具有緩激肽受體結(jié)合活性的多肽及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬藥學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及蛋白質(zhì)多肽，具體涉及可與緩激肽受體特異性結(jié)合的多肽；更具體的涉及可與緩激肽受體特異性結(jié)合的多肽及其在制備治療腦腫瘤組合藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)公開了激肽家族是一類具有強效血管活性和促炎特性的多肽，其包含緩激肽(Bradykinin，BK)、胰激肽(Kallidin，KD)以及它們的活性代謝產(chǎn)物等。上個世紀70年代，Regoli等發(fā)現(xiàn)存在兩種激肽受體BI和B2 ;研究還顯示激肽激活與G蛋白偶聯(lián)的激肽受體BI和B2，影響激肽釋放酶一激肽系統(tǒng)，進而產(chǎn)生多種生理效應(yīng)。在心血管自我穩(wěn)定、平滑肌收縮與舒張、炎癥以及傷害性感知等方面，激肽的作用已經(jīng)被人們所揭示。另外，激肽在細胞增殖、纖維化以及血管新生等方面的作用也在不斷被人們所了解。作為一種內(nèi)源性物質(zhì)，激肽通過激肽釋放酶一激肽系統(tǒng)參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如哮喘、過敏反應(yīng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、糖尿病、高血壓、左心室肥厚、心肌病以及腎臟疾病等。有研究表明，激肽受體在腫瘤微環(huán)境中的多種細胞表面高度表達，如腫瘤細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞等，激肽受體被激活時會增加血管的滲透性，與細胞的增殖、基質(zhì)金屬蛋白酶的釋放以及細胞的侵襲存在關(guān)聯(lián)，因此，有關(guān)研究開始將激肽受體作為靶點進行腫瘤的治療。有關(guān)激肽受體拮抗劑被建議用于多種癌癥的治療，尤其是肺癌和前列腺癌，已經(jīng)有報道證明某些拮抗劑可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡或抑制其生長。雖然激肽受體的效應(yīng)具有危害，但其就像一把雙刃劍，當(dāng)激肽受體激動劑和受體結(jié)合后會增加腦血管的通透性，因此有研究利用激肽受體激動劑來輔助治療腦腫瘤，幫助化療藥物更好的穿過血腦屏障或血腦腫瘤屏障而到達腦腫瘤，起到更好的治療效果。
[0003]緩激肽是一種內(nèi)源性多肽，其氨基酸序列為RPPGFSPFR，早在1994年TakanoriInamura和KeithL.Black研究發(fā)現(xiàn)低劑量的緩激肽可以選擇性開放血腦腫瘤屏障,研究顯示，腦腫瘤微環(huán)境中的星形膠質(zhì)細胞和腦腫瘤細胞表面的激肽受體B2的表達顯著高于正常腦血管內(nèi)皮細胞，使得低劑量緩激肽在不影響血腦屏障的前提下選擇性開放血腦腫瘤屏障，所述的低劑量緩激肽主要是通過跨細胞和細胞旁兩條途徑開放血腦腫瘤屏障，首先，低劑量的緩激肽與激肽受體B2結(jié)合后使得胞內(nèi)鈣離子水平升高，而鈣離子又會與鈣調(diào)蛋白結(jié)合激活一氧化氮合成酶，進而產(chǎn)生一氧化氮，引起細胞內(nèi)環(huán)單磷酸鳥苷水平升高，使得細胞的鈣激活性鉀通道蛋白的表達增加，促進跨內(nèi)皮細胞胞飲囊泡的形成；同時，緩激肽還可通過上調(diào)質(zhì)膜微囊蛋白(caveolin)的表達增加胞飲小泡的數(shù)量,從而調(diào)節(jié)血腦腫瘤屏障的通透性；其次，研究還發(fā)現(xiàn)緩激肽還可通過影響cAMP/PKA信號通路、RhoA/ROCK信號通路和腫瘤壞死因子一 ct的方式減少緊密連接相關(guān)蛋白(如ZO — l、occludin、claudin — 5)和細胞骨架蛋白(F — actin)的表達，從而打開緊密連接，繼而增加血腦腫瘤屏障的通透性。
[0004]由于緩激肽在體內(nèi)容易被降解，因此有研究通過結(jié)構(gòu)改造制備了生物穩(wěn)定的激肽B2受體激動一RMP-7，利用RMP-7和化療藥物聯(lián)合給藥從而達到輔助治療腦部腫瘤的效果。然而，到目前為止，由于RMP-7在激肽受體結(jié)合活性以及給藥劑量等方面還存在一定問題使得研究停滯不前，仍處在二期臨床的研究過程中，而且在制備過程中需要用到特殊氨基酸以及還原肽鍵的技術(shù)，因此增加了制備的難度和經(jīng)濟成本。
[0005]另外，天然存在的緩激肽及其衍生物是L構(gòu)型氨基酸組成的多肽，當(dāng)L型多肽進入血液后，很容易被血清中的蛋白酶所降解。由于L型多肽在體內(nèi)穩(wěn)定性差，導(dǎo)致其作為藥物研發(fā)存在諸多缺陷。針對上述問題，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過D構(gòu)型氨基酸代替L構(gòu)型氨基酸的方式來提高多肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性；D構(gòu)型氨基酸的構(gòu)型與L構(gòu)型氨基酸不同，相同序列的D型多肽具有與L型多肽不同的手性，導(dǎo)致其生物活性也可能不同。
[0006]本申請的發(fā)明人擬提供一種在體內(nèi)穩(wěn)定，且具有緩激肽受體結(jié)合活性的有效肽類物質(zhì)，尤其是在該基礎(chǔ)上提供一種能與化療藥物聯(lián)用的上述肽類物質(zhì)，以達到提高化療藥物治療腦部腫瘤的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種在體內(nèi)穩(wěn)定，且具有緩激肽受體結(jié)合活性的有效肽類物質(zhì)，具體涉及可與緩激肽受體特異性結(jié)合的D型多肽及其在制備治療腦腫瘤的組合藥物中的用途。
[0008]本發(fā)明的D型多肽可作為腦腫瘤治療輔助藥物，進一步制備治療腦腫瘤的組合藥物，該組合藥物能提高化療藥物治療腦部腫瘤的效果。
[0009]本發(fā)明利用多肽序列翻轉(zhuǎn)原理，以內(nèi)源性緩激肽為模板，設(shè)計了三條D型多肽，其氨基酸序列分別為RFPSFGPPR，RFPSFGPPRK和RFPSFGPPRL，分別命名為R1-BK，R1-KD和R1-L-BK，經(jīng)實驗表明，對緩激肽受體具有高親和性。
[0010]本發(fā)明所述的多肽通過固相合成法制備，制備過程中使用的氨基酸為D型氨基酸；
[0011 ] 本發(fā)明中，根據(jù)緩激肽和受體的結(jié)合特性，在D型多肽R1-BK的C端共價連接6 —氨基己酸作為連接分子，同時D構(gòu)型半胱氨酸作為功能基團引入,與6 —氨基己酸的羧基相連；利用D構(gòu)型半胱氨酸的巰基與馬來酰亞胺的特異性反應(yīng)，將RFPSFGPPRXC (其中X代表6 —氨基己酸)與Mal-FITC反應(yīng)，將FITC標記在多肽分子上，制得標有熒光素的多肽R1-BK-FITC ；
[0012]本發(fā)明中，將標有熒光素的多肽進行細胞特異性攝取實驗，實驗結(jié)果表明，C6、HEK和U87等細胞均對R1-BK-FITC有較高的攝取，其中，所述的D型多肽R1-BK，R1-KD和R1-L-BK能抑制C6細胞對R1-BK-FITC的攝取。
[0013]本發(fā)明的多肽可用于治療由于緩激肽和緩激肽的相關(guān)肽類所調(diào)解、引起或支持的所有病理狀態(tài)，尤其是在治療腦腫瘤方面，其可以作為化療藥物的輔助用藥，選擇性打開血腦腫瘤屏障，可以顯著提高藥物在腦腫瘤部位的蓄積，減少對正常腦組織的損傷；本發(fā)明的實施例中所述的多肽與載紫杉醇的PEG-PLA聚合物膠束聯(lián)合用藥干預(yù)原位腦膠質(zhì)瘤裸鼠，結(jié)果顯示，能延長原位腦膠質(zhì)瘤裸鼠的中位生存期，與單獨使用紫杉醇聚合物膠束組相比具有極顯著性差異。
[0014]與本發(fā)明的多肽聯(lián)合給藥的聚合物膠束給藥系統(tǒng)，除了 PEG-PLA聚合物膠束，還可以是PEG-DSPE、PEG-PLGA、PEG-PCL以及PEG-聚谷氨酸等形成的聚合物膠束等聚合物膠束系統(tǒng)或脂質(zhì)體以及納米粒等；所述的聚合物膠束遞藥系統(tǒng)不僅包載紫杉醇，還可以包載阿霉素和伊曲康唑等抗腫瘤藥物。
【附圖說明】
[0015]圖1:R1-BK，R1-KD 和 R1-L-BK 的 HPLC 以及 ES1-MS 圖譜，其中，
[0016]色譜方法:色譜柱:YMCC185 μ 150X4.6mm ;流動相A:水(含0.1%三氟乙酸);流動相B:乙腈(含0.1 %三氟乙酸)；洗脫程序:2?32分鐘5% B-65% B，共45分鐘；流速:
0.7ml/ 分鐘；柱溫:25V ;檢測:UV214nm ；
[0017]A 為 R1-BK 的 HPLC 圖譜以及 ES1-MS 圖譜，Tri bk = 16.1Omin, Mff: 1060.4
[0018]B 為 R1-KD 的 HPLC 圖譜以及 ES1-MS 圖譜，Tri kd = 15.36min, MW: 1188.6
[0019]C 為 R1-L-BK 的 HPLC 圖譜以及 ES1-MS 圖譜，Tri l bk = 18.40min, MW: 1173.4。
[0020]圖2:C6、U87、HUVEC 和 bEncL 3 細胞對 R1-BK-FITC 的攝取熒光照片，
[0021]其中，
[0022]A為C6細胞對R1-BK-FITC的攝取結(jié)果；B為U87細胞對R1-BK-FITC的攝取結(jié)果；C為HUVEC細胞對R1-BK-FITC的攝取結(jié)果；D為bEnd.3細胞對R1-BK-FITC的攝取結(jié)果。
[0023]圖3:R1-BK, R1-KD和R1-L-BK抑制C6細胞對R1-BK-FITC攝取的熒光照片和流式檢測結(jié)果，其中，
[0024]A為C6細胞對R1-BK-FITC的攝取的熒光照片；B、C和D分別為R1-BK，R1-KD和R1-L-BK抑制C6細胞對R1-BK-FITC攝取的熒光照片；E為R1-BK，R1-KD和R1-L-BK抑制C6細胞對R1-BK-FITC攝取的流式檢測結(jié)果。
[0025]圖4 =R1-BK與PEG-PLA膠束聯(lián)合給藥在腦部的藥時曲線，其中，
[0026]檢測了 9個時間點的腦部所含香豆素6濃度,分別為:5min、10min、15min、30min、lh、2h、4h、8h、12h,每個時間點 3 只小鼠(n = 3) ;Mic