專利名稱：：一種用酶催化生產(chǎn)煙酸及其衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種制備煙酸及其衍生物的方法，尤其涉及一種利用氰基水解酶水解煙腈制備煙酸的方法。
背景技術(shù)：
：煙酸，化學(xué)名為吡啶-3-羧酸，英文名nicotinicacid，又稱維生素B5和尼克酸。煙酸作為一種常用的化工原料主要被用于醫(yī)藥生產(chǎn)，食品和飼料添加劑行業(yè)。傳統(tǒng)的煙酸生產(chǎn)主要由吡啶衍生物氧化而得。一種已知的合成煙酸的方法是由3-甲基吡啶在75~300°C的高溫先利用硫酸和硝酸對(duì)其在液相下進(jìn)行氧化而得，該法由于使用到大量的強(qiáng)酸，對(duì)設(shè)備的要求非常高，同時(shí)設(shè)備的使用周期很短，并且在此生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的廢水，同時(shí)，在酸堿中和過程中產(chǎn)生大量的無機(jī)鹽負(fù)載，另外，此法在反應(yīng)過程中會(huì)產(chǎn)生較多的共沸物，在反應(yīng)過程中難維持最佳的反應(yīng)溫度，由此導(dǎo)致收率較低。另外還有專利報(bào)道將3-甲基吡啶連續(xù)流過鈦釩催化床由空氣或氧氣將其氧化為煙酸的方法，這樣的方法同樣要求較為復(fù)雜的生產(chǎn)設(shè)備，容器效率低，產(chǎn)生了較高的能耗，并且產(chǎn)生較大量的有毒催化劑廢渣，處理困難。日本專利JP07233150采用鈷鹽，錳鹽，溴化物催化，采用氧氣等氧化3-甲基吡啶，此法三廢排放少，產(chǎn)品純度高，后處理簡單，同時(shí)反應(yīng)液可以循環(huán)使用，但是產(chǎn)率低，并需要在高溫高壓下進(jìn)行，同時(shí)使用了小分子的有機(jī)酸作為溶劑，在高溫下對(duì)于設(shè)備的腐蝕也難以忽視。世界專利WO9305022改進(jìn)了此法，在催化劑體系中加入氯化氫氣體，使得反應(yīng)溫度和壓力都降低，產(chǎn)率提高，但是加入氯化氫氣體使得設(shè)備的耐腐蝕能力進(jìn)一步減弱，設(shè)備要求更高，使用周期更短。另有一些專利對(duì)此法也進(jìn)行了各種的改進(jìn)嘗試，但是各自帶來新的問題和不足。還有一種利用高錳酸鉀等高價(jià)金屬氧化劑氧化3-甲基吡啶的方法，此法消耗氧化劑多，成本高，廢液量大，只能停留在實(shí)驗(yàn)室小量合成時(shí)使用。氧化5-甲基-2-乙基吡啶到吡啶二羧酸再脫羧制備煙酸的方法收率高，但工藝復(fù)雜，原料難得。氧化喹啉的方法則收率低，副產(chǎn)物多，并難分離。4目前最常用的方法是將同樣由3-甲基吡啶在氣相中通過氨氧化法氧化獲得的3-氰基吡啶水解而得煙酸，水解3-氰基吡啶的過程通常在強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿性條件下進(jìn)行的，如此一來，這一方法同樣對(duì)生產(chǎn)設(shè)備提出了很高的要求，同時(shí)，大量的廢液產(chǎn)生也是不可避免的。EP442430利用微生物氧化3-甲基吡啶為煙酸，在反應(yīng)16小時(shí)后只能獲得50%收率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種全新的生物轉(zhuǎn)化制備煙酸的方法，主要解決現(xiàn)有煙酸常規(guī)合成方法存在的使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿導(dǎo)致設(shè)備易腐蝕以及工藝復(fù)雜、收率低等技術(shù)問題。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種用酶催化生產(chǎn)煙酸的方法，以3-氰基吡啶為原料，用發(fā)酵產(chǎn)生的氰基水解酶水解3-氰基吡啶獲得煙酸。本發(fā)明以反應(yīng)式可表述為為方便寫作及節(jié)省篇幅，以下將各種數(shù)據(jù)單位以通用西文符號(hào)代替，其中包括g(克)，mg(毫克)，mol(摩爾)，mmol(毫摩爾)，W」(微升)，mL(毫升)，L(升)，。C(攝氏度)等。反應(yīng)體系為純水或者pH值為5.5-9.0的緩沖溶液，緩沖pH值優(yōu)選為6.5-8.0。緩沖液濃度為5-200mmol/L，優(yōu)選濃度為10-100mmol/L。底物3-氰基吡啶以固體或者濃度為1-100g/L的溶液加入，溶解底物的溶劑為二甲基亞砜或者丙酮或者乙腈等水溶性有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑的體積為不超過水溶液體積的20%，優(yōu)選為不超過水溶液體積的10%。上述底物混合溶液攪拌均勻后，加入氰基水解酶，氰基水解酶可以干粉形式加入或者溶解于水或緩沖溶液中加入。然后在10-40°C之間緩慢攪拌反應(yīng)一定時(shí)間，以高效液相色譜(HPLC)或液相-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)檢測轉(zhuǎn)化率。經(jīng)過后處理，重結(jié)晶等工序，可獲得純品煙酸。具體的后處理方法為若反應(yīng)體系為純水，則在反應(yīng)結(jié)束后將水減壓蒸餾濃縮。濃縮比例每投入lg原料3-氰基吡啶，對(duì)應(yīng)濃縮后體積為5~20mL。濃縮后的煙酸溶液加熱回流半小時(shí)，緩慢降溫冷卻，煙酸晶體結(jié)晶析出，過濾，真空烘干，得到煙酸，酶則因其水溶性而被此過程除去。若反應(yīng)體系為緩沖溶液，則在反應(yīng)結(jié)束后將溶劑水完全蒸干，然后加入乙醇(乙醇的量為lg蒸干后殘留固體用10200mL乙醇)加熱回流，使煙酸溶解，然后過濾，無機(jī)緩沖鹽因?yàn)樵谝掖贾袔缀醪蝗芙舛怀?。母液蒸干，殘留物再按上法用水重結(jié)晶可獲得煙酸。經(jīng)高效液相色譜(HPLC)和液相-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)檢測以本發(fā)明方法生產(chǎn)的煙酸純度達(dá)99%以上，氫譜核磁共振(HNMR)檢測無雜質(zhì)氫存在。另外，2-氰基吡啶，4-氰基吡啶也可以通過同樣的方法被氰基水解酶水解為相應(yīng)的酸。除了氰基外，在吡啶環(huán)上還可以存在其他的一些取代基團(tuán)，如下面反應(yīng)式所示R、R、-CN,解酶'圓NN其中氰基可以出現(xiàn)在環(huán)上的2位到5位的任意一個(gè)位置。R則表示一個(gè)或多個(gè)其他位置的取代基，包括但不僅僅包括氫原子，一個(gè)到十個(gè)碳原子的烷基、環(huán)烷基、烯基，一個(gè)到十個(gè)碳原子的烷氧基，鹵素，酯基，硝基等。需要指出的是，由于酶催化具有其特殊的選擇性，故相同的酶對(duì)結(jié)構(gòu)非常類似的底物都具有不同的選擇性和轉(zhuǎn)化率，對(duì)于每個(gè)不同的底物，均需要以許多種不同的酶對(duì)其進(jìn)行篩選從而找到相應(yīng)的能將其水解，或者說對(duì)其具有很強(qiáng)水解能力的酶。對(duì)于以上所描述的系列化合物，均可以從杭州恩然生物技術(shù)有限公司的生產(chǎn)的標(biāo)號(hào)為NITIOI、NIT102、NIT103、NIT104、NIT105、NIT106、NIT107、NIT108、NIT109、NITllO、NITlll、NIT112、NIT113、NIT114、NIT115、NIT116、NIT117、NIT118、NIT119、NIT120、NIT121、NIT122、NIT123、NIT124、NIT125、NIT126、NIT127、NIT128、NIT129、NIT130、NIT131、NIT132、NIT133、NIT134、NIT135、NIT136、NIT137、NIT138、NIT139和NIT140這些酶中篩選獲得。本發(fā)明的有益效果是該法利用發(fā)酵產(chǎn)生的氰基水解酶水解3-氰基吡啶(英文名nicotinonitrile)獲得煙酸，作為原料的3-氰基吡啶可以由3-甲基吡啶在氣相中通過氨氧化法獲得。此法反應(yīng)條件溫和，對(duì)設(shè)備要求極低，生產(chǎn)過程無需高溫6或者冷卻，能耗低，由于酶催化具有高效，專一的選擇性，故以此法生產(chǎn)煙酸無副產(chǎn)物產(chǎn)生，純化方便。反應(yīng)絕大部分溶劑為水，三廢排放低，綠色環(huán)保。具體實(shí)施方式-以下配合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳述。實(shí)施例l適合于3-氰基吡啶的氰基水解酶的篩選。將底物(3-氰基吡啶)配制成10g/L的二甲基亞砜溶液。氰基水解酶NIT101NIT140共40種酶分別溶解于磷酸鹽緩沖液配制濃度為10g/L的溶液，緩沖液pH值為8.0，緩沖鹽濃度為100mmol/L。取底物溶液40份置于平行反應(yīng)容器里，每份20PL，并向每份底物溶液中都加入160PL磷酸鹽緩沖液，緩沖液pH值為8.0，緩沖鹽濃度為100mmol/L。將平行反應(yīng)容器置于搖床上振搖均勻，然后分別單獨(dú)加入NIT101NIT140酶溶液20PL，并做好標(biāo)記。室溫下?lián)u床振搖過夜。然后每份分別取樣IOPL，并加入l(HC乙腈淬滅反應(yīng)，用HPLC和LC-MS檢測反應(yīng)。結(jié)果如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例2將10mg3-氰基吡啶溶解于1mL二甲基亞砜中，加入9mLpH值為5.5，濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后加入10mg氰基水解酶NIT104，室溫下緩慢攪拌過夜，通過HPLC和LC-MS檢測鑒定3-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化率達(dá)100%。減壓蒸餾除去水和二甲基亞砜，殘留固體加入1mL乙醇，攪拌1小時(shí)，過濾除去緩沖鹽，濾液蒸干乙醇，用水重結(jié)晶，得煙酸8mg。實(shí)施例3將10mg3-氰基吡啶溶解于1mL丙酮中，加入8mLpH值為7.0，濃度為10mmol/L的磷酸鹽緩沖液，混合均與。稱取1mg氰基水解酶NIT129溶解與1mL上述磷酸鹽緩沖液中，并將此酶溶液加入上述反應(yīng)液，35。C下反應(yīng)16h。通過HPLC和LC-MS檢測鑒定3-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化率達(dá)100%。減壓蒸除溶劑，殘留固體加入lmL乙醇，攪拌1小時(shí)，過濾除去無機(jī)鹽，濾液蒸干乙醇，用水重結(jié)晶，得煙酸8mg。實(shí)施例4將10mg3-氰基吡啶溶解于1mL乙腈中，加入9mLpH值為6.5，濃度為50mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液。加入0.5mg氰基水解酶NIT103，25°C下反應(yīng)32小時(shí)，通過HPLC和LC-MS檢測鑒定3-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化率為72%。乙醚萃取回收未水解完全的原料，水相減壓蒸除溶劑，殘留固體加入lmL乙醇，攪拌l小時(shí)，過濾除去緩沖鹽，濾液蒸干乙醇，用水重結(jié)晶，得煙酸5.8mg。實(shí)施例5將50mg3-氰基吡啶溶解于10mL純水，加入lmg氰基水解酶NIT131，室溫下攪拌過夜，通過HPLC和LC-MS檢測鑒定3-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化率達(dá)100%。減壓蒸餾至0.2~0.3mL，加熱至卯。C并保持10分鐘，緩慢降溫冷卻，析出煙酸晶體，過濾，少量水洗滌，干燥，得煙酸52mg。實(shí)施例6將500mg3-氰基吡啶溶解于70mLpH值為8.0，濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，加入5mg氰基水解酶NIT131，35°C緩慢攪拌16h，通過HPLC和LC-MS檢測鑒定3-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化率達(dá)100%。減壓蒸除溶劑，殘留固體加入20mL乙醇，攪拌下加熱回流半小時(shí)，過濾除去無機(jī)鹽，濾液蒸干乙醇，用水重結(jié)晶，得煙酸533mg。實(shí)施例7取100mg/mL的3-氰基吡啶-二甲基亞砜溶液0.1mL，加入pH為7.5，濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液0.3mL，混合均勻后加入lmg氰基水解酶NIT126，30°C緩慢攪拌40h，通過HPLC和LC-MS檢測鑒定3-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化率為31%。乙醚萃取回收未水解完全的原料，水相減壓蒸除溶劑，殘留固體加入lmL乙醇，攪拌1小時(shí)，過濾除去緩沖鹽，濾液蒸干乙醇，用水重結(jié)晶，得煙酸2.4mg。實(shí)施例8取10mg3-甲基-4氰基吡啶溶于lmL二甲基亞砜中，加入10mLpH為7.0，濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后加入lmg氰基水解酶NIT138,室溫緩慢攪拌15小時(shí)，HPLC及LC-MS鑒定轉(zhuǎn)化率達(dá)100%。后處理后可得3-甲基吡啶-4-甲酸8.4mg。實(shí)施例9取10mg2-氰基-5-溴吡啶溶于lmL二甲基亞砜中，加入10mLpH為7.5，濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后加入lmg氰基水解酶NIT139，室溫緩慢攪拌15小時(shí)，HPLC及LC-MS鑒定轉(zhuǎn)化率達(dá)96%。后處理后可得5-溴吡啶-2-甲酸7.3mg。實(shí)施例10取10mg2-氰基吡啶-4-甲酸乙酯溶于lmL二甲基亞砜中，加入10mLpH為7.5，濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后加入lmg氰基水解酶NIT126，室溫緩慢攪拌20小時(shí)，HPLC及LC-MS鑒定轉(zhuǎn)化率達(dá)93%。后處理后可得2-羧基吡啶-4-甲酸乙酯7.6mg。權(quán)利要求1、一種用酶催化生產(chǎn)煙酸及其衍生物的方法，其特征是以R-氰基吡啶為原料，用發(fā)酵產(chǎn)生的氰基水解酶水解R-氰基吡啶獲得相應(yīng)的酸，以反應(yīng)式表述為其中氰基出現(xiàn)在環(huán)上的2位到5位的任意一個(gè)位置；R則表示一個(gè)或多個(gè)其他位置的取代基，選自下述基團(tuán)中的一種氫原子，或一個(gè)到十個(gè)碳原子的烷基、環(huán)烷基、烯基，或一個(gè)到十個(gè)碳原子的烷氧基、鹵素、酯基、硝基。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用酶催化生產(chǎn)煙酸及其衍生物的方法，其特征是以3-氰基吡啶為原料，用發(fā)酵產(chǎn)生的氰基水解酶水解3-氰基吡啶獲得煙酸，以反應(yīng)式表述為CN氰基水解酶A乂OOH<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用酶催化生產(chǎn)煙酸及其衍生物的方法，其特征是所述的3-氰基吡啶溶解在水或水溶性有機(jī)溶劑或緩沖液中。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用酶催化生產(chǎn)煙酸及其衍生物的方法，其特征是所述的水溶性有機(jī)溶劑為二甲基亞砜或者丙酮或者乙腈。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用酶催化生產(chǎn)煙酸及其衍生物的方法，其特征是所述的緩沖溶液pH值為5.5-9.0，緩沖液濃度為5-200mmol/L。6、根據(jù)權(quán)禾〕j要求5所述的一種用酶催化生產(chǎn)煙酸及其衍生物的方法，其特征是所述的緩沖溶液pH值為6.5-8.0,緩沖液濃度為10-100mmol/L。7、根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用酶催化生產(chǎn)煙酸及其衍生物的方法，其特征是所述的有機(jī)溶劑的體積不超過水溶液體積的20%。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種用酶催化生產(chǎn)煙酸及其衍生物的方法，其特征是所述的有機(jī)溶劑的體積不超過水溶液體積的10%。9、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用酶催化生產(chǎn)煙酸及其衍生物的方法，其特<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>氰基水解酶征是所述的氰基水解酶以干粉形式加入或者溶解于水或緩沖溶液中加入，然后在10-40。C之間緩慢攪拌反應(yīng)，經(jīng)過后處理，重結(jié)晶，獲得純品煙酸。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種用酶催化生產(chǎn)煙酸及其衍生物的方法，其特征是所述的后處理為若反應(yīng)體系為純水，則在反應(yīng)結(jié)束后將水減壓蒸餾濃縮,濃縮比例每投入lg原料3-氰基吡啶，對(duì)應(yīng)濃縮后體積為5~20mL，濃縮后的煙酸溶液加熱回流半小時(shí)，緩慢降溫冷卻，煙酸晶體結(jié)晶析出，過濾，真空烘干，得到煙酸。11、根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種用酶催化生產(chǎn)煙酸及其衍生物的方法，其特征是所述的后處理為若反應(yīng)體系為緩沖溶液，則在反應(yīng)結(jié)束后將溶劑水完全蒸干，然后加入乙醇加熱回流，乙醇的量為lg蒸干后殘留固體加入10200mL乙醇，使煙酸溶解，然后過濾，無機(jī)緩沖鹽因?yàn)樵谝掖贾袔缀醪蝗芙舛怀ィ敢赫舾?，殘留物用水重結(jié)晶獲得煙酸。12、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用酶催化生產(chǎn)煙酸及其衍生物的方法，其特征是所述的氰基水解酶選自NIT101、NIT102、NIT103、NIT104、NIT105、NIT106、NIT107、NIT108、NIT109、NITllO、NITlll、MT112、NIT113、NIT114、NIT115、NIT116、NIT117、NIT118、NIT119、NIT120、NIT121、NIT122、NIT123、NIT124、NIT125、NIT126、NIT127、NIT128、NIT129、NIT130、NIT131、NIT132、NIT133、NIT134、NIT135、NIT136、NIT137、NIT138、NIT139和NIT140中的—種。全文摘要本發(fā)明涉及一種制備煙酸及其衍生物的方法，尤其涉及一種利用氰基水解酶水解煙腈制備煙酸的方法。主要解決現(xiàn)有煙酸合成方法存在的使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿導(dǎo)致設(shè)備易腐蝕以及工藝復(fù)雜、收率低等技術(shù)問題。技術(shù)方案為一種用酶催化生產(chǎn)煙酸的方法，以3-氰基吡啶為原料，用發(fā)酵產(chǎn)生的氰基水解酶水解3-氰基吡啶獲得煙酸。本發(fā)明的反應(yīng)式可表述為上式。文檔編號(hào)C12P17/10GK101550432SQ200910057210公開日2009年10月7日申請(qǐng)日期2009年5月11日優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日發(fā)明者姚黔禹,軍文,陶軍華申請(qǐng)人:尚科生物醫(yī)藥(上海)有限公司