一種抗乳酸發(fā)酵菌干擾的大腸桿菌含量測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗乳酸發(fā)酵菌干擾的大腸桿菌含量測定方法，具體涉及一種用于 食品、醫(yī)藥、畜牧等行業(yè)中大腸桿菌含量的檢測方法，特別是涉及一種用于發(fā)酵產(chǎn)乳酸的微 生態(tài)制劑中大腸桿菌含量的檢測方法。。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸桿菌是大腸菌群的一種，它被作為評(píng)價(jià)受腸道致病菌污染的指標(biāo)菌，是評(píng)價(jià) 水質(zhì)和食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，也是評(píng)價(jià)微生態(tài)制劑產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)之 〇
[0003] 目前國家對(duì)食品行業(yè)中大腸桿菌測定主要有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，即國家標(biāo)準(zhǔn)GB/ T4789. 3-2008和進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T0169-2010。GB/T4789. 3-2008中采用的是MPN計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)法測定大腸桿菌數(shù)，主要用于食品行業(yè)；MPN計(jì)數(shù)法歷經(jīng)初發(fā)酵、復(fù) 發(fā)酵確認(rèn)LST陽性管數(shù)，再對(duì)應(yīng)最可能數(shù)檢索表(MPN表）求得最可能的大腸桿菌數(shù)量。平 板計(jì)數(shù)法是通過VRBA培養(yǎng)基培養(yǎng)、再通過BGLB肉湯管產(chǎn)氣確認(rèn)來計(jì)算大腸桿菌數(shù)量的。 無論是MPN計(jì)數(shù)法還是平板計(jì)數(shù)法都存在耗時(shí)長（4-5天)、操作復(fù)雜等問題，MPN計(jì)數(shù)法 得到的更是一個(gè)最有可能的數(shù)值并非一個(gè)確切的數(shù)值。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T0169-2010中只是 在國標(biāo)GB/T4789. 3-2008的基礎(chǔ)上加入了 葡萄糖苷酶熒光法和濾膜/MUG法。這兩種 方法需要專業(yè)的設(shè)備輔助，檢測成本高，對(duì)于一般的企業(yè)來講操作比較困難，只適合于科研 院所、高校等有一定經(jīng)濟(jì)實(shí)力的企事業(yè)單位。水質(zhì)中大腸桿菌的檢測采用的實(shí)行標(biāo)準(zhǔn)HJ/ T347-2007。為濾膜法和15管發(fā)酵法，濾膜法是先將水樣經(jīng)過濾膜抽濾后，再將濾膜片放到 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)典型或可疑菌落進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)后得出結(jié)論，耗時(shí)2天；15管發(fā)酵法操 作分為三步，后兩步驗(yàn)證試驗(yàn)耗時(shí)三天。因此不難看出，以上的各種方法明顯存在試驗(yàn)步驟 繁瑣、耗時(shí)長、檢測成本高、檢測結(jié)果不精確等不足。更值得注意的是，上述所有的方法只適 用于一般常規(guī)的食品、水質(zhì)中大腸桿菌的檢測，并不適用于一些特殊產(chǎn)品的檢測，例如：微 生態(tài)制劑產(chǎn)品。
[0004] 微生態(tài)制劑是一類由乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等其中的一種或多種組成的活菌 制劑產(chǎn)品，它可提高人類、畜禽宿主或植物寄主的健康水平，或促進(jìn)宿主或寄主體內(nèi)正常菌 群生長，可調(diào)整宿主體內(nèi)的微生態(tài)失調(diào)，保持微生態(tài)平衡。而大腸桿菌是微生態(tài)制劑產(chǎn)品中 重要控制的衛(wèi)生指標(biāo)之一。大腸桿菌數(shù)量的多少直接影響微生態(tài)制劑產(chǎn)品質(zhì)量好壞。大腸 桿菌超標(biāo)將直接引起人拉稀、腸炎，動(dòng)物腹瀉等疾病。因此需要找到一種用于檢測微生態(tài)制 劑產(chǎn)品中大腸桿菌含量的檢測方法。
[0005]目前市面上在售的微生態(tài)制劑產(chǎn)品都是革蘭氏陽性菌，如：乳酸菌、酵母菌、芽孢 桿菌類等。乳酸菌和芽孢桿菌中一些種是可以發(fā)酵乳糖產(chǎn)乳酸的革蘭氏陽性菌。國標(biāo)GB/ T4789. 3-2008中的MPN計(jì)數(shù)法中是通過判定發(fā)酵管中是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣來驗(yàn)證是否有大腸桿 菌的存在，而微生態(tài)產(chǎn)品中有些菌種(凝結(jié)芽孢桿菌、乳酸菌等）也是也是可以在厭氧環(huán)境 中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的，因此會(huì)干擾大腸桿菌的檢測結(jié)果；在平板計(jì)數(shù)法中是加入膽鹽、 結(jié)晶紫和中性紅作為顯色劑進(jìn)行大腸桿菌的檢測，通過顯色反映來判定大腸桿菌的含量， 而微生態(tài)制劑中的乳酸菌和凝結(jié)芽孢桿菌也可以通過發(fā)酵的方式代謝乳酸從而降低培養(yǎng) 基的pH導(dǎo)致指示劑顯色，從而干擾檢測結(jié)果。因此平板計(jì)數(shù)法與MPN計(jì)數(shù)法一樣沒有充 分考慮微生態(tài)制劑產(chǎn)品中活菌對(duì)大腸桿菌測定結(jié)果的干擾，比如芽孢桿菌是否會(huì)在平板計(jì) 數(shù)法的培養(yǎng)基上生長？能夠產(chǎn)酸的益生菌(如乳酸菌類）是否會(huì)干擾大腸桿菌的檢測，等 等……，所有這些關(guān)鍵性的問題都是現(xiàn)行大腸桿菌含量檢測方法所沒有考慮到的。因此，現(xiàn) 有的大腸桿菌檢測方法并不能用于微生態(tài)制劑產(chǎn)品中的大腸桿菌檢測。
[0006] 專利CN1796568發(fā)明了一種大腸桿菌檢測方法，采用月桂基硫酸鈉作為抑菌劑加 入到培養(yǎng)基中，可用于檢測飲用水、環(huán)境水和食品中的大腸桿菌。但專利CN1796568的使 用范圍有限，飲用水、環(huán)境水和食品中微生物含量少，特別是抗月桂基硫酸鈉的芽孢桿菌類 微生物更是少之又少，而微生態(tài)制劑產(chǎn)品是一類包含芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌等微生物 的活菌制劑，其微生物數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于飲用水、環(huán)境水和食品中的微生物數(shù)量。綜上，專利 CN1796568并沒有考慮微生態(tài)制劑產(chǎn)品中大量活菌對(duì)大腸桿菌含量檢測結(jié)果的影響，并不 適用于微生態(tài)制劑中的大腸桿菌含量檢測。到目前為止，文獻(xiàn)檢閱未發(fā)現(xiàn)一種針對(duì)于微生 態(tài)制劑產(chǎn)品中大腸桿菌含量的有效檢測方法。針對(duì)以上種種情況，需要尋找一種適合于微 生態(tài)制劑產(chǎn)品中大腸桿菌含量檢測的培養(yǎng)基。因此，我們提出一種專門用于微生態(tài)制劑產(chǎn) 品中大腸桿菌含量的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提出一種抗乳酸發(fā)酵菌干擾的大腸桿菌含量的計(jì)數(shù)方法，可明顯提升大腸 桿菌含量檢測方法的實(shí)用性，采用該方法可在24小時(shí)內(nèi)檢測出大腸桿菌的確切數(shù)量。本發(fā) 明能明顯擯棄乳酸發(fā)酵菌對(duì)檢測結(jié)果的干擾，減少假陽性和假陰性出現(xiàn)的幾率，提高檢測 效率和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0008] 本發(fā)明所述的大腸桿菌檢測培養(yǎng)基由胰蛋白胨10.0-15.0g，乳糖10.0-20.0g， SDS0.5-1. 0g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的TTC溶液3.0-7.0ml，磷酸氫二鉀4.0-6.0g，氯化鈉 3.0-5. 0g，質(zhì)量濃度為1.6g/100ml溴甲酚紫溶液2.0-6.0ml，瓊脂粉10. 0-20.0g或聚 丙烯酸鈉15.0-25.0g，蒸餾水1 000ml，最終的pH為6. 0-6. 5。
[0009] 培養(yǎng)基中胰蛋白胨作為培養(yǎng)基的基本營養(yǎng)物質(zhì)；乳糖作為大腸桿菌檢測的發(fā)酵底 物；TTC和溴甲酚紫作為指示劑；SDS作為革蘭氏陽性菌的抑菌劑加入，能有效抑制乳酸發(fā) 酵菌的生長，防止乳酸發(fā)酵菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)乳酸，產(chǎn)生假陽性，影響大腸桿菌檢測結(jié)果。
[0010] 檢測方法：將待檢樣品按稀釋涂布平板法涂布于大腸桿菌檢測專用培養(yǎng)基中，適 宜溫度培養(yǎng)。
[0011] 檢測結(jié)果的判定及計(jì)算：若菌落周邊先變成黃色再變成紅色，說明此菌落是大腸 桿菌，計(jì)數(shù)紅色菌落數(shù)量。
[0012] 樣品中大腸桿菌數(shù)=紅色菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)。
[0013]
【具體實(shí)施方式】
[0014] 實(shí)施例1、大腸桿菌檢測專用培養(yǎng)基的制備 1.6g/100ml溴甲酚紫溶液配制：稱取溴甲酚紫1.6g倒入小燒杯，用少量無水酒精 溶解，移至100ml容量瓶，用無水酒精多次洗小燒杯，洗液移入容量瓶，最后用無水酒精定 容至100ml，搖勻備用。
[0015] 2%的TTC溶液配制：2gTTC溶于100ml緩沖液（100ml蒸餾水中溶解0.832 gNa2HP04.2H20 和 0? 273gKH2P04,pH7. 2)即可。
[0016] 稱取胰蛋白胨10.0g，乳糖15.0g，SDS0.5g，磷酸氫二鉀4.0g，氯化鈉3.0g， 瓊脂粉15.0g，蒸餾水500mr混勻，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的TTC溶液5ml，質(zhì)量濃度為 1.6g/100ml溴甲酚紫溶液4ml，補(bǔ)蒸餾水至1 000ml，調(diào)節(jié)pH到6. 0-6. 5。
[0017] 將上述培養(yǎng)基分裝于三角瓶中放入高壓滅菌鍋中115°C滅菌15min，冷卻至50°C 后倒制平板備用。
[0018] 實(shí)施例2、培養(yǎng)基實(shí)用性驗(yàn)證 摸索培養(yǎng)基配方，找出適合大腸桿菌生長，但可以抑制微生態(tài)制劑中其它有益菌的生 長的配方。
[0019] 挑取枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、糞腸球菌、乳酸 菌、酵母菌和大腸桿菌劃線于添加不同濃度SDS的大腸桿菌專用培養(yǎng)基中，在適宜溫度下 培養(yǎng)48hr后觀察平板上菌落生長情況。
[0020] 表1不同SDS濃度對(duì)細(xì)菌/真菌生長的影響
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗乳酸發(fā)酵菌干擾的大腸桿菌含量測定方法，可用于食品、醫(yī)藥、畜牧等行業(yè)中 的大腸桿菌檢測，特別適用于能發(fā)酵產(chǎn)乳酸的微生態(tài)制劑產(chǎn)品中大腸桿菌含量的檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測大腸桿菌含量的培養(yǎng)基，其配方如下：胰蛋白胨(或 蛋白胨）10. 0-15. O g，乳糖10. 0-20.0 g，SDS 0.5-1. O g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的TTC溶液5 ml，磷酸氫二鉀4.0 g，氯化鈉3.0 g，質(zhì)量濃度為1.6 g/100 ml溴甲酚紫溶液4.0 ml，瓊 脂粉10. 0-20.0 g或聚丙烯酸鈉15.0-25.0 g，蒸餾水1 000 ml，pH6. 0-6. 5,115°C滅菌15 min〇
3. 權(quán)利要求1所述的檢測方法是用于微生態(tài)制劑產(chǎn)品中大腸桿菌含量的測定，任意變 換其使用范圍，或者在此基礎(chǔ)上進(jìn)行延伸均屬于此權(quán)利保護(hù)范圍。
4. 權(quán)利要求2中提供的培養(yǎng)基配方是一個(gè)變量值，任意改變培養(yǎng)基中單一或多種成 分的含量均屬于此權(quán)利保護(hù)范圍。
【專利摘要】一種抗乳酸發(fā)酵菌干擾的大腸桿菌含量測定方法，屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括一種用于大腸桿菌含量測定的專用培養(yǎng)基及其測定方法。本方法操作簡單、快捷、準(zhǔn)確、高效，可廣泛運(yùn)用于食品、醫(yī)藥、畜牧等行業(yè)中大腸桿菌的檢測；特別適用于能發(fā)酵產(chǎn)乳酸的微生態(tài)制劑產(chǎn)品中大腸桿菌含量的檢測。
【IPC分類】C12Q1-06, C12R1-19
【公開號(hào)】CN104745671
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310751813
【發(fā)明人】羅國升, 張煌, 常翠維, 王玲, 戴富全, 彭地緯, 劉亞力
【申請(qǐng)人】湖南普菲克生物科技有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2013年12月31日