專利名稱：：核受體配體結(jié)合區(qū)蛋白融合表達在噬菌體表面的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種衣殼表面融合有外源的核受體或核受體LBD蛋白的噬菌體以及將所述核受體或核受體LBD蛋白融合表達在噬菌體表面的方法。
背景技術(shù)：
：噬菌體表面展示技術(shù)自從其建立以后，被廣泛用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究。外源蛋白、隨機肽段、cDNA或基因組片斷通過與噬菌體外殼基因融合表達而展示在噬菌體表面，組成蛋白庫或多肽庫。理論上，通過生物“淘洗”(biopanning)過程可以用來篩選與目標蛋白、受體、細胞表面受體及化學(xué)小分子(藥物)有相互作用的蛋白或多肽。該技術(shù)主要應(yīng)用于以下各方面1.篩選特異結(jié)合的抗體，或者通過結(jié)合篩選技術(shù)改造抗體，提高抗體的親和力和結(jié)合的特異性；2.研究蛋白-蛋白的相互作用，用來確定受體或配體的結(jié)合蛋白或多肽；3.確定功能決定簇或抗體決定簇；4.酶或蛋白的定向進化等。但以往的噬菌體展示表達的蛋白質(zhì)都屬于可溶性類的蛋白質(zhì)，尚未涉及難于可溶性表達的外源蛋白。目前為止，尚無難溶性蛋白展示表達在噬菌體衣殼表面的相關(guān)報導(dǎo)。核受體(nuclearreceptor)是一類轉(zhuǎn)錄因子超家族，通過對已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的家族成員cDNA和所編碼的氨基酸的序列比較發(fā)現(xiàn)，它們之間結(jié)構(gòu)相似，在進化上相當(dāng)保守，核受體與配體結(jié)合后被激活，作用于其目標基因的特定應(yīng)答元件HRE(hormonerespondsequence)上，從而介導(dǎo)特定的基因轉(zhuǎn)錄。核受體在結(jié)構(gòu)上有著共同的特征，一般包括A～F6個功能區(qū)A/B區(qū)含有一個配體非依賴的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)稱為AF-1(ActivationFunction-1)，通過和輔活化因子、輔阻遏因子等其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用而調(diào)控目的基因；C區(qū)是最保守的DNA結(jié)合區(qū)(DNAbindingdomain，DBD)，各種核受體DBD之間的同源性達到90％以上，由兩個鋅指結(jié)構(gòu)構(gòu)成，介導(dǎo)受體與靶基因結(jié)合；D區(qū)是鉸鏈區(qū)，連接DNA結(jié)合區(qū)和配體結(jié)合區(qū)；E區(qū)為配體結(jié)合區(qū)(LigandBindingDomain，LBD)，是由約250個氨基酸構(gòu)成的長疏水區(qū)，含有一個核定位區(qū)和一個受體依賴的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)(AF-2)，相對較大。不同的核受體LBD之間的同源性約為15％，雖然同源性小于DNA結(jié)合區(qū)，但根據(jù)已解析的LBD空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，所有核受體LBD的三維結(jié)構(gòu)大體相同，都由12個α螺旋組成，且都具有結(jié)合配體、受體二聚體化和結(jié)合輔助因子的功能。此外F區(qū)位于核受體的羧基端。過氧化物酶體增殖物激活受體(PeroxisomeProliferators-ActivatedReceptors，PPARs)屬于核受體家族成員，在細胞的能量代謝、細胞增殖與分化、炎癥反應(yīng)中起重要作用。PPARs在哺乳動物中有三種亞型α、β、γ。與其他核受體超家族成員一樣，PPAR也同樣由六個結(jié)構(gòu)區(qū)(A-F)構(gòu)成。PPAR與其配基結(jié)合后，與另一個激活的核受體維甲酸受體(retinoidXreceptor，RXR)形成異二聚體，結(jié)合于靶基因上特異性的PPAR反應(yīng)元件PPRE(PeroxisomeProliferatorResponseElements)，從而啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄。曲格列酮(troglitazone)通過激活核受體家族中PPARγ受體，抑制TNF-a信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，能有效地增強胰島素敏感性，是第一個作為II型糖尿病治療藥被FDA批準的噻唑烷二酮類化合物，但該藥因肝臟毒性等不良反應(yīng)而撤出市場。吡格列酮(pioglitazone)和羅格列酮(rosiglitazone)是目前已批準上市的用于治療II型糖尿病的該類藥物，它們也可有效地降低胰島素拮抗，但是，此類藥物同樣也存在嚴重的不良反應(yīng)，如導(dǎo)致體重增加，可能加重心力衰竭患者的病情等。因此，研究和篩選核受體配體對于開發(fā)更好的治療糖尿病、肥胖等代謝性疾病的藥物具有十分重要的意義。傳統(tǒng)的基于受體與配基親和分析而建立的小分子化合物體外篩選分子模型的技術(shù)和方法，都需要獲得足夠量的可溶的純化蛋白，并且需要分離鑒定結(jié)合的配基或蛋白。但是，對于如核受體或核受體配體結(jié)合區(qū)(LBD)這種可溶性差的蛋白質(zhì)，這兩個問題成為發(fā)展藥物篩選分子模型的巨大障礙。盡管目前人們試圖采用各種方法來篩選核受體的小分子配體，但是由于核受體的配體結(jié)合區(qū)(LBD)是一種難溶性的蛋白質(zhì)且很難獲得足夠量的可溶的純化蛋白，仍然難于建立一個非常有效的篩選分子模型。因此，現(xiàn)有技術(shù)中迫切需要開發(fā)一種方法，獲得能用于篩選核受體或其配體的重組蛋白，以滿足配體篩選對蛋白質(zhì)純度和溶解性的要求，以便早日找到更好的治療糖尿病、肥胖等代謝性疾病的藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種衣殼表面融合有外源的核受體或核受體配體結(jié)合區(qū)的噬菌體。本發(fā)明的目的還在于提供所述衣殼表面融合有外源的核受體或核受體配體結(jié)合區(qū)的噬菌體的用途。本發(fā)明的目的還在于提供利用所述表面融合有外源的核受體或核受體配體結(jié)合區(qū)的噬菌體進行核受體配體篩選的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種噬菌體，由衣殼和位于衣殼內(nèi)的噬菌體核酸構(gòu)成，所述噬菌體的衣殼表面融合有外源的核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的噬菌體的衣殼蛋白pD上融合有外源的核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)。在另一優(yōu)選例中，所述的核受體或核受體配體結(jié)合區(qū)是一類分布于胞漿或核內(nèi)的配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，通過結(jié)合于靶基因的反應(yīng)元件而影響基因轉(zhuǎn)錄；所述的核受體或核受體配體結(jié)合區(qū)通常由N端的配體非依賴的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)、保守的鋅指結(jié)構(gòu)構(gòu)成的DNA結(jié)合區(qū)、絞鏈區(qū)、相對保守的含有核定位區(qū)和配體依賴轉(zhuǎn)錄活化區(qū)的配體結(jié)合區(qū)構(gòu)成；N端的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)和DNA結(jié)合區(qū)與C端的配體結(jié)合區(qū)在空間結(jié)構(gòu)上相對獨立。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的核受體選自下組①類固醇激素受體；②甲狀腺素受體；③孤兒核受體。在另一優(yōu)選例中，固醇激素受體家族的核受體包括但不限于糖皮質(zhì)激素(GR)、鹽皮質(zhì)激素(MR)、雄激素受體(AR)、雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)。在另一優(yōu)選例中，甲狀腺素受體家族的核受體包括但不限于甲狀腺素受體(TR)、維甲酸受體(RAR)和維生素D受體(VDR)。在另一優(yōu)選例中，所述的孤兒核受體是指未發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)生理配體的核受體，包括但不限于RXRs、LXRs、FXRs、PPARs、COUP-TFs、ERRs、HNFs等亞家族。在另一優(yōu)選例中，所述的PPARs包括但不限于PPARα、PPARβ、PPARγ，更優(yōu)選的，所述的PPARs為PPARγ。在另一優(yōu)選例中，所述的噬菌體衣殼由頭部和尾部構(gòu)成，所述的核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)位于衣殼頭部。在另一優(yōu)選例中，所述的核受體結(jié)合區(qū)是PPARγ的配體結(jié)合區(qū)(LBD)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的噬菌體選自下組λ噬菌體，T7噬菌體，T4噬菌體，絲狀噬菌體M13、fd和f1。在另一優(yōu)選例中，所述的噬菌體是烈性噬菌體，如λ，T7，T4噬菌體。在另一優(yōu)選例中，所述噬菌體為λ噬菌體，更優(yōu)選的，所述的噬菌體為含有衣殼蛋白pD的λ噬菌體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的噬菌體核酸編碼噬菌體衣殼蛋白以及外源的核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)。在本發(fā)明的第二方面，提供所述的噬菌體的用途，用于篩選與核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的與核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合的物質(zhì)選自下組配體、抗體、多肽或小分子化合物。在本發(fā)明的第三方面，提供一種篩選與核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合的物質(zhì)的方法，包括步驟(a)將候選物質(zhì)分別與第一噬菌體和第二噬菌體接觸，其中所述的第一噬菌體是前面所述的衣殼上融合有核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)的噬菌體，所述的第二噬菌體是在衣殼表面上不存在融合的外源核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)的與所述的噬菌體同一種類的噬菌體；(b)觀察候選物質(zhì)與第一噬菌體和第二噬菌體的結(jié)合情況，其中，結(jié)合于第一噬菌體但不結(jié)合于第二噬菌體的候選物質(zhì)就是與核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合的物質(zhì)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的與核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合的物質(zhì)選自配體、抗體、多肽或小分子化合物。在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中通過以下方法觀察候選物質(zhì)與第一噬菌體和第二噬菌體的結(jié)合噬菌體和候選物質(zhì)結(jié)合后，通過競爭洗脫回收噬菌體或通過直接侵染宿主菌測定結(jié)合的噬菌體滴度。在本發(fā)明的第四方面，提供一種核酸分子，它含有以下元件啟動子、操縱子、復(fù)制位點、篩選標記位點、噬菌體外殼蛋白編碼區(qū)、噬菌體外源蛋白編碼區(qū)；并且，所述的噬菌體外源蛋白編碼區(qū)編碼外源的核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)。在另一優(yōu)選例中，在噬菌體外源蛋白編碼區(qū)和噬菌體外殼蛋白編碼區(qū)上游存在啟動子(tacpromoter)、操縱子(lacoperator)，以及質(zhì)粒擴增所需的復(fù)制位點和抗生素篩選標記(Ampicillin)等。在另一優(yōu)選例中，所述的噬菌體外殼蛋白編碼區(qū)編碼噬菌體的衣殼蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的噬菌體外源蛋白編碼區(qū)與pD蛋白的編碼區(qū)相連。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，還提供了一種融合蛋白，包括第一部分和第二部分，其中第一部分為噬菌體的衣殼蛋白pD；第二部分為所述的核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)。在另一優(yōu)選例中，所述的核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)為PPARγ或PPARγ的配體結(jié)合區(qū)(PPARγLBD)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1顯示了pCGMT-LBD、p171-LBD、pET-hPPGLBD質(zhì)粒構(gòu)建模式圖。圖2顯示了克隆在p171Bio3上的PPARγLBD片斷的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜，其中，control表示空白對照。圖3顯示了質(zhì)粒p171Bio3和新構(gòu)建的質(zhì)粒p171-LBD的EcoRI酶切圖譜。圖4顯示了IPTG誘導(dǎo)PPARγLBD在宿主菌BL21(DE3)中的蛋白電泳圖譜。S表示裂解液上清，P表示裂解液離心沉淀。蛋白主要以包涵體形式存在，且占菌體超聲破碎后沉淀物90％以上。圖5顯示了融合蛋白LBD-gp3和pD-LBD表達的Westernblot分析。圖6顯示了Westernblot顯示部分pD-LBD融合蛋白以可溶形式表達宿主菌細胞質(zhì)中。圖7A顯示了抗PPARLBD抗體分析顯示PPARLBD組裝進入λ噬菌體中；圖7B顯示了抗pD抗體分析顯示PPARLBD組裝進入λ噬菌體中。圖8顯示了λp171-LBD噬菌體能結(jié)合于抗PPARγLBD抗體包被的酶標板孔，說明PPARγLBD展示表達在λ噬菌體表面。具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究和試驗，發(fā)現(xiàn)可將難溶性的核受體或其配體結(jié)合區(qū)展示在噬菌體的衣殼表面，從而率先獲得了衣殼上融合有核受體配體結(jié)合區(qū)的噬菌體。所述的噬菌體可用于篩選與核受體或其配體結(jié)合區(qū)相結(jié)合的物質(zhì)。本發(fā)明人在研究之初，面臨著核受體蛋白難于可溶表達、噬菌體展示表達難溶蛋白尚無任何現(xiàn)有技術(shù)報道以資借鑒和噬菌體展示對外源蛋白組裝大小有所限制的困難，經(jīng)過長期的研究和反復(fù)的試驗，解決了展示表達的部位確定、外源蛋白局部表達組裝和溶解性增強等問題。在試驗過程中，本發(fā)明人選擇核受體配體結(jié)合區(qū)作為優(yōu)先展示表達，并優(yōu)選適合大分子蛋白展示表達的絲狀噬菌體外殼蛋白gp3和λ噬菌體外殼蛋白pD作為載體蛋白，通過比較表達的外源重組蛋白的溶解性，發(fā)現(xiàn)λ等裂解性噬菌體更加適合難溶性核受體的展示表達，從而將難溶性的核受體或其配體結(jié)合區(qū)展示在噬菌體的衣殼表面，獲得了融合表達在噬菌體外殼的核受體或核受體配體結(jié)合區(qū)重組蛋白。所述融合表達在噬菌體表面的重組蛋白可用于篩選與核受體或其配體結(jié)合區(qū)相結(jié)合的物質(zhì)。如本發(fā)明所用，所述的“核受體”蛋白是指一類具有共同的結(jié)構(gòu)特點的、同源性較高的調(diào)控因子蛋白。所述核受體蛋白與糖尿病、肥胖等代謝性疾病的致病機制密切相關(guān)，因此是一種有用的藥物靶點。如本發(fā)明所用，所述的“核受體的配體結(jié)合區(qū)”是指存在于核受體的一個結(jié)構(gòu)區(qū)域，具有結(jié)合核受體的配體的能力。所有核受體LBD的三維結(jié)構(gòu)大體相同，都由12個α螺旋組成，且都具有結(jié)合配體、受體二聚體化和結(jié)合輔助因子的功能。在本發(fā)明的優(yōu)選例中，選擇了屬于核受體家族的(特別是PPARγ的配體結(jié)合區(qū))作為示范例，由于結(jié)構(gòu)上的相似性，其它核受體家族的成員(或是它們的配體結(jié)合區(qū))也能夠被展示表達在所述的噬菌體的表面。如本發(fā)明所用，所述的“與核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合的物質(zhì)”包括任何與核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合的物質(zhì)，包括但不限于配體、抗體、多肽或小分子化合物等。應(yīng)理解，在實施例或?qū)嶒灢牧虾头椒ㄖ兴@示的成分用量、反應(yīng)條件等數(shù)字或是本申請說明書內(nèi)容所使用的數(shù)字均為大約數(shù)值。因此，除非文中特別注明，本說明書的上述數(shù)字參數(shù)均為近似值，其可根據(jù)欲求得的本發(fā)明結(jié)果而加以變化。并且，這些參數(shù)并非用來限定與本發(fā)明申請專利范圍均等的原理，而是應(yīng)用正常操作技術(shù)下所得到的較佳數(shù)據(jù)。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅做示范之用。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)將核受體或其配體結(jié)合區(qū)展示表達在噬菌體的衣殼表面，從而構(gòu)建了衣殼上融合有核受體或其配體結(jié)合區(qū)的噬菌體。(2)核受體或其配體結(jié)合區(qū)可被展示表達在噬菌體表面，可直接利用噬菌體的侵染宿主菌能力作為篩選核受體與其它物質(zhì)結(jié)合情況的檢測指標。并且，采用本發(fā)明的噬菌體進行與核受體或其配體結(jié)合區(qū)相結(jié)合的物質(zhì)篩選，具有篩選靈敏度高和篩選效率高的特點，只需很低的蛋白表達量即可進行篩選。(3)將核受體或其配體結(jié)合區(qū)與噬菌體的衣殼蛋白融合表達，能夠增進表達的融合蛋白的可溶性，克服了由于核受體或其配體結(jié)合區(qū)因?qū)儆陔y溶性蛋白而很難用于篩選其結(jié)合物質(zhì)的問題。I.材料和實驗方法本發(fā)明具體實施方式中使用到以下的材料和方法，以下所提供的材料和方法并非用于對本發(fā)明的限制。菌株和質(zhì)粒大腸桿菌DH5α、BB4來源于Stratagene公司，BL21(DE3)來源于Navogen公司。DH5αF-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rK-mK+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1BB4supF58，supE44，hsdR514，galK2，galT22，trpR55，metB1，tonA，ΔlacU169/F’[proAB+，lacIq，lacZΔM15Tn10(tetr)]BL21(DE3)F-，ompT，hsdSB(rB-mB-)，gal(λcI857，ind1，Sam7，nin5，lacUV5-T7genel)，dcm(DE3)人PPARγ2基因克隆自肝cDNA文庫(Gnebank號NM_015869)；pGEX-2T為AmershamPharmacia公司產(chǎn)品；質(zhì)粒pET-21a(+)來源于Navogen公司；質(zhì)粒p171Bio3構(gòu)建參見文獻(SantiE，CaponeS，MennuniC，LahmA，TramontanoA，LuzzagoA，NicosiaABacteriophagelambdadisplayofcomplexcDNAlibrariesanewapproachtofunctionalgenomics.J.Mol.Biol.2000，296497-508.)；pCGMT噬菌粒構(gòu)建參見文獻(GaoC，LinCH，LoCH，MaoS，WirschingP，LernerRA，JandaKDMakingchemistryselectablebylinkingittoinfectivity.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A1997，9411777-11782)；溶源性噬菌體λD1180(λDam15b538cIts857nin5Sam100)制備參照文獻(EguchiA，AkutaT，OkuyamaH，SendaT，YokoiH，InokuchiH，F(xiàn)ujitaS，HayakawaT，TakedaK，HasegawaM，NakanishiMProteintransductiondomainofHIV-1TatproteinpromotesefficientdeliveryofDNAintomammaliancells.J.Biol.Chem.2001，27626204-26210)。酶和化學(xué)試劑實驗過程中所需化學(xué)試劑和生化試劑均購自上海華舜生物工程有限公司，為Amresco產(chǎn)品。動物免疫所需佐劑為Sigma產(chǎn)品；Westernblot的PVDF膜(Immobilon-P)為Millipore公司產(chǎn)品；HRP-羊抗鼠IgG為Calbiochem公司產(chǎn)品。各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA分子量標準購自TaKaRa生物工程有限公司；用于PCR的dNTP、pfuDNA聚合酶購自上海申能博彩生物技術(shù)公司，PCR引物合成和序列測定由上海申能博彩生物技術(shù)公司完成。主要儀器設(shè)備PTC-150PCR儀(美國MJ公司)；低溫高速離心機TL-100(美國Beckman公司)；振蕩培養(yǎng)搖床(上海琪特分析儀器有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海上海精律實驗設(shè)備有限公司)；JY-882超聲波細胞粉碎機(上海新芝生物技術(shù)研究所)；DY-A電泳儀(上海西巴斯生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；DY-24D小型電泳槽；DY-1轉(zhuǎn)移電泳槽(江蘇省興化市分析儀器廠)。培養(yǎng)基和緩沖溶液細菌培養(yǎng)和噬菌體滴度測定所需培養(yǎng)基配置參照分子克隆實驗指南(SambrookJ.，RussellDW分子克隆實驗室指南，ColdSpringHarbor，NY.ColdSpringHarborLaboratoryPress；2001.)；實驗過程中所需TE、PBS緩沖溶液，SDS-PAGE電泳相關(guān)溶液，Westernblot檢測相關(guān)溶液，以及其他所需溶液的配置參照分子克隆實驗指南。主要實驗方法常規(guī)的PCR、酶切、連接，感受態(tài)細胞的制備、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和提取等操作參照分子克隆實驗指南(SambrookJ.，RussellDW分子克隆實驗室指南，ColdSpringHarbor，NY.ColdSpringHarborLaboratoryPress；2001.)。一.重組質(zhì)粒構(gòu)建與驗證1.PPARγLBD片斷的PCR擴增以PPARγLBD的cDNA(GenBank登錄號NM_015869)為模板，利用PPLBD_Fwd1和PPLBD_Rev1兩個引物進行PCR擴增，擴增PPARγLBD片斷，與質(zhì)粒pET-21a(+)連接，所得重組質(zhì)粒命名為pET-hPPGLBD。利用PPLBD_Fwd2和PPLBD_Rev2為引物進行PCR擴增，所得PPARγLBD的PCR片斷與質(zhì)粒p171Bio3連接，所得重組質(zhì)粒命名為p171-LBD。其中，引物PPLBD_Fwd15’-AGGGATCCGTGGGGATGTCTCATAATGC-3’(BamHI)；引物PPLBD_Rev15’-ACGCGTCGACGTACAAGTCCTTGTAGAT-3’(SalI)；引物PPLBD_Fwd25’-AGACTAGTGTGGGGATGTCTCATAATGC-3’(SpeI)；引物PPLBD_Rev25’-TGTTGCGGCCGCTACAAGTCCTTGTAGATC-3’(NotI)。并且，上述引物序列中下劃線所指為括號中所示酶切位點。2.PCR擴增片斷與噬菌體載體的連接、轉(zhuǎn)化與驗證通過PCR引物在PCR片斷的兩端引入了不同的酶切位點，PCR產(chǎn)物雙酶切后與同樣雙酶切的載體質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化宿主菌感受態(tài)細胞，具體方法參照分子克隆實驗指南。挑選平皿上長出的克隆，接種于3mlLB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜后，用試劑盒提取質(zhì)粒，酶切驗證。經(jīng)酶切驗證連接正確的重組子于-70℃保存。二.外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達與分析轉(zhuǎn)化含外源蛋白質(zhì)粒的宿主菌，于50mlLB(氨芐青霉素60μg/ml，0.1％葡萄糖)，37℃振蕩至OD600約為0.4～0.5，加入IPTG至終濃度為1mM誘導(dǎo)外源蛋白表達，30℃振蕩培養(yǎng)8小時。8000rpm離心10分鐘收集IPTG誘導(dǎo)后的菌體，懸浮于超聲緩沖溶液中(50mMTrispH8.0，150mMNaCl，1mMEDTA)，冰浴下超聲破碎細胞，4℃10000rpm離心15分鐘，分離超聲波破碎物中的可溶部分和沉淀物。離心后的各組分經(jīng)過10％SDS-PAGE變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。溴酚藍電泳至分離較底部時，電泳完成后取出凝膠，冷卻條件下500mA恒流轉(zhuǎn)移2小時，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF印跡膜上。電泳轉(zhuǎn)移完成后，取出PVDF膜，封閉液(2％BSA，TBS)封閉過夜，TBST緩沖液(TBS，0.05％Tween20)室溫下漂洗3次，每次10分鐘；用抗-LBD(制備方法見下)或抗-pD血清(制備方法見下)(封閉液1∶1000稀釋)作為一抗，37℃輕搖溫浴1小時；重復(fù)漂洗三次，每次10分鐘；加入HRP-羊抗鼠IgG二抗(封閉液1∶5000稀釋)，37℃輕搖溫浴1小時；重復(fù)漂洗步驟后，加入HRP底物反應(yīng)液室溫下顯色，待顯色適度時大量水沖洗終止顯色，ddH2O水漂洗后陰干保存，貯藏于4℃。三.多克隆抗體抗-LBD和抗-pD的制備轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒pET-hPPGLBD的大腸桿菌BL21(DE3)利用IPTG誘導(dǎo)PPARγLBD表達，超聲波裂解，PPARγLBD蛋白主要以不溶的包涵體存在，可通過離心分離出PPARγLBD蛋白。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒p171Bio3的大腸桿菌BB4用IPTG誘導(dǎo)pD蛋白表達，菌體超聲波裂解物利用SDS-PAGE膠分離，電泳完成后切割pD蛋白條帶所在凝膠，于-70℃室溫反復(fù)凍融分離出pD蛋白。利用純化的PPARγLBD蛋白和pD蛋白分別免疫小鼠?？偣裁庖呶宕?，從小鼠眼角取血，收集血清。測定效價后，分裝后于-70℃保存?？贵w免疫方法和效價測定參照分子克隆實驗指南。四.外源蛋白在噬菌體表面的展示表達與分析在本發(fā)明的優(yōu)選例中，將核受體或其配體結(jié)合區(qū)融合于λ噬菌體的衣殼上，具體的展示表達與分析步驟如下1.溶源菌BB4(λD1180)的制備原噬菌體λD1180(λDam15b538cIts857nin5Sam100)構(gòu)建和制備前述的參考文獻(EguchiA，AkutaT，OkuyamaH，SendaT，YokoiH，InokuchiH，F(xiàn)ujitaS，HayakawaT，TakedaK，HasegawaM，NakanishiMProteintransductiondomainofHIV-1TatproteinpromotesefficientdeliveryofDNAintomammaliancells.J.Biol.Chem.2001，27626204-26210)。獲得的λD1180噬菌體稀釋104倍，取1μl與200μl新鮮的對數(shù)期大腸桿菌BB4混合，30℃靜置30分鐘后，用接種針取少量菌液在平板上劃線，32℃培養(yǎng)。次日用牙簽挑取單克隆，分別接種于兩個平板上，并一一對應(yīng)。一個平板置于32℃，另一個平板置于42℃培養(yǎng)12小時，挑選32℃生長42℃不生長的菌落，即為整合有原噬菌體λD1180的BB4溶源菌，稱為BB4(λD1180)。2.溶源菌BB4(λD1180)感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化BB4(λD1180)感受態(tài)的制備與其它菌株相似，但菌體生長、培養(yǎng)溫度為32℃。質(zhì)粒p171Bio3、重組質(zhì)粒p171-LBD轉(zhuǎn)化BB4(λD1180)感受態(tài)，轉(zhuǎn)化過程與其它細菌轉(zhuǎn)化過程類似，但冰浴后不用42℃熱激，直接加入LB液體培養(yǎng)基于32℃復(fù)蘇。涂板后于32℃培養(yǎng)。3.λ噬菌體擴增和滴度測定λ噬菌體的培養(yǎng)、擴增和滴度(噬菌斑形成單位pfu，plaqueformingunit)測定參考分子克隆實驗指南。4.λ噬菌體結(jié)合分析鼠抗PPARγLBD多抗(抗-LBD血清，制備方法見上)用包被液稀釋100倍后包被酶標板孔，每孔100μl，共6孔。同時無免疫的小鼠血清也同樣用包被液稀釋100倍作為對照，加入3個酶標板孔中，4℃包被過夜。次日每孔加入200μl封閉液PBST(2％BSA，0.05％Tween-20)37℃封閉2小時。然后在抗-LBD包被的三個孔中加入1×108λp171Bio3噬菌體，而另外三個孔中加入同樣數(shù)量的λpD-LBD噬菌體(pD蛋白上融合有LBD的λ噬菌體)，同時在無抗體小鼠血清包被的孔中也加入1×108λpD-LBD噬菌體，37℃溫浴1小時。去除噬菌體溶液，酶標板每孔用200μl清洗液(PBS，0.05％Tween-20，10mMMgSO4)清洗三次，最后用PBS溶液清洗一次(10mMMgSO4)。然后加入對數(shù)期細菌BB4，37℃溫浴30分鐘。利用上述λ噬菌體滴度測定方法確定結(jié)合在酶標板孔中的噬菌體數(shù)目。所得結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，利用t檢驗(student’spairedttest)確定兩組數(shù)據(jù)之間有無顯著的差異性，當(dāng)p＜0.05時認為兩者之間存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異性。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。II.具體實施例實施例1外源蛋白PPARγLBD表達質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒構(gòu)建的示意圖見圖1。質(zhì)粒p171Bio3包含有編碼λ噬菌體頭部衣殼蛋白pD的基因，PPARγLBD的PCR擴增片斷連接在pD蛋白基因的3’端。利用引物PPLBD_Fwd2和PPLBD_Rev2，擴增出PPARγLBD片斷，基因片斷約為900bp。瓊脂糖電泳顯示PCR產(chǎn)物片段的大小與預(yù)期相吻合(圖2)，構(gòu)建的質(zhì)粒為p171-LBD。p171-LBD質(zhì)粒用EcoRI酶切驗證，酶切片斷和大小與預(yù)期相吻合(圖3)，說明外源蛋白PPARγLBD基因片斷連接進入了質(zhì)粒p171Bio3中利用引物PPLBD_Fwd1和PPLBD_Rev1擴增的PPARγLBD，通過BamHI和SalI酶切位點與質(zhì)粒pET-21a(+)連接，構(gòu)建的質(zhì)粒為pET-hPPGLBD。同樣擴增的PCR片斷與pCGMT連接，構(gòu)建的質(zhì)粒為pCGMT-LBD。實施例2PPARγLBD在大腸桿菌中的表達及抗-LBD和抗pD多克隆抗體的制備pET-hPPGLBD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，IPTG誘導(dǎo)PPARγLBD表達，超聲破碎處理后的菌液上清(S)和沉淀(P)進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4中所示，菌體裂解液沉淀中在分子量約31kDa處有顯著的蛋白條帶(第4道)，而在上清裂解液中的相應(yīng)位置可溶性的重組蛋白量比較少(第3道)，說明PPARγLBD在大腸桿菌中主要以不溶性的包涵體形式表達。PPARγLBD在整個包涵體蛋白中達到了95％以上，離心分離包涵體蛋白用于免疫小鼠。p171Bio3載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BB4后，IPTG誘導(dǎo)質(zhì)粒上的pD蛋白基因表達，SDS-PAGE電泳分離后，割膠后反復(fù)凍融回收pD蛋白，抽提到的蛋白用于免疫小鼠。利用純化獲得的PPARγLBD和pD蛋白多次免疫小鼠后，分別獲得的抗-LBD和抗pD多克隆抗體血清利用間接ELISA法測定效價后，備用。實施例3λ噬菌體展示系統(tǒng)比絲狀噬菌體gp3系統(tǒng)更適合于PPARγLBD蛋白的展示表達PPARγLBD分別融合表達在噬菌粒pCGMT編碼的的gp3蛋白N末端和質(zhì)粒p171Bio3編碼的pD蛋白C末端，IPTG誘導(dǎo)后分別表達融合蛋白LBD-gp3(55kDa)和pD-LBD(46kDa)。菌體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達后利用超聲波破碎。超聲波裂解物進行SDS-PAGE電泳，利用抗LBD多克隆抗體進行Westernblot檢測(圖5)。圖中T、S、P分別代表融合蛋白菌體總蛋白、菌體裂解液上清和菌體裂解液沉淀中的蛋白。可見可溶性的gp3-LBD融合蛋白主要分布在沉淀中，以不溶的包涵體的形式存在。而相同條件下誘導(dǎo)的pD-LBD融合蛋白同時存在于超聲波裂解物的上清和沉淀中，有一部分的pD-LBD蛋白以可溶的形式存在。因為可溶性的外源蛋白有利于其組裝展示到噬菌體顆粒中。因此從此可以看出，λ噬菌體展示系統(tǒng)比絲狀噬菌體gp3系統(tǒng)更適合于PPARγLBD蛋白的展示表達。實施例4部分與pD蛋白融合的PPARγLBD以可溶形式表達在宿主菌細胞質(zhì)中進一步地對pD-LBD融合蛋白在宿主菌中誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)條件下的表達情況進行Westernblot分析。結(jié)果見圖6，顯示作為空白對照的載體p171Bio3轉(zhuǎn)化菌在誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)條件下都無pD-LBD蛋白的表達。而轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒p171-LBD的細菌克隆在非誘導(dǎo)條件下，在46kDa處有新生蛋白pD-LBD可溶性表達(第6道)，而在裂解沉淀中相應(yīng)位置無條帶出現(xiàn)(第7道)。IPTG誘導(dǎo)后，pD-LBD融合蛋白的表達量在裂解液上清中顯著增加(第8道)，同時由于pD蛋白提高外源蛋白的溶解性是有限的，隨著IPTG誘導(dǎo)后大量pD-LBD融合蛋白的表達，融合蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在于宿主菌細胞質(zhì)中(第9道)。其中可溶性的pD-LBD約占其總表達量的30％。這結(jié)果進一步說明了pD蛋白可以在一定程度上促進與其融合的蛋白保持溶解狀態(tài)，雖然大部分表達的融合蛋白是仍以包涵體形式存在(第9道)，但這小部分保持溶解狀態(tài)的融合蛋白足夠用于噬菌體的展示。圖中S、P分別代表菌體裂解液上清和菌體裂解液沉淀中的蛋白。實施例5PPARγ能組裝進入λ噬菌體衣殼蛋白中載體p171Bio3和p171-LBD分別轉(zhuǎn)化溶源菌BB4(λD1180)，熱誘導(dǎo)λ噬菌體裂解組裝和釋放，PEG沉淀所得的λp171Bio3和λp171-LBDSDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，利用抗LBD多克隆抗體(圖7A)和抗pD多克隆抗體(圖7B)檢測。圖7A中，λp171-LBD在46kDa處出現(xiàn)一條明顯條帶，而在作為對照的λp171Bio3處無對應(yīng)條帶，這條帶的蛋白應(yīng)該是組裝到λ噬菌體中的pD-LBD。進一步用抗λ噬菌體外殼蛋白pD的抗體檢測，λp171-LBD除在46kDa處的pD-LBD蛋白條帶外，另外在11kDa處還出現(xiàn)一條pD蛋白(圖7B)，其來源于溶源在宿主菌BB4中的原噬菌體λD1180基因組中的gpD基因編碼的pD蛋白。pD蛋白和pD-LBD融合蛋白兩者的比值反應(yīng)了外源蛋白PPARγLBD組裝進入λ噬菌體的能力。通常每個野生型λ噬菌體含有405個拷貝的pD蛋白，通過對圖7B中兩條帶的掃描定量分析，可以得出pD-LBD與pD的比值約為0.4，因此融合有外源蛋白的pD的數(shù)量占總共pD數(shù)量的28％，從而可以計算出大概每個λ噬菌體組裝有115個PPARγLBD分子。實施例6融合表達在λp171-LBD噬菌體上PPARγLBD的能被抗LBD抗體識別并捕獲通過組裝有PPARγLBD的噬菌體與其抗體之間的相互作用，確定外源蛋白組裝到λ噬菌體中的位置。利用抗PPARγLBD包被酶標板孔，分別與λp171Bio3和λp171-LBD噬菌體結(jié)合，并同時以無抗體的小鼠血清包被的酶標板孔作為對照(圖8)。在抗LBD包被的酶標板孔中捕獲的λp171-LBD數(shù)量是捕獲的λp171Bio3數(shù)量的四倍，統(tǒng)計學(xué)分析說明兩者之間具有顯著差異(P＜0.01)。兩者的差異來源于λp171-LBD中組裝了PPARγLBD蛋白，說明抗LBD血清與PPARγLBD蛋白存在強烈的結(jié)合。同時無抗體小鼠血清包被的酶標板孔捕獲λp171-LBD的量顯著下降(P＜0.01)，說明抗LBD血清與PPARγLBD蛋白存在的強烈結(jié)合主要來自抗體血清中的抗LBD抗體與PPARγLBD融合蛋白之間。λp171-LBD能被抗體捕獲說明PPARγLBD表達在λ噬菌體表面。同時也說明了組裝在λ噬菌體中的PPARγLBD是展示表達在λ噬菌體的外表面，并且保持了能被抗體識別并結(jié)合的結(jié)構(gòu)特征。實施例7用組裝于λ噬菌體表面的PPARγLBD進行基于展示表達重組蛋白定性定量檢測的應(yīng)用第一噬菌體衣殼表面組裝有PPARγLBD的λ噬菌體。第二噬菌體衣殼表面不組裝有PPARγLBD的λ噬菌體。將候選物質(zhì)分別與上述的第一噬菌體和第二噬菌體接觸，觀察候選物質(zhì)與第一噬菌體和第二噬菌體的結(jié)合情況。分別分析候選物質(zhì)與第一和第二噬菌體的結(jié)合結(jié)果，如果一種候選物質(zhì)能夠結(jié)合于第一噬菌體但不結(jié)合于第二噬菌體的，其就是與核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合的物質(zhì)。討論(1)可溶性差的外源蛋白與pD融合表達后蛋白的溶解度有所改善大腸桿菌因其操作方便和易于培養(yǎng)等優(yōu)點，使之仍然是主要的蛋白表達體系，但真核蛋白在大腸桿菌中表達時，往往形成不可溶的蛋白質(zhì)包涵體，它是蛋白在表達過程中非正確折疊而形成的蛋白質(zhì)中間產(chǎn)物。蛋白功能研究并不能直接利用包涵體來進行，通常的辦法是先將分離到的包涵體蛋白進行復(fù)性，但蛋白復(fù)性并無一定的規(guī)律可循，因此蛋白復(fù)性在當(dāng)前的技術(shù)條件下還有很大的困難。另外一種繞過蛋白復(fù)性問題的方法是，通過減少蛋白表達過程中包涵體產(chǎn)生，提高蛋白溶解度來實現(xiàn)的。通常的方法是通過優(yōu)化蛋白表達條件或者與能提高溶解度的蛋白融合表達來提高蛋白的溶解度，如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GlutathioneS-Transferase，GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MaltoseBindingProtein，MBP)、硫氧化還原蛋白(Thioredoxin，Trx)等。核受體以及核受體的配體結(jié)合區(qū)(如PPARγLBD)由于含有與疏水性小分子配體結(jié)合的界面，其整體的疏水性氨基酸的含量較高，因此表達過程中更易于形成包涵體，本發(fā)明人的試驗結(jié)果也證實了這一點，PPARγLBD在大腸桿菌中表達時，大部分表達的蛋白都是以不溶性的形式存在于細菌中。即使是在融合GST蛋白后，PPARγLBD的溶解性并沒有很大的提高。而λ噬菌體衣殼蛋白pD與PPARγLBD融合后，能顯著提高后者的溶解性，說明利用pD蛋白是一種較好選擇。(2)蛋白保持溶解性是組裝到噬菌體中的前提噬菌體展示技術(shù)雖然無需蛋白的純化，但外源蛋白在宿主菌中表達時保持一定的溶解性，這也是外源蛋白得以展示表達到噬菌體表面的前提。雖然并不需要外源蛋白全部都保持可溶狀態(tài)，但是至少需要一部分能可溶性表達。已有研究表明提高外源蛋白的可溶性，包括與促溶的蛋白融合表達或者共表達蛋白伴侶分子，可以提高外源蛋白組裝到噬菌體表面的效率。從這點上來看，選擇pD蛋白作為載體蛋白，適合于那些容易在表達過程中形成不可溶性包涵體蛋白的展示表達。(3)蛋白大小限制在λ噬菌體展示系統(tǒng)中不是主要限制因素本發(fā)明人的結(jié)果顯示較大的外源蛋白可以在噬菌體表面展示表達。其它的報道也顯示，大分子量的蛋白，如β-半乳糖苷酶、β-內(nèi)酰胺酶、蛋白毒素能高拷貝地組裝到λ噬菌體中，這些結(jié)果說明λ噬菌體對于其所展示的蛋白大小限制相對比較寬。因此利用λ噬菌體展示系統(tǒng)是比較適合展示大分子量蛋白。(4)λ噬菌體展示系統(tǒng)是多價展示系統(tǒng)λ噬菌體是一個多價展示系統(tǒng)，比較適合于篩選親和力較小的配基。對于高親和力配基的篩選，可以選擇廣泛應(yīng)用的單價的絲狀噬菌體gp3系統(tǒng)，也可以通過調(diào)節(jié)啟動子來調(diào)控融合有外源蛋白的pD蛋白的表達，通過改變野生型pD蛋白和融合的pD的分子數(shù)量的比值，從而達到調(diào)控組裝到λ噬菌體中外源蛋白的價數(shù)。(5)其它核受體或核受體配體結(jié)合區(qū)同樣可以展示表達在噬菌體表面其它核受體在結(jié)構(gòu)上非常類似，配體結(jié)合區(qū)大小都在250個氨基酸左右，相差不大，并且由于都是與脂溶性的配體結(jié)合，因此具有強疏水性，在大腸桿菌中表達時都易于形成不溶性的包涵體。對于外源蛋白在噬菌體表面的展示表達，主要的限制來源于外源蛋白的溶解性限制和分子大小限制，根據(jù)本發(fā)明的實施例，PPARγLBD可以展示表達在噬菌體表面，因此可以推斷，對于其它類似的核受體或核受體結(jié)合區(qū)同樣也可以展示表達在噬菌體表面。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種噬菌體，由衣殼和位于衣殼內(nèi)的噬菌體核酸構(gòu)成，其特征在于，所述噬菌體的衣殼表面融合有外源的核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)。2.如權(quán)利要求1所述的噬菌體，其特征在于，所述的噬菌體的衣殼蛋白pD上融合有外源的核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)。3.如權(quán)利要求1所述的噬菌體，其特征在于，所述的核受體選自下組①類固醇激素受體；②甲狀腺素受體；③孤兒核受體。4.如權(quán)利要求1所述的噬菌體，其特征在于，所述的噬菌體選自下組λ噬菌體，T7噬菌體，T4噬菌體，絲狀噬菌體M13、fd和f1。5.如權(quán)利要求1所述的噬菌體，其特征在于，所述的噬菌體核酸編碼噬菌體衣殼蛋白以及外源的核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)。6.如權(quán)利要求1所述的噬菌體的用途，其特征在于，用于篩選與核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合的物質(zhì)。7.一種篩選與核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合的物質(zhì)的方法，其特征在于，包括步驟(a)將候選物質(zhì)分別與第一噬菌體和第二噬菌體接觸，其中所述的第一噬菌體是權(quán)利要求1所述的噬菌體，所述的第二噬菌體是在衣殼表面上不存在融合的外源核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)的與權(quán)利要求1所述的噬菌體同一種類的噬菌體；(b)觀察候選物質(zhì)與第一噬菌體和第二噬菌體的結(jié)合情況，其中，結(jié)合于第一噬菌體但不結(jié)合于第二噬菌體的候選物質(zhì)就是與核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合的物質(zhì)。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的與核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合的物質(zhì)選自配體、抗體、多肽或小分子化合物。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(b)中通過以下方法觀察候選物質(zhì)與第一噬菌體和第二噬菌體的結(jié)合噬菌體和候選物質(zhì)結(jié)合后，通過競爭洗脫回收噬菌體或通過直接侵染宿主菌測定結(jié)合的噬菌體滴度。10.一種核酸分子，其特征在于，它含有以下元件啟動子、操縱子、復(fù)制位點、篩選標記位點、噬菌體外殼蛋白編碼區(qū)、噬菌體外源蛋白編碼區(qū)；并且，所述的噬菌體外源蛋白編碼區(qū)編碼外源的核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)。全文摘要本發(fā)明公開了一種噬菌體，由衣殼和位于衣殼內(nèi)的噬菌體核酸構(gòu)成，所述噬菌體的衣殼表面融合有外源的核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)。本發(fā)明的噬菌體能夠用于篩選與核受體或核受體的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合的物質(zhì)，具有篩選靈敏度高和篩選效率高的特點，只需很低的蛋白表達量即可進行篩選。文檔編號C12N15/33GK1990859SQ20051011248公開日2007年7月4日申請日期2005年12月30日優(yōu)先權(quán)日2005年12月30日發(fā)明者馬維駿,孔波申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院