專利名稱：：從大腸桿菌BL21CCM7394中無色菌CCM4824制備固定重組青霉素?；复呋瘎┑姆椒捌?..的制作方法從大腸桿菌BL21CCM7394中無色菌CCM4824制備固定重組青霉素?；复呋瘎┑姆椒捌湓诤铣搔?內(nèi)酰胺抗生素中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從重組大腸桿菌BL21CCM7394中無色菌CCM4824制備的青霉素酰化酶，關(guān)系到重組質(zhì)粒PKXIPl和青霉素?；傅闹苽湓诠I(yè)合成抗生素中的生物催化作用。尤其涉及從反應(yīng)混合物合成的半合成內(nèi)酰胺抗生素，這種反應(yīng)混合物由被青霉素酰化酶催化所得的頭孢羥氨芐(制備阿莫西林和頭孢羥氨芐的羥苯基甲基酯或氨基化合物；制備氨比西林和頭孢氨芐的苯基甘氨酸或氨基化合物)和親核試劑(6-ΑΡΑ或7-ADCA)組成，青霉素?；甘且灾亟M大腸桿菌BL21CCM7394作為生物催化劑所得。
背景技術(shù)：
：幾十年來，青霉素G?；敢淹度肷虡I(yè)使用，以水解青霉素G?；〗M及其六種不同成分的乙酰環(huán)氧基頭孢菌素G，分別用于生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸(6-ΑΡΑ)和7-氨基脫乙氧基頭孢菌素，是制備內(nèi)酰胺抗生素的關(guān)鍵障礙。由大腸桿菌ATCC11105合成青霉素?；傅臈l件是適度的，從而導(dǎo)致產(chǎn)品的轉(zhuǎn)換速率不完全。據(jù)報(bào)道，類似的青霉素?；甘菑臈淇宋譅柧屠资掀章渫撬咕茫?，這些沒的合成潛力沒有很好的記載下來。最近幾年，用動(dòng)力學(xué)性質(zhì)改變的突變異種，特別是用改進(jìn)的S/H比率已經(jīng)由站點(diǎn)控制的突變形成構(gòu)造形成。然而，這些變種大腸桿菌青霉素酰化酶并沒有起到預(yù)期的效果。有生物體被發(fā)現(xiàn)可以生產(chǎn)青霉素酰化酶，例如醋酸桿菌、氣單胞菌、產(chǎn)堿桿菌、白色不顯枝菌、強(qiáng)堿桿菌、黃單胞菌、雷氏普羅威登斯菌、帶黃色素的單細(xì)胞、巨大芽孢桿菌、大腸桿菌，其中大腸桿菌是最常用的。正如大多數(shù)情況大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)，蛋白質(zhì)被輸送到周質(zhì)空間經(jīng)過翻譯后修飾成為一個(gè)全功能的酶。這使利用選擇性方法破壞細(xì)胞成為可能，這樣就沒有太大的能量消耗，各自的酶可以從細(xì)胞中高純度釋放。破壞細(xì)胞可以采取傳統(tǒng)的機(jī)械方法，如高壓均質(zhì)或在水磨機(jī)中瓦解，其中同質(zhì)化經(jīng)常是在工業(yè)水平。另外，有機(jī)溶劑和用于破壞細(xì)胞和提取產(chǎn)品。目前有報(bào)道稱使用溶劑組合以提升細(xì)胞裂解酶的產(chǎn)量和純度。德萊昂等在(2003年)，報(bào)告了使用各種有機(jī)溶劑從重組大腸桿菌中提取青霉素G?；?德萊昂、加西亞、丹麥馬巴爾巴德保險(xiǎn)業(yè)監(jiān)督羅莎、比利亞塞尼奧爾、埃斯塔達(dá)、洛佩茲-維利，生物化學(xué)過程，39:301-305，2003)。然而，化學(xué)裂解方法必須根據(jù)定制開發(fā)的微生物和酶對有機(jī)溶劑的敏感性。青霉素酰化酶可用于合成內(nèi)酰胺抗生素時(shí)的熱力學(xué)以及動(dòng)力學(xué)控制。青霉素?；竿ㄟ^帶有各自內(nèi)酰胺核子的活性?；系臐饪s用于合成內(nèi)酰胺抗生素的動(dòng)力學(xué)控制。這些酶催化過程，雖然表面上與傳統(tǒng)化學(xué)合成具有競爭力，事實(shí)上，它所面對的一大難題決定了抗生素的總收率，即活動(dòng)?；系乃庖约翱股氐男纬伞?ΜΑ.Wegman,U.Heinemann，A.Stloz,F.VanRantwijkandRA.Sheldon,有機(jī)過禾呈雜志，4318-322,2000)β-內(nèi)酰胺抗生素酶的合成可直接從?；希驈孽セ蝓０费苌镩_始。(微生物酶技術(shù)，18:4-16，1986)。在第一種控制合成熱力學(xué)中，主要的問題是改變產(chǎn)品的反應(yīng)平衡，雖然目前這可能不會(huì)成功，這將是一個(gè)理想和上流的解決方法。在第二種控制合成動(dòng)力學(xué)中，一個(gè)激活的先導(dǎo)?；希瑹o論是與內(nèi)酰胺核子反應(yīng)的D-酰胺形式抗生素?；鶄?cè)鏈的酯形式或氨基化合物形式，釋放除了酒精或加銨之外的抗生素，未反應(yīng)的反應(yīng)物和抗生素。通常動(dòng)力學(xué)控制方法，酰基原料的摩爾過剩以推動(dòng)反應(yīng)向合成方向進(jìn)行，使得該進(jìn)程沒有吸引力。(LucianaR.B.Goncalves,RuySousa,Jr.Roberto,Fernandez-Lafuente,JoseΜ.Guisan,RaquelL.C.Giordano,RobertoC.Giordano,生物技術(shù)與生物工程，8:6，622-631，2002)。這種酶動(dòng)力學(xué)控制方法的主要問題是產(chǎn)量，可量測性和經(jīng)濟(jì)學(xué)過程導(dǎo)致?；系倪^度使用。許多研究的目的在于改進(jìn)這種情況，其中包括流程優(yōu)化，此外還有助溶劑或高濃度培養(yǎng)基的使用或改善固定化的生物催化劑活性。酶的固定化在酶穩(wěn)定性和選擇性中起著至關(guān)重要的作用，它決定著酶發(fā)展的未來。酶進(jìn)程總體上與發(fā)展已久的化學(xué)過程競爭，如果經(jīng)濟(jì)學(xué)進(jìn)程中沒有吸引人的地方將最終被淘汰?？傮w上說，工業(yè)酶固定化已相當(dāng)成功，因?yàn)榍嗝顾谿酰化酶已成功應(yīng)用到制藥工業(yè)中數(shù)年。通常的共價(jià)固定型，酶的靶象必須充分凈化，從而增加了時(shí)間和成本。另外，載體材料的具體特征需要加以研究，來預(yù)測是否適合特定的蛋白，因?yàn)檫@些載體傾向于改變蛋白質(zhì)的二級、三級或四級結(jié)構(gòu)，阻礙其后的具體用途。這也導(dǎo)致探測其他非共價(jià)固定型的可能。包埋和封裝已成為非共價(jià)固定型的首選方法。包埋特別有利，因?yàn)樗枰鞍踪|(zhì)較低的純化形式，甚至整個(gè)細(xì)胞都被各種載體適當(dāng)?shù)陌瘛Ｔ诿钢刑崛〉牡鞍踪|(zhì)可通過加成聚合鹽、有機(jī)或非離子型聚合物，包括蛋白質(zhì)形成超分子形式和使他們在水溶液中不溶解和同樣適當(dāng)?shù)慕o交聯(lián)酶聚合體交聯(lián)。(A.M.vanderWei1en,Μ·Ottens禾口A.J.J.Straathofetal,Straathof,A.J.J.Panke,S.andSchmid,A.CurrentOpinBiotechnol,13:548_556,2002禾口Cao,L,VanLangen,L,M,VanRantwijkFetal，酶微生物技術(shù)，11:665-670，2001)?；谏鲜龅膯⑹竞蛷慕?jīng)濟(jì)角度來看，我們不得不選擇包埋作為從無色菌CCM4824制備固定重組青霉素?；傅姆椒?。包埋作為一種發(fā)明的固定方法，既沒有用于整個(gè)細(xì)胞也沒有用于蛋白質(zhì)的純化，這對表達(dá)活性的產(chǎn)量或酶純化的成本造成妥協(xié)。發(fā)明中使用的酶是通過沉淀飽和溶液中的蛋白質(zhì)部分純化的，這種飽和溶液時(shí)通過緩慢添加像固體硫酸銨沉淀而成的。(蛋白質(zhì)純化及工藝工程，主編羅杰摹哈里森，馬塞爾德克公司出版，141-183，1993)酶固定化的對象包括較高的催化活性、較高的機(jī)械和運(yùn)行穩(wěn)定性、循環(huán)使用和較高的S/H比，使這種酶被用于合成反應(yīng)和制造成本。除了上述方法，一種提高質(zhì)量的更加基本的方法是使用新的生物催化劑改進(jìn)動(dòng)力學(xué)性能，既然已經(jīng)令人信服的證明動(dòng)力學(xué)控制的反應(yīng)對酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)有很大的影響。因此，目前的研究趨勢導(dǎo)致大量用于化學(xué)/制藥工業(yè)中的新生物催化劑/新的酶種類的發(fā)展。這些新的酶(生物催化劑)可通過傳統(tǒng)微生物產(chǎn)品從大自然中隔離和從環(huán)境基因庫重組DNA技術(shù)獲得，或者通過酶的直接進(jìn)化產(chǎn)生一個(gè)具有改進(jìn)合成潛能的青霉素酰化酶家族的方法獲得。因此，具有顯著合成能力的青霉素?；傅膶?shí)用性對內(nèi)酰胺合成酶的發(fā)展進(jìn)程是一個(gè)至關(guān)重要的因素。其中一個(gè)主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)是抗生素的合成與活性酰基原料的水解比率(縮寫為S/H)。這個(gè)比率是生物催化的關(guān)鍵性能參數(shù)。謝爾登的研究等(Sheldon，VanRantwijk,VanLangen,Wegman,CAO和Janssen，合成內(nèi)酰胺類抗生素，由AlleBruggink主編，KluwerAcademic出版126-129，2003)發(fā)現(xiàn)在水解過程中有一個(gè)很大的變化，并且合成活性在大腸桿菌所得不同制劑青霉素酰化酶之間有很大的變化。水解活性(u/g)Poly-XDA-GA-PAPoly-XDA-GA200Assemblase7500明膠殼聚糖260PGA450特殊的聚合物210PcAEupergitC^O在上述例子中，Poly-XDA-GA-PA從1，4-二(氨基甲基)苯(對二甲苯二胺，由戊二醛活化)所得微球，被證明在內(nèi)酰胺的合成中是一種有效的催化劑。在氨比西林的合成中，用此種酶制劑的S/H比在轉(zhuǎn)化85%時(shí)是2.0，它與游離酶的效果相當(dāng)，比ASSemblaSe(S/H比在轉(zhuǎn)化80%時(shí)是1.22)的效果好。在合成阿莫西林的情況時(shí)，此種酶的效果同樣良好，在轉(zhuǎn)化75%時(shí)S/H比為4.5略高于其他自由青霉素?；浮臒o色菌CCM4824(原始睪丸酮甲單胞菌CCM4824；Plhackova等.(K.Plhackova等.應(yīng)用微生物技術(shù)，32:507_516，2001)，Skrob等，酶微生物技術(shù)，32=738-744,2003)所得的青霉素酰化酶(PA；E.G.3.5.1.11，青霉素?；饷?當(dāng)與從外源所得的青霉素酰化酶相比時(shí)顯示出更好的性能，因而被用于合成氨比西林、阿莫西林、頭孢氨芐和頭孢羥氨芐。Kysklik等(捷克專利申請PV2007-82)對上述從質(zhì)粒載體上重組大腸桿菌BL21(PKXIPI)CCM7394中無色菌CCM4824所得青霉素?；傅目寺『捅磉_(dá)所作的進(jìn)一步工作。這種基因的克隆和表達(dá)方法以及它的發(fā)酵條件在捷克專利申請(PV-2007-82)中有描述，在印度申請?zhí)枮镻CT/TN07/00193的PCT申請中也有描述。本發(fā)明涉及上述青霉素?；冈诠I(yè)合成內(nèi)酰胺抗生素中的應(yīng)用申請。因此本發(fā)明主要涉及從大腸桿菌BL21(PKXIPI)中提取的青霉素?；敢约半S后在合成內(nèi)酰胺抗生素中所用青霉素?；?、新的生物催化劑，以改進(jìn)最終產(chǎn)品的質(zhì)量。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供從與重組質(zhì)粒PKXIPI(CCM7394)有關(guān)的重組菌株大腸桿菌BL21中表達(dá)的無色菌CCM4824所得的青霉素?；?，作為一種生物催化劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用固定化酶工業(yè)合成內(nèi)酰胺類抗生素的方法。發(fā)明摘要本發(fā)明顯示，從無色菌CCM4824中所得青霉素?；?PA)與重組菌株大腸桿菌BL21CCM7394關(guān)聯(lián)的重組質(zhì)粒PKXIPI和青霉素酰化酶在作為生物催化劑在工業(yè)合成抗生素中的應(yīng)用是相互獨(dú)立的。因此，一種利用青霉素?；缸鳛樯锎呋瘎┖铣蓛?nèi)酰胺抗生素的方法，其中所述的青霉素?；干锎呋瘎┦莵碜杂谠诖竽c桿菌BL21CCM7394中表達(dá)的無色菌CCM4824，其過程包括a、利用溶劑和化學(xué)清潔劑或金屬螯合物來增加細(xì)胞通的透性，從而以化學(xué)方法提取青霉素?；?；b、用分級沉淀和層析對可溶性酶進(jìn)行純化；C、在-2到2°C的溫度下，利用比率范圍為151到201的丙烯酰胺和N，N’-二甲基乙二胺對上述酶進(jìn)行固定化；d、通過與戊二醛交聯(lián)穩(wěn)定固定化酶，以獲得粒子尺寸在100到300微米的粗粒子，優(yōu)選的粒子尺寸為150到250微米之間；e、利用上述固定青霉素?；复呋；瘞в谢钚怎；系挠H核試劑，以獲得具有較高產(chǎn)量和純度的內(nèi)酰胺抗生素。上述萃取所用溶劑選自甲苯、乙酸乙酯、氯仿和丁酯，化學(xué)清潔劑或金屬螯合劑選自EDTA、溴棕三甲胺、尿素和十二烷基硫酸鈉。化學(xué)提取過程是利用1到3%w/v的氯仿和0.1到0.2%w/v的十二烷基硫酸鹽的混合物。提取時(shí)的溫度為15到35°C，優(yōu)選是在28到30°C的溫度下提取6到12小時(shí)，PH值保持在5.5到9.0之間，優(yōu)選的為6.5到7.5之間，以獲得可溶解的酶。酶的純化是使用硫酸銨處理或使用離子交換層析。酶的固定化包括聚合形式的酶，酶蛋白的聚合是使用相當(dāng)于飽和度為30到70%的硫酸銨完成的。這種聚合是在使用比例范圍為151到201的丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺實(shí)現(xiàn)的。酶的固定化進(jìn)程是在硫酸鈉或鉀鹽緩沖溶液中進(jìn)行，固定化還包括與戊二醛的交聯(lián)，所使用的戊二醛的濃度為2mM到8mM，優(yōu)選在4mM到6mM之間。酶的固定化還包括與濃度范圍為0.3到0.5%(w/v)的戊二醛的二次交聯(lián)。為制備β-內(nèi)酰胺抗生素所準(zhǔn)備的酶的?；^程包括帶有活性?；系挠H核試劑和上面固定青霉素?；附M成的混合物，適宜的PH值為5.2到7.2之間。反應(yīng)混合物PH的調(diào)節(jié)通過添加酸實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選鹽酸。?；线x自D-對羥基苯甘氨酸甲酯或D-對羥基苯甘氨酸氨基化合物，或是D-苯甘氨酸甲酯或D-苯甘氨酸氨基化合物，親核試劑選自6-氨基青霉烷酸或7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸?？股氐暮铣蛇€包括通過降低上述反應(yīng)混合物的PH值，將一部分β-內(nèi)酰胺抗生素從反應(yīng)混合物中去除。所述內(nèi)酰胺抗生素是阿莫西林，該抗生素由6-氨基青霉烷酸與D-羥苯甘氨酸甲酯?；铣?，其中6-氨基青霉烷酸與D-羥苯甘氨酸甲酯的摩爾比率范圍為1.2到4.5，更優(yōu)的在1.5到1.8之間。所述的β-內(nèi)酰胺抗生素是氨比西林，該抗生素由6-氨基青霉烷酸與D-苯甘氨酸甲酯?；铣?，其中6-氨基青霉烷酸與D-羥苯甘氨酸甲酯的摩爾比率范圍為1.2到4.5，更優(yōu)的在1.3到1.7之間。所述的β-內(nèi)酰胺抗生素是頭孢氨芐，該抗生素由7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸和D-苯甘氨酸甲酯?；铣?，其中7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸與D-羥苯甘氨酸甲酯的摩爾比率范圍為1.2到4.5，更優(yōu)的在1.5到1.7之間。本發(fā)明進(jìn)一步顯示以補(bǔ)料模式從無色菌CCM4824中培養(yǎng)含有青霉素?；傅霓D(zhuǎn)基因大腸桿菌BL21CCM7394，這項(xiàng)發(fā)明主要包括細(xì)胞裂解、酶分離、通過穩(wěn)定酶制備生物催化劑和為從利用無色菌CCM4824作為生物催化劑分離的固定重組青霉素?；缸鳛樯锎呋瘎┧玫陌⒛髁?、氨比西林、頭孢羥氨芐和頭孢氨芐設(shè)計(jì)有效的綜合參數(shù)。青霉素?；傅墓潭ɑ^程也適當(dāng)?shù)奶嵘潭傅暮铣赡芰驮黾用傅幕钚詴r(shí)間，以保證生物催化劑的穩(wěn)定性。圖la(IA/VI)顯示用FERMASEΝΑ150從6_氨基青霉烷酸(親核試劑)和HPGMeHCl(酰基原料)中合成阿莫西林三水酸(AMOX)的轉(zhuǎn)化過程(例8)。圖lb(IB/VI)顯示用FERMASEPA1500從6_氨基青霉烷酸(親核試劑)和HPGMeHCl(?；?中合成阿莫西林三水酸(AMOX)的轉(zhuǎn)化過程(例8)。圖2a(IIA/VI)顯示用FERMASENA150從6-氨基青霉烷酸和HPGMeHCl合成阿莫西林三水酸的轉(zhuǎn)化過程以及阿莫西林三水酸的凈化(例9)。圖2b(IIB/VI)用FERMASENA150，在?；?親核試劑比為1.49時(shí)，從6-氨基青霉烷酸和HPGMeHCl在控制PH情況下合成阿莫西林三水酸的轉(zhuǎn)化過程(例10)。圖3(III/VI)顯示用FERMASENA150從6-氨基青霉烷酸和HPGMeHCl合成阿莫西林三水酸的轉(zhuǎn)化時(shí)間過程以及阿莫西林三水酸的凈化(例11)。圖4(IV/VI)顯示用FERMASENA150從6-氨基青霉烷酸和HPGMeHCl通過延遲酰基原料的加入合成阿莫西林三水酸的間歇反應(yīng)過程(例13)。圖5a(VB/VI)顯示用FERMASENA150從6_氨基青霉燒酸和PGMeHCl合成氨比西林三水酸(AMP)的轉(zhuǎn)化過程，酰基原料/親核試劑的比率為1.5(例19)。圖5b(VB/VI)顯示?；?親核試劑的比率為1.35，在？!1值為5.9、201的條件下用FERMASENA150從6-氨基青霉烷酸和PGMeHCl合成氨比西林三水酸的間歇反應(yīng)過程(例20)。圖6a(VIA/VI)顯示?；?親核試劑的比率為1.5，在PH值為6.3、25°C的條件下用FERMASENA150從7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸和PGMeHCl合成頭孢氨芐水合物(CEX)的間歇轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程(例21)。圖6b(VIB/VI)顯示?；?親核試劑的比率為1.34，在PH值為6.3、25°C的條件下用FERMASENA150從7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸和PGMeHCl合成頭孢氨芐水合物的間歇轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程(例22)。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及酶進(jìn)程領(lǐng)域中具有重要商業(yè)價(jià)值的半合成β-內(nèi)酰胺的制備。這些抗生素是最常用的醫(yī)藥品，其中半合成青霉素和頭孢菌素(例如氨比西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢羥氨芐)和其他一些在全球銷售中超過60%。本發(fā)明提供的重組分離青霉素?；福菑霓D(zhuǎn)基因大腸桿菌BL21CCM7394所表達(dá)的無色菌CCM4824中所得到的，這項(xiàng)發(fā)明主要包括細(xì)胞裂解、酶分離、通過穩(wěn)定酶制備生物催化劑和為從利用大腸桿菌CCM7394中分離所得固定重組青霉素?；缸鳛樯锎呋瘎┧玫陌⒛髁?、氨比西林和頭孢氨芐設(shè)計(jì)有效的綜合參數(shù)。這種培養(yǎng)重組菌株CCM7394的方法在捷克專利PV-2007-82中有描述。本發(fā)明內(nèi)酰胺抗生素是從活性?；?用于阿莫西林和頭孢羥氨芐的D-對羥基苯甘酸甲酯或氨基化合物；用于氨比西林的頭孢氨芐的D-苯甘氨酸甲酯或氨基化合物)和親核試劑(6-氨基青霉烷酸或7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸)組成的反應(yīng)混合物，在從無色菌CCM4824所得的重組青霉素酰化酶的催化作用下合成的。具體的，本發(fā)明提供一種從無色菌CCM4824中包含青霉素?；傅拇竽c桿菌BL21CCM7394的細(xì)胞裂解方法，使用例如高壓均質(zhì)的各種方法；利用各種諸如醋酸乙酯、甲苯、醋酸丁酯和氯仿的溫和化學(xué)提?。挥貌煌軇┘?xì)胞裂解的程度通過在反應(yīng)介質(zhì)中周期性的采樣繪圖所測得。因?yàn)槿軇?dǎo)致細(xì)胞裂解的程度通過實(shí)驗(yàn)分析樣品表面的AHPme和與細(xì)胞懸浮液初始活性的對比測得(％細(xì)胞裂解)。這種培養(yǎng)重組菌株CCM的方法在捷克專利PV-2007-82中有描述。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明產(chǎn)量為60%中氯仿是最適合的溶劑，因此進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)是優(yōu)化酶使其有更高的AHPme，結(jié)果如表1所示。按照上面的程序，不同濃度的氯仿被添加到初始的化學(xué)裂解中，隨后對酶進(jìn)行提取。在氯仿濃度為2%ν/ν時(shí)，與其他濃度相比觀察到的細(xì)胞裂解為80%。結(jié)果如表2所示。更進(jìn)一步地，為提高細(xì)胞裂解的程度，將化學(xué)清潔劑和選自EDTA(乙二胺四乙酸)、溴棕三甲胺、尿素和十二烷基硫酸鈉的金屬螯合物添加到氯仿，觀察到用十二烷基硫酸鈉作為補(bǔ)充時(shí)增加了細(xì)胞裂解的程度。結(jié)果如表3所示。這個(gè)反應(yīng)可在溫度為15到35°C條件下方便的進(jìn)行。更進(jìn)一步地，該細(xì)胞溶解生物量在溫度為5°C條件下保存12小時(shí)，使來自裂解細(xì)胞的蛋白質(zhì)分離。懸浮液的溫度提高到28到30°C并用蒸餾水稀釋；PH值用2M乙酸調(diào)節(jié)到5.0。在40°C下，向懸浮液中添加聚乙烯亞胺，一個(gè)小時(shí)后酸性蛋白凝結(jié)。絮凝材料是通過離心和溶液分離的。浮在表面的液體用4N氫氧化鈉調(diào)節(jié)其PH到7.5，所獲得的溶液被認(rèn)為是可溶解酶(SE)。上述部分可溶解酶溶液在溫度為5°C、PH調(diào)節(jié)到7.5時(shí)攪拌。因此，固體硫酸銨，390克每公升，相當(dāng)于60%飽和度(w/v)緩慢加入20分鐘。經(jīng)過進(jìn)一步的攪拌在同樣的溫度下保持60分鐘。飽和溶液冷卻12個(gè)小時(shí)，沉淀下的酶在50°C下被分離。沉淀物每克包含700單位AHPme。f并且2個(gè)單位每毫克蛋白質(zhì)有顯著的活性。在另一個(gè)首選的實(shí)例中，本發(fā)明描述了在30分鐘內(nèi)通過向冷卻的可溶解酶(O-VC)中添加每公升283.6克的固體硫酸銨制備酶的過程。降水進(jìn)行2個(gè)小時(shí)候進(jìn)行離心以獲得酶漿。酶的產(chǎn)量是74%。上述所得的酶漿將用于聚丙烯酰胺凝膠的固定化或下述青霉素酰化酶的進(jìn)一步凈化。在另外一個(gè)具體實(shí)例中，該發(fā)明提供了一種用離子交換色譜法凈化青霉素酰化酶的步驟。在帶有羧基組功能的CATEX色譜板中，弱陽離子交換，已用于從酶漿中所得青霉素?；傅募兓?，用于如S印abeadsandDILBEADS的大孔聚丙烯樹脂的固定化。青霉素?；赣羞x擇的綁定在離子交換器上，大多數(shù)低等電點(diǎn)蛋白質(zhì)經(jīng)歷排列。綁定的青霉素?；赣寐然浱荻葟呐帕兄惺栈?。純化酶的溶液包括兩種相同的Ahp‘呈現(xiàn)的重量比率為12.7。純化后總的活性產(chǎn)量達(dá)到45%。青霉素酰化酶的固定化過程也可適當(dāng)?shù)奶岣吖潭傅暮铣赡芰?，增加更長的反應(yīng)活性時(shí)間，可確保生物催化劑有更好的穩(wěn)定性。固定化過程涉及一種酶包埋的方法。聚丙烯酰胺是酶包埋中最常用的聚合物，因?yàn)樗麄兊南嗨瞥潭扰c自由酶接近。在蛋白質(zhì)綁定時(shí)期，固定化可以達(dá)到接近90%，在活性表達(dá)階段達(dá)到近60-70%。聚丙烯酰胺使用的限制是來源于非活性聚合物的酶的缺乏、物理穩(wěn)定性和遭遇大基質(zhì)分子所遇到的擴(kuò)散問題。這些限制都被利用交聯(lián)的優(yōu)化所克服。所有其他交聯(lián)劑，戊二醛、雙功能交聯(lián)劑是為基于包埋凝膠體的聚丙烯酰胺的選擇(蛋白質(zhì)固定化的基礎(chǔ)和應(yīng)用，由查理德泰勒主編，馬塞爾德克爾公司出版，40:1991)。這種優(yōu)化的主要標(biāo)準(zhǔn)是保留合成酶的活性，盡管一定程度的失活是不可避免的，也向聚合體凝膠傳達(dá)機(jī)械強(qiáng)度，以限制來源于聚合體的酶的缺乏。凝膠包埋酶進(jìn)一步再次交聯(lián)，以確保作為最終產(chǎn)品的生物催化劑的穩(wěn)定性。該方法更適合具有相當(dāng)數(shù)量的非特異性蛋白質(zhì)與戊二醛更好的交聯(lián)。這也有助于加快聚合過程。使用活性低的酶使得過程更加經(jīng)濟(jì)，在產(chǎn)品和活性方面具有更高的收益。如上述獲得的100克酶酶漿經(jīng)過磷酸鈉緩沖液的稀釋以獲得一種均質(zhì)溶液。從包含丙烯酰胺單體溶液(10%w/v)和N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(0.5%w/v)的原液中取14.5ml，在5°C溫度下加入到上述攪拌的酶溶液中，再繼續(xù)攪拌5分鐘。這種反應(yīng)質(zhì)量，將25%(w/v)的戊二醛5ml加入其中，再準(zhǔn)確攪拌8分鐘。然后將0.5%(w/v)的四甲基二乙胺溶液和1.0%(w/v)的飽和過硫酸銨溶液添加到溶液中。在2分鐘內(nèi)開始聚合。對為實(shí)現(xiàn)完全聚合所加入的過硫酸銨和四甲基二乙胺的數(shù)量進(jìn)行研究，結(jié)果如表6所示。已經(jīng)證實(shí)過硫酸銨和四甲基二乙胺的比率為10.6時(shí)，最好實(shí)現(xiàn)完全聚合。獲得一層厚厚的、不透明的聚合體，將它導(dǎo)入預(yù)先冷凍盤中，并充分聚合孵育30分鐘。所形成的凝膠被切斷，并用30目(500微米)的濾網(wǎng)過濾。所得到的凝膠用水在50目(300微米)的濾網(wǎng)中清洗，以除去細(xì)顆粒、沒有反應(yīng)的單體顆粒和其他試劑。用1.2M的氯化鈉對包埋酶進(jìn)行進(jìn)一步的清洗，以除去未綁定的蛋白質(zhì)顆粒。為了加固交聯(lián)，將聚合體在0.5%(w/v)的戊二醛溶液中在25°C下攪拌30分鐘。再次交聯(lián)后，用5體積水將戊二醛顆粒清洗除去。最后催化劑進(jìn)行真空過濾除去多余的水分，儲(chǔ)存在50mM磷酸鈉緩沖液，PH7.8含有500ppm的對羥基苯甲酸乙酯中。最終產(chǎn)品的干重(％)在12-15%之間，98%的粒子尺寸在100-300微米之間。重量范圍介于88到92%之間。表達(dá)活性產(chǎn)量(AHPenG=110U/gww；AHPenG=750U/gdw)相當(dāng)于采用固定化活性的47%?；钚杂墒褂玫?5mM青霉素G，50MmPH為8.0的磷酸鈉緩沖液在37°C進(jìn)行的堿量滴定所決定。阿莫西林的合成活性(Asamx=150U/gdw)是由使用的40mmoles的6-APA和60mmoles的HPGMeHCL，PH為6.3，溫度為40°C的反應(yīng)條件所決定。該反應(yīng)進(jìn)行了30分鐘，然后用高效液相色譜分析其活性。上述過程用可變濃度的丙烯酰胺和N，N-亞甲基雙丙烯酰胺重復(fù)操作，以確定相同包埋酶的最好可行比例。丙烯酰胺和N，N-亞甲基雙丙烯酰胺的最佳可行濃度比例發(fā)現(xiàn)時(shí)191，這時(shí)酶活性的產(chǎn)量為92%。這個(gè)范圍的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。上述實(shí)驗(yàn)繼續(xù)選擇從1到5mm0le每毫克蛋白質(zhì)的戊二醛可變濃度用于交聯(lián)。所得結(jié)果表明，隨著戊二醛濃度的增加，生物催化劑的活性也增加，但是活性的產(chǎn)量是與戊二醛的濃度呈反比的。結(jié)果如表6所示。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明描述了在25°C和37°C時(shí)水解活性和凝膠聚合體(FERMASENA150和FERMASENA1500)的測量，觀察到在較高的溫度下，酶的活性可達(dá)到近2倍。在另外一項(xiàng)更優(yōu)的實(shí)施例中，本發(fā)明被用FERMASENA150和FERMASENA1500從6-APA(親核試劑)和HPGMeHCL(?；?所得的阿莫西林三水化合物的合成所控制。本發(fā)明過程中，酰基原料的摩爾過剩使得開始反應(yīng)向生產(chǎn)產(chǎn)品，一種抗生素的方向移動(dòng)。這兩種反應(yīng)物(?；?，親核試劑)在反應(yīng)的剛開始就加入到間歇反應(yīng)中，這樣可形成厚厚的懸浮液使得?；系娜芙庑暂^低，或者?；弦灾鸩降姆绞郊尤氲椒磻?yīng)中以防止懸浮液的形成。在后來的情況下，反應(yīng)溶液一直是澄清的，直到不溶產(chǎn)品(抗生素)的形成，?；铣跏嫉乃獗嚷瘦^低，這個(gè)過程可以在連續(xù)模式下進(jìn)行。兩種添加?；系姆椒梢越Y(jié)合使用。在反應(yīng)過程中，PH值有下降的趨勢，因此有必要調(diào)整反應(yīng)過程中的PH值。最終PH值為6.3是實(shí)現(xiàn)6-APA最大程度轉(zhuǎn)化為阿莫西林三水化合物的必需條件。PH值使用磷酸或氫氧化鈉或氨水調(diào)節(jié)。類似的用FERMASEPA1500在控制PH條件下從6-APA(親核試劑)和HPGMeHCl(?；?合成阿莫西林的實(shí)驗(yàn)被進(jìn)行。隨著6-APA的轉(zhuǎn)化(％)和阿莫西林的增加，反應(yīng)終止。這種酶從反應(yīng)物中消除，用水清洗并作為以后的應(yīng)用。類似的方式，其他β-內(nèi)酰胺抗生素的合成可利用重組青霉素?；缸鳛樯锎呋瘎臒o色菌CCM4824獲得。用6-ΑΡΑ(親核試劑)和PGMeHCl(作為?；?的濃縮液合成氨比西林；7-ADCA(親核試劑)和HPGMeHCl酯或酰胺(?；?合成頭孢羥氨芐；7-ADCA(親核試劑)和HPGMeHCl酯或酰胺(?；?合成頭孢氨芐。縮寫Aapenc代表PenG的水解活性SAapenc代表每毫克蛋白質(zhì)的表達(dá)活性SE代表通過例5所制備的可溶解酶PA代表青霉素酰化酶PGA代表青霉素G?；竢PAAS代表從無色菌所得的重組青霉素酰化酶rPGAAS代表從大腸桿菌所得的重組青霉素G?；窰PGMeHCl代表D-對羥基苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽PGMeHCl代表D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽HPG代表D-羥苯基甘氨酸PG代表D-苯基甘氨酸AAD代表活性酰基原料Wn代表與初始親核試劑的轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)AMOX代表阿莫西林三水合物AMP代表氨比西林三水合物CEX代表頭孢氨芐水合物Ahaad代表活性?；系乃饣钚訟sabox代表阿莫西林三水合物的合成能力Asadip代表氨比西林三水合物的合成能力Ascex代表頭孢氨芐水合物的合成能力S/Hinit代表Α、。χ、Asaiiip或AsCex/AHMDRM代表反應(yīng)混合物cdw代表細(xì)胞干重dw代表干重ww代表濕重TEMED代表N，，N，，N，，N，-四甲基二乙胺Cellpaste代表含有從無色菌所得青霉素?；傅拇竽c桿菌BL21細(xì)胞FERMASEPA1500代表被從大腸桿菌所得重組青霉素G?；赴竦木郾０纺zFERMASENA150代表被從無色菌所得重組青霉素?；赴竦木郾０纺zRPM代表每分鐘轉(zhuǎn)速U代表活性單位⑶定義為在37°C，PH為8，在53Mm青霉素G鉀鹽，周圍用50mM硫酸鈉緩沖在零級動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)每分鐘催化形成1微摩爾6-APA所需要的酶的量。下面的例子，其中包括較優(yōu)例子，將更好的有助于說明本發(fā)明的實(shí)行，可以通過舉例對其有詳細(xì)的理解，并可實(shí)現(xiàn)對本發(fā)明更優(yōu)實(shí)施例說明討論的目的。實(shí)施例實(shí)施例1細(xì)胞在高壓均質(zhì)下的分解大腸桿菌BL21CCM7394隨著從無色菌CCM4824所得青霉素酰化酶的活性通過離心過濾以細(xì)胞漿的方式(卷式離心機(jī))或者以細(xì)胞懸浮液的方式(阿爾法離心機(jī))從培養(yǎng)基中獲得。獲得的微生物懸浮在0.02M磷酸鈉得到5%(cdw/v)，懸浮液的pH調(diào)整為7，并且用20%w/v氫氧化鈉使其保持不變。冷卻到8-13°C的細(xì)胞懸浮液(2350ml，4.9%cdw/v,AHPenGof86.5U/ml)開始破裂。(均勻，壓力40-50MPA，三個(gè)連續(xù)的周期)。每個(gè)周期后，均勻的細(xì)胞溶液溫度降到8-13°C，pH調(diào)整到7.0。細(xì)胞碎片和一小部分蛋白質(zhì)碎片通過熱凝被清除，它包括用50%乙酸調(diào)整PH值到5.OJnASedipurCL930絮凝劑(2_4g/L)并且保持溫度在40°C—個(gè)小時(shí)。細(xì)胞溶液經(jīng)過快速冷卻至8-13°C，勻漿與700毫升水稀釋，PH值調(diào)整為8.0(20%氫氧化鈉溶液)和混合離心(貝克曼離心機(jī)，角轉(zhuǎn)子，4X350毫升，10，OOOrpm)20分鐘。澄清酶溶液的pH值(2580毫升，8.7mg蛋白/ml,AHpenG為64.8U/ml)調(diào)整為7.0，酶溶液在_16°C冷卻，酶的產(chǎn)量(SAHpenG=8.4U/mg蛋白質(zhì))為82%(細(xì)胞懸浮液的活性在分裂前等于100%)。實(shí)施例2A.通過溫和化學(xué)提取對酶的提取在發(fā)明的另一項(xiàng)具體實(shí)施例中，細(xì)胞懸浮液(1050ml，5%cdw/v，AHpenG為10.2U/ml)用0.IM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)在20°C條件下稀釋。溫和的化學(xué)裂解在帶pH電極，溫度探頭和可變攪拌設(shè)備的三頸玻璃反應(yīng)器中進(jìn)行。用稀釋的氨水溶液把PH值調(diào)整為7.0后，溫度達(dá)到28°C。為了稀釋生物數(shù)量，將1%的溶劑如甲苯，乙酸乙酯，氯仿，醋酸丁酯加入到初始細(xì)胞裂解的反應(yīng)中，在恒溫條件下監(jiān)測該反應(yīng)PH值的變化。樣本周期性的取出以估測細(xì)胞溶解的程度。該反應(yīng)在PH7.0和28°C下持續(xù)了2小時(shí)。由溶解度導(dǎo)致的裂解程度通過分析樣品表面AHpenG測定并與細(xì)胞懸浮液的初始活性比較(％細(xì)胞裂解，表1)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)果表明，氯仿達(dá)到最好的產(chǎn)量為60%，從而，進(jìn)一步要做通過高SAHpenG優(yōu)化酶產(chǎn)量的實(shí)驗(yàn)。B.用氯仿通過溫和化學(xué)提取對酶的提取。遵循上述相同的步驟，將不同濃度的氯仿添加到初始化學(xué)裂解中以及后來的酶提取。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>很明顯，使用2%濃度的氯仿能有效地實(shí)現(xiàn)最大程度的裂解如上述表2所示。較高濃度的氯仿導(dǎo)致較低的產(chǎn)量的情況是由于溶解時(shí)使酶產(chǎn)生了變性。C.用氯仿和不同補(bǔ)充劑的混合物對酶的提取。遵循上述相同的步驟，將不同濃度的化學(xué)清潔劑和金屬螯合劑與氯仿一起加入，以提高化學(xué)裂解和酶的產(chǎn)量。如乙二胺四乙酸(乙二胺四乙酸)，銨，尿素是眾所周知的有助于細(xì)胞裂解的物質(zhì)，無論是單獨(dú)形式或混合。十二烷基硫酸鈉的添加提高了裂解的程度。結(jié)果如下表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例3濃縮酶的制備準(zhǔn)備如實(shí)施例1的350gm細(xì)胞漿，用蒸餾水稀釋至最終濃度在20_25°C下為5%(cdw/v)。細(xì)胞懸液的PH值用2%(ν/ν)的冰三氯甲烷調(diào)整為7.0，并將0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉添加初始裂解中。樣品總時(shí)間為5小時(shí)過程中定期抽取。裂解的物質(zhì)在將蛋白質(zhì)從裂解的細(xì)胞中分離過程之前儲(chǔ)存在5°C的環(huán)境中12小時(shí)。懸浮液的溫度提高到28-30°C和用蒸餾水稀釋2倍。pH值用2M的乙酸調(diào)整到5.0。酸性蛋白凝結(jié)物通過在40°C添加一個(gè)小時(shí)的聚乙烯亞胺從懸浮液中分離。絮凝物在轉(zhuǎn)速為7000rmp的離心分離中從溶液中分離。上清液PH值用四氫氧化鈉溶液調(diào)整為7.5，所得的溶液被稱為可溶性酶(SE)。酶的產(chǎn)量與初始細(xì)胞漿的活性有關(guān)，為90%。表4分離過程中活性青霉素酰化酶的產(chǎn)量可溶性酶(SE)進(jìn)一步用于催化劑的分離。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例4用硫酸銨對酶漿進(jìn)行純化。方法A像實(shí)施例1一樣(2580毫升，8.7mg蛋白/ml，AHpenGof64，8U/ml，pH值7.0)對酶溶液進(jìn)行分離，進(jìn)一步通過硫酸銨進(jìn)行純化。再冷卻30分鐘過程中，將固體硫酸銨(283.6克/升)加入到冷酶溶液(Ο-rC)中。沉淀2小時(shí)，沉淀物通過離心過濾清除。這種酶漿被用于聚丙烯酰胺凝膠的固定化或青霉素?；傅倪M(jìn)一步純化。酶的產(chǎn)率為74%(細(xì)胞懸浮液裂解前的活性等于100%)。方法B實(shí)施例3中的部分可溶性酶在5°C進(jìn)行攪拌并將pH調(diào)整到7.5。固體硫酸銨，390克每公升，相當(dāng)于60%飽和度(w/v)，在20分鐘內(nèi)緩慢的加入。在5°C下經(jīng)過進(jìn)一步的攪拌60分鐘；飽和酶溶液冷卻12小時(shí)。酶沉淀通過轉(zhuǎn)速為7000rmp的離心過濾(雷米離心機(jī))30分鐘被分離。沉淀物包括AHPenG700單位每克和具有顯著活性的2單位每毫克蛋白質(zhì)。方法C通過離子交換色譜對青霉素?；傅募兓瘞Чδ荇然后wCATEX的色譜，弱陽離子交換，用于從酶漿所得青霉素酰化酶的純化，適合諸如SePAbeads和DILBEADS的大孔聚丙烯樹脂的固定化。作為一個(gè)弱陽離子交換，F(xiàn)ractogelCOO“(Merck)與0.02M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)被使用。細(xì)胞漿(實(shí)施例6中準(zhǔn)備的)被溶解在0.IM磷酸鈉緩沖液(pH值7.0，400毫升)，對0.02M磷酸鈉緩沖液(PH7.0)徹底透析，使樣品的電導(dǎo)率和緩沖區(qū)是相同的。溶液離心，顆粒被丟棄。懸浮液中的AHpenG達(dá)到259U/ml和SAHpenG=16.8U/mg蛋白質(zhì)。這種溶液被應(yīng)用到柱，青霉素?；赣羞x擇性的綁定到離子交換器和大量較低等電點(diǎn)蛋白質(zhì)通過柱。綁定的青霉素?；赣寐然浱荻?0.0-0.14米氯化鉀梯度在0.02米磷酸鈉緩沖液，pH值7.0)從柱中除去。從0.41透析溶液組織中分離出青霉素?；?，一個(gè)體積為11的玻璃柱被使用。純化的酶溶液(體積為1.251，AHpenG為43.4U/ml)載有相同的兩種異構(gòu)體SAHPen6(38.1和42.6U/mg蛋白)的重量比為12.7。經(jīng)過這種純化，總收益等于45%。實(shí)施例5聚丙烯酰胺凝膠-FERMASENA150的再次制備方法A從實(shí)施例3A中獲得的酶漿，用0.3M的磷酸鈉緩沖液(pH7.5)稀釋，以獲得75毫升青霉素?；溉芤?AHPenG為250U/ml)。溶液在5°C攪拌。將14.5毫升10%的丙烯酰胺單體和0.5%(w/v)的N’，N’的亞甲基丙烯酰胺添加到酶溶液中，并攪拌5分鐘。加入5ml25%(ν/ν)的戊二醛，并準(zhǔn)確攪拌8分鐘。然后，將0.5%(ν/ν)四甲基溶液和新鮮的1.0%(w/v)過硫酸銨溶液添加到溶液中。在2分鐘內(nèi)開始聚合。在這一階段，有一個(gè)厚厚的、不透明的聚合塊注入到預(yù)先冷凍盤，并允許充分聚合和孵育30分鐘。所形成的聚合凝膠切割，并通過30目(500微米)篩過濾。由此產(chǎn)生的聚合凝膠用水通過50目篩(300微米水)清洗以除去細(xì)顆粒、未反應(yīng)的單體和其他試劑。進(jìn)一步用120M氯化鈉清洗包埋酶5次，以除去游離蛋白質(zhì)。為了提高交聯(lián)，聚合體在溫度為25°C的0.5%戊二醛中攪拌30分鐘。再次交聯(lián)后，用5體積的水清洗以除去戊二醛。最后，催化劑用真空過濾以除去多余的水份并儲(chǔ)存在50mMpH值7.8的磷酸鈉緩沖液內(nèi)，含有500ppm的對羥基苯甲酸乙酯。最后制備的干重在12-15%之間，98%的顆粒粒徑分布在100-300微米之間。產(chǎn)量范圍為88到92%。表達(dá)活性的產(chǎn)量(AHpenG=110U/gww；AHpenG=750U/gdw)相當(dāng)于47%，其為固定化所得的活性。這些活性由堿滴定法測定，在37°C下，使用25mM青霉素G鉀、50mMpH值為8.0磷酸鈉緩沖液。阿莫西林的合成活性(ASAmox=150U/gdw)在使用40mmol6-APA和60HPGMe.HClmmol的情況、pH值為6.3和溫度為40°C的條件下而定。反應(yīng)進(jìn)行了30分鐘，用高效液相色譜法測定活性。方法B如實(shí)施例5方法A所描述的過程，但是使用可變濃度的丙烯酰胺和N，N’-二亞甲基丙烯酰胺(表5)。報(bào)告表明了在從21到201的比例不等的兩個(gè)單體的使用的變化導(dǎo)致了不同孔徑將包埋不同程度凝膠基質(zhì)蛋白質(zhì)分子。同樣，不同比率的丙烯酰胺和N’N-亞甲基丙烯酰胺也對孔徑尺寸和所得作為生物催化劑的酶活性有影響。表5實(shí)丙烯酰胺的濃IN，N’-二亞甲基的濃丙烯酰胺和N，N’-二亞甲~~活性結(jié)~驗(yàn)度度基的比例果~10θΓδ51811~2—295θΓδ191544~~395θΓδ1816~90Λ719154~~586θΓδ715136依據(jù)上述結(jié)果，為了得到更好地酶活性，丙烯酰胺和N’N-亞甲基用于催化劑制備的濃度分別為8.35%(w/v)和0.43%(w/v)，比率相當(dāng)于191(實(shí)施例6)。方法C改性聚合聚丙烯酰胺凝膠的制備FermaseNA1500如實(shí)施例5所述的程序，方法B是用8.35%(w/v)丙烯酰胺和0.43%(w/v)N'，N’-二亞甲基進(jìn)行重復(fù)，希望不同濃度的戊二醛可用于交聯(lián)。從1到5毫摩爾每毫克選擇不同的濃度的蛋白質(zhì)。最佳濃度戊二醛的選擇是基于生物催化劑的強(qiáng)度。生物催化劑的強(qiáng)度由生物催化劑的屈服機(jī)械應(yīng)力決定。為此，在水中準(zhǔn)備10%的生物催化劑懸浮液準(zhǔn)備并在250°C轉(zhuǎn)速為70rpm軌道振動(dòng)篩受到玻璃珠(5毫米直徑)的被迫震動(dòng)12小時(shí)。壓力處理后，生物催化劑用于檢測殘余酶的活性和重力沉降時(shí)間。結(jié)果總結(jié)如表6。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>由于這些細(xì)顆粒的浮力，相對較少的機(jī)械強(qiáng)度的生物催化劑容易打成細(xì)顆粒，穩(wěn)定時(shí)間增加。所以，沉淀時(shí)間被作為機(jī)械穩(wěn)定性的測量。雖然實(shí)施例4的活性與其配對物相比較低，因此其穩(wěn)定性也被選定為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的最佳組合。方法D(由IchiroChibata編制的固定化酶的制備，78_92，1978)建議使用0.75%-1.0%(w/v)過硫酸銨和0.5%(v/v)TEMED用于聚合。完全聚合所需的時(shí)間在每次實(shí)驗(yàn)斗檢測。討論的結(jié)果如下表7。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)施例6聚丙烯酰胺凝膠聚合的評測(FERMASEΝΑ150)通過從在大腸桿菌BL21CCM7394中表達(dá)的無色菌CCM4824(rPAAs)所得重組青霉素?；赴裰苽浯呋瘎＞郾０纺z包埋被用在如實(shí)施例5所述的情況。方法A催化劑的水解活性測定采用堿滴定法(15mM青霉素G鉀，0.IM的磷酸鈉，pH值在25°C時(shí)8.0)。催化劑與27.5U/gww的AHPenG(13.5%dw,204U/gdw的AHPenG)用在合成實(shí)驗(yàn)。此外，同一催化劑的水解活性測定在較高溫度下使用堿滴定法(15mM青霉素G鉀，0.IM的磷酸鈉，pH值在37°C是8.0)催化劑的活性近2倍(AHPen=58U/gww,AHpenG=430U/gdw)。方法B合成阿莫西林的水解活性ASAmox192U/gdw在反應(yīng)條件300mmol6-APA，700mmolHPGMe.HCl,pH值6.3，25°C下測定。在合成阿莫西林的過程中反應(yīng)物是在恒溫28°C由高效液相色譜法用columnLuna5μCl8,150X2mm(Phenomenex)測定的，色譜分析的流動(dòng)相用pH值3.1的0.05M磷酸鈉緩沖液，含括流速0.2毫升/分鐘的7.5%甲醇。頂峰是215nm.樣品制備反應(yīng)混合物樣品用含有0.05%十二烷基硫酸鈉的流動(dòng)相稀釋200倍，離心(14000rmp,10分鐘)并注入(體積為10微升)。HPG，6-APA，HPGMe和AMOX在高效液相色譜仲停留時(shí)間分別為2.3,3.2,5.5和7.6分鐘。阿莫西林合成的單位是在反應(yīng)的條件每分鐘合成一微克阿莫西林。實(shí)施例7聚合聚丙烯酰胺凝膠的制備(FERMASEPA1500).為了比較從大腸桿菌BL21CCM7394所表達(dá)的霧色菌CCM4824所得重組青霉素酰化酶的合成效率，(FERMASENA150)，從重組大腸桿菌E.coliPGA(rPGAEC)制備類似的固定化。催化劑用與實(shí)施例6類似的合成物的變化和酶的裝填的方法包埋rPGAEC制備。催化劑(15.7%dw)水解活性用堿滴定法(15mM青霉素G鉀，0.IM的磷酸鈉，25°C下pH值8.0)測定。帶43.6U/gdwAHPenG的催化劑被用于阿莫西林合成。此外，同一催化劑的水解活性測定在較高溫度下使用堿滴定法(15mM青霉素G鉀，0.IM的磷酸鈉，pH值在37°C是8.0)催化劑的活性接近兩倍(AHpen=81U/gww，或516U/gdw)。54U/gdw的阿莫西林合成活性測定的反應(yīng)條件300mmol6-APA，700mmolHPGMcHCl，pH值6.3，25°C，如實(shí)施例6所述。實(shí)施例8用FERMASEΝΑ150和FERMASEPA1500從6_APA(親核試劑)和HPGMeHCl(?；?合成阿莫西林三水合物(AMOX)-間歇反應(yīng)。一個(gè)夾套反應(yīng)器(體積25毫升)底部裝有濾網(wǎng)(125微米，尼龍)和攪拌裝置，用9.4ml軟化水(25°C)和376毫克6-APA(純度92%，1.6mmol的親核試劑)裝滿并用40%的氫氧化鈉將PH值調(diào)整至7.5。然后，加入766mgHPGMe-HCl(99%純度，3.48mmol?；?并用40%的氫氧化鈉將pH值調(diào)整到6.3。在此之后，HPGMe.HCl晶體懸浮液形成。隨后，總量為0.6g(ww)的FERMASENA150)轉(zhuǎn)入到反應(yīng)器，開始攪拌(丨=0分鐘)，溫度保持在25°C。大約60分鐘后，懸浮液的粘度緩慢下降(HPGMe.HCl晶體溶解和AMOX晶體形成)。PH值由6.3緩慢增加到6.4，在第180分鐘，用20%磷酸將pH值重新調(diào)整為6.3。200分鐘后，pH值為6.17，轉(zhuǎn)化率達(dá)到96.9%Wn。270分鐘后，pH值下降到5.85，轉(zhuǎn)化率為99.1%Wn。AMOX的初始合成速率(AsAmox)等于85U/gdw的催化劑，HPG的形成速率為27U/gdw的催化劑。比值S/Hinit為3.15。轉(zhuǎn)化的過程如圖1.a.(IA/VI)所示。同樣的實(shí)驗(yàn)是在裝有fermasepai500的反應(yīng)器(如上)裝滿9.4ml的軟化水(250C)，和376mg的6_APA(92%純度，1.6mmol親核試劑)并用40%氫氧化鈉將pH值調(diào)整到7.5。然后，加入766mg的HPGMeHCl(99%純度，3.52mmol酰基原料)并用40%氫氧化鈉將PH值調(diào)整到6.3。隨后，總量為0.6g(濕重)的FERMASEPA1500轉(zhuǎn)入反應(yīng)器，開始攪拌(t=0分鐘)，溫度保持在250C0pH值，從6.3緩慢增加至6.4，在第160分鐘用20%磷酸將PH值調(diào)整為6.3。200分鐘后，pH值為6.2和轉(zhuǎn)化率達(dá)到65.1%Wn0270分鐘后，pH值下降到6.2，轉(zhuǎn)化率為75.6%Wn。AMOX的初始合成速率(AsAmox)相當(dāng)于53.7U/gdw的催化劑，HPG形成的速率為62.3U/gdw的催化劑。比值S/Hinit為0.86。轉(zhuǎn)化的過程如圖1.b.(IB/VI)所示。最后剩余反應(yīng)物的濃度如表8所示。實(shí)施例9用FERMASENA150從6-APA和HPGMeHCl合成AMOX以及AMOX的純化。一個(gè)底部裝有濾網(wǎng)(125微米，尼龍)和攪拌裝置的夾套反應(yīng)器(體積25毫升)，用94ml軟化水(25°C)和3.028mg的6-APA(純度92%，1.6mmol的親核試劑)裝滿并用40%的氫氧化鈉將pH值調(diào)整至7.5。然后，加入6.964mg的HPGMeHCl(99%純度，32mmoIe的?；?，用40%的氫氧化鈉將pH值調(diào)整到6.3。隨后，將總量為0.6g(ww)的FERMASENA150轉(zhuǎn)入到反應(yīng)器，開始攪拌(丨=0分鐘)，溫度保持在251。pH值開始增加緩慢，在第60分眾、第80分鐘和第100分鐘，用磷酸(20%)將pH值調(diào)整到6.3。140分鐘后，pH值為6.01和轉(zhuǎn)化率達(dá)到96.8%Wn,反應(yīng)停止。ASAmox相當(dāng)于167.2U/gdw的催化劑，HPG形成的速率為55.9U/gdw的催化劑。比值S/Hinit為2.99。轉(zhuǎn)化的過程如圖2.a.(IIA/VI)所示。最后剩余反應(yīng)物的濃度見表8。反應(yīng)混合物酸化至pH值為1.8，溶液在溫和的真空過濾下從催化劑中分離。催化劑用少量的水清洗。溶液通過纖維濾網(wǎng)在真空條件下過濾變得澄清，并用冰水浴使其冷卻。澄清溶液的PH值調(diào)整至4.2，將溶液放置在冰箱中16個(gè)小時(shí)，形成的阿莫西林三水合物晶體被留下。晶體通過尼龍過濾網(wǎng)(125微米)過濾分離，迅速用冰丙酮(_18°C)清洗并干燥。分離所得的5.Og阿莫西林三水合物代表其產(chǎn)量為92.5%。實(shí)施例10通過pH值控制用FERMASENA150從6-APA和HPGMeHCl合成ΑΜ0Χ，?；?親核試劑的比率為1.49。一個(gè)與實(shí)施例8類似的反應(yīng)器，用82ml軟化d水(25°C)和5.64g的6-APA(純度92%,24.Ommole親核試劑)裝滿，并用40%氫氧化鈉將pH值調(diào)整為7.5。然后，加入7.84g的HPGMeHCl(純度99%，35.66mmole?；?，并用40%氫氧化鈉將pH值調(diào)整為6.3。隨后，將總量為18.Og(WW)的FERMASENA150轉(zhuǎn)入到反應(yīng)器，開始攪拌(t=0分鐘)，溫度保持為25°C。在反應(yīng)過程中的第30分鐘和第80分鐘，用磷酸(20%)將pH值重新調(diào)整到6.3。240分鐘后，pH值為5.65和轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.3%Wn0ASAmox(0-20分鐘)相當(dāng)于75.6U/gdw的催化劑，而HPG的形成速率為17.8U/gdw的催化劑。比值S/Hinit是4.25。最后剩余反應(yīng)物的濃度見表8。轉(zhuǎn)化的過程如圖2.b.(IIB/VI)所示。實(shí)施例11用FERMASENA150從6-APA和HPGMeHCl合成AMOX以及AMOX的純化-聯(lián)合間歇反應(yīng)。一個(gè)像實(shí)施例8中的反應(yīng)器，用188ml的軟化水(25°C)和6.92g的6-APA(純度為92%，29.44mmole親核試劑裝滿，并用40%的氫氧化鈉調(diào)整其PH值為7.5。然后，加入6.964g(第一部分)的HPGMeHCl(純度為99%，31.68mmole酰基原料)并用40%的氫氧化鈉將其PH值調(diào)整到6.3。培養(yǎng)溶液澄清，HPGMeHCl完全溶解。隨后，總量為12.Og(驟)的FERMASENA150加入到反應(yīng)器中，開始攪拌(t=0分鐘)，溫度保持在25°C。反應(yīng)20分鐘后，加入6.964g(第二部分)HPGMeHCl(31.68mmole)并用40%的氫氧化鈉將PH值調(diào)整到6.3。在反應(yīng)過程中的第40分鐘，加入第三部分(6.964g)HPGMeHCl(31.68mmoles)。在反應(yīng)過程中PH值有降低的趨勢，所以在第60分鐘、第80分鐘和第110分鐘需要用40%的氫氧化鈉將PH值重新調(diào)整到6.3。140分鐘后，PH值降低到5.67，轉(zhuǎn)化率達(dá)到98.7%Wn。在反應(yīng)過程中的第40分鐘，AMOX開始結(jié)晶。Asadiox(0-20分鐘)相當(dāng)于123.OU/gdw的催化劑，HGP形成的速率為20.5U/gdw的催化劑。加入第二次劑量的HPGMeHCl之后，合成速率提高到190.OU/gdw催化劑，加入第三劑量之后相當(dāng)于143.OU/gdw。S/H—的比值為6.0(0-20分鐘)，加入第二次劑量和第三次劑量的?；虾蟊戎捣謩e降低到2.28和0.96。反應(yīng)過程的時(shí)間如圖3(III/VI)所示。最終剩余反應(yīng)物的濃度見表8。在反應(yīng)過程中的第40分鐘，AMOX開始結(jié)晶并且懸浮液的粘度變得更大。將反應(yīng)混合物稀釋兩倍并將AMOX懸浮液在真空和攪拌的條件下除去。最后，將催化劑用少量體積的水反復(fù)清洗。體積量可以參考(465ml)，在冰水淋浴中冷卻并用10%的鹽酸酸化使其PH為1.8。AMOX溶液(497ml)的PH值重新調(diào)整到2.2。溶液通過纖維濾網(wǎng)過濾在真空條件下過濾澄清并用水清洗過濾器。澄清溶液(522ml)的PH值調(diào)整到4.2，AMOX晶體在冰箱中保存16小時(shí)。晶體通過尼龍濾布(125μm)過濾被分離，快速用冰丙酮(_18°C)清洗并干燥。所得到的10.5gAM0X代表摩爾產(chǎn)量為85%。在母液、催化劑和丙酮中所分離的剩余阿莫西林產(chǎn)品的濃度分別為9.9,3.1和0.6%。實(shí)施例12用FERMASEΝΑ150從6-ΑΡΑ和HPGMeHCl合成AMOX以及AMOX的純化-聯(lián)合間歇反應(yīng)。一個(gè)與實(shí)施例11相似的反應(yīng)器，用78ml的軟化水(25°C)和3.46g的6-APA(純度為92%，14.2mmole親核試劑裝滿，并用40%的氫氧化鈉調(diào)整其PH值為7.5。然后，力口入3.482g的HPGMeHCl(純度為99%，15.84mmole?；?并用40%的氫氧化鈉將其PH值調(diào)整到6.3。培養(yǎng)溶液澄清，HPGMeHCl完全溶解。隨后，總量為22.Og(ww)的FERMASENA150加入到反應(yīng)器中，開始攪拌(丨=0分鐘)，溫度保持在251。反應(yīng)20分鐘后，加入3.482g(第二部分)HPGMeHCl(15.84mmole)并用40%的氫氧化鈉將PH值調(diào)整到6.3。在反應(yīng)過程中的第40分鐘，加入第三部分(1.738g)HPGMeHCl(7.92mmoles)。在反應(yīng)過程中PH值有降低的趨勢，所以在第50分鐘和第80分鐘需要用40%的氫氧化鈉將PH值重新調(diào)整到6.3。最終剩余反應(yīng)物的濃度見表8。70分鐘后，PH值降低到5.67，轉(zhuǎn)化達(dá)到98.1%Wn。Asadim(0-20分鐘)相當(dāng)于71.3U/gdw的催化劑，HGP形成的速率為23.5U/gdw的催化齊IJ。加入第二次劑量的HPGMeHCl之后，合成速率提高到121.2U/gdw催化劑，加入第三劑量之后降低到37.2U/gdw。S/Hinit的比值為3.0(0-20分鐘)，加入第二次劑量和第三次劑量的酰基原料后比值分別降低到2.8和0.47。反應(yīng)20分鐘后，AMOX開始結(jié)晶并且懸浮液的粘度變得更大。將產(chǎn)品稀釋兩倍，并將AMOX用與實(shí)施例11相類似的方法分離?？傻玫?.IgAMOX，其代表產(chǎn)量為82.6%。實(shí)施例13用FERMASENA150從6-APA和HPGMeHCl合成AMOX-?；暇徛尤氲拈g歇反應(yīng)。一個(gè)與實(shí)施例9類似的反應(yīng)器，用94ml軟化水(25°C)和3.46g的6_APA(純度為92%,14.72mmole的親核試劑)裝滿，并用40%的氫氧化鈉將其PH值調(diào)節(jié)到7.5。然后，力口入6.094gHPGMeHCl(純度為99%，27.72mmole的?；?并用40%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)其PH值到6.3。因?yàn)镠PGMe.HCl結(jié)晶的形成使得混合物變得渾濁。隨后，將總量為6.Og(驟)的FERMASENA150加入到反應(yīng)器中，開始攪拌(t=0分鐘)，并將溫度保持在25°C。反應(yīng)60分鐘后，加入1.567g(第二部分)HPGMe.HCl(純度為99%，7.13mmole)并用40%的氫氧化鈉將PH值調(diào)整到6.3。在反應(yīng)過程中PH值有降低的趨勢，所以在第90分鐘需要用40%的氫氧化鈉將PH值重新調(diào)整到6.3。160分鐘后，PH值為6.32，轉(zhuǎn)化達(dá)到96.6%w.r.n。AsAm。x(0_20分鐘)相當(dāng)于124.8U/gdw的催化劑，HGP形成的速率為30.2U/gdw。加入第二次劑量的HPGMeHCl之后，合成速率提高到190.OU/gdw催化劑。S/Hinit的比值為6.0(0-20分鐘)，加入第二次劑量的酰基原料后比值為2.28。轉(zhuǎn)化過程的時(shí)間如圖4(IV/VI)所示。最后剩余的反應(yīng)物濃度見表8。將產(chǎn)品稀釋兩倍，并將AMOX用與實(shí)施例11相類似的方法分離?？傻玫?.2gAM0X,其代表產(chǎn)量為84.2%。表8阿莫西林合成結(jié)果匯總<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>370.6022.21)aVg=110U/gdw；750U/gdw；PH8，37°C實(shí)施例14用FERMASENA150從6-APA和HPGMeHCl合成AMOX的放大以及AM0X的純化400ml規(guī)模。酶的耦合是使用一個(gè)1000ml、工作體積為400ml、底部有三個(gè)出口的圓柱形夾套玻璃反應(yīng)器進(jìn)行。混合是通過具有可變速控制的三葉漿式葉輪完成。反應(yīng)是在恒定轉(zhuǎn)速為300+/-5的攪拌下進(jìn)行。6.9克的6-APA、相當(dāng)于80mmoles和27.84克的HPGMeHCl、相當(dāng)于320mmoles加入到反應(yīng)器中，分散開以后，用11摩爾的氨水調(diào)整PH值在6.4到7.4之間。最終調(diào)整PH值到6.3、體積到400ml后，將FERMASENA150加入到初始合成反應(yīng)中。裝滿的酶相當(dāng)于裝填的644UAHpm(;如本文其他地方提到的每克0-內(nèi)酰胺核子。酶耦合是在28°C和通過反應(yīng)監(jiān)控的PH條件下進(jìn)行。樣品在固定的時(shí)間間隔抽取并用高效液相色譜分析。反應(yīng)隨著6-APA的轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)和隨之AM0X的增加而終止。將酶從反應(yīng)體系中撤離并用50ml的水清洗三次，直到所有的沉淀都從酶上清洗下來。酶將一直保存在5°C環(huán)境中直到下次使用。固定化酶撤離后將溶液的PH值調(diào)整到2并將澄清的溶液通過濾紙過濾，然后將溶液冷卻到5°C并將PH調(diào)整到6.3。出現(xiàn)的沉淀經(jīng)過過濾并將剩余母液的PH值調(diào)整到8到9。第二次所得的沉淀也經(jīng)過過濾。所得的沉淀均進(jìn)行真空干燥。6-APA轉(zhuǎn)化為AM0X的轉(zhuǎn)化率大約為92%。高效液相色譜分析顯示AM0X的純度達(dá)到98.50%,AM0X的摩爾產(chǎn)量為57.6%。實(shí)施例15用FERMASENA150從6-APA和HPGMeHCl合成AM0X的放大以及AM0X的純化50ml規(guī)模。酶的耦合是使用一個(gè)250ml、工作體積為50ml、底部有三個(gè)出口的圓柱形夾套玻璃反應(yīng)器進(jìn)行?；旌鲜峭ㄟ^具有可變速控制的三葉漿式葉輪完成。反應(yīng)是在恒定轉(zhuǎn)速為300+/-5的攪拌下進(jìn)行。1.296克的6-APA、相當(dāng)于120mmoles和3.48克的HPGMeHCl、相當(dāng)于320mmoles加入到反應(yīng)器中，分散開以后，用11M的氨水調(diào)整PH值在6.4到7.4之間。最終調(diào)整PH值到6.3、體積到50ml后，將FERMASENA150加入到初始合成反應(yīng)中。裝滿的酶相當(dāng)于裝填的178UAHpm(;如本文其他地方提到的每克內(nèi)酰胺核子。酶耦合是在28°C和通過反應(yīng)監(jiān)控的PH條件下進(jìn)行。樣品在固定的時(shí)間間隔抽取并用高效液相色譜分析。反應(yīng)隨著6-APA的轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)和隨之AM0X的增加而終止。將酶從反應(yīng)體系中撤離并用20ml的水清洗三次，直到所有的沉淀都從酶上清洗下來。酶將一直保存在5°C環(huán)境中直到下次使用。固定化酶撤離后溶液冷卻到5°C并將PH調(diào)整到6.3。出現(xiàn)的沉淀經(jīng)過過濾并將剩余母液的PH值調(diào)整到8到9。出現(xiàn)的沉淀也經(jīng)過過濾。所得的沉淀均進(jìn)行真空干燥。6-APA轉(zhuǎn)化為AM0X的轉(zhuǎn)化率大約為91.8%。高效液相色譜分析顯示AM0X的純度達(dá)到98.2%，通過6-APA轉(zhuǎn)化的AM0X的摩爾產(chǎn)量為57%。實(shí)施例16用FERMASENA150從6-APA和HPGMeHCl合成AM0X的放大以及AM0X的純化50ml規(guī)模。酶的耦合是使用一個(gè)250ml、工作體積為50ml、底部有三個(gè)出口的圓柱形夾套玻璃反應(yīng)器進(jìn)行?；旌鲜峭ㄟ^具有可變速控制的三葉漿式葉輪完成。反應(yīng)是在恒定轉(zhuǎn)速為300+/-5的攪拌下進(jìn)行。1.51克的6-APA、相當(dāng)于140mmoles和3.48克的HPGMeHCl、相當(dāng)于320mmoles加入到反應(yīng)器中，分散開以后，用11M的氨水調(diào)整PH值在6.4到7.4之間。最終調(diào)整PH值到6.3、體積到50ml后，將FERMASENA150加入到初始合成反應(yīng)中。裝滿的酶相當(dāng)于裝填的178UAHpm(;如本文其他地方提到的每克內(nèi)酰胺核子。酶耦合是在28°C和通過反應(yīng)監(jiān)控的PH條件下進(jìn)行。樣品在固定的時(shí)間間隔抽取并用高效液相色譜分析。反應(yīng)隨著6-APA的轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)和隨之AM0X的增加而終止。將酶從反應(yīng)體系中撤離并用20ml的水清洗三次，直到所有的沉淀都從酶上清洗下來。酶將一直保存在5°C環(huán)境中直到下次使用。固定化酶撤離后溶液冷卻到5°C并將PH調(diào)整到6.3。出現(xiàn)的沉淀經(jīng)過過濾并將剩余母液的PH值調(diào)整到8到9。第二次出現(xiàn)的沉淀也經(jīng)過過濾。所得的沉淀均進(jìn)行真空干燥。6-APA轉(zhuǎn)化為AM0X的轉(zhuǎn)化率大約為94%。高效液相色譜分析顯示AM0X的純度達(dá)到98.54%,AM0X的摩爾產(chǎn)量為70%。實(shí)施例17用FERMASENA150從6-APA和HPGMeHCl合成AM0X的放大以及AM0X的純化100ml規(guī)模。酶的耦合是使用一個(gè)250ml、工作體積為100ml、底部有三個(gè)出口的圓柱形夾套玻璃反應(yīng)器進(jìn)行。混合是通過具有可變速控制的三葉漿式葉輪完成。反應(yīng)是在恒定轉(zhuǎn)速為300+/-5的攪拌下進(jìn)行。2.16克的6-APA、相當(dāng)于lOOmmoles和6.96克的HPGMeHCl、相當(dāng)于320mmoles加入到反應(yīng)器中，分散開以后，用11M的氨水調(diào)整PH值在6.4到7.4之間。最終調(diào)整PH值到6.3、體積到100ml后，將FERMASENA150加入到初始合成反應(yīng)中。裝滿的酶相當(dāng)于裝填的178UAHP‘如本文其他地方提到的每克0-內(nèi)酰胺核子。酶耦合是在28°C和通過反應(yīng)監(jiān)控的PH條件下進(jìn)行。樣品在固定的時(shí)間間隔抽取并用高效液相色譜分析。反應(yīng)隨著6-APA的轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)和隨之阿莫西林的增加而終止。將酶從反應(yīng)體系中撤離并用20ml的水清洗三次，直到所有的沉淀都從酶上清洗下來。酶將一直保存在5°C環(huán)境中直到下次使用。固定化酶撤離后溶液冷卻到5°C并將PH調(diào)整到6.3。出現(xiàn)的沉淀經(jīng)過過濾并將剩余母液的PH值調(diào)整到8到9。沉淀出現(xiàn)并過濾。所得的沉淀均進(jìn)行真空干燥。6-APA轉(zhuǎn)化為AM0X的轉(zhuǎn)化率大約為95%。高效液相色譜分析顯示AM0X的純度達(dá)到98.48%,AM0X的摩爾產(chǎn)量為74.9%。實(shí)施例18用FERMASENA150從6-APA和HPGMeHCl重復(fù)合成AM0X，以及AM0X的純化酶循環(huán)。反應(yīng)的進(jìn)行是使用一個(gè)250ml、工作體積為100ml、底部有三個(gè)出口的圓柱形夾套玻璃反應(yīng)器?；旌鲜峭ㄟ^具有可變速控制的三葉漿式葉輪完成。3.88克的6^々、相當(dāng)于180mmoles和6.96克的HPGMeHCl、相當(dāng)于320mmoles加入到反應(yīng)器中，分散開以后，用40%的氫氧化鈉調(diào)整PH值在6.4到7.4之間。最終調(diào)整PH值到6.3、體積到100ml后，將15克ww的FERMASENA150(AHpenG為146IU/g濕重，724IU/干重，AsAm。x45.7U每克濕重，221U/g干重)加入到初始合成反應(yīng)中。裝滿的酶相當(dāng)于裝填的576UAHP‘如本文其他地方提到的每克內(nèi)酰胺核子。酶耦合式在28°C和通過反應(yīng)監(jiān)控的PH條件下進(jìn)行。樣品在固定的時(shí)間間隔抽取并用高效液相色譜分析。反應(yīng)隨著6-APA的轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)和隨之AM0X的增加而終止。將酶從反應(yīng)體系中撤離并用50ml的水清洗三次，直到所有的沉淀都從酶上清洗下來。酶將一直保存在5°C環(huán)境中直到下次使用。固定酶撤離以后，AM0X通過在實(shí)施例16中描述的下游過程分離。酶可循環(huán)使用多個(gè)周期(如表9所示的25個(gè)循環(huán)次數(shù))。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>6-APA的平均轉(zhuǎn)化率為85.66，平均摩爾產(chǎn)量為82.02。實(shí)施例19使用FERMASENA150從6-APA和PGMeHCl合成氨比西林三水合物。?；?親核試劑比率為1.5。間歇反應(yīng)在PH為5.9、20°C下進(jìn)行。一個(gè)夾套反應(yīng)器(體積為250ml)，底部裝有濾網(wǎng)(125ym，尼龍)和攪拌器，用94ml軟化水(25°C)、8.827g6_APA(純度為98%，40.Ommoles的親核試劑)裝滿，并用40%的氫氧化鈉將PH值調(diào)整到7.5。然后，加入12.473gPGMeHCl(純度為97%,60.Ommoles的?；?，并用40%的氫氧化鈉將PH值調(diào)整到5.9。隨后，將重量為6g(w/w)的FERMASENA150轉(zhuǎn)入反應(yīng)器中，開始攪拌(t=0分鐘)，溫度保持在20°C。大約70分鐘后，形成AMP結(jié)晶，懸浮液的粘度在增強(qiáng)。在反應(yīng)過程中PH值保持在5.9不變。360分鐘后轉(zhuǎn)化率達(dá)到了94.6%Wn。合成AMP的初始速率(AsAmp)相當(dāng)于351.lU/gdw催化劑，形成PG的速率相當(dāng)于56.4U/gdw催化劑。S/Hinit&比值為6.0。最后剩余反應(yīng)物濃度見表9。轉(zhuǎn)化的過程如圖5.a(VA/VI)所示。合成氨比西林的過程中的反應(yīng)物通過高效液相色譜的方法測定，用Tessek柱5iiC8，250X4mm(Tessek，捷克共和國)在恒溫28°C下，流動(dòng)相為0.05M、PH值為6.0每升含有0.5ml三乙胺和40%甲醇的磷酸鈉緩沖液，流速為0.5ml/分鐘。監(jiān)測到的高峰在215nm。樣品制備反應(yīng)混合物用含有0.05%十二烷基硫酸鈉的流動(dòng)相稀釋400倍，離心分離(14000rmp,10分鐘)并注入(體積為10yl)。6_APA、PG、AMP和PGMeHCl在高效液相色譜中保留的時(shí)間分別為5.9,6.85,8.6和15.3。反應(yīng)混合物用30ml水稀釋，催化劑在真空過濾下從AMP懸浮液中分離。晶體通過離心過濾從母液中分離。酶催化劑用母液清洗三次，最后一次用20ml的水清洗。晶體懸浮在母液(清洗液)中，用20%的鹽酸調(diào)節(jié)PH為1.5呈酸性使其溶解，通過纖維濾網(wǎng)在真空下過濾使溶液澄清，并在冰水浴中冷卻。將溶液的PH值調(diào)整到4.2，并將懸浮液在冰箱中存儲(chǔ)16小時(shí)。然后晶體通過離心分離，用冰丙酮(_18°C)清洗并干燥。分離所得的13.2gAMP占總產(chǎn)量的76%.實(shí)施例20使用FERMASENA150從6-APA和PGMeHCl合成AMP。?；?親核試劑比率為I.35。間歇反應(yīng)在PH為5.9、20°C下進(jìn)行。一個(gè)與例19類似的反應(yīng)器，用90ml軟化水(25°C)、8.827g6_APA(純度為98%，40mmoles的親核試劑)裝滿，并用40%的氫氧化鈉將PH值調(diào)整到5.9。然后，加入II.226gPGMeHCl(純度為97%、54mmoles的?；?，并用40%的氫氧化鈉將PH值調(diào)整到6.3。隨后，將重量為10g(w/w)的FERMASENA150轉(zhuǎn)入反應(yīng)器中，開始攪拌(t=0分鐘)，溫度保持在20°C。大約50分鐘后，形成CMP結(jié)晶，懸浮液的粘度在增強(qiáng)。在反應(yīng)過程中PH值保持在5.9不變。360分鐘后轉(zhuǎn)化率達(dá)到了94.6%Wn。合成AMP的初始速率(A3-)相當(dāng)于272.2U/gdw催化劑，形成PG的速率相當(dāng)于25.8U/gdw催化劑。S/Hinit的比值為10.55。最后剩余反應(yīng)物濃度見表9。轉(zhuǎn)化的過程如圖5.b(VB/VI)所示。產(chǎn)品像例19一樣同樣分離。分離所得的13.38的々1^(純度為95.7%)占產(chǎn)量的82.5%。表9氨比西林合成結(jié)果總表<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>"aVg=HOU/gww；750U/gdw;PH8,37°C實(shí)施例21使用FERMASENA150從7-ADCA和PGMeHCL合成頭孢氨芐水合物(CEX)。酰基原料/親核試劑比率為1.5。間歇反應(yīng)在PH為6.3、25°C下進(jìn)行。一個(gè)與例19類似的反應(yīng)器，用91ml軟化水(25°C)、5.18g7_ADCA(重結(jié)晶、純度為99%,24.Ommoles的親核試劑)裝滿，并用40%的氫氧化鈉將PH值調(diào)整到7.5。然后，加入7.49gPGMeHCl(純度為97%、40.5mmoles的酰基原料)，并用40%的氫氧化鈉將PH值調(diào)整到6.3。隨后，將重量為9g(w/w)的FERMASENA150轉(zhuǎn)入反應(yīng)器中，開始攪拌(t=0分鐘)，溫度保持在25°C。大約50分鐘后，形成CEX結(jié)晶，懸浮液的粘度在增強(qiáng)。PH值緩慢降低到6.3時(shí)保持不變。210分鐘后轉(zhuǎn)化率達(dá)到了88.5%Wn。合成CEX的初始速率(Asepx)相當(dāng)于139U/gdw催化劑，形成PG的速率相當(dāng)于21.5U/gdw催化劑。S/Hinit的比值為6.5。最后剩余反應(yīng)物濃度見表10。轉(zhuǎn)化的過程如圖6.a(VI/VI)所示。合成頭孢氨芐的過程中的反應(yīng)物通過高效液相色譜的方法測定，用Tessek柱5iiC8，250X4mm(TeSSek，捷克共和國)在恒溫28°C下，流動(dòng)相為0.05M、PH值為6.0每升含有0.5ml三乙胺和40%甲醇的磷酸鈉緩沖液，流速為0.5ml/分鐘。監(jiān)測到的高峰在215nm。樣品制備反應(yīng)混合物用含有0.05%十二烷基硫酸鈉的流動(dòng)相稀釋200倍，離心分離(14000rmp,10分鐘)并注入(體積為5-10u1)。7-ADCA、PG、CEX和PGMeHCl在高效液相色譜分析中保留的時(shí)間分別為5.85,6.85,8.2和15.3。實(shí)施例22用FERMASENA150從7-ADCA和PGMeHCl合成CEX，?；?親核試劑的比率為1.34，間歇反應(yīng)在PH為6.3、溫度為25°C下進(jìn)行。一個(gè)與例19類似的反應(yīng)器，用94ml軟化水(25°C)、6.56g7_ADCA(重結(jié)晶、純度為99%,30.3mmoles的親核試劑)裝滿，并用40%的氫氧化鈉將PH值調(diào)整到7.5。然后，加入8.4IgPGMeHCl(純度為97%、40.5mmoles的?；?，并用40%的氫氧化鈉將PH值調(diào)整到6.3。隨后，將重量為6g(w/w)的FERMASENA150轉(zhuǎn)入反應(yīng)器中，開始攪拌(t=0分鐘)，溫度保持在25°C。大約70分鐘后，形成CEX結(jié)晶，懸浮液的粘度在增強(qiáng)。PH值緩慢降低到6.3時(shí)保持不變。300分鐘后轉(zhuǎn)化率達(dá)到了88.5%Wn。合成CEX的初始速率(Asepx)相當(dāng)于208U/gdw催化劑，形成PG的速率相當(dāng)于18.5U/gdw催化劑。S/Hinit的比值為11.3。最后剩余反應(yīng)物濃度見表10。轉(zhuǎn)化的過程如圖6.b(VI/VI)所示。表10頭孢氨芐合成結(jié)果總表<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>0AapenG=110U/gww；750U/gdw；PH8，37°C權(quán)利要求一種利用青霉素?；缸鳛樯锎呋瘎┖铣搔?內(nèi)酰胺抗生素的方法，其中所述的青霉素?；干锎呋瘎┦莵碜杂谠诖竽c桿菌BL21CCM7394中表達(dá)的無色菌CCM4824，在其特征在于包括f、利用溶劑和化學(xué)清潔劑或金屬螯合物來增加細(xì)胞通的透性，從而以化學(xué)方法提取青霉素?；?；g、用分級沉淀和層析對可溶性酶進(jìn)行純化；h、在-2到2℃的溫度下，利用比率范圍為15∶1到20∶1的丙烯酰胺和N，N’-二甲基乙二胺對上述酶進(jìn)行固定化；i、通過與戊二醛交聯(lián)穩(wěn)定固定化酶，以獲得粒子尺寸在100到300微米的粗粒子，優(yōu)選的粒子尺寸為150到250微米之間；j、利用上述固定青霉素?；复呋；瘞в谢钚怎；系挠H核試劑，以獲得具有較高產(chǎn)量和純度的β-內(nèi)酰胺抗生素。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的溶劑選自甲苯、乙酸乙酯、氯仿和丁酯。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的化學(xué)清潔劑或金屬螯合物選自EDTA、溴棕三甲銨、尿素和十二烷基硫酸鈉。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的化學(xué)提取是利用1到3%w/v氯仿和0.1到0.2%w/v十二烷基硫酸鈉的混合物。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的提取時(shí)的溫度為15到35°C、優(yōu)選是在28到30°C的溫度下提取6到12小時(shí)。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述提取過程中的PH值保持在5.5到9.0的范圍內(nèi)，優(yōu)選為6.5到7.5之間。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的純化過程是使用硫酸銨進(jìn)行處理。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的純化是使用離子交換層析。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶的固定化包括聚合形式的酶。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述酶蛋白的聚合是使用相當(dāng)于飽和度為30到70%的硫酸銨完成的。11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述酶的固定化過程是在硫酸鈉或鉀鹽緩沖溶液中進(jìn)行。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的固定化還包括與戊二醛的交聯(lián)。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所使用的戊二醛的濃度為2mM到8mM，優(yōu)選在4mM至Ij6mM之間。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的固定化還包括與濃度范圍為0.3到0.5%(w/v)的戊二醛的二次交聯(lián)。15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的親核試劑選自6-氨基青霉烷酸或7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸。16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的?；线x自D-對羥基苯甘氨酸甲酯或D-對羥基苯甘氨酸氨基化合物，或是D-苯甘氨酸甲酯或D-苯甘氨酸氨基化合物。17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述抗生素的合成時(shí)，適宜的PH值為5.2到，7.2之間。18.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述抗生素的合成還包括通過降低上述反應(yīng)混合物的PH值，將一部分β-內(nèi)酰胺抗生素從反應(yīng)混合物中去除。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)混合物的PH值通過增加酸，優(yōu)選為濃鹽酸來調(diào)節(jié)。20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述β-內(nèi)酰胺抗生素是阿莫西林，該抗生素由6-氨基青霉烷酸與D-羥苯甘氨酸甲酯?；铣?，其中6-氨基青霉烷酸與D-羥苯甘氨酸甲酯的摩爾比率范圍為1.2到4.5，更優(yōu)的在1.5到1.8之間。21.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的內(nèi)酰胺抗生素是氨比西林，該抗生素由6-氨基青霉烷酸與D-苯甘氨酸甲酯?；铣桑渲?-氨基青霉烷酸與D-羥苯甘氨酸甲酯的摩爾比率范圍為1.2到4.5，更優(yōu)的在1.3到1.7之間。22.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的內(nèi)酰胺抗生素是頭孢氨芐，該抗生素由7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸和D-苯甘氨酸甲酯?；铣桑渲?-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸與D-羥苯甘氨酸甲酯的摩爾比率范圍為1.2到4.5，更優(yōu)的在1.5到1.7之間。全文摘要本發(fā)明公開一種從大腸桿菌BL21CCM7394重組菌株表達(dá)的無色菌CCM4824所得的獨(dú)立青霉素?；?PA)，關(guān)系到pKXIPl的重組質(zhì)體，以及青霉素酰化酶作為生物催化劑用于工業(yè)合成抗生素的過程。更具體的，本發(fā)明公開一種用反應(yīng)混合物合成半合成β-內(nèi)酰胺抗生素的方法，反應(yīng)混合物由活性?；?用于阿莫西林和頭孢羥氨芐的D-對羥基苯甘酸甲酯或氨基化合物；用于氨比西林的頭孢氨芐的D-苯甘氨酸甲酯或氨基化合物)和親核試劑(6-APA或7-ADCD)組成，由從重組大腸桿菌BL21CCM7394所得的青霉素?；缸鳛樯锎呋瘎┐呋?。文檔編號(hào)C12P37/04GK101802212SQ200780100019公開日2010年8月11日申請日期2007年7月27日優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日發(fā)明者克猶馬·尼昆杰,威瑟瑞阿尼·威廉姆斯·瑞杰斯克,帕維爾·尅斯里克,斯坦尼斯拉伍·貝克,贊博瑞·蘇加特·優(yōu)格西,阿夏爾·特瑞特·克瑞斯納克德,阿奴帕馬·達(dá)特拉申請人:酵素生物技術(shù)有限公司;微生物研究所