關重要，并且在各種生化途徑中具有關鍵作用。從機理上來理解這些大分子復合物如何進行它們任務的關鍵是對它們的三維結構的認知。研究大分子復合物的結構、特別是其功能的一個主要障礙是其組合的復雜性和常見的所述結構的相對不穩(wěn)定性，特別是當大分子復合物從自然環(huán)境中分離時。也就是說，在純化過程中和在經純化的狀態(tài)下或在重組表達或合成制造時，大分子復合物的結構的確定及正確的構造(formation)組合是困難的。也就是說，現(xiàn)行的生物科學研究揭示大分子一般不會孤立地起作用，而是組織成超分子組合體。這些被稱為大分子復合物或分子機器的組件(modules)是活性物種(active species),其進行對維持細胞內穩(wěn)態(tài)必不可少的生化反應。分子機器或大分子復合物(以下稱為大分子復合物或通常稱作復合物)可分為三大類:僅由蛋白質組成的那些復合物、由蛋白質和核酸組成的復合物和整合膜復合物(integral membrane complex)。
[0003]不拘束于大分子復合物的本質，確定其三維結構以獲得對在細胞內各自作用模式的機理性認識是必不可少的。為此，諸如“TAP-標記(TAP-tagging)”和重組多蛋白表達技術的最新進展已經使得許多大分子復合物的生化提純在技術上變得可行。盡管在分離和重組細胞的分子機器能力方面上有巨大的進步，但仍然缺乏有關它們的結構信息。這一差距可能是因為這些復合物所固有的且限制純化收率的生化復雜性。此外，大多數(shù)分子機器純化前是不穩(wěn)定的并且往往在構象上是異構體。然而，大多數(shù)的純化方案會采用有限制的一組緩沖體系，例如磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)、Tris緩沖生理鹽水(TBS)或HEPES緩沖生理鹽水(HBS)。也就是說，純化方案并沒有配合最適宜于純化的條件來進行生物大分子復合物的純化，其中所述復合物以其在天然環(huán)境(即細胞環(huán)境)中的形式存在。
[0004]此外，經分離的大分子復合物通常是相當不穩(wěn)定的，因此穩(wěn)定化的復合物或穩(wěn)定性改進的復合物是內在的需要。因此，在分離和純化復合物的過程中，需要盡早一步地對許多純化的大分子復合物，特別是生物大分子復合物的穩(wěn)定性進行優(yōu)化以使這些組成符合結構生物學以及適用于例如功能性的研究。
[0005]通常已知蛋白質的穩(wěn)定性取決于緩沖體系。pH、離子強度、在溶液中鹽及其濃度、添加劑、配體和介電常數(shù)以及粘度會影響復合物的穩(wěn)定性。確定任意的大分子材料穩(wěn)定性的簡單方法是在任意給定的溶質中測量其對溫度的逐漸增加做出響應的解疊行為。這可以通過差示掃描量熱法(DSC)或差示掃描光散射(DSLS)的方法來完成。第三種可能性是在存在染料的情況下進行熱解疊，該染料的熒光性在極性環(huán)境中淬滅，而在解疊前當所述染料被暴露在例如蛋白質的疏水核心(hydrophobic core)的疏水環(huán)境中時強烈地發(fā)出突光信號。這種方法被稱為熱突光法(thermofluor method)或差示掃描突光法(DSF)。這些方法受限于高通量的設定并且也被用來在各種緩沖條件和小分子存在下確定單域蛋白質(single-domain proteins)的穩(wěn)定條件。W02010/109204于近期描述了與確定熱穩(wěn)定性的分析方法有關的熱熒光法。其中所述的方法可以確定單域蛋白質的穩(wěn)定條件并僅是以確定所述蛋白質的解鏈溫度TmS基礎。然而，從中所確定的是在復合物(即多域蛋白質)中該蛋白質的各個部分可以獨立地解鏈從而產生多個的TM。最近，Kopec J.，and SchneiderG.，J.Structural Biol.2011，do1: 10.1016/J.JSB2011.04.006 論述了基于熒光和光散射比較的方法以接近蛋白質-蛋白質復合物的形成和穩(wěn)定。其中，已經應用DSLS和DSF方法以確定蛋白質的穩(wěn)定條件。特別地，已將這兩種方法的比較應用于蛋白質-蛋白質復合物的緩沖條件的優(yōu)化。然而，其中所描述的方法還是僅以蛋白質-蛋白質復合物的Tm的確定為基礎。
[0006]DSF的簡單性和低樣品要求使得用所述方法對于確定大分子復合物的穩(wěn)定性來說尤為有用。然而，除了 Kopec等人的最近公開物(其中分析了蛋白質-蛋白質復合物)夕卜，基于每個單獨的域/亞單元(subunit)會獨立地解疊從而產生多相的解疊曲線，所述方法并未被認為可用于多域蛋白質和分子機器。這樣的曲線不包含復合物穩(wěn)定性的信息，而只包含各個組分的穩(wěn)定性的信息。
[0007]因此，不斷需要可以確定生物大分子復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的方法和系統(tǒng)。所述方法對于確定所述大分子復合物的穩(wěn)定條件(stabilizingconditions)來說應當是尤為可用的,從而可以對所述復合物進行進一步的功能分析。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種確定生物大分子復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的新方法。已經被認知的是，計算大分子復合物明顯的解鏈溫度不足以分析其穩(wěn)定條件(stabilizing conditions)并優(yōu)化所述穩(wěn)定條件。相比之下，要求通過以根據(jù)多態(tài)解疊模型(優(yōu)選二態(tài)至六態(tài)的模型范圍)擬合所述曲線的方式確定作為溫度函數(shù)的樣品表面的二態(tài)解疊熒光曲線來改進現(xiàn)有方法。根據(jù)解疊模型的物理參數(shù)，通過例如Levenberg-Marquardt算法來進行擬合以獲得過渡性的解疊曲線。然后用最佳擬合曲線來進行進一步的處理，并且僅當與最佳擬合模型的數(shù)據(jù)差異小到可以忽略時假定二態(tài)的模型。
[0009]因此，第一方面，本發(fā)明提供了一種確定生物大分子復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的方法。包括以下步驟:
[0010]-提供在包含緩沖體系和熒光染料的樣品中的一種或多種生物大分子的復合物；[0011]-在熱平衡后，以適用于測量所述樣品熒光度的速率逐漸地增加所述樣品的溫度，從而在適當?shù)牟ㄩL下以熒光曲線的形式確定作為溫度函數(shù)的熒光度，其中所述熒光反映出所述復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的狀態(tài)；
[0012]-基于以下的方法計算所述復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性:
[0013]a)根據(jù)二態(tài)至六態(tài)模型的多態(tài)解疊模型，通過擬合所述曲線來確定樣品的作為溫度函數(shù)的表觀二態(tài)解疊突光曲線(apparent two state unfolding fluorescence curve),例如通過確定基于Levenberg-Marquardt算法的解疊狀態(tài)用來獲得過渡曲線和X2的最小化并比較所述曲線來優(yōu)化二態(tài)曲線；通過將所述曲線擬合至二態(tài)到六態(tài)模型的多態(tài)解疊模型來確定樣品的作為溫度函數(shù)的表觀二態(tài)解疊熒光曲線，例如通過確定以用于獲得過渡曲線和X2的最小化的Levenberg-Marquardt算法為基礎的解疊狀態(tài)并比較所述曲線來優(yōu)化二態(tài)曲線；
[0014]b)計算二態(tài)模型中拐點處的所述過渡性曲線的斜率；
[0015]c)計算解鏈溫度Tm和/或解疊焓Λ H。
[0016]此外，本發(fā)明提供一種確定生物大分子復合物(例如多態(tài)復合物)的穩(wěn)定條件的方法，包括以下步驟:根據(jù)上述用于至少兩個或多個不同樣品的方法比較樣品的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性并確定該條件，其中存在最穩(wěn)定的條件。
[0017]此外,本發(fā)明的方法允許配體結合(ligand binding)的篩選,對去穩(wěn)定的或抑制復合物形成的或穩(wěn)定化的或促進復合物形成的化合物的篩選，或對確定配體對由一個生物體相對于另一個生物體分離出的復合物的專一'I"生(specificity)的篩選。
[0018]另一方面，本發(fā)明提供一個用于實施本發(fā)明方法的以具有程序代碼的計算機可讀形式存在的計算機程序。而且，本發(fā)明提供了一種用于確定生物大分子復合物(例如多態(tài)復合物)的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的系統(tǒng)，該系統(tǒng)是基于DSF，其包括DSF裝置和包含根據(jù)本發(fā)明的用于實施本發(fā)明方法的軟件或計算機程序的數(shù)據(jù)處理單元。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1示出了緩沖條件對DSF曲線的影響的比較和電子顯微圖像。次優(yōu)的緩沖條件揭示了多相的解疊曲線(前兩行)。在最佳的緩沖條件下獲得二態(tài)的解疊曲線(第三行)。在這些條件下不能再在EM圖像上觀察到聚集體(aggregates)。
[0020]圖2示出了在不存在或存在dATP或ATP的情況下的GroEL/GroES復合物的形成。如圖所示，在存在dATP或ATP的情況下形成GroEL/GroES復合物。
[0021]圖3示出了用50mM EDTA80S核糖體處理后會變得不穩(wěn)定并且不再顯示出二態(tài)的解疊狀態(tài)(behaviour)(中圖)。pH6時在咪唑和IOmM MgCl2中穩(wěn)定狀態(tài)最佳(右圖)。
[0022]圖4示出了對由13個不同的不含半胱胺酸的球蛋白域以及較小的具有3個半胱胺酸的N端非球蛋白(nonglobin)域組成的BGHb (Biomaphalaria glabrata的血紅蛋白，haemoglobin of Biomaphalaria glabrata)作出的復合物形成方面的分析。
[0023]圖5示出了根據(jù)本發(fā)明所執(zhí)行的步驟流程圖。
[0024]圖6示出了基于本發(fā)明的不同的選擇步驟所選擇或排除的曲線。參考圖5所示的流程圖所標識的步驟?！揪唧w實施方式】
[0025]第一方面，本發(fā)明涉及確定生物大分子復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的方法，其包括以下步驟:
[0026]-提供在包含緩沖體系和熒光染料的樣品中的一種或多種生物大分子的復合物；
[0027]-以適于測量所述樣品的熒光度的速率逐漸增加所述樣品的溫度，從而在合適的波長下以熒光曲線的形式確定作為溫度函數(shù)的熒光度，其中所述熒光度反映出所述復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的狀態(tài)；
[0028]-基于以下方法計算所述復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性:
[0029]a)根據(jù)二態(tài)至六態(tài)模型的多態(tài)解疊模型，通過擬合所述曲線來確定作為溫度函數(shù)的樣品表觀二態(tài)解疊突光曲線，例如通過確定基于Levenberg-Marquardt算法的解疊狀態(tài)用來獲得過渡曲線和X2的最小化并比較所述曲線來優(yōu)化二態(tài)曲線；通過將所述曲線擬合至二態(tài)到六態(tài)模型的多態(tài)解疊模型來確定樣品的作為溫度函數(shù)的表觀二態(tài)解疊熒光曲線，例如通過確定以用于獲得過渡曲線和X2的最小化的Levenberg-Marquardt算法為基礎的解疊狀態(tài)并比較所述曲線來優(yōu)化二態(tài)曲線；
[0030]b)計算二態(tài)模型中拐點處的所述過渡性曲線的斜率；
[0031 ] c)計算解鏈溫度Tm和/或解疊焓Λ H。
[0032]本文所用術語“ X2最小化”是Levenberg-Marquardt算法的一部分(NumericalRecipes,第三版,第十五章,第799頁)。
[0033]此外，術語“解疊過渡的拐點”被定義為復合物的解鏈點(melting point)。
[0034]本文所用術語“R2”是指實驗曲線符合模型的程度。當R2在0.999以下時，優(yōu)選將該曲線摒棄。優(yōu)選R2盡可能接近I。
[0035]所述突光染料優(yōu)選為溶劑化顯色(solvatochromatic)的染料。溶劑化顯色的染料是一種在極性溶劑中其熒光發(fā)射會淬滅的染料，而當置于疏水性溶劑的環(huán)境時所述染料會發(fā)出強烈的突光。
[0036]也就是說，當由升溫而導致逐漸解疊時，生物大分子復合物的疏水性殘基的溶劑暴露(solvent exposition)出現(xiàn),并且同時由于疏水性溶劑環(huán)境的存在度不斷增加使溶劑化顯色染料的熒光發(fā)射信號增加。本領域技術人員非常了解適合的熒光染料。換言之，公知的適用于熱突光分析的突光染料包括:寶石橙(sypro orange)、硫代肌苷(thioinosine)、N-亞乙烯基腺苷(N-ethenoadenosine)、間型霉素、丹酰衍生物(dansyl derivatives)、熒光素衍生物、6-丙酰基-2-( 二甲基氨基)-萘(PRODAN)、2_苯胺基萘和N-芳基氨萘磺酸衍生物(N-arylamino-naphthalene sulfonate derivatives),例如 1-苯胺萘 _8_ 橫酸(1，8-ANS)、2-苯胺萘-6-磺酸(2，6-ANS)、2-氨基萘-6-磺酸、N，N-二甲基-2-氨基萘-6-磺酸、N-苯基-2-氨基萘、N-環(huán)己基-2-氨基萘-6-磺酸、N-苯基-2-氨基萘-6-磺酸、N-苯基-N-甲基-2-氨基萘-6-磺酸、N-(鄰甲苯?；?-2-氨基萘-6-磺酸、N-(間甲苯酰基)-2-氨基萘-6-磺酸、N-(對甲苯酰基)-2-氨基萘-6-磺酸、2-(對甲苯氨基萘)-萘-6-石黃酸(2- (p-toluidinyl) -naphthalene-6-sulfonic acid) (2, 6-TNS)、4_ ( 二氰基乙烯基)久洛利啶(DCVJ)、6_十二?；?2-二甲基氨基萘(LAURDAN)、6-十六?；?2-( ((2_(三甲基胺基)乙基)甲基)氨基)萘氯(6-hexadecanoyl-2- (((2- (trimethylammonium) ethyl)methyl) amino) naphthalenech loride) (PATMAN)、尼羅紅、N-苯基-1-萘胺、1，1- 二氰基-2-[6_( 二甲基氨基)萘-2_基]丙烯(DDNP)、4，4’ - 二苯胺基-1，1-聯(lián)萘-5, 5- 二橫酸(4, 4，-dianilino-1, l-binaphthyl-5, 5-disulfonic acid) (b1-ANS)和DAPOXYL 衍生物(Molecular Probes, Eugene, Oreg.)。
[0037]在一項實施方式中，所述染料為購自Molecular Probes Inc.公司的寶石橙(sypro orange) ?在一項實施方式中，在波長530nm處測量突光度。
[0038]用于測量發(fā)射光的合適的儀器包括裝有在適當波長處發(fā)射和測量光的任意第二代的實時 PCR 系統(tǒng)，例如購自 Applied Biosystems 的 7900HT fast real-time PCR 系統(tǒng)和購自 Biorad 的 CFX96real_time PCR 儀器。
[0039]通常運行的溫度約為:例如基于384個孔板(well block),從20°C~100°C使用約為0.020C /sec的溫度梯度，但如果需要也可以從40~100°C。在使用7900HT系統(tǒng)的情況下，基于384個孔板的最小升降溫速率(ramp rate)可例如為0.02°C /sec(l%的功率)。該系統(tǒng)中基于384個孔板的最大升降溫速率可例如為2V /sec.(100%的功率)。因此，適合的升降溫速率范圍為約0.02~約2V /sec。
[0040]在一項實施方式中，同時分析2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、94、96、100、150、200、250、300、350個或更多個例如384或1024個蛋白質樣品。所述儀器可
結合自動裝置使用以進一步地自動化所述過程并且無需人為干預就可增加可處理的樣品的數(shù)量。 [0041]所述方法優(yōu)選以DSF (差示掃描熒光法)為基礎。DSF可用作高通量的篩選技術，其產生大量的需要翻譯的數(shù)據(jù)，從而要求數(shù)據(jù)分析的自動化。優(yōu)選地將歸因于錯誤信號的數(shù)據(jù)組或曲線濾出。這些錯誤的信號或測量包括歸因于氣泡、移液錯誤、染料結晶或大分子復合物的部分聚結等的錯誤結果。此外，該方法優(yōu)選包括用于數(shù)據(jù)歸一化的背景扣除(background subtraction)。這一方面,在另一項優(yōu)選的實施方式中將作為溫度的函數(shù)的熒光曲線歸一化以獲得過渡曲線，其中將所述曲線最低的局部最小值設定為O并將最高的最大值設定為1000，而位于由這兩個數(shù)據(jù)點所定的范圍之外的實驗值被從所述曲線的計算中排除。
[0042]熒光的增加等同于大分子復合物的解疊是公認的。
[0043]因此，下一步需要根據(jù)多態(tài)的解疊模型來擬合作為溫度函數(shù)的樣品的熒光曲線，所述多態(tài)的解疊模型包括二態(tài)、三態(tài)、四態(tài)、五態(tài)和六態(tài)。在穩(wěn)定條件下會獲得一個表面二態(tài)解疊熒光曲線。這些經擬合的曲線也被稱為過渡曲線。例如，通過使用Levenberg-Marquardt-算法和最小化X2來進行擬合。此外，優(yōu)選基于對二態(tài)的R2的確定來測定用于優(yōu)化二態(tài)曲線的相似度。
[0044]此外，在優(yōu)選的實施方式中，所述方法包括:計算二態(tài)模型中拐點處過渡曲線的斜率，并附加地或任選地，優(yōu)選計算溫度Tm和/或解疊焓ΛΗ。本領域技術人員熟知適用于計算各個參數(shù)的裝置和方法。
[0045]此外，在進一步優(yōu)選的實施方式中，所述方法包括步驟:使用緩沖體系的ΛΡΚα/Τ值來確定解疊過渡曲線的拐點處的實驗pH值，其用于示出作為溫度函數(shù)的適當波長的熒光曲線。
[0046]特別優(yōu)選的是，以非線性地擬合解疊過渡曲線的斜率為基礎來計算ΛΗ。在這種情況下，△ H表示全部解疊焓和離解焓的加權平均值。[0047]為了進一步的分析，本發(fā)明的方法包括確定生物大分子復合物(例如多肽復合物)的穩(wěn)定條件，對于來說，包括以下步驟:正如本發(fā)明的方法所確定的，比較至少兩個或多個不同的樣品的樣品組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性，并在最穩(wěn)定的狀態(tài)出現(xiàn)時確定該條件。
[0048]優(yōu)選將用于確定最穩(wěn)定的狀態(tài)的曲線啟發(fā)性地(heuristically)分類以用于確定預定參數(shù)。也就是說，本發(fā)明的方法可以確定生物大分子復合物的最穩(wěn)定的狀態(tài)。因此，這種方法特別適用于確定所述復合物的穩(wěn)定緩沖條件(stabilizing bufferconditions),特別是用于這些復合物的分離和技術分析。
[0049]在一項優(yōu)選的實施方式中，所述復合物包括蛋白質、核酸、糖和/或脂質。例如可檢查蛋白質/蛋白質復合物的組成、均勻性和熱力學穩(wěn)定性。此外，發(fā)明人成功地分析了蛋白質-核酸復合物。
[0050]在另一項優(yōu)選的實施方式中，將曲線啟發(fā)性地分類以確定預定參數(shù)。特別地，優(yōu)選按下列順序來選擇預定參數(shù):得出多相解疊模型擬合實驗數(shù)據(jù)的結果，擬合該結果以優(yōu)化二態(tài)模型、二態(tài)模型的解疊焓△ H、二態(tài)模型的Tm、最佳擬合模型的ΛΗ、最佳擬合模型的^以及在過渡曲線的最低局部最小值和最高局部最大值下方的封閉區(qū)域。
[0051]因此，通過使用高通量的方法能夠容易且方便地確定生物大分子復合物的穩(wěn)定和不穩(wěn)定狀態(tài)。
[0052]該方法可用于不同的用途。例如通過使用本發(fā)明的方法能夠篩選配體結合。也就是說，通過觀察和比較熒光曲線，能夠確定配體與所述復合物的結合。此外，該方法可以用于篩選去穩(wěn)定或抑制復合物形成的化合物。另一方面，本發(fā)明的方法可以用于篩選穩(wěn)定或促進復合物形成的化合物。此外，本發(fā)明可以在不同的生物體之間確定與復合物結合的配體的專一性。這在例如開發(fā)抗生素或其它化合物的領域內會令人特別感興趣，所述抗生素或其它化合物應能在一個生物體內起效，而在另一個生物體中則不會起相同的效果，例如對病原體有效而不對主體有效。
[0053]本發(fā)明方法的另一個優(yōu)`勢在于，其適用于高通量的篩選反而卻僅需少量的樣品。
[0054]令人驚訝的是，已確定可以通過應用差不掃描突光技術(differential scanningfluorimetry technology)來分析由各種組分(例如至少2種、3種、4種或更多種不同的組分)組成的生物大分子復合物。因此，能夠提供這些生物大分子復合物以用于新的活性成分的篩選方法，例如有這些大分子復合物參與的新療法。
[0055]另一方面，本發(fā)明提供一種存儲于計算機可讀介質的計算機程序，其具有用于實施本發(fā)明方法的程序代碼。本發(fā)明還提供一種計算機程序，當其在計算機上運行或被加載在計算機上時，會使計算機執(zhí)行本發(fā)明的方法。
[0056]此外，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的計算機程序的計算機程序存儲介質。
[0057]另一項實施方式涉及包含計算機可讀存儲介質的裝置，該存儲介質包含用于執(zhí)行本發(fā)明方法的計算機指令。
[0058]最后，本發(fā)明提供了一種用于確定生物大分子復合物(例如多肽復合物)的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的系統(tǒng)，該系統(tǒng)以差示掃描熒光法和包含根據(jù)本發(fā)明的用于實施本發(fā)明方法的軟件或計算機程序的數(shù)據(jù)處理單元為基礎。
[0059]不受理論的束縛，熱熒光測定法是基于所用染料的環(huán)境依賴性熒光。例如盡管作為合適的熒光染料的代表的SYPRO橙在極性環(huán)境中表現(xiàn)出較低的量子產率，但是在疏水環(huán)境中變成了超熒光。測定過程中，在升溫的情況下蛋白質解疊并暴露出疏水性斑點(patch)從而導致熒光的增加。當溫度進一步上升時，隨后通過快速的聚集隱藏了先前暴露的疏水性斑點，從而導致熒光信號的降低。至此，通過曲線的非線性回歸(non-linearregression)將所獲得的DSF曲線i全釋成一個簡單的Boltzmann模型以確定突光增加過程中的拐點。這確定了蛋白質的解鏈溫度并且被用作單鏈蛋白穩(wěn)定性的結果讀出(readout)(Niesen, F.H., et al.，(2007)，2，2212-2221)。不過僅解鏈溫度的讀出對于蛋白質復合物來說是不夠的。在W02010/109204中也得到證實，確定復合物、多域蛋白質、蛋白質的單獨部分可以獨自地解鏈從而出現(xiàn)多個Tm。
[0060]假設上述的方法能夠于任意的時間點在溶液中找到三種不同種類的染料:具有最大熒光值Ftl的游離的染料，具有最大信號Fn的與天然狀態(tài)蛋白質相結合的染料，表示所有的天然蛋白質是原生的且與染料結合的，以及與解疊的蛋白質結合的染料，即F?。可將在每個時間點測量的熒光信號表示為由這三種染料所發(fā)出的信號部分的總和:
[0061]F = f/N+f/u+Fo (1)
[0062]其中&和分別為解疊蛋白質狀態(tài)和未解疊蛋白質狀態(tài)的分數(shù)。因為相比于蛋白質，染料大量的，所以Ftl在實驗過程中不會改變，并且通過基線實驗可將其在實驗中簡單地扣除。因此，在下文中可以忽略F。。
[0063]假設由平衡常數(shù)1(=4/%來表示簡單的二態(tài)模型，這推導出:
[0064]
【權利要求】
1.一種確定生物大分子復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的方法，包括以下步驟: -提供包含緩沖體系和熒光染料的樣品中的一種或多種生物大分子的復合物； -在熱平衡后以適用于測量所述樣品的熒光的速率逐漸地增加所述樣品的溫度，從而在適當波長下確定作為溫度函數(shù)的熒光強度，其中所述熒光強度反映出所述復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的狀態(tài)； -基于以下方法計算出所述復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性: a)根據(jù)二態(tài)至六態(tài)模型的多態(tài)解疊模型，通過擬合所述曲線來確定樣品的作為溫度函數(shù)的表觀二態(tài)解疊熒光曲線，例如通過確定以用于獲得過渡曲線和X2的最小化的Levenberg-Marquardt算法為基礎的解疊狀態(tài)并比較所述曲線來優(yōu)化二態(tài)曲線； b)計算二態(tài)模型中所述過渡性曲線在拐點處的斜率； c)計算解鏈溫度Tm和/或解疊焓ΛH。
2.權利要求1所述的方法，其中計算所述復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的步驟包括根據(jù)所述曲線的第一部分中明顯的負斜率確定待丟棄的曲線。
3.權利要求1或2所述的方法，其中歸一化作為溫度函數(shù)的所述熒光曲線用于獲得過渡曲線，其中將所述曲線最低的局部最小值設定為O并將最高的最大值設定為1000，將處于由這兩個數(shù)據(jù)點所定的范圍之外的實驗值從所述曲線的計算中排除。
4.前述權利要求中任一項所述的方法，其中使用緩沖體系的ApKaA值來確定所述解疊過渡的曲線的拐點處的實驗PH值，所述曲線示出適當波長的作為溫度函數(shù)的熒光強度。
5.前述權利要求中任一項所述的方法，其中基于所述解疊過渡的斜率來計算所述ΔΗ。
6.確定例如多態(tài)復合物的生物大分子復合物的穩(wěn)定條件的方法，包括步驟:對于至少兩個或多個不同樣品，比較根據(jù)方法權利要求1~5中任一項所確定樣品的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性，并且在最穩(wěn)定條件出現(xiàn)時，確定該條件。
7.權利要求6所述的方法，其中將所述曲線啟發(fā)性地排序以獲得預定參數(shù)。
8.權利要求7所述的方法，其中按下列順序選擇所述預定參數(shù):實驗數(shù)據(jù)的R2、優(yōu)化的二態(tài)模型的R2、二態(tài)模型的解疊△ H、二態(tài)模型的Tn1、最佳擬合模型的ΛΗ、最佳擬合模型的Tffl以及在所述過渡曲線的最低局部最小值和最高局部最大值下方的封閉區(qū)域。
9.前述權利要求中任一項所述的方法，其中預先丟棄具有高光散射強度的曲線。
10.前述權利要求中任一項所述的方法用于確定所述復合物的去穩(wěn)定條件的用途。
11.前述權利要求中任一項所述的方法用于篩選配體結合，用于篩選穩(wěn)定化、去穩(wěn)定化或抑制復合物形成的化合物，用于確定配體對由一個生物體相對于另一個生物體分離出的復合物的專一性用途。
12.前述權利要求中任一項所述的方法用于確定允許進一步分析和處理所述復合物的緩沖條件的用途。
13.前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述曲線以差示掃描熒光法(DSF)為基礎。
14.前述權利要 求中任一項所述的方法，其中所述計算是由軟件來實現(xiàn)的。
15.一種存儲于計算機可讀介質上的計算機程序，具有用于實施權利要求1~14中至少一項所述方法的程序代碼。
16.一種計算機程序，當其在計算機上運行或加載于計算機時，使計算機運行權利要求1~14中至少一項所述的方法。
17.一種計算機存儲介質，包含權利要求15或16所述的計算機程序。
18.包含計算機可讀存儲介質的設備，所述計算機可讀存儲介質包含用于實施權利要求I~14中至少一項所述的方法的程序指令。
19.一種用于確定例如多態(tài)復合物的生物大分子復合物的組成、均勻性和/或熱力學穩(wěn)定性的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)以差示掃描熒光法為基礎，包括用于差示掃描熒光的裝置和包含權利要求15或16中任一項用于實施權利要求1~14中至少一項所述的方法的軟件或計算機程序的數(shù)據(jù)處理 單元 。
【文檔編號】G01N33/68GK103797367SQ201180073278
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2011年9月6日 優(yōu)先權日:2011年9月6日
【發(fā)明者】H.斯塔克, A.查里, D.哈茲爾巴赫, J-M.柯維斯 申請人:馬克斯.普朗克促進科學協(xié)會