專利名稱：使用固氮弓菌的脫氫酶由鏈烷酮制備旋光醇的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過將相應的酮酶促還原來制備旋光鏈烷醇的方法，特別涉及制備(1S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)丙-1-醇和(1S)-3-氯-1-(2-噻吩基)丙-1-醇。
背景技術：
(1S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)丙-1-醇(“度洛西汀(Duloxetine)醇”)是度洛西汀合成中的組成單元。度洛西汀是目前處于審批階段，預期用于抑郁和失禁適應癥領域的藥物。
EP-B-0273658描述了如下制備與度洛西汀相對應的堿的方法在曼尼希反應中使2-乙酰噻吩與甲醛和二甲胺反應、將由此獲得的曼尼希堿的酮基還原成外消旋(S)-3-N，N-二甲氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇，用氟化萘基使醇官能醚化并最終將二甲氨基轉化成甲氨基官能。使用手性原材料或通過外消旋物在最終產物階段的分解，例如通過使用旋光酸的鹽或通過在手性固定相上的色譜法，獲得所需的萘基酯對映體。
US-5,362,886描述了類似的方法，其包括在酮基還原之后獲得的外消旋丙醇中加入S-苯乙醇酸。將以該方法獲得的醇的S-對映體用于隨后的反應階段。
EP-A-0457559也描述了與EP-B-0273658類似的方法。在此，使用不對稱還原系統(tǒng)LAH-lcb(氫化鋁鋰[(2R，2S)-(-)-4-二甲氨基-1，2-二苯基-3-甲基-2-丁醇])將曼尼希醇的酮基還原成醇的S-對映體形式。在此，除成本外，缺點還在于LAH-lcb還原系統(tǒng)的敏感性僅能穩(wěn)定數(shù)分鐘。
W.J.Wheeler和F.Kuo在Labelled Compounds andRadiopharmaceuticals雜質，XXXVI卷，第3期，213至223頁中描述了制備度洛西汀的方法。最后，在存在催化量的在DMPU(二甲基亞丙基脲)中的芐基氯-雙(三苯膦)鈀(II)的情況下，使噻吩-2-羰基氯在Stille偶聯(lián)中與乙烯基三正丁基錫烷反應以產生式(V)的1-(噻吩-2-基)-丙烯酮。
隨后用氯化氫處理，將其轉化成式(VI)的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮 然后使用手性oxazaborylidine和BH3將由此方式獲得的氯丙酮還原以獲得式(VII)的(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇 通過隨后與碘化鈉反應并隨后與甲胺反應，將由此方式獲得的醇轉化成(S)-3-甲氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇。隨后相繼與氫化鈉、1-氟萘和氯化氫反應，產生了鹽酸鹽形式的度洛西汀。
Hal＝鹵素T.Stillger等人在Chemie Ingenieur Technik(74)1035-1039頁，2002，描述了使5-氧代己酸乙酯酶促對映體選擇性還原以產生(S)-5-羥基己酸乙酯的底物(substrate)偶聯(lián)輔因子再生法。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的目的在于發(fā)現(xiàn)立體有擇還原取代鏈烷酮(例如3-甲氨基-1-(2-噻吩基)丙酮和3-氯-1-(2-噻吩基)丙酮)的方式，其用于盡可能以廉價方法定量制造產品的反應法。
由于意外地發(fā)現(xiàn)具有脫氫酶活性的酶，特別是可以由固氮弓菌屬(Azoarcus)的微生物制成的酶，能夠立體有擇地催化上述反應，同時進行輔因子再生，由此實現(xiàn)了該目的。
本發(fā)明首先涉及制備式I的旋光鏈烷醇的方法 其中n是0至5的整數(shù)；Cyc是任選取代的單核或多核、飽和或不飽和碳環(huán)或雜環(huán)，且R1是鹵素、SH、OH、NO2、NR2R3或NR2R3R4+X-，其中R2、R3和R4彼此獨立地為氫或低碳烷基或低碳烷氧基且X-是抗衡離子，該方法包括在存在還原等同物(equivalent)的情況下，在包含式II的鏈烷酮的培養(yǎng)基中孵育選自脫氫酶、醛還原酶和羰基還原酶類的酶(E)， 其中n、Cyc和R1如上所定義，將式II的化合物酶促還原以產生式I的化合物，并借助于酶(E)使犧牲醇(sacrificial alcohol)反應以產生相應的犧牲酮并從反應培養(yǎng)基中至少部分去除所述犧牲酮，從而使反應過程中消耗的還原等同物再生，并分離形成的產物(I)。
根據(jù)本發(fā)明特別合適的酶(E)是醛-酮還原酶超家族的醛-酮還原酶家族的酶(K.M.Bohren，B.Bullock，B.Wermuth和K.H.Gabbay J.Biol.Chem.1989，264，9547-9551)和短鏈醇脫氫酶/還原酶[SDR]。在例如H.Jrnvall，B.Persson，M.Krook，S.Atrian，R.Gonzalez-Duarte，J.Jeffery和D.Ghosh，Biochemistry，1995，34，6003-6013頁或U.Oppermann，C.Filling，M.Hult，N.Shafqat，X.Q.Wu，M.Lindh，J.Shafqat，E.Nordling，Y.Kallberg，B.Persson和H.Jornvall，Chemico-Biological Interactions，2003，143，47-253頁中詳細描述了后一類酶。
在所述酶類中，短鏈醇脫氫酶特別合適。
本發(fā)明的特別合適的實施方案是在上述方法中使用酶(E)，其中E具有多肽序列(i)SEQ ID NO2或(ii)與SEQ ID NO2相比，其中多達25％的氨基酸基團已經通過缺失、插入、取代或其結合改變，且保持了SEQ ID NO2的至少50％酶活性。
在特別優(yōu)選的實施方案中，該方法用于制備式III的1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇的衍生物。
其中R1＝Cl或NHCH3，其中在包含式IV的1-(2-噻吩基)丙酮衍生物的培養(yǎng)基中 將該化合物酶促還原以產生式III的化合物，并分離形成的基本對映純性產物。
優(yōu)選在該方法中使用具有脫氫酶活性的酶，其可以由固氮弓菌屬、Azonexus、Azospira、Azovibrio、脫氯單胞菌屬(Dechloromonas)、高鐵桿菌屬(Ferribacterium)、Petrobacter、Propionivibrio、四瓣藻屬(Quadricoccus)、紅環(huán)菌屬(Rhodocyclus)、Sterolibacterium、Thauera和陶厄氏菌屬(Zoogloea)的微生物制成。
特別優(yōu)選的是固氮弓菌屬的脫氫酶。
由于其氨基酸序列，固氮弓菌屬物種EbN1苯基乙醇脫氫酶可以包括在短鏈醇脫氫酶/還原酶[SDR]中。在例如，H.Jrnvall，B.Persson，M.Krook，S.Atrian，R.Gonzalez-Duarte，J.Jeffery和D.Ghosh，Biochemistry，1995，34，6003-6013頁或U.Oppermann，C.Filling，M.Hult，N.Shafqat，X.Q.Wu，M.Lindh，J.Shafqat，E.Nordling，Y.Kallberg，B.Persson和H.Jornvall，Chemico-Biological Interactions，2003，143，247-253頁中詳細描述了所述類型的酶。在SDR類中，各個代表物的氨基酸序列可以互相差別很大。然而，已知特殊的氨基酸或氨基酸區(qū)域在SDR類中高度保守。C.Filling，K.D.Berndt，J.Benach，S.Knapp，T.Prozorovski，E.Nordling，R.Ladenstein，H.Jornvall和U.Oppermann，Journal of Biological Chemistry，2002，277，25677-25684頁描述了重要的保守SDR區(qū)。
固氮弓菌屬的實例是Azoarcus anaerobius、Azoarcus buckelii、Azoarcus communis、Azoarcus evansii、Azoarcus indigens、Azoarcustoluclasticus、Azoarcus tolulyticus、Azoarcus toluvorans、固氮弓菌屬物種、固氮弓菌屬物種22Lin、固氮弓菌屬物種BH72、固氮弓菌屬物種CC-11、固氮弓菌屬物種CIB、固氮弓菌屬物種CR23、固氮弓菌屬物種EB1、固氮弓菌屬物種EbN1、固氮弓菌屬物種FL05、固氮弓菌屬物種HA、固氮弓菌屬物種HxN1、固氮弓菌屬物種mXyN1、固氮弓菌屬物種PbN1、固氮弓菌屬物種PH002、固氮弓菌屬物種T和固氮弓菌屬物種ToNI。
特別優(yōu)選使用固氮弓菌屬物種EbN1脫氫酶。
在本發(fā)明方法的特別優(yōu)選實施方案中，具有脫氫酶活性的酶選自包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或由其衍生出的下述序列的酶——其中最多25％，優(yōu)選最多20％，特別優(yōu)選最多15％，特別是最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸殘基已經通過缺失、取代、插入或缺失、取代和插入的結合方式改變，其中與SEQ ID NO2相比，改變的多肽序列保持了SEQ ID NO2的至少50％，優(yōu)選65％，特別優(yōu)選80％，特別是高于90％的活性。在這點上，SEQ ID NO2的酶活性是指以對映體選擇性方式將式(IV)的酮(其中R1＝Cl)還原以產生具有通式(III)的(S)醇的能力。在實施例3和4中陳述了測定酶活性的確切條件。
在添加還原等同物，特別是NADH或NADPH的情況下進行本發(fā)明的方法。使用犧牲醇，優(yōu)選異丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇、3-己醇使反應過程中消耗的還原等同物再生，其中的犧牲醇在反應條件下通過酶(E)氧化成相應的犧牲酮。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，加入的犧牲醇不僅用再生使消耗的還原等同物，還充當助溶劑。優(yōu)選在液體2-相系統(tǒng)中操作，其中一相由水或水可混溶性溶劑構成，另一相由犧牲醇構成。優(yōu)選使用2-戊醇作犧牲醇。
相對于所用的每摩爾鏈烷酮(II)，還原等同物的用量優(yōu)選為0.001至100毫摩爾，特別優(yōu)選為0.01至1毫摩爾。
本發(fā)明的方法包括，從反應混合物中至少部分去除在消耗的還原等同物再生過程中通過犧牲醇的氧化制成的犧牲酮。優(yōu)選從反應培養(yǎng)基中完全去除形成的犧牲酮。這可以通過多種方法實現(xiàn)，例如使用選擇性膜或通過萃取或蒸餾法。優(yōu)選通過蒸餾的方法去除酮。在通過蒸餾去除酮的同時，通常同時還去除了部分犧牲醇，有時還額外去除了部分水相。通常通過進一步加入犧牲醇并且如果合適，進一步加入水，以平衡這些蒸餾損耗。蒸餾率為反應體積的0.02％/分鐘至2％/分鐘，優(yōu)選0.05％/分鐘至1％/分鐘。反應器護套溫度優(yōu)選在反應器內部溫度以上5-70開，優(yōu)選10-40開。
蒸餾在1-500毫巴，優(yōu)選10-200毫巴的壓力范圍內進行得尤其順利。
優(yōu)選實施方案包括在選自腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、假單孢菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)、Rhodococcaceae和諾卡氏菌科(Nocardiaceae)的細菌微生物存在下使通式II，例如式IV的化合物反應。所述微生物尤其可以是已經用上述定義的具有脫氫酶活性的酶編碼的核酸構建體轉化的重組微生物。
本發(fā)明特別涉及-從天然來源分離或重組制備產生具有脫氫活性的酶的微生物，
-繁殖所述微生物，-合適時，從所述微生物中分離所述具有脫氫酶活性的酶，或從所述微生物制備包含所述酶的蛋白質組分，及-將根據(jù)階段b)的微生物或根據(jù)階段(c)的酶轉移到包含式I的化合物的培養(yǎng)基中。
此外，本發(fā)明涉及包含如上定義的多肽的編碼序列的編碼核酸序列。
本發(fā)明進一步涉及包含有效連接到至少一個調節(jié)核酸序列上的如上定義的編碼核酸序列的表達盒。
本發(fā)明進一步涉及包含至少一個這種表達盒的重組載體。
本發(fā)明還涉及用至少一種本發(fā)明的載體轉化的原核或真核宿主。
最后，本發(fā)明涉及使用如上定義的具有脫氫酶活性的酶或使用產生所述酶的微生物制備式I或III的化合物，并涉及其的進一步加工，例如用以制備度洛西汀(式VIII) 發(fā)明詳述A.一般術語和定義除非另行說明，適用下列通用含義“鹵素”是氟基、氯基、溴基或碘基，特別是氟基或氯基。
“低碳烷基”是含有1至6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、異丙基或正丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基、正戊基或2-甲基丁基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2-乙基丁基。
“低碳鏈烯基”是上述含有2至6個碳原子的烷基的單或多，優(yōu)選單或二不飽和類似物，雙鍵可以位于碳鏈的任何位置。
“低碳烷氧基”是上述烷基的氧封端的類似物。
“芳基”是單核或多核，優(yōu)選單核或雙核，任何取代的芳基，特別是經由任何環(huán)位置鍵合的苯基或萘基，例如1-或2-萘基。如何合適，這些芳基可以包含1個或2個相同或不同的選自上述鹵素、低碳烷基、低碳烷氧基或三氟甲基的取代基。
取代鏈烷酮，(S)-鏈烷醇及其衍生物可根據(jù)本發(fā)明通過酶促催化獲得的鏈烷醇是上式(I)的那些，其中n是0至5的整數(shù)；Cyc是任選取代的單核或多核、飽和或不飽和碳環(huán)或雜環(huán)，且R1是鹵素、SH、OH、NO2、NR2R3或NR2R3R4+X-，其中R2、R3和R4彼此獨立地為氫或低碳烷基或低碳烷氧基且X-是抗衡離子。
可用于酶促合成的上式II的鏈烷酮本身是已知的化合物并可通過應用公知的有機合成法獲得(參照例如EP-A-0 273 658)。
在上述化合物中，n優(yōu)選為0、1或2，特別是1。
可以提出的碳環(huán)或雜環(huán)基團Cyc的實例具體是含有最多4個，優(yōu)選1或2個相同或不同的選自O、N和S的環(huán)雜原子的單核或雙核，優(yōu)選單核基團這些碳環(huán)或雜環(huán)具體含有3至12個，優(yōu)選4、5或6個環(huán)碳原子?？梢蕴岢龅膶嵗黔h(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、它們的單或多不飽和類似物，例如環(huán)丁烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基、環(huán)庚烯基、環(huán)己二烯基、環(huán)庚二烯基；以及含有1至4個選自O、N和S的雜原子的5至7元飽和或單或多不飽和雜環(huán)基團，如果合適，雜環(huán)可以與另一雜環(huán)或碳環(huán)稠合。必須特別提到由吡咯烷、四氫呋喃、哌啶、嗎啉、吡咯、呋喃、噻吩、吡唑、咪唑、唑、噻唑、吡啶、吡喃、嘧啶、噠嗪、吡嗪、苯并呋喃、吲哚和喹啉生成的雜環(huán)基團。
在這種情況下，基團Cyc可以經由任何環(huán)位置，優(yōu)選經由環(huán)碳原子鍵合到鏈烷酮或鏈烷醇上。
合適的Cyc基團的實例是2-噻吩基、3-噻吩基；2-呋喃基、3-呋喃基；2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基；4-甲基-2-噻吩基、3-乙基-2-噻吩基、2-甲基-3-噻吩基、4-丙基-3-噻吩基、5-正丁基-2-噻吩基、4-甲基-3-噻吩基、3-甲基-2-噻吩基；3-氯-2-噻吩基、4-溴-3-噻吩基、2-碘-3-噻吩基、5-碘-3-噻吩基、4-氟-2-噻吩基、2-溴-3-噻吩基和4-氯-2-噻吩基。
基團Cyc可以進一步被單或多取代，例如，單或二取代。取代基優(yōu)選位于環(huán)碳原子上。合適的取代基的實例是鹵素、低碳烷基、低碳鏈烯基、低碳烷氧基、-OH、-SH、-NO2或NR2R3，其中R2和R3如上所定義，優(yōu)選為鹵素或低碳烷基。
R1具體是鹵素、NR2R3或NR2R3R4+X-，其中R2、R3以及R2、R3和R4彼此獨立地為鹵素或低碳烷基或低碳烷氧基，且X-是抗衡離子，優(yōu)選基團R2、R3和R4任一個是氫。合適的抗衡離子的實例是酸陰離子，例如在制備酸加成鹽時制成的陰離子。其實例，例如在EP-A-0 273 658中提及，其經此引入本文?；鶊FR1的優(yōu)選實例具體是氟基或氯基以及NR2R3，其中R2和R3相同或不同，是氫或甲基、乙基或正丙基；R1特別優(yōu)選為氯基或-NH甲基。
C.具有脫氫酶活性的合適的酶具有脫氫酶活性的酶優(yōu)選包含根據(jù)SEQ ID NO2的氨基酸序列。
本發(fā)明還包括明確公開的具有脫氫酶活性的酶的“功能等同物”及其在本發(fā)明方法中的應用。
在本發(fā)明中，明確公開的酶的“功能等同物”或類似物是與這些酶不同但是仍然具有所需生物活性(例如，底物特異性)的多肽。由此，“功能等同物”是指，例如，將3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮還原成相應的S-醇并具有含有SEQ ID NO2中所列氨基酸序列的酶的至少50％，優(yōu)選60％，特別優(yōu)選75％，非常特別優(yōu)選90％活性的酶。功能等同物還優(yōu)選在pH 4至10之間穩(wěn)定并有利地具有pH 5至8的pH最佳范圍及20℃至80℃的溫度最佳范圍。
根據(jù)本發(fā)明，“功能等同物”還特別是指，在上述氨基酸序列的至少一個序列位點上具有與明確公開的氨基酸不同的氨基酸，但仍然具有上述生物活性之一的突變體?！肮δ艿韧铩庇纱税ㄍㄟ^一個或多個氨基酸添加、氨基酸取代、氨基酸缺失和/或氨基酸倒置獲得的突變體，所述改變可以在任何序列位點上發(fā)生，只要其產生具有本發(fā)明的特性譜的突變體。特別地，當突變體和未改變多肽的反應性模式(pattern)在性質上相符，也就是以不同的速率轉化相同的底物時，也存在功能等同性。
可以在下表中找到合適的氨基酸取代的實例


根據(jù)本發(fā)明，“功能等同物”還特別是指，在上述氨基酸序列的至少一個序列位點上具有與明確公開的氨基酸不同的氨基酸，但仍然具有上述生物活性之一的突變體?！肮δ艿韧铩庇纱税ㄍㄟ^一個或多個氨基酸添加、氨基酸取代、氨基酸缺失和/或氨基酸倒置獲得的突變體，所述改變可以在任何序列位點上發(fā)生，只要其產生具有本發(fā)明的特性譜的突變體。特別地，當突變體和未改變多肽的反應性模式在性質上相符，也就是以不同的速率轉化相同的底物時，也存在功能等同性。
上述意義上的“功能等同物”也是所述多肽的“前體”、所述多肽的“功能衍生物”及其“鹽”。
在本文中，“前體”是具有或沒有所需生物活性的多肽的天然或合成前體。
術語“鹽”是指本發(fā)明蛋白質分子的羧基的鹽及氨基的酸加成鹽。羧基的鹽可以以本身已知的方式制備并包含無機鹽，例如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽和鋅鹽，以及含有有機堿的鹽，例如胺，例如三乙醇胺、精氨酸、賴氨酸、哌啶和類似物。本發(fā)明還涉及酸加成鹽，例如無機酸(例如鹽酸或硫酸)的鹽，或有機酸(例如乙酸和草酸)的鹽。
也可以通過已知技術在官能氨基酸側基或在它們的N-末端或C-末端上制備本發(fā)明的多肽的“功能衍生物”。這種衍生物包括，例如，羧酸基團的脂族酯、羧酸基團的酰胺，這些酰胺可通過與氨或與伯胺或仲胺反應獲得；自由氨基的N-?；苌?，這些衍生物是通過與酰基的反應制成；或自由羥基的O-?；苌?，這些衍生物是通過與?；姆磻瞥?。
“功能等同物”自然還包括可由其他微生物獲得的多肽以及天然存在的變體。例如，可以通過序列比較確定同源序列區(qū)域并可以根據(jù)本發(fā)明的具體準則確定等同的酶。
“功能等同物”還包括本發(fā)明的多肽的片段，優(yōu)選各個結構域或序列基序，這些片段具有，例如，所需的生物功能。
此外，“功能等同物”是包含任何上述多肽序列或其衍生的功能等同物，以及至少一個在功能上與其不同并與其在N-末端或C-末端功能性連接的其他異源序列(即融合蛋白各部分間相互沒有顯著的功能損害)的融合蛋白。這種異源序列的非限制性實例是例如信號肽或酶。
本發(fā)明包含的“功能等同物”也是明確公開的蛋白質的同源物。所述同源物與明確公開的氨基酸序列之一具有使用Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad，Sci.(美國)85(8)，1988，2444-2448的算法計算出的至少60％，優(yōu)選至少75％，特別是至少85％，例如90％，95％或99％的同源性本發(fā)明的同源多肽的同源性百分率具體指基于本文明確描述的某一氨基酸全長的氨基酸殘基一致性百分率。
在蛋白質可能糖基化的情況下，本發(fā)明的“功能等同物”包含上述類型蛋白質的脫糖基或糖基化形式，以及可通過改變糖基化類型獲得的改性形式。
本發(fā)明的蛋白質或多肽的同源物可以通過突變，例如通過蛋白質的點突變或截短產生。
可以通過例如篩選突變體(例如截短突變體)的組合文庫來鑒定本發(fā)明蛋白質的同源物。例如，可以通過核酸水平的組合誘變(例如，通過合成寡核苷酸混合物的酶促連接)產生蛋白質變體的花斑文庫(variegatedlibrary)。有多種方法可用于從簡并的寡核苷酸序列制備可能的同源物的文庫。可以在DNA合成儀中進行簡并基因序列的化學合成，接著可將合成基因連接到合適的表達載體上。基因簡并集的使用使得可能在一種混合物中提供編碼需要的一組可能的蛋白質序列的全部序列。合成簡并寡核苷酸的方法為技術人員所公知(例如，Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 393；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等人(1984)Science1981056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11477)。
在先技術公開了多種用于篩選通過點突變或截短制備的組合文庫的基因產物的技術，以及多種用于篩選cDNA文庫以尋找具有所選特性的基因產物的技術?？梢允惯@些技術適用于快速篩選通過本發(fā)明同源物的組合誘變產生的基因文庫。通過高通量分析篩選大基因文庫最常使用的技術包括將基因文庫克隆進可復制的表達載體、將得到的載體文庫轉入合適的細胞并在所需活性的鑒定便于分離載體的條件下表達組合基因，所述載體編碼其產物已被檢測的基因?？膳c篩選實驗組合應用提高文庫中功能性突變體頻率的遞歸系綜誘變(Recursive ensemble mutagenesis，REM)技術，以鑒定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 897811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。
D.脫氫酶的編碼核酸序列本發(fā)明特別涉及本發(fā)明的具有脫氫酶活性的酶的編碼核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)。優(yōu)選例如根據(jù)SEQ IDNO2的氨基酸序列或者其特征部分序列的編碼核酸序列，或者包含根據(jù)SEQ ID NO1的核酸序列或其特征部分序列的核酸序列。
本文所述的所有核酸序列可以根據(jù)本身已知的方法從核苷酸結構單元的化學合成制備，例如通過雙螺旋的各個重疊的互補核酸結構單元的片段縮合。寡核苷酸可按已知方式化學合成，例如通過亞磷酰胺酸法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，896-897頁)。在Sambrook等人(1989)，Molecular ClongingA laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratory Press中描述了合成的寡核苷酸的裝配并借助于DNA聚合酶Klenow片段和連接反應填補缺口，以及普通的克隆法。
本發(fā)明還涉及編碼上述任一多肽的核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)以及使用例如人工核苷酸類似物得到的它們的功能等價物。
本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽或蛋白質或其生物活性片段的分離的編碼核酸分子，并涉及可用作例如雜交探針或識別或擴增本發(fā)明編碼核酸的引物的核酸片段。
本發(fā)明的核酸分子還可包含基因編碼區(qū)3’和/或5’端的非翻譯序列。
本發(fā)明還包含與具體描述的核苷酸序列互補的核酸分子或其片段。
本發(fā)明的核苷酸序列可能產生可用于鑒定和/或克隆其他細胞類型和生物中同源序列的探針和引物。這些探針和引物通常含有在“嚴格”條件(見下文)下與本發(fā)明核酸序列的有義鏈或相應反義鏈的至少約12、優(yōu)選至約25(例如大約40、50或75)個連續(xù)核苷酸雜交的核苷酸序列區(qū)。
“分離的”核酸分子與該核酸天然來源中存在的其他核酸分子分離，另外，如果通過重組技術產生，則基本上不含其他細胞材料或培養(yǎng)基；如果是化學合成則不含化學前體或其他化學物。
本發(fā)明的核酸分子可按照標準分子生物學技術和按照本發(fā)明提供的序列信息來分離。例如，可通過使用任一明確公開的全長序列或其片段作為雜交探針和標準雜交技術(例如Sambrook.J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989中所述)從適當?shù)腸DNA文庫中分離cDNA。另外，可使用基于任一公開序列產生的寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈式反應分離含有該序列或其片段的核酸分子。通過這種方法擴增的核酸可以克隆進入合適的載體，并通過DNA序列分析描述特征。此外本發(fā)明的寡核苷酸可使用標準合成方法(例如使用自動DNA合成儀)制備。
原則上可從所有生物中鑒定和分離本發(fā)明的核酸序列。有利地，可從真菌、酵母、古細菌或細菌中分離本發(fā)明的核酸序列或其同源物。此處可能提到的細菌指革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌。本發(fā)明的核酸優(yōu)選從革蘭氏陰性細菌，有利地從α-蛋白菌(proteobacteria)、β-蛋白菌或γ-蛋白菌中分離，特別優(yōu)選從伯克氏菌目(Burkholderiales)、嗜氫菌目(Hydrogenophilales)、嗜甲基菌目(Methylophilales)、奈瑟氏球菌目(Neisseriales)、亞硝化單胞菌目(Nitrosomonadales)、普羅卡桿菌目(Procabacteriales)或紅環(huán)菌目(Rhodocyclales)細菌中分離，非常特別優(yōu)選從紅環(huán)菌科(Rhodocyclaceae)細菌，尤其優(yōu)選從固氮弓菌屬，尤其是從Azoarcus anaerobius、Azoarcus buckelii、Azoarcus communis、Azoarcus evansii、Azoarcus indigens、Azoarcus toluclasticus、Azoarcustolulyticus、Azoarcus toluvorans、固氮弓菌屬物種、固氮弓菌屬物種22Lin、固氮弓菌屬物種BH72、固氮弓菌屬物種CC-11、固氮弓菌屬物種CIB、固氮弓菌屬物種CR23、固氮弓菌屬物種EB1、固氮弓菌屬物種EbN1、固氮弓菌屬物種FL05、固氮弓菌屬物種HA、固氮弓菌屬物種HxN1、固氮弓菌屬物種mXyN1、固氮弓菌屬物種PbN1、固氮弓菌屬物種PH002、固氮弓菌屬物種T和固氮弓菌屬物種ToN1中分離。
特別優(yōu)選使用來自固氮弓菌屬物種EbN1的脫氫酶。
可使用例如普通雜交方法或PCR技術，通過例如基因組或cDNA文庫從其他生物中分離本發(fā)明的核酸序列。這些DNA序列在標準條件下與本發(fā)明序列雜交。有利地使用保守區(qū)(如活性位點)的短寡核苷酸進行雜交，這些保守區(qū)可以通過技術人員已知的方式與本發(fā)明地脫氫酶進行比較來鑒定。然而，也可以使用本發(fā)明核酸的較長片段或全序列進行雜交。所述標準條件根據(jù)使用的核酸(寡核苷酸、長片段或全序列)或根據(jù)用于雜交的核酸類型(DNA或RNA)而變化。因此，例如DNA:DNA雜交體的解鏈溫度比同樣長度的DNA:RNA雜交體約低10℃。
根據(jù)核酸，標準條件指例如在42至58℃的溫度，在具有0.1至5×SSC(1×SSC＝0.15MNaCl、15mM檸檬酸鈉、pH7.2)濃度的水性緩沖溶液或另外存在50％甲酰胺中，例如42℃、5×SSC、50％甲酰胺。DNA:DNA雜交體的有利雜交條件為0.1×SSC且溫度為大約20℃至45℃，優(yōu)選為大約30℃至45℃。DNA:RNA雜交體的有利雜交條件為0.1×SSC且溫度為大約30℃至55℃，優(yōu)選為大約45℃至55℃。這些給出的雜交溫度為通過約100個核苷酸長度且G+C含量為50％的核酸在不存在甲酰胺時的情況下計算出的解鏈溫度。DNA雜交的實驗條件描述于相關的遺傳學教科書，例如Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，1989，并可使用技術人員所公知的公式計算，例如作為核酸長度、雜交類型或G+C含量的函數(shù)。技術人員可在以下教科書中找到雜交的其他信息Ausubel等編，1985，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York；Hames和Higgins編，1985，Nucleic Acids HybridizationA Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown編，1991，Essential Molecular BiologyA Practical Approach，IRLPress at Oxford University Press，Oxford。
本發(fā)明還涉及明確公開的或可衍生的核酸序列的衍生物。
因此，本發(fā)明的其他核酸序列也可能衍生自例如SEQ ID NO1并通過添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸與其相區(qū)別，且仍然編碼具有需要的特性譜的多肽。
本發(fā)明還包括含有“沉默”突變或與明確提到的序列相比按照特定來源生物或宿主生物的密碼子選擇進行修飾的核酸序列，以及其天然存在的變體例如剪切變體或等位變體。
本發(fā)明還涉及通過保守核苷酸取代(即所述氨基酸被相同電荷、大小、極性和/或溶解性的氨基酸取代)得到的序列。
本發(fā)明還涉及明確公開的核酸通過序列多態(tài)性衍生的分子。由于天然變異，這些遺傳多態(tài)性可存在于種群內的個體間。這些天然變異通常導致基因的核苷酸序列中1到5％的差異。
本發(fā)明核酸序列的衍生物是指例如在推斷的氨基酸水平上，在完整序列區(qū)具有至少40％同源性、優(yōu)選至少60％同源性、更特別優(yōu)選至少80％、85％、90％、93％、95％或98％同源性的等位變體(關于氨基酸水平的同源性，可以參考上文關于多肽的注解)。有利的是，在序列的某些部位同源性可以更高。
另外，衍生物也指本發(fā)明核酸序列的同源物，例如真菌或細菌同源物、截短序列、編碼或非編碼DNA序列的單鏈DNA或RNA。因此，例如在DNA水平，在完整DNA區(qū)至少有40％、優(yōu)選60％、特別優(yōu)選70％、更特別優(yōu)選80％的同源性。
另外，衍生物指例如與啟動子的融合體。位于核苷酸序列上游的所述啟動子可以通過一個或多個核苷酸的取代、插入、倒置和/或缺失被修飾，卻對該啟動子的功能或效率沒有不利影響。另外，可以通過修飾其序列提高所述啟動子的效率，或者該啟動子可被更有效的啟動子(包括不同種生物的啟動子)完全取代。
衍生物還指改變了起始密碼子上游從-1到-1000堿基或終止密碼子下游從0到1000堿基區(qū)域的核苷酸序列，以修飾(優(yōu)選為提高)基因表達和/或蛋白質表達的變體。
另外，本發(fā)明還包括在“嚴格條件”下與前述編碼序列雜交的核酸序列。這些多核苷酸可通過篩選基因組文庫或cDNA文庫鑒定，并可在適當時使用合適的引物通過PCR方法從中擴增，接著使用例如合適的探針進行分離。另外，本發(fā)明的多核苷酸也可以化學合成。這一特性意味著多或寡核苷酸能在嚴格條件下與基本互補的序列結合，而在這些條件下非互補的配偶體間沒有非特異的結合。為此，序列應為70-100％，優(yōu)選90-100％互補?；パa序列能彼此特異結合的特性被利用，例如在Northern或Southern印跡技術或PCR或RT-PCR中的引物結合。為此，通常使用長度可達30個堿基對的寡核苷酸。嚴格條件是指，例如在Northen印跡技術中，為洗脫非特異雜交的cDNA探針或寡核苷酸，在溫度55-70℃，優(yōu)選為60-65℃下使用洗脫液，例如含有0.1％SDS的0.1×SSC緩沖液(20×SSC3M氯化鈉、0.3M檸檬酸鈉，pH7.0)。在該過程中，只有如前述高度互補的核酸仍然彼此結合。嚴格條件的設置為技術人員所公知，并在例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中有描述。
E.本發(fā)明的構建體的實施方案本發(fā)明還涉及含有在調控核酸序列的遺傳控制下，編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的表達構建體；以及含有至少一個所述表達構建體的載體。
這些本發(fā)明的構建體優(yōu)選含有特定編碼序列5’上游啟動子和3’下游終止子，并在適當位置含有其他通用調控元件，每種元件均與編碼序列有效連接。
“有效連接”指啟動子、編碼序列、終止子和適當位置的其他調控元件以使每個調控元件均能在編碼序列的表達中發(fā)揮自身作用的方式順次排列。有效連接序列的實例如靶向序列和增強子、多腺苷酸化信號等等。其他調控元件包括可選擇標記、擴增信號、復制起點等等。合適的調控序列在例如Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有所描述。
本發(fā)明的核酸構建體具體指含有本發(fā)明的脫氫酶基因，其有利地與一個或多個用于控制(例如增強基因表達)的調控信號有效或功能性連接。
除這些調控序列之外，所述序列的天然調控仍然存在于實際的結構基因上游，并在適當時可被遺傳修飾，以關閉天然調控而提高基因的表達。然而，核酸構建體的構建也可以更簡單，即沒有額外的調控信號插入編碼序列上游，且不去除原有啟動子及其調控。反之，以使得調控不再發(fā)生并提高基因表達的方式突變天然調控序列。
優(yōu)選的核酸構建體還有利地含有與使核酸序列表達增強的啟動子功能性連接的一個或多個上述增強子序列。其他有利的序列(例如其他調控元件或終止子)也可被插入DNA序列的3’末端。構建體中可存在一個或更多拷貝的本發(fā)明核酸。為選擇構建體，構建體適當時還可以含有其他標記，例如抗生素抗性或營養(yǎng)缺陷互補基因。
本發(fā)明方法的有利調控序列存在于例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、lambda-PR或lambda-PL的啟動子中，這些啟動子可有利的用于革蘭氏陰性菌中。其他有利的調控序列存在于例如革蘭氏陽性啟動子amy和SPO2中，酵母或真菌啟動子ADC1、Mfalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。在本文中，和例如來自漢森酵母(Hansenula)的丙酮酸脫羧酶甲醇氧化酶的啟動子也是有利的。也可用人工啟動子來調控。
核酸構建可通過插入到載體(例如使基因在宿主中得到最佳表達的質粒或噬菌體)而在宿主生物中有利的的表達。除了質粒和噬菌體以外，載體還指其他技術人員已知的載體，即例如病毒(如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒等)、轉座子、IS元件、噬粒、粘粒和線性或環(huán)形DNA。這些載體可在宿主生物中自主復制或隨染色體復制。這些載體構成了本發(fā)明的另一實施方案。合適的質粒為，例如大腸桿菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、Igt11或pBdCI，鏈霉菌屬(Streptomyces)中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，芽孢桿菌(Bacillus)中的pUB110、pC194或pBD214，棒狀桿菌(Corynebacterium)中的pSA77或pAJ667，真菌中的pALS1、pIL2或pBB116，酵母中的2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述的質粒是可能的質粒的一小部分。其他質粒為技術人員所熟知并可以在例如Cloning Vectors(Pouwels P.H.等人編輯，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)一書中找到。
為了表達存在的其他基因，核酸構建體有利地額外含有增強表達的3’和/或5’末端調節(jié)序列，為實現(xiàn)最佳表達，取決于宿主生物和選擇的基因對它們進行選擇。
這些調控序列旨在使基因的特定表達及蛋白質表達成為可能。取決于宿主生物，這是指例如基因只在誘導后表達或過表達，或被瞬時表達和/或過表達。
在這點上，調控序列或因子可優(yōu)選具有正面影響，并因此提高引入基因的基因表達。因此，通過使用強轉錄信號(例如啟動子和/或增強子)，調節(jié)元件可在轉錄水平被有利地加強。然而，另外也可通過例如提高mRNA穩(wěn)定性來增強翻譯。
在載體的另一實施方案中，含有本發(fā)明核酸構建體或本發(fā)明核酸的載體還可以有利地以線性DNA的形式引入微生物，并通過異源或同源重組整合入宿主生物基因組。該線性DNA可由線性化載體(如質粒)或僅由本發(fā)明的核酸構建體或核酸組成。
為了異源基因在生物體中的最佳表達，可有利地按照該生物使用的特定密碼子選擇來修飾核酸序列。密碼子選擇可以在所述生物其他已知基因的計算機評估基礎上方便的確定。
本發(fā)明的表達盒通過將適當?shù)膯幼优c適當?shù)暮塑账峋幋a序列以及終止子信號或多腺苷酸化信號融合而制備。為此，使用常規(guī)重組和克隆技術，例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1984)和在Ausubel，F(xiàn).M.等人，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中所描述的。
通過將重組核酸構建體或基因構建體有利的插入能使基因在宿主中最佳表達的宿主特異載體而使其在適當?shù)乃拗魃镏斜磉_。載體為技術人員所熟知，并可以在例如“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等人編輯，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。
F.根據(jù)本發(fā)明可使用的宿主可以借助本發(fā)明的載體或構建體制備轉化了例如至少一種本發(fā)明載體并可用于產生本發(fā)明的多肽的重組微生物。有利地將上述本發(fā)明的重組構建體引入合適的宿主系統(tǒng)并表達。在這一點上，優(yōu)選使用技術人員熟悉的克隆和轉染方法，例如共沉淀、原生質體融合、電穿孔法、逆轉錄病毒轉染等等，以在特定表達體系中表達所述核酸。合適的系統(tǒng)描述于CurrentProtocols in Molecular Biology，F(xiàn).Ausubel等人編輯，Wiley Interscience，New York 1997或Sambrook等人的Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989。
根據(jù)本發(fā)明，也可以通過同源重組制備微生物。為此，制備含有本發(fā)明基因或編碼序列的至少一個片段的載體，為了修飾(例如功能性破壞)本發(fā)明的序列(“敲除”載體)，適當時在其中引入至少一個氨基酸的缺失、至少一個氨基酸的添加或至少一個氨基酸的取代。引入的序列也可以是例如來自相關微生物的同源物或可來自哺乳動物、酵母或是昆蟲來源。另外，可以按如下方式設計用于同源重組的載體，其內源基因經同源重組突變或者修飾，而仍然編碼功能蛋白質(例如，可修飾上游調控區(qū)以引起內源蛋白質的表達改變)。本發(fā)明基因的修飾片段存在于同源重組載體中。用于同源重組的適當載體的構建描述于如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51503。
用于本發(fā)明核酸或核酸構建體的適當?shù)闹亟M宿主生物原則上是所有的原核或真核生物。使用的有利的宿主生物為微生物，如細菌、真菌或酵母。使用有利的為革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌，優(yōu)選腸桿菌科、假單胞菌科、根瘤菌科、鏈霉菌科和諾卡氏菌科的細菌，特別優(yōu)選埃希氏菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、農桿菌屬(Agrobacterium)和紅球菌屬(Rhodococcus)的細菌。極其優(yōu)選大腸桿菌屬和種。另外，其他有利的細菌可見于α-蛋白菌、β-蛋白菌或γ-蛋白菌的組。
在這點上，本發(fā)明的一種或多種宿主生物體優(yōu)選包含至少一種本發(fā)明中所述的并為本發(fā)明的具有脫氫酶活性的酶的編碼核酸序列、核酸構建體或載體。
取決于宿主生物，以技術人員公知的方法培養(yǎng)或生長本發(fā)明方法中所使用的生物。微生物一般在有氧條件下培養(yǎng)于含有通常以糖形式存在的碳源、通常以有機氮源形式(例如酵母提取物)或鹽形式(如硫酸銨)存在的氮源、微量元素(如鐵、錳、鎂鹽)，及適當時含有維生素的液體培養(yǎng)基中，溫度為0℃到100℃之間，優(yōu)選10℃到60℃之間。在這點上，營養(yǎng)液的pH可保持或不保持恒定，即培養(yǎng)時可調節(jié)或不調節(jié)。培養(yǎng)可是分批的、半分批的或連續(xù)的。營養(yǎng)素可在發(fā)酵起始時引入或半連續(xù)或連續(xù)地加入。酮可直接加入培養(yǎng)物中或在培養(yǎng)后有利的加入。酶可依照實施例中所述方法從生物體中分離，或作為粗提取物用于反應。
G.本發(fā)明的多肽的重組制備本發(fā)明另外涉及重組制備本發(fā)明多肽或其功能性、生物活性片段的方法，其中培養(yǎng)產生多肽的微生物，適當時誘導所述多肽的表達，將后者從培養(yǎng)物中分離出來。如果需要的話，也可以通過這種方法以工業(yè)規(guī)模生產多肽。
重組微生物可通過已知方法培養(yǎng)和發(fā)酵。例如，可以在20到40℃pH6到9的條件下在TB或LB培養(yǎng)基中繁殖細菌。合適的培養(yǎng)條件在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook的Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1989)中有詳細描述。
多肽不分泌進培養(yǎng)基中時，裂解細胞，通過已知蛋白質分離方法從裂解液中獲得產物。可通過高頻超聲、通過高壓(例如弗氏壓碎器)、通過滲透壓、通過去污劑、水解酶或有機溶劑的作用、通過勻漿器或通過所列方法中兩種或多種的組合裂解細胞。
多肽的純化可通過已知的層析方法如分子篩層析(凝膠過濾)，例如Q瓊脂糖層析、離子交換層析和疏水層析，以及其他常用方法如超濾、結晶、鹽析、透析和非變性凝膠電泳。合適的方法在例如Cooper，T.G.，Biochemische Arbeitsmethoden的The Tools of Biochemistry(原始題目)，Verlag Walter de Gruyter，Berlin，New York或在Scopes，R.，ProteinPurification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin中有所描述。
可以有利地通過例如載體系統(tǒng)或寡核苷酸有利的分離重組蛋白質，所述寡核苷酸通過特定的核苷酸序列延伸cDNA并因而編碼修飾的多肽或融合蛋白質從而簡化純化。例如，這類合適的修飾為作為錨的“標簽”，例如已知的6組氨酸錨，或可以作為抗原被抗體識別的表位(在例如Harlow，E.和Lane，D.，1988，AntibodiesA Laboratory Manual.Cold SpringHarbor(N.Y.)Press中有所描述)的修飾。這些錨可用于將蛋白質附著于固體載體上，例如可以填充入層析柱或微滴定板上或另一支持物的聚合物基質。
同時，這些錨還可以用于鑒定蛋白質。此外，可以單獨或與所述錨組合使用常用標記(如熒光染料、與底物反應后形成可檢測的反應產物的酶標記或者放射性標記)，以鑒定蛋白質從而衍生所述蛋白質。
H.實施本發(fā)明的方法以制備(S)-鏈烷醇根據(jù)本發(fā)明使用的具有脫氫酶活性的酶可以作為游離或固定化酶在本發(fā)明的方法中使用。
本發(fā)明的方法有利地在0℃至95℃，優(yōu)選10℃至85℃，特別優(yōu)選15℃至75℃之間進行。
在本發(fā)明的方法中，pH值有利地保持pH4至12，優(yōu)選pH4.5至9，特別優(yōu)選pH5至8。
在本發(fā)明的方法中，對映純性或手性產物或旋光醇是指表現(xiàn)出對映體富集性(enrichment)的對映體。優(yōu)選在該方法中實現(xiàn)至少70％ee，優(yōu)選至少80％ee，特別優(yōu)選至少90％ee，非常特別優(yōu)選至少98％ee的對映體純度。
可以為本發(fā)明的方法所使用含有本發(fā)明的核苷酸、核苷酸構建物或載體的生長細胞。也可以使用靜息的或破碎的細胞。破碎的細胞是指例如通過如溶劑處理為可滲透的細胞，或通過酶處理、通過機械處理(如弗氏壓碎器或超聲)或通過其他方法破碎的細胞。通過這種方法獲得的粗提取物有利地適用于本發(fā)明的方法。純化的或部分純化的酶也可以用于該方法。可在反應中有利的使用的固定微生物或酶同樣適用。
當用于本發(fā)明的方法時，方便地在萃取之前例如通過過濾或離心去除游離微生物或酶。
由本發(fā)明的方法制備的產物，例如(1S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)丙-1-醇可以有利地由水性反應溶液通過萃取或蒸餾獲得。為了提高收率，萃取可以重復數(shù)次。合適萃取劑的實例是甲苯、二氯甲烷、乙酸丁酯、二異丙醚、苯、MTBE或乙酸乙酯之類的溶劑，但不限于這些溶劑?；蛘?，由本發(fā)明的方法制備的產物，例如(1S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-丙-1-醇可以有利地通過萃取或蒸餾或/和結晶從反應溶液的有機相中分離。萃取可以重復數(shù)次以提高收率。合適萃取劑的實例是甲苯、二氯甲烷、乙酸丁酯、二異丙醚、苯、MTBE或乙酸乙酯之類的溶劑，但不限于這些溶劑。
在濃縮有機相之后，通常獲得具有良好化學純度的產物，也就是超過80％化學純度。在萃取之后，也可以將包含產物的有機相僅部分濃縮并可以使產物結晶。為此，有利地將該溶液冷卻至0℃至10℃。還可以直接從有機溶液或從水溶液中進行結晶。結晶產物可以再重懸于用于重新結晶的相同或不同的溶劑中，并重結晶。如果需要，隨后有利的至少進行一次的結晶可以進一步提高產物的對映體純度。
以用于該反應的底物為基礎，上述加工類型能夠以60％至100％，優(yōu)選80％至100％，特別優(yōu)選90％至100％的收率分離本發(fā)明方法的產物，例如3-甲氨基-1-(2-噻吩基)丙-1-酮。分離的產物以大于90％，優(yōu)選大于95％，特別優(yōu)選大于98％的高化學純度為特征。此外，如果需要，可以有利地通過結晶進一步提高產物具有高對映體純度。
本發(fā)明的方法可以分批、半分批或連續(xù)進行。
該方法可以有利地在例如Biotechnology，卷3，第二版，Rehm等人編著，(1993)，特別是第二章中所述的生物反應器中進行。
以上說明和以下實施例僅用于闡述本發(fā)明。本發(fā)明同樣包括技術人員所顯而易見的各種可能的修改。
本發(fā)明的方法的優(yōu)點是式(I)的旋光鏈烷醇的特別高收率或鏈烷酮(II)的幾乎定量轉化。
實驗部分實施例1通過合成寡核苷酸的方式克隆固氮弓菌屬物種EbN1的苯基乙醇脫氫酶固氮弓菌屬物種EbN1的苯基乙醇脫氫酶的基因序列記錄于數(shù)據(jù)庫中(Genbank ID 25956124，區(qū)域25073至25822)。根據(jù)已知方法合成基因的寡核苷酸衍生自苯基乙醇脫氫酶基因的核酸序列。表1概括了所述寡核苷酸的DNA序列。圖3顯示了各個寡核苷酸相對于整個固氮弓菌屬物種EbN1苯基乙醇脫氫酶基因的位置。在例如Y.P.Shi，P.Das，B.Holloway，V.Udhayakumar，J.E.Tongren，F(xiàn).Candal，S.Biswas，R.Ahmad，S.E.Hasnain和A.A.Lal，Vaccine 2000，18，902-2914頁中描述了制備合成基因的方法。所得序列于公開的序列相同。
用限制性內切酶NdeI和BamHI消化PCR產物并克隆到已由此消化的pDHE19.2載體(DE19848129)中。將連接混合物轉入大腸桿菌XL1 Blue(Stratagene)。將pDHEEbN1質粒轉入大腸桿菌菌株TG10 pAgro4pHSG575(TG10衍生自大腸桿菌TG1的RhaA-(Stratagene)；pAgro4Takeshita，S；Sato，M；Toba，M；Masahashi，W；Hashimoto-Gotoh，T(1987)Gcne 61，63-74；pHSG575T.Tomoyasu等人(2001)，MoL.Microbiol.40(2)，397-413)。
該重組大腸桿菌被稱作大腸桿菌LU 11558。
表1制備固氮弓菌屬物種EbN1苯基乙醇脫氫酶的合成基因的寡核苷酸


實施例2通過PCR方法克隆固氮弓菌屬物種EbN1的苯基乙醇脫氫酶固氮弓菌屬物種EbN1的苯基乙醇脫氫酶的基因序列已經記錄于數(shù)據(jù)庫中(Genbank ID 25956124，區(qū)域25073至25822)。寡核苷酸(引物MKe0387和MKe0388)衍生自苯基乙醇脫氫酶基因的核酸序列，其用于如下通過PCR擴增方法來克隆脫氫酶基因。
PCR

引物

將等摩爾量(各130納克)的引物MKe0387和MKe0388混合。根據(jù)標準Stratagene方案使用PfuTurbo聚合酶(Roche Applied Science)和下列溫度梯度程序進行PCR95℃5分鐘；95℃45秒、55℃達45秒和75℃1分鐘，進行30個循環(huán)；72℃10分鐘；10℃直至使用。通過瓊脂糖膠電泳(1.2％E-Gel，Invitrogen)和柱層析(GFX試劑盒，AmershamPharmacia)分離PCR產品(大約0.75kB)，然后測序(測序引物MKe0387和MKe0388)。所得序列與公開序列相同。用限制性內切酶Ndel和BamHI消化PCR產物并克隆到已由此消化的pDHE19.2載體(DE19848129)中。將連接混合物轉入大腸桿菌XL1 Blue(Stratagene)。由此獲得的質粒中的插入物，pDHEEbN1(通過為相應的克隆測序，揭示該插入物)是SEQID NO1中所示的核酸序列。
將pDHEEbN1質粒轉入大腸桿菌菌株TG10 pAgro4 pHSG575(TG10衍生自大腸桿菌TG1的RhaA-(Stratagene)；pAgro4Takeshita，S；Sato，M；Toba，M；Masahashi，W；Hashimoto-Gotoh，T(1987)Gene 61，63-74；pHSG575T.Tomoyasu等人(2001)，Mol.Microbiol.40(2)，397-413)。
該重組大腸桿菌被稱作大腸桿菌LU 11558。
實施例3大腸桿菌LU 11558的重組苯基乙醇脫氫酶的提供在100毫升錐形燒瓶(bafflers)中，大腸桿菌LU 11558在20毫升LB-Amp/Spec/Cm(100微克/升氨芐青霉素；100微克/升壯觀霉素；20微克/升氯霉素)、0.1mM IPTG、0.5克/升鼠李糖中37℃將培養(yǎng)18小時，以5000*g離心10分鐘，用10mM TRIS*HCl，pH7.0洗滌一次，并再重懸于2毫升相同的緩沖劑中。在振動球磨機(vibratory mill)(3×5分鐘，中間在冰上冷卻卻)中用0.7毫升玻璃珠(d＝0.5毫米)破碎大腸桿菌LU11558細胞糊(cell paste)，由此制備無細胞的蛋白質粗提物。
實施例4大腸桿菌LU 11558重組脫氫酶活性的測定在每種情況下，在100毫升錐形燒瓶(bafflers)中，6種轉化體在20毫升LBAmp/Spec/Cm(100微克/升Amp；10毫克/升Spec；20微克/升Cm)、0.1mM IPTG、0.5克/升鼠李糖中37℃將培養(yǎng)18小時，以5000*g離心10分鐘，用10mM Tris/HCl pH7.0洗滌一次，并再重懸于2毫升相同的緩沖劑中。在含有50微升/毫升葡萄糖DH、100mM葡萄糖、10mMNaCl、1mM NADH、1mM NADPH的900微升50mM MES pH6中及10mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮，將100毫升細胞懸浮液振蕩培養(yǎng)20分鐘。根據(jù)與實施例4類似的方式分析反應混合物。平均而言，制造0.13mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇，相當于6.6U/l的培養(yǎng)懸浮液的活性。在包含已經通過在振動球磨機(3×5分鐘，中間在冰上冷卻卻)中用0.7毫升玻璃珠(d＝0.5毫米)破碎細胞獲得的粗提物的類似反應混合物中，測得0.21mM3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇，相當于10.7U/l的活性。在培養(yǎng)過程中不添加鼠李糖的對照實驗中沒有可檢測的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇。
實施例53-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮和3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的分析可以通過HPLC測定3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮和3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的濃度。除濃度外，還可以根據(jù)靜止和流動相的選擇測定ee值。
a)非手性分析使用下列系統(tǒng)定量分析該反應靜止相Chromoltih SpeedROD RP18，50*4，6微米，Merck(Darmstadt，德國)，加熱至45℃流動相洗脫劑A10mM KH2PO4，pH2.5洗脫劑B乙腈梯度0-0.5分鐘，35％B；0.5-10分鐘35至80％B；1.0-1.2分鐘80％B；1.2-1.3分鐘80％-35％B；1.3-2.0分鐘35％B；流速1.5毫升/分鐘檢測在230和260納米進行UV檢測停留時間3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮大約1.6分鐘
3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇大約1.3分鐘使用可靠材料，制造校準系列，根據(jù)其可以測定未知樣品的濃度。
b)手性分析靜止相Chiracel OD-H，250*4，6微米，Daicel，加熱至40℃流動相洗脫劑A正己烷洗脫劑B異丙醇用2.5％B等度洗脫(isocratic)流速1.0毫升/分鐘檢測在230和260納米進行UV檢測停留時間3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮大約9.5分鐘(1S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇大約16.6分鐘(1R)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇大約18.3分鐘使用可靠材料，制造校準系列，根據(jù)其可以測定未知樣品的濃度。
實施例6大腸桿菌LU 11558重組脫氫酶活性的測定在每種情況下，在100毫升錐形燒瓶(bafflers)中，6種大腸桿菌LU11558轉化體在20毫升LBAmp/Spec/Cm(100微克/升Amp；50毫克/升Spec；10微克/升Cm)、0.1mM IPTG、0.5克/升鼠李糖中37℃培養(yǎng)18小時，以5000*g離心10分鐘，用10mM Tris/HCl pH7.0洗滌一次，并再重懸于2毫升相同的緩沖劑中。在含有50微升/毫升葡萄糖DH(實施例......)、100mM葡萄糖、10mM NaCl、1mM NADH、1mM NADPH及10mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮的900微升50mM MES pH6中，將100毫升細胞懸浮液振蕩培養(yǎng)20分鐘。根據(jù)與實施例4類似的方式分析反應混合物。平均而言，制造0.13mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇，相當于6.6U/l的培養(yǎng)懸浮液的活性。在含有已經通過在振動球磨機(3×5分鐘，中間在冰上冷卻卻)中用0.7毫升玻璃珠(d＝0.5毫米)破碎細胞獲得的粗提物的類似反應混合物中，測得0.21mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇，相當于10.7U/l的活性。在培養(yǎng)過程中不添加鼠李糖的對照實驗中沒有可檢測的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇。
實施例7使用包含2-戊醇的固氮弓菌屬物種EbN1的重組脫氫酶制備(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇在0.75升反應器中，在221毫升50mM KH2PO4和250毫升2-丙醇中將大腸桿菌LU11558(1-20克/升生物量)的靜息細胞與0.2mM NAD+和185mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮(12.5毫升)在40℃(250轉/分鐘)攪拌。通過用5M NaOH滴定，使反應保持在pH5.5。通過HPLC分析監(jiān)測反應直至有機相中50-350mM TACA的濃度。
實施例8使用包含2-戊醇的固氮弓菌屬物種EbN1的重組脫氫酶制備(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇在4升反應器中，在1432毫升50mM KH2PO4和2000毫升2-丙醇中將大腸桿菌LU11558(1-20克/升生物量)的靜息細胞與0.2mM NAD+和370mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮(200毫升)在40℃(250轉/分鐘)攪拌。通過用5M NaOH滴定，使反應保持在pH5.5。通過HPLC分析監(jiān)測反應直至有機相中100-650mM TACA的濃度。
實施例9使用包含2-戊醇的固氮弓菌屬物種EbN1的重組脫氫酶制備(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇在4升反應器中，在1432毫升50mM KH2PO4和2000毫升2-丙醇中將大腸桿菌LU11558(1-20克/升生物量)的靜息細胞與0.2mM NAD+和370mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮(200毫升)在40℃(250轉/分鐘)攪拌。通過用5M NaOH滴定，使反應保持在pH5.5。施加大約85毫巴的真空和50-70℃的護套溫度。在反應過程中以2-10毫升/分鐘的蒸餾速率連續(xù)再加入蒸餾量的水和所得2-丙醇。通過HPLC分析監(jiān)測反應直至有機相中300-700mM TACA的濃度。使3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮反應至0-30％的殘留部分。
實施例10使用包含2-戊醇的固氮弓菌屬物種EbN1的重組脫氫酶制備(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇在0.75升反應器中，在221毫升50mM KH2PO4和250毫升2-丙醇中將大腸桿菌LU11558(1-20克/升生物量)的靜息細胞與0.2mM NAD+和200mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮(12.5毫升)在40℃(250轉/分鐘)攪拌。通過用5M NaOH滴定，使反應保持在pH5.5。通過HPLC分析監(jiān)測反應直至有機相中50-320mM TACA的濃度。
附圖
SEQ ID NO1 固氮弓菌屬物種EbN1的苯基乙醇脫氫酶的核酸序列(GenbankID 25956124，區(qū)域25073至25822)1 atgacgcaaa gactgaagga caagcttgca gtaattaccg gcggtgccaa cggcatcggg61 cgggcaattg cggagcgatt tgcggtcgaa ggtgccgaca tcgcaatcgc ggatctggtg121 ccggccccgg aagccgaggc agcaatcagg aacctcggtc ggcgcgttct gaccgtgaag181 tgcgatgtct cgcaacctgg cgacgtagaa gcattcggaa agcaggtcat ctccacgttt241 ggtcgctgcg acatcctcgt caacaacgcg ggaatttacc cgctgattcc ttttgacgag301 ctgacctttg aacagtggaa gaaaacattc gagatcaacg tcgattcagg ttttcttatg361 gcgaaggctt ttgtccccgg gatgaagagg aacgggtggg gacgcatcat caacctgact421 tcgacgacat attggctaaa gatcgaggcg tatacccatt acatcagcac gaaagcggca481 aacataggct ttacccgcgc ccttgcctcg gacctgggga aggacggaat cactgttaac541 gccatcgcgc cgagccttgt ccgcacggca acaaccgaag cttctgcatt gtccgcgatg601 ttcgacgtgc tgccaaacat gcttcaggcg attccgcgtc ttcaggtgcc cctggatctg661 acgggcgcag ctgcgttcct ggcttccgat gacgccagtt ttattacagg ccagacgctc721 gcggttgatg gcggtatggt gagacactgaSEQ ID NO2固氮弓菌屬物種EbN1的苯基乙醇脫氫酶的氨基酸序列(Genbank蛋白質登錄號CAD58337)1 MTQRLKDKLA VITGGANGIG RAIAERFAVE GADIAIADLV PAPEAEAAIR51 NLGRRVLTVK CDVSQPGDVE AFGKQVISTF GRCDILVNNA GIYPLIPFDE101 LTFEQWKKTF EINVDSGFLM AKAFVPGMKR NGWGRIINLT STTYWLKIEA151 YTHYISTKAA NIGFTRALAS DLGKDGITVN AIAPSLVRTA TTEASALSAM201 FDVLPNMLQA IPRLQVPLDL TGAAAFLASD DASFITGQTL AVDGGMVRH
權利要求
1.制備式I的旋光鏈烷醇的方法 其中n是0至5的整數(shù)；Cyc是任選取代的單核或多核、飽和或不飽和碳環(huán)或雜環(huán)，且R1是鹵素、SH、OH、NO2、NR2R3或NR2R3R4+X-，其中R2、R3和R4彼此獨立地為氫或低碳烷基或低碳烷氧基，且X-是抗衡離子，該方法包括在存在還原等同物的情況下，在包含式II的鏈烷酮的培養(yǎng)基中孵育選自脫氫酶、醛還原酶和羰基還原酶類的酶(E)， 其中n、Cyc和R1如上所定義，將式II的化合物酶促還原以產生式I的化合物，并借助于酶(E)使犧牲醇反應以產生相應的犧牲酮并從反應培養(yǎng)基中至少部分去除所述犧牲酮，由此使反應過程中消耗的還原等同物再生，并分離形成的產物(I)。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述酶(E)是醇脫氫酶。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述酶(E)含有以下多肽序列(i)SEQ ID NO2，或(ii)與SEQ ID NO2相比，其中多達25％的氨基酸基團已通過缺失、插入、取代或其結合改變，且保持了SEQ ID NO2的至少50％酶活性。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其用于制備式III的1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇衍生物 其中R1＝Cl或NHCH3，其中在包含式IV的1-(2-噻吩基)丙酮衍生物的培養(yǎng)基中 將該化合物酶促還原以產生式III的化合物并分離形成的基本對映純性產物。
5.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述酶選自固氮弓菌屬微生物的酶。
6.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述酶由根據(jù)SEQID NO1的核酸序列或由其功能等同物編碼。
7.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所用犧牲醇是2-戊醇。
8.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中通過蒸餾從反應培養(yǎng)基中至少部分去除反應過程中由犧牲醇形成的犧牲酮。
9.根據(jù)權利要求8的方法，其中所述犧牲酮在反應過程中通過蒸餾從酶反應器中除去。
10.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中式II的化合物在選自腸桿菌科、假單孢菌科、根瘤菌科、乳酸桿菌科、鏈霉菌科、Rhodococcaceae和諾卡氏菌科細菌的微生物存在下反應。
11.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中微生物是已用根據(jù)權利要求1至3中任一項定義的酶的編碼核酸構建體轉化的重組微生物。
12.具有以下多肽序列的酶(E)用于制備式I或III的化合物的用途，(i)SEQ ID NO2，或(ii)與SEQ ID NO2相比，其中多達25％的氨基酸基團已通過缺失、插入、取代或其結合改變，且保持了SEQ ID NO2的至少50％酶活性。
13.在制備度洛西汀的方法中根據(jù)權利要求12的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備式(I)的旋光醇的方法，其中n是0至5的整數(shù)；Cyc代表任選取代的單核或多核、飽和或不飽和碳環(huán)或雜環(huán)，并且R
文檔編號C12P17/00GK1950513SQ200580014367
公開日2007年4月18日 申請日期2005年5月4日 優(yōu)先權日2004年5月5日
發(fā)明者R·施蒂默爾, M·凱塞勒, B·豪爾, T·弗里德里希, M·布羅伊爾, H·施羅德 申請人:巴斯福股份公司