專利名稱：使用具有高通量和低體積要求的界面室系統(tǒng)的快速灌注系統(tǒng)和膜片鉗技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對于生物膜及其整合膜蛋白研究，開展快速灌注以及以“盲法膜片”方式獲得膜片鉗記錄的系統(tǒng)。更具體地講，本發(fā)明涉及具有高通量和低體積要求的膜片鉗灌注系統(tǒng)，其用于電生理藥物處理和應(yīng)用裝置以篩選化學(xué)品例如藥物。本發(fā)明還提供一種高通量篩選的裝置以及使用該裝置的方法。
背景技術(shù)：
通過因載體蛋白和離子通道作用引起的細胞膜電位的變化來控制許多細胞過程。載體蛋白結(jié)合特定的溶質(zhì)，并通過構(gòu)象變化將它們進行跨生物細胞膜脂雙層的轉(zhuǎn)移，該構(gòu)象變化即順序地將溶質(zhì)結(jié)合位點暴露于膜的一側(cè)和另一側(cè)。一些載體蛋白僅“沿下坡”，即沿其濃度和/或電化學(xué)梯度方向來運輸單一溶質(zhì)。其它載體蛋白可作為泵起作用，以逆著其濃度和/或電化學(xué)梯度方向“上坡”運輸溶質(zhì)，其使用ATP水解或另一溶質(zhì)(例如鈉)的“下坡”流所提供的能量來驅(qū)動所必需的系列構(gòu)象變化(在B.Alberts等人，1994，Molecular Biology of the Cell，第3版，Garland Publishing，Inc.，NewYork，N.Y.進行了綜述)。幾種載體蛋白例如ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族在臨床上是特別重要的。已知這些蛋白質(zhì)是造成囊性纖維變性、以及癌細胞和引起瘧疾的寄生物中的藥物抗性的原因。
與載體蛋白不同，離子通道蛋白是在生物膜中形成孔隙的跨膜蛋白質(zhì)，其允許離子和其它分子從一側(cè)通過到另一側(cè)。離子通道有多種類型。例如，“滲漏通道”在所有生理膜狀態(tài)下是開放的。“電壓門控通道”響應(yīng)跨膜的電位而開啟?！芭潴w門控通道”響應(yīng)特定分子例如細胞外介質(zhì)(例如神經(jīng)遞質(zhì))或細胞內(nèi)介質(zhì)(例如離子或核苷酸)的結(jié)合而開啟。還有其它離子通道通過與蛋白質(zhì)例如G蛋白的相互作用而受到調(diào)節(jié)。
離子通道蛋白主要介導(dǎo)特定離子的透過性。例如，已鑒定出鈉(Na+)、鉀(K+)、氯(Cl-)和鈣(Ca2+)通道。離子通道主要負責(zé)產(chǎn)生細胞膜電位，該細胞膜電位為細胞膜相對側(cè)的電荷差(B.Alberts等人，同上)。在動物細胞中，Na+和K+ATP酶保持細胞內(nèi)低Na+濃度和細胞內(nèi)高K+濃度。與這些ATP酶相反，K+滲漏通道允許K+離子順K+濃度梯度移動而出細胞。以這種方式，幾種離子通道共同促成細胞膜電位的形成。
電壓門控離子通道和配體門控離子通道負責(zé)在包括大多數(shù)肌肉和神經(jīng)細胞在內(nèi)的電興奮細胞中產(chǎn)生細胞膜動作電位(B.Albert，同上)。例如，通過由Na+經(jīng)電壓門控Na+通道內(nèi)流而引起的細胞膜去極化觸發(fā)動作電位。動作電位觸發(fā)分泌細胞和神經(jīng)元中激素和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放；它們觸發(fā)肌肉細胞的收縮并影響生物化學(xué)事件和基因表達水平。然而，應(yīng)該注意，離子通道并不局限于可興奮細胞。事實上，在多種不可興奮細胞類型中存在電壓門控Na+、K+或Ca2+通道(B.Alberts，同上)。
廣泛多種載體蛋白和離子通道代表著豐富的藥物試劑新靶點。已知許多化學(xué)品、化合物和配體影響載體蛋白和/或離子通道活性。而且調(diào)節(jié)載體蛋白和離子通道的試劑可制成用于治療多種疾病、損傷或狀況的藥物組合物(S.A.N.Goldstein等人，1996，Neuron 16913-919)。例如，調(diào)節(jié)ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性的試劑可用于治療囊性纖維變性和/或癌癥。調(diào)節(jié)Ca2+通道活性的試劑可用于治療癲癇、焦慮和阿爾茨海默病。另外，調(diào)節(jié)Na+通道活性的試劑可用于治療肌肉痙攣、斜頸、顫動、學(xué)習(xí)障礙、腦癌、疼痛和阿爾茨海默病。阻斷Na+通道的試劑可用作局部麻醉劑。調(diào)節(jié)上皮Na+通道的試劑可用于治療囊性纖維變性、哮喘和高血壓。此外，調(diào)節(jié)K+通道活性的試劑可用于抵制缺氧和缺血性疾病以及高血壓的損害效應(yīng)，以及保護紅細胞免受瘧疾和鐮狀細胞病的損害(J.R.Enfeild等人，1995年，Pharmaceutical News 223-27)。
使用膜片鉗分析技術(shù)可測量離子通道活性。Neher、Sakmann和Steinback在“The Extracellular Patch Clamp，A Method For ResolvingCurrents Through Individual Open Channels In BiologicalMembranes，”Pflueger Arch.375；219-278，1978，中概述了使用微量吸管電隔離一片膜以及研究電壓鉗狀況下該膜片中的通道蛋白的總構(gòu)思。他們發(fā)現(xiàn)，通過將含有乙酰膽堿(ACH)的吸管壓在肌肉細胞膜表面上，可觀測到電流的不連續(xù)跳動，這助于ACH活化的離子通道的開啟和關(guān)閉。然而，由于吸管玻璃和膜間的密封阻抗(10-50兆歐)相對于通道阻抗(約10千兆歐姆)而言非常小，所以他們的工作受到限制。
然后發(fā)現(xiàn)，通過火拋光玻璃吸管以及當(dāng)吸管接觸細胞的表面時，對該吸管的內(nèi)部施加輕微的吸力，可獲得高電阻(1-100千兆歐姆)的密封。此技術(shù)將背景噪聲降低了一個數(shù)量級，達到了可以研究生物學(xué)感興趣的大部分通道的水平。此種改善的密封已被稱為“千兆歐密封(giga-seal)”，并且吸管已被標(biāo)記為“膜片吸管(patch pipette)”。由于Neher和Sakmann在發(fā)展膜片鉗技術(shù)中的工作，他們被授予1991年諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎。
膜片鉗技術(shù)代表著生物和醫(yī)學(xué)中的重要發(fā)展。例如，該技術(shù)允許測量流經(jīng)單離子通道蛋白的離子流，以及允許研究單離子通道對藥物的響應(yīng)。簡言之，在標(biāo)準(zhǔn)膜片鉗技術(shù)中，將薄玻璃吸管(具有直徑一般約1μm的尖端)按壓在細胞膜表面。該吸管尖端與細胞緊密密封，且隔離了微小片膜中的少許離子通道蛋白?？呻姕y量這些通道的活性(單通道記錄)，或備選地，將膜片破裂使得可測量整個細胞膜的通道活性(全細胞記錄)。
在單通道記錄和全細胞記錄中，通過施加跨膜“電壓鉗”，可進一步分辨各通道亞型的活性。通過使用反饋環(huán)，該“電壓鉗”施加跨膜的電壓梯度，這限制和控制整個通道活性并允許分辨?zhèn)€別通道亞型。
這種實驗中的時間分辨率和電壓控制給人留下深刻印象，通常為毫秒甚至微秒范圍。然而，膜片鉗技術(shù)作為藥物篩選普通方法的主要障礙是每日可測試化合物的數(shù)量有限。另外，由于樣品化合物變化速度緩慢以及膜片鉗吸管所需要的空間精確度，進一步限制了該標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
決定膜片鉗技術(shù)通量的主要限制為灌注系統(tǒng)的性質(zhì)，該灌注系統(tǒng)將溶解的測試化合物導(dǎo)引到細胞和膜片。在傳統(tǒng)膜片鉗裝置中，細胞放置在大實驗腔(0.2-2mL孔)，用生理鹽水連續(xù)地灌注。然后，通過將入口改變成與小數(shù)量的溶液瓶連接的閥，來施加化合物。然而，此技術(shù)具有一些缺點。首先，一次可連接的不同化合物的數(shù)量受到瓶數(shù)量的限制。第二，由于時間和供應(yīng)成本，支持測試所需要的液體和/或樣品的體積仍為限速步驟。第三，改變細胞和片周圍的溶質(zhì)組合物所需要的時間仍然高。因此，存在一些嘗試來增加膜片鉗記錄的通量能力。
用于局部應(yīng)用化合物來激活神經(jīng)遞質(zhì)所調(diào)節(jié)通道的復(fù)雜系統(tǒng)，如U毛細管和其它系統(tǒng)的開發(fā)降低了有效應(yīng)用時間。然而，這些快速應(yīng)用系統(tǒng)所交換的浴溶液的體積相當(dāng)大，并導(dǎo)致每日篩選多個化合物的能力有限。這限制了這些方法在醫(yī)藥上的使用，這是因為在測試數(shù)萬個化合物或不同濃度時所需要試劑成本過高。主要的原因在于，灌注U毛細管的進給系統(tǒng)的不靈活性以及低容量，其實際上與傳統(tǒng)膜片鉗試驗所使用的系統(tǒng)相同。
Olesen等人(總稱，“Olesen”)的美國專利號6,063,260、6,117,291和6,470,226公開了一種引起膜片吸管密封自細胞浴中自動選擇細胞的計算機化電動機控制系統(tǒng)。然后，該吸管的尖端和細胞仍附著于灌注室以便于膜片鉗測量。自動取樣器控制著閥，該閥交替地將自多種來源的流體引入灌注室，其包括一種或多種測試化學(xué)溶液和沖洗液。灌注室中的導(dǎo)管從該室中吸出用過的流體。當(dāng)細胞浸在測試溶液中時，可進行膜片鉗測量。在Olesen中，灌注室不移動。而是，復(fù)雜的一組管和泵用于將測試化學(xué)品和沖洗浴抽入和抽出界面室。因此，不將細胞(和吸管)移動到不同的測試和沖洗溶液中，而是通過自動取樣器將溶液加入到固定的細胞中。為了測試溶液最少化，Olesen將自動取樣器置于非?？拷嘧⑹摇．?dāng)進行膜片鉗測量時，必須特別注意以使自動取樣器所引起的電干擾(和振動)最小。
Farb等人(“Farb”)的美國專利號6,048,722公開了一種自動膜片鉗灌注系統(tǒng)，其用多個測試溶液和沖洗溶液灌注所密封細胞。測試溶液和沖洗溶液通過多筒的總管從多個儲器中注入容納所密封細胞的記錄室中。一個閥控制著在特定時間哪一種溶液灌注細胞。同Olesen系統(tǒng)一樣，F(xiàn)arb系統(tǒng)使溶液移動到細胞，而不是使細胞移動到溶液。
Weaver等人(“Weaver”)于2001年7月6日提交的美國申號09/900,627公開了一種不使用吸管尖端來附著細胞膜而測量細胞電性質(zhì)的系統(tǒng)。而是，多孔表面上的多個孔與多處細胞膜連接并密封。多孔表面的一側(cè)連接地電極，而另一側(cè)連接測量電極。在多孔表面為微芯片的一實施方案中，每一細胞可附著到其自己的地電極和測量電極，從而使得可以進行特定的細胞測量。當(dāng)將測試溶液施加到多孔表面一側(cè)或多側(cè)時，可測量所附著細胞的膜片鉗記錄。該系統(tǒng)可自動化，從而在一多孔板上同時測試多個多孔表面。
Norwood等人(“Norwood”)于2001年3月21日提交的美國專利申請?zhí)?0/239,046(公布號US 2003/0139336 A1)提供了一種系統(tǒng)，其中膜片吸管與位于懸浮液體如從毛細管底部懸浮的液滴的液體-空氣界面處的細胞連接。增加(或降低)管內(nèi)的壓力引起液體-空氣界面的彎月面向外(或向內(nèi))凸出。由于細胞位于彎月面，因此通過調(diào)整內(nèi)管壓力可控制細胞位置。彎月面向外凸出引起細胞接觸正好位于管下并且向上正對著彎月面的膜片吸管。一旦細胞接觸到膜片吸管，吸管可形成千兆歐密封(千兆歐姆密封)以及“密封”細胞以準(zhǔn)備膜片鉗測量。在Norwood的系統(tǒng)中，細胞在被密封之前位于膜片吸管之外。此外，對控制和懸掛細胞液體的第二個管應(yīng)用氣壓系統(tǒng)；不對膜片吸管本身施加氣壓。
仍然需要一種開展高通量篩選的更快、更便宜和/或更實用的方法。此類高通量篩選對于尋找和鑒別調(diào)節(jié)離子通道活性的試劑是非常寶貴的。反回來，此類試劑將用于治療各種疾病，例如癌癥、心臟病、囊性纖維變性、癲癇、疼痛、失明和耳聾。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供一種自動藥物處理和應(yīng)用的系統(tǒng)，以及使用該系統(tǒng)來篩選化學(xué)品，例如藥物。具體地，所述方法和系統(tǒng)可用于測量對離子通道轉(zhuǎn)運的影響，同時提供高通量和低流體體積的要求。對于本發(fā)明的目的，“離子通道”指的是滲漏通道、電壓門控通道、機械門控通道、配體門控通道以及任何其它類型的通道蛋白。
本發(fā)明的一實施方案降低了測試所需要的化學(xué)化合物的量。另一實施方案提供一種方法，由此可對單一細胞應(yīng)用大量的篩選，導(dǎo)致篩選率增加。
另一實施方案提供一種系統(tǒng)以及使用該系統(tǒng)以便在整個篩選過程中保持細胞浸在液體中的方法。另一實施方案降低了處于膜片鉗控制下圍繞細胞膜的灌注液的平衡時間，這對于研究快速脫敏配體門控離子通道是必要的。
本發(fā)明的另一實施方案提供一種包括界面室的系統(tǒng)，其中所述界面室提供能夠懸浮細胞的界面浴。所述系統(tǒng)尤其可應(yīng)用于開展膜片鉗技術(shù)的方法。
另一實施方案提供一種包括界面室的系統(tǒng)，其中通過千兆歐密封將一細胞貼附到毛細管上，并且其中所述界面室和毛細管可相對移動以致于所述毛細管可在所述界面室中滑動，所述界面室適合用于懸浮液體。
另一實施方案提供一種膜片鉗系統(tǒng)，其包括包括一電極的毛細管；以足于在毛細管與所述細胞的細胞膜間形成千兆歐密封的方式與所述毛細管連接的細胞；包括一電極的界面室，其中所述界面室和毛細管可相對移動，從而毛細管可在界面室中滑動，所述界面室可合適地成形以容納和懸浮液體；用于測量所述電極間電流和電壓中至少一種的設(shè)備；以及包括多個儲器的板，其中至少一個儲器包含測試化合物。
在一實施方案中，本發(fā)明提供一種測量細胞特性的方法，其包括將一細胞置于一界面室中，其中所述界面室在界面室的界面浴中懸浮所述細胞并且其中所述細胞貼附到毛細管上。然后測量細胞的一種或多種特性。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種測量細胞特性的方法，其包括將一細胞置于一界面室中，其中所述細胞經(jīng)千兆歐密封貼附到毛細管上并且其中所述界面室和毛細管可相對移動以致于毛細管可在界面室中滑動。然后測量細胞的一種或多種特性。
另一實施方案提供一種測量細胞特性的方法，其包括建立一個包括界面室的界面系統(tǒng)，其中以足于在毛細管和細胞間形成密封的方式將細胞貼附到毛細管上，并且其中所述界面室和毛細管可相對移動以致于毛細管可在界面室中滑動，所述界面室可合適地成形以便容納和懸浮液體；建立測量所述電極間電流和電壓中至少一種的手段；將界面系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至包含測試化合物的儲器中；和測量流過所述細胞膜的電流。
另一實施方案提供一種將細胞貼附到毛細管上的方法。在毛細管內(nèi)施加正壓力。將所述毛細管插入細胞層。降低所述毛細管內(nèi)的壓力以在毛細管和特定細胞間形成千兆歐密封。在降低步驟之后，將毛細管從細胞層移開。在移開步驟之后，進一步降低毛細管內(nèi)壓力以便建立特定細胞的全細胞模式(whole cell configuration)。
本發(fā)明的前述的和其它的目的、優(yōu)點和突出特征，通過下面對一些示例性實施方案的描述并結(jié)合附圖而變得顯而易見，其中在各附圖中，相同的標(biāo)號表示相同的元件。


圖1A-1C圖解示例性膜片鉗系統(tǒng)，其中繞組(coil)形界面室相對于細胞放置以形成界面系統(tǒng)。
圖2A-2C顯示根據(jù)本發(fā)明實施方案的高細胞密度盲法膜片鉗。
圖3圖解包括一界面系統(tǒng)和多孔板的示例性膜片鉗系統(tǒng)。
圖4顯示毛細管和細胞的示例性實施方案。
圖5圖解示例性界面系統(tǒng)。
圖6顯示使用圖1A-1C系統(tǒng)的方法的流程圖。
圖7圖解顯示跨細胞膜的電流與時間的關(guān)系圖。
圖8圖解顯示峰電流和分部阻斷與測試物質(zhì)濃度的關(guān)系圖。
圖9圖解顯示跨細胞膜的電流與時間的關(guān)系圖。
圖10A-10B圖解顯示使用本發(fā)明的實施方案獲得的離子通道電流測量結(jié)果圖。
圖11A-11B圖解從穩(wěn)定表達hERG通道的HEK293細胞所獲得的離子電流圖。
圖12A-12B圖解顯示在穩(wěn)定表達hERG通道的HEK293細胞中E4031對鉀電流影響圖。
發(fā)明詳述圖1A-1C圖解說明根據(jù)本發(fā)明的一實施方案的界面系統(tǒng)7。界面系統(tǒng)7包括細胞10；可連接到細胞膜10a的毛細管2；可移動以圍住毛細管尖端2a的界面室6；其連接到界面室6的桿8；和可浸沒毛細管尖端2a的液體12。
如圖1A所示，例如在顯微機下可建立膜片鉗技術(shù)的全細胞模式。在圖1B中，繞組形界面室6可拉到越過電極尖端，并且細胞可浸在溶液中，形成界面系統(tǒng)7。在圖1C中，界面系統(tǒng)7可從該溶液移開。
如圖1B、1C和圖3所示，“界面系統(tǒng)”7可包括毛細管2、以足以在毛細管2和細胞膜10a之間形成密封的方式貼附到毛細管尖端2a上的細胞10、和界面室6，界面室6圍住毛細管尖端2a、細胞10和小體積的通過毛細力和/或液體的表面張力懸浮于界面室6中的液體26。液體26懸浮于界面室6的內(nèi)部區(qū)域中。
毛細管2可以在一端或兩端為中空的，并且優(yōu)選地其形狀為近似圓柱形。毛細管2可以在其尖端2a處有一開口。毛細管2可以為近似錐形。毛細管尖端2a可具有使其可附著細胞10如哺乳動物、昆蟲、兩棲動物或其它細胞的尺寸和形狀。例如，毛細管尖端2a的開口可具有近似0.1到10微米的直徑。
毛細管2可包括任何管狀裝置，或形狀為管狀的裝置的任一部分。優(yōu)選地，毛細管2包括膜片吸管。如本文所使用，術(shù)語“膜片吸管”指的是膜片鉗技術(shù)中所使用的任何管，該管附著到細胞10并形成千兆歐密封。更優(yōu)選地，毛細管2包括端部為錐形的、具有毛細管尖端2a的管，且被稱作“微量吸管”?？蓪⑽⒘课芗舛?a的開口構(gòu)造成能附著到動物細胞10，例如哺乳動物細胞的細胞膜10a上。
圖2A-2C顯示根據(jù)本發(fā)明實施方案的高細胞密度盲法膜片鉗。此高細胞密度盲法膜片鉗可用于將細胞10附著到毛細管2。在一實施方案中，穩(wěn)定表達hERG通道的細胞可通過傳統(tǒng)方法酶解分離，收集到管中并離心。隨后，將細胞收集到另一管中并允許沉淀形成密集細胞層11，例如深度為1-10mm，優(yōu)選地深度為2-7mm，更優(yōu)選地深度為3-5mm的層。上述的細胞層11的性質(zhì)使得能夠?qū)⒛て?插入細胞，而不使吸管尖端2a破裂。例如，膜片吸管尖端2a可插入細胞層11中1-4mm深。這可實現(xiàn)膜片吸管的盲法操作，以及特定細胞10的細胞膜和膜片吸管2間高電阻緊密電連接(千兆歐密封)的盲法形成。下面描述實現(xiàn)其的一種方法。
首先，參考圖2A，對膜片吸管2內(nèi)施加正壓。例如，正壓力可以為900-1000mmHg(絕對值)。吸管2可置于管內(nèi)并在細胞層11表面之上，例如表面之上10mm。
第二，參考圖2B，將膜片吸管2插入細胞層11中。插入的深度可在毫米或微米的任何范圍間變動。在圖2B所示的例子中，深度可改變，例如在1mm和5mm間改變。改變壓力(例如，改變到700mmHg)可引起自發(fā)形成吸管2和特定細胞10間的千兆歐密封。形成千兆歐密封后，膜片吸管2和附著到吸管尖端2a的細胞10可從細胞層11移開。然后，吸管2和細胞10可置于細胞層11之上，例如該層11之上10-15mm。
第三，參考圖2C，通過改變該膜片吸管2內(nèi)的壓力，例如改變到600-650mmHg，可建立全細胞模式。此后，壓力可保持在另一壓力下，例如700-740mmHg的較高壓力下，以確保膜片鉗記錄的穩(wěn)定性。
應(yīng)該注意，在圖2A-2C所示的過程期間的任何時間點，界面室6可用于容納細胞10和/或液體12。例如，在吸管2位于圖2B所示位置時，界面室6可從液體12表面之上的、吸管2的軸上的一位置移動到液體12表面下的一位置，其中界面室6容納細胞10，如圖2C所示。這可在吸管2與細胞10形成千兆歐密封之后(或之前)發(fā)生。在一優(yōu)選實施方案中，界面室6不插入細胞層11(圖2B)，因為這可潛在地損害細胞并因此增加失敗率。
一旦細胞10附著到膜片吸管2，其可移出細胞層11(圖2C)，并且界面室6以覆蓋所密封連接的細胞10的方式放置。然后，界面室6和吸管2可作為組合整體，即作為界面系統(tǒng)7移動，這保持細胞10、吸管2以及界面室6的相對位置。如果期望，現(xiàn)在可將界面系統(tǒng)7移出該管，并經(jīng)空氣安全地移入一種或多種不同的儲器18。當(dāng)期望避免細胞10暴露于空氣中時，此方法或有關(guān)方法是優(yōu)選的，這是因為界面室6能夠帶起包圍細胞10的液體浴。
本發(fā)明的其它實施方案涉及使用例如圖1B、1C和圖3中的本發(fā)明的界面系統(tǒng)7來測量細胞10的特性的方法。該界面系統(tǒng)7包括毛細管2；以足以在毛細管2和該細胞10的細胞膜10a間形成密封的方式貼附于毛細管尖端2a的細胞10；和界面室6，界面室6圍住毛細管尖端2a、細胞10和小體積的通過毛細力和/或液體的表面張力懸浮于界面室6中的液體26。
圖3圖解說明包括界面系統(tǒng)和多孔板的示例性膜片鉗系統(tǒng)。該膜片鉗系統(tǒng)可包括一多孔板16，該板16包括一個或多個儲器18。如本文中所使用的，術(shù)語“儲器”指的是能容納小體積液體的任何表面。這包括孔和凹坑以及平的表面，其中小體積液體形成通過液體表面張力維持在一起的不同液滴。優(yōu)選地，儲器18可以容納的液體的最小體積為1μL、5μL、10μL、50μL、100μL、200μL或500μL。優(yōu)選地，儲器18可以容納的液體的最大體積為1mL、2mL、5mL或10mL。儲器還可容納這些最小值和最大值的組合，例如，儲器18可容納增加量的液體，例如5μL和2mL之間、或100μL和1mL之間以及增量間的增量。更優(yōu)選地，儲器18可容納10μL和2mL之間的液體。更為優(yōu)選地，儲器18可容納20μL和1mL之間的液體。儲器18的每一個可含有一種或多種測試化合物20，或可含有中性溶液。該測試化合物20可包括藥品，或者備選地其包括惰性液體，例如惰性水溶液或鹽溶液。
優(yōu)選地，界面室6包括電極，并且優(yōu)選地毛細管尖端2a與細胞膜10a密封。在一實施方案中，界面系統(tǒng)7被轉(zhuǎn)移至含有包含測試化合物20的溶液的儲器18。優(yōu)選地，電極4接到測量流經(jīng)該電極4的電流的設(shè)備和/或測量跨電極4和另一參考如界面室6的電壓的設(shè)備?？蓪λ鲭姌O施加外電流，以建立期望值的參考電壓或電流。此外，在界面系統(tǒng)7置于包含測試化合物20的溶液之前和/或之后，可用電測量裝置測量流過細胞膜10a的電流(和/或跨界面室6和電極4的電壓)，該電測量裝置包括在界面室6和電極4之間連接的電路。
在優(yōu)選實施方案中，可以在細胞中測量一種或多種下列參數(shù)(例如，電性質(zhì))電壓鉗中的電流、跨電極和/或跨細胞或細胞膜的電壓、電阻、阻抗、電容、光學(xué)熒光、等離子共振(plasmon resonance)、機械共振、流動性和/或硬度。
在本發(fā)明的另一方面，可對同一細胞10進行進一步測試。在本發(fā)明的該方面，界面系統(tǒng)7移開儲器18并通過將該界面系統(tǒng)7置于沒有測試化合物的溶液20中以沖洗界面系統(tǒng)7。優(yōu)選地，沖洗進行2-5次，從而殘留在界面室6所含流體中的任何測試化合物被稀釋到其對細胞10的活性水平之下。然后，界面系統(tǒng)7可轉(zhuǎn)移至含有包含另一測試化合物20的溶液(或沖洗液)的另一儲器18。備選地，若細胞10自同一測試化合物的較低濃度處移動到較高濃度處，則根據(jù)實驗室的標(biāo)準(zhǔn)慣例可取消沖洗步驟。如上所述，可測量細胞、細胞膜或系統(tǒng)的電性質(zhì)。根據(jù)需要重復(fù)該過程多次。
優(yōu)選地，由一多孔或微量滴定板16提供儲器18。為了本發(fā)明的目的，儲器18應(yīng)該是用于容納液體的孔和凹坑以及平板陣列，其提供足夠的表面張力以允許測試樣品的聚結(jié)足夠使界面室插入到儲器18中。儲器18可包括一種或多種不同的化合物。在本發(fā)明的一方面中，測試化合物20包括候選藥物或活性試劑，例如通道或轉(zhuǎn)運蛋白阻斷劑或活化劑。例如，儲器18可包含治療癌癥的藥物溶液。測試化合物20還可包括惰性液體，例如惰性水溶液或鹽溶液。
優(yōu)選地，測量細胞10的特性所需要的測試化合物20的溶液體積小于5毫升。所需要的最小的體積可以為10μL、20μL、30μL、50μL和80μL以及這些體積之間的增量。所需要的最大體積可以為0.5mL、1mL、2mL和5mL以及這些體積之間的增量。測試溶液體積也可為這些最小值和最大值的任何組合；例如，體積可以是液體的增量，例如在30μL和0.5mL之間或在50μL和5mL之間。更優(yōu)選地，體積在20μL和1mL間。例如，可以為一96孔板，其中每一孔設(shè)計成容納0.3-0.35mL溶液。
本發(fā)明的一優(yōu)點在于，其能夠?qū)崿F(xiàn)靶細胞10從一個儲器18到另一儲器的快速轉(zhuǎn)移。界面系統(tǒng)7可簡單地從一個儲器18移出并插入到另一儲器中。不需要耗時的化合物稀釋和灌注系統(tǒng)調(diào)整操作。重要地是，通過灌注來替換含有細胞10的浴室中的容納物的通常緩慢的步驟，被降低到將界面系統(tǒng)7從一儲器18移到下一儲器所花費的時間。此外，本發(fā)明消除了對附加管道系統(tǒng)或附件的需要，這極大地降低了成本和灌注系統(tǒng)內(nèi)可能殘留的殘留物引起的意外污染。測試化合物20通常可附著到灌注系統(tǒng)所用的管道系統(tǒng)，因此需要清潔或替換管道系統(tǒng)。本發(fā)明的測試系統(tǒng)消除了此問題。
本發(fā)明的另一優(yōu)點在于，當(dāng)細胞10在界面系統(tǒng)7中時其提供了圍繞細胞10的小的界面浴26體積，這確保了將細胞10從一儲器18移動到另一儲器時的小的稀釋體積。例如，在一優(yōu)選實施方案中，界面浴26的體積為儲器18中溶液體積的1/50和3/10之間，以及這些體積間的任何增量。更優(yōu)選地，界面浴26的體積小于儲器18中溶液體積的2/10。
優(yōu)選地，界面浴26可容納增加量的液體，例如最小體積為0.02μL、0.1μL、0.2μL、1μL、2μL、5μL、10μL或20μL，以及這些體積間的任何增量。優(yōu)選地，界面浴26可容納的液體最大體積為0.03mL、0.05mL、0.1mL、0.5mL、1mL、2mL或5mL，以及這些體積間的任何增量。界面浴26還可容納這些最小值和最大值的任何組合；例如，界面浴26可容納2μL和0.5mL之間或10μL和0.05mL之間的液體。更優(yōu)選地，界面浴26可容納10μL和0.5mL之間的液體。甚至更為優(yōu)選地，界面浴26可容納0.02mL和0.03mL之間的液體。例如，界面浴26可具有0.02-0.03mL的體積并且儲器溶液的體積可以為0.3-0.35mL。界面浴26的小體積進一步提供改善的平衡時間，這是因為界面浴26被化合物20快速稀釋，并且由于可使用較小的浸浴液體積，因此節(jié)約測試化合物20。
另一優(yōu)點在于，由于測試溶液和沖洗液應(yīng)用時間快，本發(fā)明的一些實施方案可用于測量配體門控通道。此優(yōu)點對于脫敏配體門控通道最明顯，這是因為在其脫敏之前(即，在其降低至基線水平以下之前)檢測離子電流。在此應(yīng)用中，如上所述從表達合適配體門控通道的細胞獲得記錄?？扇苄耘潴w放置在板的孔中，當(dāng)細胞移入孔中時，誘導(dǎo)出電流。孔還可包含測試化合物(除配體以外)，因此可檢查化合物對配體門控通道的效應(yīng)。
在本發(fā)明的另一方面中，使用圖1和圖3的界面系統(tǒng)7測量細胞10的特性的任何方法可以任選地通過計算機所控制的標(biāo)準(zhǔn)機器人和機械設(shè)備進行自動化。例如，機械系統(tǒng)可連接到毛細管2和桿8，并將界面系統(tǒng)7從一存儲器18移動到另一存儲器。此外，多個毛細管2可彼此相連，每一毛細管2帶有與毛細管尖端2a密封的細胞。多個毛細管2和桿8可插入多個儲器18。這允許同時測試多個細胞10。
圖4顯示根據(jù)本發(fā)明實施方案的毛細管2和細胞10的示例性實施方案。
對于本發(fā)明而言，毛細管2的長度不是關(guān)鍵的，只要毛細管2允許形成可與細胞10完全密封(優(yōu)選千兆歐姆密封)的毛細管尖端2a即可。優(yōu)選地，毛細管2可由不同的不導(dǎo)電材料例如塑料(例如聚苯乙烯)或玻璃制成。更優(yōu)選地，毛細管2可由任何這樣的材料制成該材料與生物膜緊密結(jié)合、具有良好非傳導(dǎo)特性、對于廣泛的化學(xué)物質(zhì)是惰性的并且容易清潔。例如，毛細管2可包括玻璃。
電極4在毛細管尖端2a內(nèi)，并且連接到電子放大器?？蓪㈦姌O4設(shè)置成能測量跨細胞膜10a的電流。如本文所使用，術(shù)語“電極”指的是物理發(fā)送器或?qū)w，其可將自毛細管溶液25(或細胞10)的電信號傳導(dǎo)或傳送到放大器。毛細管溶液25可傳導(dǎo)細胞10和電極4間的電流。在這里，電極4可在(或部分在)毛細管2內(nèi)。當(dāng)電極4接觸毛細管2內(nèi)的毛細管溶液25時，毛細管2充當(dāng)膜片電極。如本文所使用，術(shù)語“膜片電極”指的是還包括電極4的膜片吸管2，其全部附著到細胞10。因此，為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“膜片電極”和“毛細管電極”可互換。
為了該申請的目的，電極4指的是用于測量(或影響)來自毛細管2內(nèi)部的細胞電性質(zhì)的結(jié)構(gòu)(即“膜片電極”)。此結(jié)構(gòu)可包括電極4以及溶液25。此結(jié)構(gòu)4不同于用于測量(或影響)毛細管2之外的電性質(zhì)的參比電極28。在毛細管尖端2a的千兆歐姆密封在兩個電極4、28所影響范圍間產(chǎn)生電屏障。
在一優(yōu)選實施方案中，膜片電極2是微電極。如本文所使用，術(shù)語“微電極”指的是適當(dāng)尺寸的用于記錄來自各個細胞的信號的膜片電極2。
根據(jù)本發(fā)明的一實施方案，膜片電極2的尖端可接觸細胞10，以形成膜片鉗記錄。如本文所使用，術(shù)語“膜片鉗”指的是膜片電極的構(gòu)造，其允許通過將膜片電極放置成與細胞膜的小區(qū)域接觸，來記錄來自生物膜的信號。該膜片鉗可以為“全細胞膜片鉗”，其指的是這樣的膜片鉗構(gòu)造其允許通過將膜片鉗放置成與細胞膜的小區(qū)域接觸，然后使細胞膜的該小區(qū)域(膜片)破裂，來記錄來自整個細胞膜的信號。
當(dāng)毛細管尖端2a接觸細胞10的細胞膜10a時，在毛細管尖端2a和細胞10之間可形成密封。優(yōu)選地，該密封足夠緊，并且在細胞膜10a和毛細管尖端2a間獲得超過1千兆歐姆、優(yōu)選10千兆歐姆的電阻。本領(lǐng)域公知形成千兆歐姆密封的方法。
電極4可連接到測量跨電極4和另一參比電極，例如界面室6或參比電極28的電流和/或電壓的測量設(shè)備?？蓪㈦姌O4設(shè)置成能測量跨與毛細管尖端2a接觸的細胞10的膜10a的電壓和/或電流，所述細胞10和毛細管尖端2a被包在包括電極的界面室6內(nèi)。
返回到圖1A-1C和圖3，本發(fā)明的界面室6可以制作成包括空腔。優(yōu)選地，腔具有的尺寸和形狀使得表面張力和/或毛細力足以使液體26附著在界面室6內(nèi)。優(yōu)選地，界面室6可懸浮少至1μL以及多至1mL的液體。因此，界面室6可懸浮增加量的液體，例如1μL、5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL、750μL或1mL的液體，以及在該增量間的增量的液體。如本文所使用，術(shù)語“懸浮”指的是容納或保持液體的能力。
在一些實施方案中，界面室6的腔比毛細管尖端2a的寬度寬，從而毛細管尖端2a可完全被圍在界面室6內(nèi)。優(yōu)選地，界面室6形狀為如圖1A所示例的基本圓柱形的。界面室6可以包括任何固體材料。優(yōu)選地，界面室6由傳導(dǎo)性材料如金屬組成。在一些實施方案中，界面室6具有充當(dāng)參比電極28的能力。
在一優(yōu)選實施方案中，界面室6可包括電極28，例如圖1和圖3所示例的金屬繞組。因此，界面室6可具有兩種功能，作為容納液體26的界面室6，和作為用于膜片鉗測量的參比電極28。優(yōu)選地，繞組6、28具有1毫米到10毫米的直徑。優(yōu)選地，繞組的環(huán)間距離在0.01毫米到2毫米之間。
繞組形界面室/電極6、28的一個優(yōu)點在于其提供最大的液體表面積，因此能夠?qū)崿F(xiàn)在界面室6內(nèi)毛細力和/或表面張力保持液體26的最大效果。反過來，這提供對液體26的穩(wěn)定參比電壓測量(部分由參比電極28維持)，其幫助獲得準(zhǔn)確的膜片鉗測量。
圖5顯示界面室6的另一實施方案。在此實施方案中，界面室6包括一管。該管6可以由塑料或另一種材料(例如另一種不導(dǎo)電材料)制成。參比電極28可以在管6之外。參比電極28可連接到管6。管6具有幾乎等于(但稍微大于)毛細管2半徑的半徑，從而通過將毛細管2滑進管6(或管6滑進毛細管2)使毛細管2與管6連接。在插入時，管6和毛細管2之間的摩擦使它們連接在一起，這類似于筆與筆帽連接的方式。
在一優(yōu)選實施方案中，桿8可連接到界面室6，如圖1與圖2所示。在一備選實施方案中，桿8和界面室6一起構(gòu)成剛性部件設(shè)備。桿8由任何剛性材料構(gòu)成。優(yōu)選地，桿8適合于連接到機器上，從而該機器可通過移動桿8而控制界面室6的移動。優(yōu)選地，桿8的表面由不導(dǎo)電材料如塑料或陶瓷構(gòu)成，從而當(dāng)人或機器接觸桿8的表面時，其不影響界面室6的電性質(zhì)。
在一些實施方案中，桿8具有內(nèi)芯，其包括參比電極28或連接到參比電極28的導(dǎo)體。(因此，界面室6、桿8或界面室6和桿8兩者可包括參比電極28。)桿8的一端可連接到界面室6，而另一端連接到電測量設(shè)備。
該電測量設(shè)備還可連接到電極4，從而該電測量設(shè)備、電極4和參比電極28為閉合線路的一部分。該閉合線路還可包括在界面室6內(nèi)的細胞10和液體26。因此，桿8的內(nèi)芯可使該電測量設(shè)備能夠控制和/或監(jiān)測界面室6的電性質(zhì)，例如流過細胞膜10a的電流，或跨參比電極28和另一設(shè)備例如電極4的電壓。
桿8可用于移動界面室6。在一優(yōu)選實施方案中，桿8用于使界面室6沿毛細管2的軸線移動。以這種方式，毛細管2和界面室6的相對移動可引起毛細管尖端2a移動到界面室6內(nèi)。在一實施方案中，桿8可用于使界面室6沿桿8的長度方向來回移動。例如，人或機器可移動桿8并且相應(yīng)地移動與桿連接的界面室6。
桿8可通過緊固件22與毛細管2連接(圖1C所示)，從而兩者可容易地一起移動，而沒有相對運動或具有少許相對運動。緊固件22可連接到毛細管2，和/或其可連接到桿8。緊固件22可包括任何將毛細管2與桿8相連的連接裝置。以這種方式，毛細管尖端2a可置于相對界面室6的一固定位置。在一優(yōu)選實施方案中，桿8、界面室6和緊固件22構(gòu)成一剛性裝置，該剛性裝置可移動，但其部件部分沒有相對運動或具有少許相對運動。此外，在一優(yōu)選實施方案中，毛細管尖端2a的固定位置可接近或位于界面系統(tǒng)7的中央。
備選地，緊固件22可直接將毛細管2與界面室6相連。在此情況下，優(yōu)選地，緊固件22由不導(dǎo)電材料構(gòu)成，以避免影響界面室6的電性質(zhì)。
若液體26懸浮在界面室6內(nèi)，則毛細管尖端2a可在液體26內(nèi)移動。備選地，若毛細管尖端2a已在液體浴12中，則界面室6可移動到液體浴12，從而界面室6可圍住毛細管尖端2a和/或全部或部分液體浴12。當(dāng)界面室6自液體浴12移開時，由于液體的表面張力和/或毛細力，界面室6的腔內(nèi)包含來自液體浴12的全部或部分液體。包含在界面室6的腔中的此體積的液體26以下稱作為“界面浴”26。
使用本發(fā)明系統(tǒng)可研究多種不同細胞類型?？裳芯康囊恍┘毎牟煌耆夸洶↗urkat淋巴瘤細胞；HEK293細胞；中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如，包含離子通道/轉(zhuǎn)運蛋白的細胞系)；自神經(jīng)元組織的原代細胞，例如海馬、神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞；骨骼??；平滑肌；心?。幻庖呒毎?；血細胞；上皮細胞；內(nèi)皮細胞；植物細胞；以及基因工程細胞。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，動物細胞10與毛細管2密封，且被測驗。更優(yōu)選地，該細胞包含位于其細胞膜10a中的天然的或通過公知的分子生物學(xué)技術(shù)人工導(dǎo)入的離子通道或轉(zhuǎn)運蛋白。在一實施方案中，細胞10為哺乳動物細胞、昆蟲細胞或兩棲動物細胞。更優(yōu)選地，該細胞為人類細胞。
圖6圖解顯示根據(jù)本發(fā)明實施方案的、使用圖1和圖3的界面系統(tǒng)7的優(yōu)選方法的流程圖。
在步驟101中，如圖1A所示，毛細管尖端2a附著到細胞10的細胞膜10a。附著時，細胞10可在液體浴12中。該附著可以以毛細管可附著到細胞的任何方式進行，其可涉及輕微的吸力和電壓來密封毛細管尖端2a與細胞10。優(yōu)選地，毛細管2以毛細管尖端2a覆蓋細胞膜10a的一種或多種蛋白離子通道的方式貼到細胞10上。更優(yōu)選地，通過更強的吸力和/或電壓使毛細管尖端2a內(nèi)的細胞膜10a的膜片破裂，以形成整個細胞膜10a的全細胞膜片記錄。優(yōu)選地，毛細管2包括電極4。優(yōu)選地，界面室6包括繞組形電極。在此步驟中，界面室可在遠離毛細管尖端2a的位置圍住毛細管2。
在步驟102中，毛細管2和界面室6可彼此相對運動，從而界面室6圍住毛細管尖端2a和貼到其上的細胞10。這可以通過移動與界面室6連接的桿8，從而界面室6沿毛細管2的軸線向毛細管尖端2a移動而實現(xiàn)，或者通過移動毛細管2，從而毛細管尖端2a和細胞11被界面室6圍住來實現(xiàn)。當(dāng)界面室6圍住毛細管尖端2a和細胞10時，形成界面系統(tǒng)7。
在可選的步驟103中，用緊固件22將毛細管2(或毛細管支持物)和界面室6安裝在一起，從而它們可以容易地一起移動，而沒有相對運動具有少許相對運動。備選地，在此步驟103中，緊固件22可用于將毛細管2直接連接到界面室6。在此情況下，優(yōu)選地，緊固件22由不導(dǎo)電材料構(gòu)成，以避免影響界面室6的電性質(zhì)。
在步驟104中，界面系統(tǒng)7從液體浴12移開，并且在該過程中優(yōu)選地將一部分液體浴12移走并懸浮。應(yīng)該注意，界面系統(tǒng)7作為組合整體移動；該系統(tǒng)7的部件可固定在一起，以促使它們作為一系統(tǒng)移動(如可選步驟103所述)，或者部件可同時一起移動，以使它們作為一個系統(tǒng)7移動。在界面室6的腔中懸浮的小體積的液體26為界面浴26，且其連續(xù)地圍繞細胞10。優(yōu)選地，界面浴26的毛細力和/或表面張力保持該液體不會通過界面室6中的任何間隙或孔泄漏。例如，若界面室6具有繞組的形狀，那么界面浴26的表面張力會防止其通過繞組的環(huán)泄漏。在一優(yōu)選實施方案中，當(dāng)毛細管2和細胞10自液體浴12移開時，毛細管尖端2a將留在相對于界面室6和界面浴26的一個固定位置。
在可選的步驟105中，沖洗細胞10。此步驟可包括將界面系統(tǒng)7插入沖洗液例如中性水溶液中。優(yōu)選地，該沖洗液不包含任何活性成分或測試藥物。更確切地說，用沖洗液沖洗細胞10。沖洗液還可清除或代替懸浮在界面室6中的液體。如過程需要，在需要沖洗細胞10的任何時候，可進行此沖洗步驟；例如，在細胞10浸入含有測試化合物20的溶液之后，可沖洗細胞10。優(yōu)選地，沖洗溶液被置于板16的儲器18中。
在步驟106中，將細胞10插入儲器18。優(yōu)選地，該儲器18含有測試溶液，例如候選藥物20。
在步驟107中，測量跨電極4和細胞膜10a的電流和/或電壓。
在可選的步驟108中，界面系統(tǒng)7自儲器18移出，并且可選地按步驟105所述沖洗。
在可選的步驟109中，將界面系統(tǒng)7插入另一儲器18中，并且對許多儲器18重復(fù)該測量過程(可選地有沖洗步驟105)。優(yōu)選地，每一儲器18含有不同濃度的同一藥物，或者備選地儲器18含有相同或不同濃度的不同藥物。使用包括電極的界面室6的一優(yōu)點在于，由于界面室6中包含的溶液體積小，因此其使得藥物擴散到細胞膜10a的效率最大化。使用相同的參比電極，并且隨著溶液的變化而膜片吸管容量(capacitance)保持相同，這保持了記錄的準(zhǔn)確性。
實施例實施例1圖7顯示根據(jù)本發(fā)明一個實施例中九種4-AP濃度對DRG神經(jīng)元中的外向鉀電流的影響。顯示了跨膜片鉗測量電極和細胞的電流與時間的關(guān)系。通過常規(guī)方法獲得全細胞記錄測量。按以上步驟101-103，界面室移動到圍繞該細胞。當(dāng)細胞處于含有正常鹽(對照)溶液的孔中時，記錄電流的測量結(jié)果。然后，將細胞從正常鹽溶液移動到含有濃度增加的(增加的增量自0mM到10mM)K+通道阻斷劑4-AP的孔中。對于每一測量，細胞保持在-50mV，以前脈沖階躍到-100mV達400ms，然后對于測試階躍到+40 mV。在測試脈沖之后，細胞被再極化到-60mV。每10秒進行掃描，并且每一孔掃描5次。在短時間如2秒內(nèi)，界面從一孔移動到下一孔。
顯示了因K+流出細胞而引起的外向電流。在所測試的最高濃度下，沒有保持任何失活電流，而存在明顯的未失活(持續(xù))電流。如所示，濃度增加的K+通道阻斷劑4-AP降低了通過細胞膜的電流。降低的電流與4-AP的預(yù)期阻斷效果是一致的。峰電流(每一測量結(jié)果圖左邊的尖峰)和端電流(對于每一測量的電流最終值)隨著4-AP濃度增加而降低。
實施例2圖8圖解顯示根據(jù)本發(fā)明一個實施例中分部阻斷的峰電流與測試物質(zhì)濃度的關(guān)系圖。在圖8中，自實施例1的峰電流(圖7)顯示為分部阻斷與測試物質(zhì)4-AP濃度的關(guān)系。如所示，如所預(yù)期隨著4-AP濃度增加，峰電流降低。所示的劑量反應(yīng)曲線說明，此系統(tǒng)具有準(zhǔn)確地測量多濃度測試物質(zhì)的能力。
實施例3圖9顯示根據(jù)本發(fā)明一個實施例中，跨膜片鉗測量電極的電壓變化的測量結(jié)果與時間的關(guān)系。在全細胞模式中，從CHO細胞膜獲得記錄。界面室在該細胞周圍移動，并固定到電極(步驟102和103)。在記錄期間，細胞自5mM KCl移動到20mM KCl。此操作由于鉀梯度跳變而改變了跨該膜的電壓。如所示，在約0.2秒內(nèi)，電壓達到穩(wěn)定狀態(tài)，該響應(yīng)時間(即溶液交換)比設(shè)計用于篩選的現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)和方法的響應(yīng)時間更快。
實施例4圖10A-10B圖解顯示使用本發(fā)明實施方案獲得的離子通道電流測量結(jié)果圖。在此實施例中，根據(jù)圖2A-2C所示方法，細胞附著到吸管上。在圖10A中，顯示了從穩(wěn)定表達hERG通道的HEK293細胞所獲得的離子電流的代表性記錄。細胞保持在-80mV。通過以20mV階躍的從-60mV到80mV的1秒測試電壓，接著-100mV的1秒超極化脈沖，誘導(dǎo)出外向鉀電流。掃描間隔時間為10秒。在圖10B中，對于hERG通道，顯示G/Gmax(電導(dǎo)系數(shù)/最大電導(dǎo)系數(shù))曲線。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，其中樣品測量數(shù)為7。
實施例5圖11A-11B圖解顯示從穩(wěn)定表達hERG通道的HEK293細胞所獲得的離子電流圖。在此實施例中，根據(jù)圖2A-2C所示方法，將細胞附著到吸管上。在圖11A中，顯示電流跡線。在圖11b中顯示相應(yīng)的尾電流-電壓曲線。在獲得這些測量結(jié)果時，細胞保持在-80mV。通過+40mV的1秒測試電壓，接著以10mV階躍的在-100mV和-20mV之間的2秒超極化脈沖，誘導(dǎo)出外向鉀電流。對于這些測量的掃描時間間隔為10秒。
實施例6圖12A-12B圖解顯示E4031對穩(wěn)定表達hERG通道的HEK293細胞中鉀電流的影響。在此實施例中，根據(jù)圖2A-2C所示方法，將細胞附著到吸管上。在圖12A中，顯示出對照細胞的電流跡線。在圖12B中，顯示出應(yīng)用5毫摩爾E4031溶液之后的細胞的電流跡線。細胞保持在-80mV。通過+40mV的1秒測試電壓，接著以0.1Hz應(yīng)用-100mV的2秒超極化脈沖，誘導(dǎo)出外向鉀電流。
實施例7本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可使用與以上方法類似的方法從配體門控通道獲得數(shù)據(jù)。將足以打開所研究通道的配體濃度加到孔中，當(dāng)將細胞插入孔中時可獲得離子電流?？梢钥吹?，數(shù)據(jù)跡線與實施例3中對于具有快速門控動力學(xué)的通道的數(shù)據(jù)跡線十分類似。此技術(shù)可用于任何配體門控通道，包括響應(yīng)谷氨酸、GABA和乙酰膽堿的通道。
應(yīng)該理解，本文所示和所述的本發(fā)明的具體實施方案僅是示例性的。在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以想到許多變體、變化、替換物和等效物。具體地，本申請中使用的術(shù)語應(yīng)該根據(jù)相關(guān)應(yīng)用中所使用的相似術(shù)語做廣義地理解。此外，應(yīng)該認識到，使用來自所述的一個實施方案的多種特征和來自另一實施方案的特征會落在本領(lǐng)域的技術(shù)人員技能范圍內(nèi)。因此意圖為，本文所述以及附圖所示的所有主題應(yīng)該被認為僅是示例性的，而非限制性的，并且本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求書決定。
權(quán)利要求
1.一種包括界面室的系統(tǒng)，其中所述界面室提供能夠懸浮細胞的界面浴。
2.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其還包括含有電極的吸管，所述吸管與所述細胞連接。
3.如權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述界面室是電極。
4.一種包括界面室的界面系統(tǒng)，其中細胞在千兆歐密封界面與毛細管連接，并且其中所述界面室和毛細管可相對移動從而毛細管可在界面室中滑動，所述界面室適于懸浮液體。
5.如權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)，其中所述微量吸管包括電極。
6.如權(quán)利要求5所述的系統(tǒng)，其中所述界面室是電極。
7.如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其中桿與所述界面室相連。
8.如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其中所述界面室形狀基本上為圓柱形。
9.如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其中所述界面室為繞組。
10.如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其中所述界面室適于懸浮體積不大于100μL的液體。
11.如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其中所述細胞為哺乳動物細胞。
12.如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其還包括用于測量所述電極間電流和電壓中至少一種的設(shè)備。
13.如權(quán)利要求12所述的系統(tǒng)，其還包括記錄裝置，其用于記錄由界面室電極和毛細管電極中至少一個所測量出的電壓和電流中的至少一種。
14.一種膜片鉗系統(tǒng)，其包括a)包括電極的毛細管；b)以足于在所述毛細管和所述細胞的細胞膜間形成千兆歐密封的方式與毛細管連接的細胞；c)包括電極的界面室，其中所述界面室和毛細管可相對移動從而毛細管可在界面室中滑動，所述界面室被適宜制作成可容納和懸浮液體；d)用于測量所述電極間電流和電壓中至少一種的設(shè)備；以及e)包含多個儲器的板，其中至少一個儲器含有測試化合物。
15.一種測量細胞特性的方法，其包括a)將細胞置于界面室中，其中所述界面室在界面浴中懸浮所述細胞，并且其中所述細胞貼附到毛細管上；以及b)測量所述細胞的一種或多種特性。
16.一種測量細胞特性的方法，其包括a)將細胞置于界面室中，其中所述細胞經(jīng)千兆歐密封貼附到毛細管上，并且其中所述界面室和毛細管可相對移動從而毛細管可在界面室中滑動；以及b)測量所述細胞的一種或多種特性。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述界面室是電極。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述界面室電極和微量吸管電極被設(shè)置成測量跨細胞膜的電流。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述界面室與桿相連，其還包括使用桿使界面室沿毛細管的軸移動。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述細胞為哺乳動物細胞。
21.如權(quán)利要求17所述的方法，其還包括a)將所述界面系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至儲器中，其中儲器含有測試化合物溶液；以及b)測量流過細胞膜的電流。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中測試化合物溶液體積小于350μL。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述儲器為布置在板上的多個儲器之一。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述多個儲器含有一種或多種不同的測試化合物。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其還包括對所述多個儲器重復(fù)所述的轉(zhuǎn)移和測量步驟，其中在每一測量步驟之前，將所述界面系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至一個不同的儲器中。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中在至少一個轉(zhuǎn)移步驟之前，沖洗界面系統(tǒng)。
27.如權(quán)利要求21所述的方法，其中一個或多個步驟是自動化的。
28.如權(quán)利要求16所述的方法，其還包括測量通過所述細胞膜中的一種或多種配體門控通道的電流。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中配體門控通道響應(yīng)選自谷氨酸、GABA和乙酰膽堿的化合物。
30.如權(quán)利要求16所述的方法，其還包括測量通過細胞膜中的一種或多種電壓門控通道的電流。
31.一種測量細胞特性的方法，其包括a)建立包括界面室的界面系統(tǒng)，其中以足于在毛細管和細胞間形成密封的方式將細胞貼附到毛細管上；并且其中所述界面室和毛細管可相對移動從而毛細管可在界面室中滑動，所述界面室被適宜制作成可容納和懸浮液體；b)建立用于測量所述電極間電流和電壓中至少一種的裝置；c)將界面系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至含有測試化合物的第一個儲器中；以及d)測量流過細胞膜的電流。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其還包括對一個或多個不同儲器重復(fù)轉(zhuǎn)移和測量步驟，其中在每一測量步驟之前將界面系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至一個不同的儲器中。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中在界面室從一個儲器轉(zhuǎn)移至另一儲器期間，毛細管電極的未補償?shù)娜萘勘３只鞠嗤?br> 34.一種將細胞附著到毛細管上的方法，其包括a)在毛細管內(nèi)施加正壓力；b)將毛細管插入密集的細胞層，其中所述毛細管插在適合于將一細胞附著到毛細管而不使毛細管尖端斷裂的深度；以及c)降低毛細管內(nèi)的壓力，以在毛細管和細胞間形成千兆歐密封。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其還包括a)從細胞層移開毛細管；以及b)進一步降低毛細管內(nèi)的壓力，以建立細胞的全細胞模式。
36.一種將細胞附著到毛細管上的方法，其包括a)在毛細管內(nèi)應(yīng)用約900-1000mm Hg(絕對值)的正壓力；b)將毛細管插入密集的細胞層；c)將毛細管內(nèi)的壓力降低到約700mm Hg，以在毛細管和細胞之間形成千兆歐密封；d)將毛細管從細胞層移開；以及e)將毛細管內(nèi)的壓力進一步降低到約600-650mm Hg，以建立細胞的全細胞模式。
37.一種測量細胞特性的方法，其包括a)將細胞置于界面室中，其中所述界面室在界面室的界面浴中將所述細胞懸浮，并且其中根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的方法將所述細胞貼附到毛細管上；b)測量細胞的一種或多種特性。
全文摘要
公開了一種用于開展用于膜片鉗技術(shù)的快速灌注的系統(tǒng)，其用于研究化合物對生物組織中的離子轉(zhuǎn)運通道的影響。本發(fā)明另外包括能夠使用小量待測試材料以及小量液體載體的微灌注室組件，從而使多個測試能夠在短時間內(nèi)完成。本發(fā)明更廣泛地涉及一種電生理藥物處理以及應(yīng)用裝置，其用于篩選化學(xué)品例如藥物，同時提供高通量和低體積的溶液和樣品。
文檔編號C12Q1/00GK101076600SQ200580014225
公開日2007年11月21日 申請日期2005年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月3日
發(fā)明者D·V·瓦瑟耶夫, M·R·鮑爾比 申請人:惠氏公司