專利名稱：一種水稻dna快速提取試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從水稻中快速提取DNA應(yīng)用于PCR反應(yīng)的試劑盒。
背景技術(shù)：
基于PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記已廣泛地運(yùn)用于種子純度鑒定、親緣關(guān)系的分 析、分子標(biāo)記輔助育種、基因定位以及轉(zhuǎn)基因植株檢測等。尤其是，DNA分子標(biāo)記輔助選擇 育種已成為分子技術(shù)在作物改良中的一個重要應(yīng)用，即通過對與表型緊密連鎖的DNA分子 標(biāo)記的篩選，以快速獲取帶目的表型的理想植株。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展、水稻基因組測 序的完成、功能基因鑒定的日益增多，分子標(biāo)記輔助選擇育種越來越多地應(yīng)用于作物新品 種改良。為了應(yīng)用PCR檢測技術(shù)，人們需要從組織樣品中提取DNA。然而，DNA提取是一項(xiàng) 耗費(fèi)人力、物力的繁瑣工作，提取的DNA也僅在篩選、鑒定時使用了很少的一部分，剩余的 大部分DNA將作為累贅而被廢棄。盡管人們也一直致力于DNA抽提方法的探討，但目前應(yīng) 用的主要方法仍然煩瑣費(fèi)時。因此，在大規(guī)模的基于PCR的基因型檢測作業(yè)中，高效、快速、 簡便的模板DNA制備顯得非常重要。目前已公開的一種用于PCR的植物基因組DNA快速制備方法(王蘭、龍?jiān)沏?、劉?光，分子植物育種 2009，7 (2) 425-428)，存在著如下缺陷1、操作較費(fèi)時，僅破碎組織樣品的時間就需要5min ；2、僅能以葉片為原料進(jìn)行提取，且最少要求有4mg的葉片；因此原料的適應(yīng)性較 差；3、所得的DNA溶液主要用于短期使用用TE制備的DNA在4°C下可保存10d以上， 在冷凍下可保存半年；不利于長期保存。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能從水稻組織中高效、快速、簡便提取模板 DNA的水稻DNA快速提取試劑盒。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種水稻DNA快速提取試劑盒，包括0 -巰基 乙醇、作為預(yù)處理液的試劑A、作為提取緩沖液的試劑B和作為PCR反應(yīng)緩沖液的試劑D ；試劑A包括100 200mM sorbitol (山梨醇)、100 150mM Tris(三羥甲基氨基 甲烷)、20 30mM EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二鈉)、400 600mM NaCl、15 25mM Na2S03、 質(zhì)量濃度0. 8%的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)和質(zhì)量濃度2%的sarkosyl (N-十二烷 基肌氨酸鈉)，其余為蒸餾水；PH7. 5 ；試劑B 包括 90 llOmM Tris、450 550mM KC1、15 20mM MgCl2 和質(zhì)量濃度 的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，其余為蒸餾水；pH9. 0 ；試劑D 包括 40 60mM Tris、200 300mM KC1、8 10mM MgCl2、質(zhì)量濃度 0. 5% 的TritonX-100和體積濃度5 10%的BSA(牛血清白蛋白)，其余為ddH20(去離子滅菌
3水)；pH9.0。作為本發(fā)明的水稻DNA快速提取試劑盒的改進(jìn)該試劑盒還包括蒸餾水、氯仿和鋼珠。作為本發(fā)明的水稻DNA快速提取試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn)試劑A 含有 150mM sorbitol, 125mM Tris,25mM EDTA_Na2，500mM NaCl, 20mMNa2S03，質(zhì)量濃度0. 8%的CTAB，質(zhì)量濃度2%的sarkosyl ；其余為蒸餾水；pH7. 5 ；試劑B 含有 lOOmM Tris,500mM KC1,18mM MgCl2，質(zhì)量濃度 1 % 的 Triton X-100， 其余為蒸餾水；PH9. 0 ；試劑D 含有 50mM Tris,250mM KCl,9mM MgCl2，質(zhì)量濃度 0. 5%的 Triton X-100, 體積濃度10%的BSA ；其余為ddH20 ；pH9. 0。在本發(fā)明中，試劑A、試劑B和試劑D均可利用HC1或NaOH對pH值進(jìn)行調(diào)整。實(shí) 際應(yīng)用時，在使用前，先將試劑A、試劑B、蒸餾水按1 2 7的體積比混合成混合液，然后 再加入占混合液0. 1 0. 3%體積比(優(yōu)選的0. 2%體積比)的3 -巰基乙醇，得作為DNA 提取液的試劑C。試劑A可以破壞水稻組織的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，試劑B則協(xié)調(diào)提供一個細(xì)胞 裂解、DNA釋出的pH環(huán)境和離子環(huán)境；在使用前才進(jìn)行試劑C的配制是為了保證試劑A和 試劑B長期存放的穩(wěn)定性。試劑D則為PCR反應(yīng)提供穩(wěn)定的環(huán)境和必需的因子。本發(fā)明的主要原理為采用試劑A破壞水稻組織的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，有助于細(xì)胞 中DNA的釋出，進(jìn)一步在機(jī)械破碎的作用下，使絕大部分的組織細(xì)胞破裂，DNA逸出。試劑B 則協(xié)調(diào)提供一個細(xì)胞裂解、DNA釋出的pH環(huán)境和離子環(huán)境，防止釋出的DNA發(fā)生沉淀或氧 化褐變。當(dāng)DNA釋出于由溶液A和溶液B配制的溶液C中時，通過氯仿的純化和離心后，獲 得的上清液可直接用于PCR反應(yīng)或通過乙醇沉淀析出DNA用于長期保存或使用。本發(fā)明所得的DNA可于_20°C長期保存?zhèn)溆没蚣?00 200 yl超純水溶解用于直 接使用。利用本發(fā)明能從水稻組織中高效、快速、簡便地提取DNA，可以簡化PCR檢測技術(shù) 中提取DNA的耗費(fèi)人力、物力的繁瑣工作。與現(xiàn)有的植物DNA提取方法相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1)、快速、簡便。本發(fā)明能夠在2min內(nèi)完成細(xì)胞破碎，且一次性可完成48份樣品 的破碎。10分鐘就可完成96份樣品的DNA提取，用于PCR擴(kuò)增。而傳統(tǒng)的CTAB提取法，完成96份樣品的DNA提取則在5小時以上。2)、成本低。提取過程中減少了多種試劑的使用量，使用本試劑盒從水稻中快速提 取DNA僅應(yīng)用于PCR反應(yīng)時，無需使用乙醇或異丙醇沉淀。3)、DNA產(chǎn)量高。0. 001g的水稻樣品用本試劑盒提取，可用作100次PCR擴(kuò)增的 DNA模板使用。而按照背景技術(shù)中告知的《用于PCR的植物基因組DNA快速制備方法》，以 0. 004g的水稻樣品為原料進(jìn)行提取，所得也無法滿足100次PCR擴(kuò)增的DNA模板所需使用量。4)、周期短。由于所需的水稻樣品少，催芽、播種5 8天就可取少量葉片用于PCR 檢測。5)、本發(fā)明不但可以葉片作為原料，還可以用別的組織(例如根、莖、老葉、嫩葉、 葉鞘、穗等)作為原料；一般來說，根在催芽、播種的5 8天內(nèi)即能取得。
6)、本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)短期使用，也可實(shí)現(xiàn)長期保存；具有更大的通用性；具體為利用本發(fā)明所得的DNA溶液可用于短期使用，進(jìn)一步沉淀獲得的DNA與傳統(tǒng)方法獲得的DNA 是一樣的，在冷凍條件下可以保存若干年。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是從水稻葉片中快速提取DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后實(shí)施的效果圖；RM8213、RM17713、RM13、RM19234、RM217、RM3183 引物序列來自 GRAMENE 網(wǎng)站 (http://www. gramene. org/)的公開信息，并委托上海申能博彩公司合成用于PCR擴(kuò)增； Marker為DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量圖譜。圖2是經(jīng)沉淀提取的DNA經(jīng)光密度測定得出的含量對比圖，1 5為5份樣品的測定值。圖3是來自不同組織樣品的模板DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、一種水稻DNA快速提取試劑盒，由以下部分組成試劑A 包括 150mM sorbitol, 125mM Tris,25mM EDTA_Na2，500mM NaCl, 20mMNa2S03，質(zhì)量濃度0. 8%的CTAB，質(zhì)量濃度2%的sarkosyl ；其余為蒸餾水；pH7. 5 ；試劑B 包括 lOOmM Tris,500mM KC1,18mM MgCl2，質(zhì)量濃度 1 % 的 Triton X-100， 其余為蒸餾水；PH9. 0 ；試劑D 包括 50mM Tris,250mM KCl,9mM MgCl2，質(zhì)量濃度 0. 5%的 Triton X-100, 體積比10%的BSA(牛血清白蛋白)，其余為去離子滅菌水；pH9.0 ；上述試劑D為10XPCR反應(yīng)緩沖液，即試劑D占PCR反應(yīng)體系的總體積的1/10 ；蒸餾水；氯仿；鋼珠，為粒徑5mm的碳素鋼鋼珠，購自上海自行車鋼珠廠。實(shí)施例2、一種水稻DNA快速提取試劑盒，由以下部分組成試劑A 包括 lOOmM sorbitol, 100mM Tris,20mM EDTA_Na2，400mM NaCl, 15mMNa2S03，質(zhì)量濃度0. 8%的CTAB，質(zhì)量濃度2%的sarkosyl ；其余為蒸餾水；pH7. 5 ；試劑B 包括 90mM Tris,450mM KC1,17mM MgCl2，質(zhì)量濃度 1 % 的 Triton X-100，其 余為蒸餾水；PH9. 0 ；試劑D 包括 40mM Tris,200mM KCl,8mM MgCl2，質(zhì)量濃度 0. 5%的 Triton X-100, 體積比8%的BSA(牛血清白蛋白)，其余為去離子滅菌水；pH9.0 ；蒸餾水；氯仿；鋼珠，為粒徑6mm的碳素鋼鋼珠。實(shí)施例3、一種水稻DNA快速提取試劑盒，由以下部分組成試劑A 包括 200mM sorbitol, 150mM Tris,30mM EDTA_Na2，600mM NaCl, 25mMNa2S03，質(zhì)量濃度0. 8%的CTAB，質(zhì)量濃度2%的sarkosyl ；其余為蒸餾水；pH7. 5 ；
試劑B 包括 llOmM Tris,550mM KC1,19mM MgCl2，質(zhì)量濃度 1 % 的 Triton X-100， 其余為蒸餾水；PH9. 0 ；試劑D 包括 60mM Tris,300mM KC1,10mM MgCl2，質(zhì)量濃度 0. 5% 的 Triton X-100, 體積比5%的BSA(牛血清白蛋白)，其余為去離子滅菌水；pH9.0 ；蒸餾水；氯仿；鋼珠，為粒徑6mm的碳素鋼鋼珠。方法實(shí)施例1、一種快速提取水稻DNA的方法，利用實(shí)施例1所得的水稻DNA快速 提取試劑盒，依次進(jìn)行以下步驟1)、取0.005g水稻葉片(日本晴經(jīng)浸種、催芽后，播種7天后的幼嫩葉片)放入 2ml的圓底離心管(江蘇海門耀華玻璃儀器廠生產(chǎn))，加入500 u 1試劑C和200 yl氯仿， 并加入1粒鋼珠；試劑C的制作方法如下先由試劑A、試劑B、蒸餾水按1 2 7的體積比混合成 混合液，然后再加入占混合液0. 2%體積比的3 -巰基乙醇，得試劑C，該試劑C作為DNA提 取液。2)、將步驟1)所得的離心管放入細(xì)胞破碎儀(TissueLyserlLQIAGEN，德國)內(nèi)， 于28HZ的頻率破碎2min ；從而實(shí)現(xiàn)對水稻葉片進(jìn)行破碎。3)、將步驟2)所得的破碎后樣品于10，OOOrpm離心5min ；得上清液。4)、以2 yl的試劑D作為PCR反應(yīng)緩沖液，取5 yl上清液直接作為模板DNA，進(jìn)行 PCR檢測；用于PCR檢測的PCR反應(yīng)體系具體如下5ii 1 上清液，2ii 1 試劑 D，lunit Taq 酶，200mM dNTP (包括 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各50mM)，引物濃度0. 2mM,加ddH20補(bǔ)至20 yl。所用引物分別為以下任意一種RM8213、RM17713、RM13、RM19234、RM217 和 RM3183 ；上述引物均可從 gramene 網(wǎng)站 (http //www, gramene. org/)上獲得。PCR反應(yīng)過程控制條件如下94°C 6 分鐘94 °C 50 秒55°C 30 秒72 °C 40 秒 42cycle72 °C 15 分鐘15°C 保存所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果如圖1所示不同的引物均能擴(kuò)增 出清晰的條帶。從而證明步驟3)所得的上清液的確含有足夠含量DNA可用于PCR擴(kuò)增， 并且不同引物均能擴(kuò)出良好的效果。方法實(shí)施例2、一種快速提取水稻DNA的方法，利用實(shí)施例1所得的水稻DNA快速 提取試劑盒，依次進(jìn)行以下步驟步驟1) 步驟3)同方法實(shí)施例1。4)、取400 ill步驟3)所得的上清液于另一個離心管內(nèi)，加600 yl無水乙醇輕搖混勻，沉淀45min后，10，OOOrpm離心15min ；棄上清液，得沉淀；5)、將步驟4)所得的沉淀用500 μ 1體積濃度70%的乙醇洗滌，10，OOOrpm離心 15min ；6)、棄步驟5)所得的上清液，倒置離心管至晾干；所得DNA可長期保存。也可將其 加100 μ 1超純水溶解獲得含DNA的溶液。上述6個步驟總計(jì)花費(fèi)在2小時。經(jīng)測試0. 005克葉片最終能獲得25 μ g左右的核酸。5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)如 圖2所示。方法實(shí)施例3、分別選用水稻(日本晴)的老葉、莖、鞘、穗、根各0.005克作為原料替代方法實(shí)施 例1中的幼嫩葉片，以RM8213作為引物，其余同方法實(shí)施例1 ；老葉、莖、鞘、穗、根均為90天 所得；最終所得的結(jié)果如圖3所示。圖3證明不同組織所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果相一致。對比實(shí)施例1 選用同方法實(shí)施例1的水稻葉片0. 005g水稻葉片，按照背景技術(shù)所告知的DNA快 速制備方法進(jìn)行提取，所得的上清液再按照上述方法實(shí)施例2的步驟4) 步驟6)進(jìn)行操 作，最終僅能獲得10 μ g左右的核酸。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實(shí)施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種水稻DNA快速提取試劑盒，其特征是包括β-巰基乙醇、作為預(yù)處理液的試劑A、作為提取緩沖液的試劑B和作為PCR反應(yīng)緩沖液的試劑D；所述試劑A包括100～200mM山梨醇、100～150mM三羥甲基氨基甲烷、20～30mM乙二胺四乙酸二鈉、400～600mM NaCl、15～25mM Na2SO3、質(zhì)量濃度0.8％的十六烷基三甲基溴化銨和質(zhì)量濃度2％的N-十二烷基肌氨酸鈉，其余為蒸餾水；pH7.5；所述試劑B包括90～110mM三羥甲基氨基甲烷、450～550mM KCl、15～20mM MgCl2和質(zhì)量濃度1％的聚乙二醇辛基苯基醚，其余為蒸餾水；pH9.0；所述試劑D包括40～60mM三羥甲基氨基甲烷、200～300mM KCl、8～10mM MgCl2、質(zhì)量濃度0.5％的Triton X-100和體積濃度5～10％的BSA，其余為去離子滅菌水；pH9.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻DNA快速提取試劑盒，其特征是所述試劑盒還包括蒸 餾水、氯仿和鋼珠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的水稻DNA快速提取試劑盒，其特征是所述試劑A含有150mM山梨醇、125mM三羥甲基氨基甲烷、25mM乙二胺四乙酸二鈉、 500mM NaCl,20mM Na2SO3、質(zhì)量濃度0. 8 %的十六烷基三甲基溴化銨和質(zhì)量濃度2 %的 N-十二烷基肌氨酸鈉；其余為蒸餾水；pH7. 5 ；所述試劑B含有IOOmM Tris、500mM KCl、18mM MgCl2和質(zhì)量濃度1 %的聚乙二醇辛基 苯基醚，其余為蒸餾水；PH9.0;所述試劑D含有 50mM Tris、250mM KCl、9mM MgCl2、質(zhì)量濃度0. 5% 的 Triton X-100 和 體積濃度10%的BSA ；其余為去離子滅菌水；pH9. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻DNA快速提取試劑盒，包括β-巰基乙醇、作為預(yù)處理液的試劑A、作為提取緩沖液的試劑B和作為PCR反應(yīng)緩沖液的試劑D；試劑A由山梨醇、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、NaCl、Na2SO3、十六烷基三甲基溴化銨、N-十二烷基肌氨和蒸餾水組成，試劑B由三羥甲基氨基甲烷、KCl、MgCl2、聚乙二醇辛基苯基醚和蒸餾水組成，試劑D由三羥甲基氨基甲烷、KCl、MgCl2、Triton X-100、BSA和去離子滅菌水組成。采用本發(fā)明的水稻DNA快速提取試劑盒，能從水稻組織中高效、快速、簡便的提取模板DNA。
文檔編號C12N15/10GK101812445SQ20101015737
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日
發(fā)明者劉堅(jiān), 張光恒, 曾大力, 楊窯龍, 胡江, 郭龍彪, 錢前, 饒玉春, 高振宇 申請人:中國水稻研究所