專利名稱：受體相關(guān)蛋白(rap)環(huán)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(RAP)環(huán)肽，包括其類似物，其組合物，以 及制備和使用此RAP環(huán)肽的方法。
背景技術(shù)：
受體相關(guān)蛋白(RAP)，也稱為a 2_巨球蛋白/低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白相關(guān)蛋 白1 (Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中編號(hào)為P30533，Pfam中編號(hào)PF06400和PF06401)，是一種獨(dú)特的 39KD的蛋白，其幾乎與低密度脂蛋白受體(LDLR)的所有家族成員結(jié)合。其位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和 高爾基體(Bu andSchwartz, Trends Cell. Biol. 8(7) :272_6，1998)，RAP 起這些家族成員 的伴侶的作用。例如，在這些間隔中RAP緊密結(jié)合LRP，防止受體和共表達(dá)的配體過早結(jié)合 (Herz and ffillnow, Atherosclerosis 118 Suppl :S37_41,1995)。全長(zhǎng)的人RAP包括其信號(hào)序列有357個(gè)氨基酸。成熟的RAP含有323個(gè)氨基酸， 其中后四個(gè)氨基酸(HNEL)組成了一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)。已有報(bào)道，RAP由三個(gè)同源性較低 的結(jié)構(gòu)域組成(dl、d2和d3)。所有這三個(gè)結(jié)構(gòu)域都能夠結(jié)合LRP，盡管d3以較高的親和 力結(jié)合。不同的出版物對(duì)RAP的三個(gè)結(jié)構(gòu)域的分界的報(bào)道稍有不同(氨基酸殘基1-100， 101-200和201-323，或18-112，113-218和219-323)，這些結(jié)構(gòu)域在結(jié)合特性方面表現(xiàn)出略 有不同。例如，據(jù)報(bào)道dl抑制0 2-巨球蛋白與1^ 的結(jié)合，而(13則被報(bào)道促進(jìn)1^ 的正 確折疊(見 Obermoeller 等人，J. Biol. Chem. 272(16) :10761_100768 (1997))。Medved 等 人，J.Biol.Chem.，274(2) :717_727 (1999)報(bào)道了另一種四結(jié)構(gòu)域的劃分方式(殘基1-92， 93-163，164-216 和 217-323)。RAP的截短和/或突變形式已有研究。Melman等人，J.Biol.. Chem.，276 (31) 29338-29346 (2001)報(bào)道了一些GST/RAP片段融合的制備方法，包括成熟RAP殘基 221-323，221-275，276-323，221-290，221-300 和 221-310，這些全部顯示出與 LRP 結(jié)合時(shí) 沒有或低的親和力。從這些數(shù)據(jù)中，Melman等得出結(jié)論，殘基201-210對(duì)于以高親和力 結(jié)合LRP是必需的。Melman等人還制備了 RAP突變體，該突變體含有203-206 (A位點(diǎn))， 282-289 (B位點(diǎn))和314-319 (C位點(diǎn))的突變；單獨(dú)A位點(diǎn)突變或單獨(dú)B位點(diǎn)突變對(duì)LRP結(jié) 合活性的降低較小。然而A位點(diǎn)和B位點(diǎn)同時(shí)突變顯著地降低LRP結(jié)合活性。Medved等 人，同上，制備了兩種GST/RAP C末端片段融合，其中一個(gè)含有成熟RAP殘基216-323，另一 個(gè)含有殘基 206-323。Rail 等人，J. Biol. Chem.，273 (37) :24152_24157 (1998)報(bào)道了將成 熟RAP蛋白水解為多種片段并鑒定作為高度蛋白酶抵抗部分的殘基223-323。Obermoeller 等人，同上，也制備了含有成熟RAP殘基191-323的RAP片段，并研究了與不同LRP結(jié)構(gòu)域 的結(jié)合相互作用。McCormick 等人，Biochemistry, 44 5794-803 (2005)構(gòu)建了含有 RAP 的 221-323殘基的GSP/RAP片段融合，并評(píng)價(jià)了其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶ERp57的結(jié)合。Andersen等人，Biochemistry 42,9355-64(2003)測(cè)試了 RAP結(jié)構(gòu)域片段與apoE受體2的結(jié)合， 并報(bào)道只有第三結(jié)構(gòu)域(殘基216-323)與之結(jié)合。Andersen等人，J Biol Chem 275， 21017-24(2000)測(cè)試了 RAP d3 (殘基216-323)與各種LRP片段結(jié)合的情況。Andersen等 人，Biochemistry 40,15408-17(2001)同樣測(cè)試了 RAP d3變體，將C末端截短形成殘基 219-309，以便能夠與融合到泛素(U-CR56)的LRP片段結(jié)合，并觀察到與U-CR56結(jié)合力顯 著下降。Lee等人Mol Cell 22，423-30 (2006)構(gòu)建了全長(zhǎng)RAP的突變體，在這些突變體中 將每個(gè)保守組氨酸突變?yōu)楸彼?，結(jié)構(gòu)域1中所有組氨酸突變?yōu)楸彼幔Y(jié)構(gòu)域2中所有組 氨酸突變?yōu)楸彼?，結(jié)構(gòu)域3中所有組氨酸突變?yōu)楸彼?。Migliorini等人，J BiolChem 278,17986-92(2003)構(gòu)建了含有在RAP的殘基206-323中隨機(jī)突變的克隆的庫(kù)，并報(bào)道 RAP256位置的賴氨酸突變或270位置的賴氨酸突變后RAP不能夠與LRP結(jié)合。脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)受體家族包括一組細(xì)胞表面和跨膜蛋白，這些蛋白介 導(dǎo)了多種生理現(xiàn)象。所有這些受體與LDLR相似，并具有相似的結(jié)構(gòu)域組成，包括LDL受體 A類結(jié)構(gòu)域組，或補(bǔ)充型重復(fù)序列(CR)，這是保守蛋白序列大家族的部分。這些家族成員的 結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)顯示CR序列采用了典型的折疊，LDL受體樣模塊(蛋白構(gòu)造分級(jí)，SC0P，術(shù)語(yǔ)學(xué))。CR 序列在多種不同類型的蛋白中均被發(fā)現(xiàn)，包括LDLR家族和II型跨膜絲氨酸蛋白酶 (matriptase)家方矣。LRP家族成員的作用機(jī)理包括結(jié)合配體的內(nèi)吞作用和從細(xì)胞外間隙的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) (1)。LRP參與多種細(xì)胞功能，包括但不限于脂蛋白的代謝(2，3)，基質(zhì)蛋白酶和凝結(jié)因子調(diào) 控(4-6)，細(xì)胞命運(yùn)(3，7)的決定，神經(jīng)細(xì)胞遷移引導(dǎo)(3，7)，腫瘤細(xì)胞增殖誘導(dǎo)，鼻病毒結(jié) 合(11，12)，通過神經(jīng)遞質(zhì)的信號(hào)傳導(dǎo)，通過抗原呈遞細(xì)胞的抗原獲取，配體通過血腦屏障 轉(zhuǎn)胞吞(16-19)，腎小球?yàn)V過液中蛋白質(zhì)回收(20)，內(nèi)分泌激素運(yùn)輸(21)，從腦中淀粉 樣蛋白流出(22)，骨沉積激活(23)和內(nèi)皮細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)(24)。LDLR起多種作用的能力部 分源于這些受體能夠結(jié)合的不同組的配體。此受體家族的另一特性就是每一個(gè)LDLR上的 多種和唯一的組織分布模式。II型跨膜絲氨酸蛋白酶家族包括corin和matriptases ST14, matriptase-2和 matriptase-3。Matriptase (MT-SP1、ST14、TADG-15)在多種上皮腫瘤(癌)中過度表達(dá) (25-33)。肝細(xì)胞激活物抑制因子l(HAI-l)引起的反式激活后，matriptase通過直接降解 細(xì)胞外基質(zhì)成分，或通過激活其他蛋白酶(如，尿激酶血漿酶原激活劑(uPA))，致使基質(zhì)降 解(26，34，35)，來促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和代謝。除LDLR和matriptase家族外，還包括多種具有 CR結(jié)構(gòu)域的其他蛋白。一種這樣的蛋白，F(xiàn)DC-8D6抗原(⑶320)，具有一對(duì)這樣的結(jié)構(gòu)域并 在淋巴濾泡中的B細(xì)胞分化中起重要作用(36，37)。含有CR的蛋白在病理生理過程中起重要作用，以及其家族的一些成員獨(dú)特的組 織分布圖形，使得這些蛋白成為有用的藥物靶標(biāo)。蛋白選擇性藥物可直接影響目標(biāo)蛋白的 功能，從而減少蛋白在具體疾病狀態(tài)下的支持效果。或者，所述藥物可利用目標(biāo)蛋白的組織 分布的優(yōu)點(diǎn)有效傳遞其他治療分子至受疾病影響的具體組織。盡管相當(dāng)多的證據(jù)證明了含 CR蛋白在哺乳動(dòng)物生理及病理生理中的重要性，也有一些選擇性作用于LDLR或含CR蛋白 家族具體成員的藥物的實(shí)例。構(gòu)建結(jié)合這些家族具體成員的分子的能力為開發(fā)此類藥物提 供了手段。
例如，W0 2006/138343 (Zankel等人)報(bào)道的數(shù)據(jù)顯示⑶NF與RAP融合(穿過血 腦屏障)后產(chǎn)生綴合物，該綴合物保留了 GDNF 二硫鍵連接的同型二聚體結(jié)構(gòu)。RAP-GDNF綴 合物以與GDNF相同的親和力(Kd)結(jié)合并激活GDNF受體(GFR a-1)，在培養(yǎng)的PC12細(xì)胞中 用RAP-GDNF誘導(dǎo)神經(jīng)突起生長(zhǎng)證明其在體外保留有生物活性。假設(shè)含有CR的蛋白普遍參與整個(gè)哺乳動(dòng)物生理過程，那么就需要保留RAP原始結(jié) 合特性的RAP片段和變體，或具有針對(duì)具體含有CR的蛋白提高的結(jié)合選擇性的RAP片段和 變體，并且顯示出其他期望的特性，如，改善的穩(wěn)定性或易生產(chǎn)和制備的特性。發(fā)明綜述補(bǔ)充型重復(fù)序列(CR)是保守蛋白序列的大家族，其采用特征性折疊。含有CR的 蛋白包括LDL受體家族成員，II型跨膜絲氨酸蛋白酶(matriptase)家族成員和其他蛋白， 如FDC-8D6抗原(⑶320)。受體關(guān)聯(lián)蛋白(RAP)與很多這些含有CR的蛋白以高親和力結(jié) 合。成熟RAP的323氨基酸序列如SEQ ID NO :95所示，成熟RAP結(jié)構(gòu)域3的氨基酸序列 (201-323氨基酸)，長(zhǎng)度為123個(gè)氨基酸，如SEQ ID N0:96闡明。氨基酸243-313如SEQ ID NO 97 闡明。RAP249-303 氨基酸如 SEQ ID NO 98 闡明。本發(fā)明提供了以高親和力與含有CR的蛋白結(jié)合的RAP環(huán)肽(包括類似物或衍生 物)，以及含有該環(huán)肽的綴合物和組合物，以及這些多肽的治療和診斷用途，如，作為這些含 有CR蛋白的抑制劑或增強(qiáng)劑，或診斷劑或治療劑到表達(dá)這些含有CR蛋白的組織的靶向傳 遞。所述RAP環(huán)肽可顯示出預(yù)期的特性，如改善的親和力，提高的對(duì)含CR蛋白的結(jié)合選擇 性，改善的穩(wěn)定性和/或易生產(chǎn)性。本發(fā)明的RAP環(huán)肽基于成熟RAP的氨基酸序列，優(yōu)選結(jié)構(gòu)域3，優(yōu)選少于123個(gè)氨 基酸的長(zhǎng)度，并在兩個(gè)非連續(xù)氨基酸之間包含共價(jià)鍵。在一些實(shí)施方式中，該共價(jià)鍵穩(wěn)定 RAP肽的三維結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方式中，該共價(jià)鍵提供改善的結(jié)合親和力以使RAP環(huán)肽與含 CR的蛋白以約lxl(T8M或更少Kd (更少意味著更好的親和力)的結(jié)合。這種結(jié)合的親和力 可通過本領(lǐng)域任何已知方法測(cè)定，如，放射性免疫測(cè)定，ELISA，基于技術(shù)(如，Biacore)分 析的表面等離子共振(SPR)，或動(dòng)力排斥試驗(yàn)(如，KinExA)。親和力數(shù)據(jù)可進(jìn)行分析，如，通 過Scatchard等人，Ann N. Y. Acad. Sci. ,51 =660(1949)中所述的方法。在示范性實(shí)施方式 中，對(duì)CR蛋白的結(jié)合親和力大約在lxlO-9，10,，10-11，10_12，10_13，10_14M或更少。本發(fā)明提供 不同大小的RAP環(huán)肽，包括長(zhǎng)度約103，約99，約95，約90，約85，約82，約80，約78，約76， 75，74，73，72，71，70，69，68，67，66，65，64，63，62，61，60，59，58，57 或 56 個(gè)氨基酸或更短的 氨基酸。在一些實(shí)施方式中，該共價(jià)鍵在氨基酸之間形成，它們分別為約76，75，74，73，72， 71，70，69，68，67，66，65，64，63，62，61，60，59，58，57 或 56 個(gè)氨基酸。本發(fā)明的RAP環(huán)肽可包含基于成熟的人的RAP序列(SEQ ID NO 95)的氨基酸序 列。在一實(shí)施方式中，RAP環(huán)肽的氨基酸序列至少缺失了成熟RAP N末端200到243個(gè)氨 基酸。因此，RAP 環(huán)肽可缺失成熟 RAP 的 1-200，1-220，1-225，1-230，1-235，1-240，1-241， 1-242，1-243氨基酸，或1-244，1-245，1-246，1-247，或1-248氨基酸。在一相關(guān)實(shí)施方式 中，所述RAP肽的氨基酸序列進(jìn)一步缺失成熟RAP C末端至少4到11個(gè)氨基酸。因此， 所述 RAP 環(huán)肽可缺失成熟 RAP 的 314-323 或 313-323，或者 304-323，305-323，306-323， 307-323，308-323，309-323，310-323，311-323，或 312-323 氨基酸。在另一實(shí)施方式中，所 述RAP肽氨基酸序列含有成熟RAP的一段連續(xù)部分，該RAP (a)至少有71氨基酸長(zhǎng)度，以及(b)包含氨基酸256-270。在一相關(guān)實(shí)施方式中，所述RAP肽氨基酸序列含有成熟RAP 結(jié)構(gòu)域3的一段連續(xù)部分，該RAP結(jié)構(gòu)域3 (a)至少有71氨基酸長(zhǎng)度，以及(b)包含氨基 酸256-270。RAP示范性部分可形成RAP環(huán)肽的基礎(chǔ)，其包括成熟RAP (SEQ ID NO 95)的氨 基酸 200-323，221-323，200-319，221-319，243-319，244-319，249-319，200-313，221-313， 243-313，244-313，249-313，200-303，221-303，243-303，244-303，246-311，246-313 或 249-303。如此處描述，可制備RAP環(huán)肽，其顯示出對(duì)含CR蛋白的親和力和選擇性與天 然的RAP相似(如，與天然RAP約5倍或者更少不同)。也可制備RAP環(huán)肽，其與天然 RAP相比，顯示對(duì)一個(gè)或多個(gè)含CR蛋白的改善的親和力和/或變化的選擇性。在一實(shí) 施方式中，所述RAP環(huán)肽顯示對(duì)含CR的蛋白至少1.5-倍，2-倍，2. 5-倍，3-倍，4-倍， 5-倍，7-倍，10-倍或20-倍提高的親和力(相對(duì)于天然RAP)和/或改善的結(jié)合選擇性， 所述含CR 的蛋白選自:LDLR(P01130), LRP1 (P98157)，LRP1B (Q9NZR2)，LRP2 (P98164)， LRP3 (075074)，LRP4 (075096)，LRP5 (075197)，LRP6 (075581)，LRP8 (Q14114)，選蛋白-相關(guān) 受體，SorLA(Q92673)，LRP10 (Q7Z4F1)，LRP11 (Q86VZ4)，LRP12 (Q9Y561)，F(xiàn)DC-8D6 (CD320)， VLDLR(P98155)，TADG-15 (ST14, Q8WVC1)，TMPS3 (P57727)，TMPS4 (Q9NRS4)，TMPS6 (Q8IU80)， Q61CC2，Q6PJ72,Q76B61，Q7RTY8，Q7Z7K9，Q86YD5，Q8NAN7，Q8NBJ0，Q8WW88，Q96NT6，Q9BYE1， Q9BYE2，Q9NPF0和corin(Q8IZR7)。這一結(jié)合選擇性是可估算的，如，通過所述肽對(duì)具體含 CR蛋白的結(jié)合親和力與所述肽對(duì)至少一種其他含CR蛋白的結(jié)合親和力的比率。所述肽可 顯示出相對(duì)于1，2，3，4，5，6，7或8個(gè)其他含CR蛋白的對(duì)含CR蛋白的結(jié)合親和力。本發(fā)明的RAP環(huán)肽可由天然的RAP序列構(gòu)成或包含這些天然序列的突變體。在 示范性實(shí)施方式中，本發(fā)明的RAP環(huán)肽包含與SEQ ID N0:97或SEQ ID N0:98至少60%， 65%，70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%相 同的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述RAP環(huán)肽少于約85個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，包含50個(gè) 連續(xù)的氨基酸，這些氨基酸與SEQ ID N0:98至少70%相同，并以約1x10-8M或更少的結(jié)合親 和力Kd與含CR蛋白相結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RAP環(huán)肽包含選自成熟RAP氨基酸 200-319，300-319或247-257中區(qū)域內(nèi)任何一個(gè)的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)或更多位 置的突變。在示范的實(shí)施方式中，所述RAP環(huán)肽包含選自成熟RAP (SEQ ID NO 95)氨基酸 175，205，213，217，226，230，232，239，241，242，246，247，249，250，251，256，257，261，266， 267，268，270，273，279，280，287，290，294，296，297，298，305，308，311，312，313，314 或 315 的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)或更多位置的突變。在其他實(shí)施方式中，所述RAP環(huán)肽包 含在 205，217，249，251，256，257，266，270，294，296，297，305 位置中的三個(gè)或更多的突變。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述RAP環(huán)肽包含成熟RAP的251，256和270位置的至少一個(gè)突變。在一方面，所述RAP環(huán)肽選擇性結(jié)合matriptase蛋白。可以預(yù)見的是matriptase 特異性的肽可含有成熟RAP(SEQ ID NO 95)的氨基酸243-313或249-303，并且進(jìn)一步含 有成熟RAP在位置251，256，257，266，270或280中的任意一位置的突變。進(jìn)一步可以預(yù)見 matriptase特異性的RAP肽含有成熟RAP在位置251，256，257，266，270和/或280中至少 1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或6個(gè)突變。在另一方面，所述RAP環(huán)肽選擇性結(jié)合VLDLR蛋白?？梢灶A(yù)見的是VLDLR特異性 肽可包含成熟RAP (SEQ ID NO :95)的氨基酸243-313或249-303，并進(jìn)一步包含在RAP的位置251，256，270或296中的任何一位置的突變。進(jìn)一步可以預(yù)見，VLDLR特異的RAP肽 含有在成熟RAP的位置251，256，270和/或296中至少一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)，或四個(gè)突變。在更進(jìn)一步方面，所述RAP環(huán)肽選擇性結(jié)合FDC_8D6(⑶320)蛋白?？梢灶A(yù)見， FDC-8D6特異性肽可含有成熟RAP(SEQ ID NO 95)的氨基酸243-313或249-303，和進(jìn)一步 含有在RAP的位置251，256，270，279或305中任一位置的突變。進(jìn)一步可預(yù)見，F(xiàn)DC-8D6特 異性肽含有在成熟RAP的位置251，256，270，279和/或305中至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè) 或五個(gè)突變。任何前述突變可包括用堿性氨基酸(K，R)置換酸性氨基酸(D，E)，或者相反置換。 任何前述突變也可包括用組(F，Y，W，H)置換選自組(A，C，D，E，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T， V)的氨基酸。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，與成熟RAP (SEQ ID NO: 95)相比，所述RAP環(huán)肽包括下 述突變的三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或更多的突變V175L，R205S, S213T，E217K，L226M，H249Y， E230V, S232P, E239G, E246G, E251L, E251K, E251T, E251G, E251P, E251N, E251R, K256R, K256V, K256A, K256I, K256P, K256L, I266F, I266T, K257Y, Q261R, A267V, H268R, K270P, K270D, K270N, K270G, K270E, K270W, L271M, H273Y, D279Y, V283M, R287H, H290Y, H290L, E294V, R296L, T297I, K298R, K305T, K306M, S312F, G313D, E246C, L247G, G280A, L311A, S312C, Q309C, F250C, L308G, L311G, E241C 和 I315C。在前述任何一個(gè)實(shí)施方式中，所述RAP肽可含有所述肽的N末端或靠近其N末端 的半胱氨酸和所述肽的C末端或靠近C末端的半胱氨酸，通過兩個(gè)半胱氨酸之間的二硫鍵 形成使所述肽環(huán)化并穩(wěn)定a螺旋。任選地，甘氨酸或脯氨酸可插入半胱氨酸和a螺旋之 間(如，N末端Cys-Gly和C末端Gly-Cys)。甘氨酸的引入使a螺旋中斷，形成鄰近的非 天然的內(nèi)部螺旋的二硫鍵。本發(fā)明也涵蓋了至少2、3、4、5或6個(gè)本發(fā)明的RAP環(huán)肽的寡聚體組合或陣列。這 些陣列可是同樣RAP環(huán)肽的重復(fù)陣列或不同RAP環(huán)肽的陣列。多種組合可以是鄰近的或者 被肽連接子(如，1，2，3，4或5個(gè)氨基酸長(zhǎng)度)分開，其展示每一個(gè)RAP環(huán)肽的三維機(jī)構(gòu)，使 得這些結(jié)構(gòu)域能夠與相同的含CR的蛋白的不同CR對(duì)結(jié)合，或與不同的含CR的蛋白的CR
對(duì)結(jié)合。在另一方面，本發(fā)明提供包含RAP環(huán)肽(或RAP環(huán)肽陣列)與診斷或治療劑綴合 的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽和診斷或治療劑通過連接子連接。在進(jìn)一步的實(shí) 施方式中，所述的連接子是肽連接子。在另一實(shí)施方式中，含有本發(fā)明多肽的綴合物為體內(nèi) 轉(zhuǎn)胞吞。在示范實(shí)施方式中，連接本發(fā)明多肽的治療劑選自膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (⑶NF)、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、或者本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他神經(jīng) 生長(zhǎng)因子、解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域10 [人]ADAM10、或其他作用于APP或Abeta的蛋 白酶、MESD( —種將受體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面所需的LRP5/6伴侶蛋白)、癌癥化療制劑、蛋白酶 抑制劑、促凋亡分子、自身免疫劑、溶酶體酶。在一相關(guān)實(shí)施方式中，含有所述RAP環(huán)肽(或 RAP環(huán)肽陣列)的綴合物與一活化劑綴合。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述活化劑是化療劑。在 更進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述化療劑是放射性同位素。在又一方面，本發(fā)明預(yù)期遞送診斷或治療劑到個(gè)體具體組織的方法，其主要通過 給所述個(gè)體施用含有所述試劑和本發(fā)明的RAP環(huán)肽(或其陣列)的綴合物。在一實(shí)施方 式中，與RAP環(huán)肽綴合的診斷或治療劑通過轉(zhuǎn)胞吞跨過上皮或內(nèi)皮屏障，遞送到具體組織。在一實(shí)方式中，所述試劑被遞送穿過血腦屏障。在一相關(guān)實(shí)施方式中，所述個(gè)體患有神經(jīng) 疾病，其包括但不限于，阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化、肌萎縮側(cè)索硬化、其他脫髓 鞘疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、創(chuàng)傷性腦損傷、脊髓損傷、中風(fēng)或腦缺血、斑樣硬化、腦脈管炎、 癲癇癥、亨廷頓病、圖雷特綜合征、吉-巴綜合征、威爾遜病、皮克病、神經(jīng)炎性疾病、腦炎、 腦脊髓炎或病毒性、真菌或細(xì)菌性腦膜炎或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、朊蛋白(prion)疾病、 小腦共濟(jì)失調(diào)、小腦變性、脊髓小腦變性綜合征、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)、毛細(xì)血管擴(kuò)張性共 濟(jì)失調(diào)、脊髓肌萎縮、進(jìn)行性核上麻痹、肌張力異常、肌肉強(qiáng)直、震顫、視網(wǎng)膜色素變性、老年 癡呆、皮層下癡呆、動(dòng)脈硬化癡呆、AIDS關(guān)聯(lián)癡呆或其他癡呆、紋狀體黑質(zhì)變性、線粒體腦 肌病、神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的溶酶體貯積紊亂、腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、尿 素循環(huán)缺陷疾病、肝性腦病、腎性腦病、代謝性腦病、嚇啉病、神經(jīng)毒性物質(zhì)中毒、放射誘導(dǎo) 的腦損傷、或精神疾病，如，精神異常、焦慮、抑郁、注意力分散、記憶障礙、認(rèn)知障礙、食欲障 礙、肥胖、成癮、傾向或藥物依賴。本發(fā)明進(jìn)一步提供遞送治療蛋白到個(gè)體特異組織中的細(xì) 胞溶酶體間隔的方法，其包括使所述細(xì)胞接觸有效量的含有與本發(fā)明RAP環(huán)肽綴合的所述 治療蛋白的綴合物。在一實(shí)施方式中，所述個(gè)體患有溶酶貯積癥(LSD)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明預(yù)期治療癌癥或轉(zhuǎn)移性腫瘤的方法，或與含CR的蛋白 聯(lián)合降低致瘤或轉(zhuǎn)移影響的方法。這些方法包括給予個(gè)體與含有CR的致瘤蛋白的RAP環(huán) 肽(或其陣列)選擇性結(jié)合，或給予含有與所述RAP環(huán)肽(或其陣列)綴合的癌癥治療 劑的綴合物。這些含CR的致瘤蛋白包括但不限于LRP5、LRP6、任何一個(gè)matriptases或 FDC-8D6抗原。本發(fā)明的RAP環(huán)肽可通過與含CR的靶蛋白結(jié)合直接干擾其功能，從而減少 致瘤效果，如，通過阻斷結(jié)合或活化位點(diǎn)。或者，包含與癌癥治療劑綴合的本發(fā)明的RAP環(huán) 肽的綴合物，可通過抗腫瘤藥藥物用于過量表達(dá)這些含CR蛋白的靶組織。例如，過量表達(dá) matriptase的組織包括癌組織，如，卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或胃 癌。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明預(yù)期遞送治療劑到達(dá)肝臟以治療肝臟疾病(包括肝炎 或肝癌)的方法。這些方法包括給個(gè)體施用綴合物，該綴合物含有與RAP環(huán)肽(或其陣列) 綴合的治療劑，該RAP環(huán)肽保持了天然RAP結(jié)合特性或?qū)RP1以甚至更高的親和力選擇性 結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括遞送化療/細(xì)胞毒性試劑到肝臟以治療肝癌或 其他肝臟疾病。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明預(yù)期治療骨質(zhì)疏松或其他伴有造骨細(xì)胞活性減少和/ 或破骨細(xì)胞活性增加的疾病，該方法包括施用RAP環(huán)肽或含有與RAP環(huán)肽綴合的活化劑的 綴合物，其特異性的結(jié)合到LRP5，因此抑制抗造骨細(xì)胞分化和骨沉積的因子，并促進(jìn)破骨細(xì) 胞活性。這種治療方法預(yù)期用于增加成骨細(xì)胞和/或減少破骨的活性，從而進(jìn)一步減少骨 的流失或增強(qiáng)骨的強(qiáng)度。在一相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含一種含有與診斷 劑或治療劑綴合的RAP環(huán)肽的綴合物，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在另一不同方面，本發(fā)明提供一種與可檢測(cè)的部分或標(biāo)記綴合的RAP環(huán)肽。所述 RAP環(huán)肽具有對(duì)特殊的含CR蛋白的結(jié)合選擇性，RAP環(huán)肽可用于檢測(cè)此類含CR蛋白的存 在。它同樣可用于檢測(cè)含CR蛋白的表達(dá)模式，包括如，與致瘤相關(guān)的過量表達(dá)。本發(fā)明進(jìn) 一步提供使用該RAP環(huán)肽來診斷含CR蛋白過量表達(dá)或表達(dá)不足相關(guān)的疾病。
在其他方面，本發(fā)明介紹一種制備RAP肽的方法，通過合成或重組方式，這一方式 可自然環(huán)化或能夠通過共價(jià)連接進(jìn)一步化學(xué)修飾而環(huán)化。本發(fā)明提供編碼任意一種上述 RAP環(huán)肽的核酸、含有該核酸的載體、含有上述核酸或載體的宿主細(xì)胞，以及制備該多肽的 方法，該方法包括在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以及從所述宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中分 離該肽。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢(shì)將在以下詳細(xì)描述中顯示出來。然而應(yīng)該理解，因?yàn)橥?過詳細(xì)的描述，在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的不同的變型和改型對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯 而易見的，盡管本發(fā)明僅僅通過示例的方式描述了詳細(xì)的說明書和具體實(shí)施例，以及本發(fā) 明優(yōu)選實(shí)施例。


圖1是對(duì)補(bǔ)充型重復(fù)序列的代表性說明，其基于低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1的 第七個(gè)重復(fù)序列的序列(LRP1 CR7，PDB 1J8E)，如Simonovic等人(43)所測(cè)定的，該圖顯 示了標(biāo)記為A，B, C，D位置形成的鈣結(jié)合環(huán)的表面，球形代表鈣。圖2顯示了為結(jié)合分析所選的CR序列對(duì)比以及RAP突變體或CR抗體選擇。在左 側(cè)用括號(hào)標(biāo)出具體序列對(duì)和三聯(lián)體。。篩選底物(LRP2 CR89)用紅色(較淺的顏色)括號(hào) 指示。對(duì)比中的AxcBxCxD基序(motif)以每一個(gè)CR序列加下劃線的位置A和C來表示。 每一對(duì)CR的A、C、A’和C’氨基酸串聯(lián)文字串在右側(cè)指示。帶底紋的氨基酸與對(duì)比位置中 突出的氨基酸相同；粗體的氨基酸與對(duì)比位置中突出的氨基酸同源。序列對(duì)比Clustal ff 格式(44)并用B0XSHADE來形成。圖3顯示了 CR蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析。在有2mM DTT或缺少2mM DTT的SDS 上樣緩沖液中純化的再折疊蛋白變性。如方法中所述，處理后的樣品溶解在12% NuPAGE Bis-Tris凝膠中。膠用考馬斯亮藍(lán)染色。每一對(duì)泳道在底部用相關(guān)檢測(cè)的CR蛋白標(biāo)注， 并標(biāo)注了分子量標(biāo)記的大小。已經(jīng)顯示了典型的結(jié)果?？s寫L1是LRP1 ;L2是LRP2 ;L6 是 LRP6 ；M 是 MAT (matriptase, ST14) ；V 是 VLDLR ；YVWR = LRP2 CR89 ；YVWD = LRP2 CR89 R1088D ；YDWR = LRP2 CR89 V1047D ；YDWD = LRP2 CR89 V1047D R1088D ；WVWR = LRP2 CR89 Y1042W ；WDWR = LRP2 CR89 Y1042W V1047D ；WVWD = LRP2 CR89 Y1042W R1088D ；WDWD = LRP2 CR89 Y1042W V1047D R1088D。圖4顯示了用制備的100-1. 25nM稀釋系列的RAP3與經(jīng)選擇的CR蛋白的結(jié)合。圖 5A-B 顯示 RAP d3、MegaRAPl d3 (RAPv2A d3)和中間序列的變體與 LRP2 CR89 和LRP1 CR3-5的結(jié)合。圖5A顯示了 RAP d3突變體和RAPv2A d3回復(fù)體與LRP2 CR89的結(jié) 合情況。圖5B顯示了 RAP d3突變體和RAPv2A d3回復(fù)體與LRP1 CR3-5的結(jié)合情況。對(duì) 數(shù)據(jù)作圖并使之適應(yīng)在假設(shè)的單個(gè)結(jié)合點(diǎn)呈非線性回歸GraphPad Prism)。Kd值和標(biāo)準(zhǔn)差 通過回歸分析得出。表2 顯示了 RAP d3 和 RAP v2 (RAP v2A)變體與 LRP1 CR3-5 和 LRP2 CR89 的結(jié)合 情況。NF顯示出結(jié)合不能測(cè)定或者說所述數(shù)據(jù)用通過假設(shè)單個(gè)結(jié)合點(diǎn)形成的非線性回歸并 不能可靠地適合。最大的結(jié)合百分比是每一個(gè)配體的最高測(cè)試濃度的0D值和在此濃度下 測(cè)得的所有這些配體的最高0D的比值。圖6顯示了 MegaRAPl d3和RAP d3與LRP2 CR89變體的結(jié)合情況。圖中所用到的縮寫LRP2 CR89 Y1042ff(WVWR) ,LRP2 CR89V1047D (YDWR), LRP2 CR89 R1088D (YVWD), LRP2 CR89 V1047DR1088D(YDWD), LRP2 CR89 Y1042W V1047D R1088D(WDWD), LRP2CR89 Y1042W V1047D(WDWR), LRP2 CR89 Y1042W R1088D(WVWD) 表3顯示了 RAP d3和RAPv2A d3與LRP2 CR89變體結(jié)合的情況。NF顯示出結(jié)合 不能測(cè)定或者說該數(shù)據(jù)用通過假設(shè)單個(gè)結(jié)合點(diǎn)形成的非線性回歸并不可靠地適合。最大的 結(jié)合百分比是每一個(gè)配體的最高測(cè)試濃度的0D值和在此濃度下所有這些配體的最高0D的 比值。表4顯示了在不同的CR對(duì)中，通過篩選突變噬菌體庫(kù)分離的RAP d3變體序列。 只顯示了可變的位置。氨基酸編號(hào)對(duì)應(yīng)成熟RAP。變體名字(d3)，用于親和力選擇的CR對(duì) (CR)，變體與靶CR對(duì)(當(dāng)測(cè)定時(shí))間的表現(xiàn)解離常數(shù)(Kd)和可變位置氨基酸的同一性均 顯示在表4。圖 7 顯示了 RAP d3 變體與 CR 對(duì)結(jié)合的情況。RAP d3, MegaRAPl d3, VRAP2 d3, MatRAPl d3 和 MatRAP2 d3 分別與 LRP1 CR3-5，LRP6 CR12, LRP6 CR23, LRP6 CR1-3，LRP2 CR89，LRP2 CR2728，LRP2 CR3031，LRP2 CR3435，LRP2 CR34-36,VLDLR CR78,VLDLR CR6-8， MAT CR12,MAT CR23和MAT CR34在80nM濃度下孵育。重復(fù)檢測(cè)兩次樣品，將數(shù)值疊加。然 后計(jì)算出平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。沒有配體孔的空白值用來校正吸光值。任何情況下的方差系數(shù) 沒有超過20% (平均為6%)并在此沒有顯示。圖8顯示了在此分離的RAP d3變體的全部氨基酸序列。圖9顯示了 MatRAPl變體N末端和C末端截短后在結(jié)合親和力上的陽(yáng)性效應(yīng)。用 所述全長(zhǎng)變體的制備方法制備截短變體。圖10顯示了 320RAP1和對(duì)應(yīng)截短變體與FDC-8D6抗原來源的靶CR的結(jié)合情況。圖11A和圖11B分別顯示了 RAP肽與rhLRPl簇2以及與rmVLDLR胞外結(jié)構(gòu)域的
相對(duì)結(jié)合情況。圖12顯示了毒素綴合的mRAPc對(duì)在表達(dá)LRP的CH0細(xì)胞和LRP缺失的CH0細(xì)胞 的細(xì)胞生存力的影響。圖13A、13B和13C顯示了 RAP環(huán)肽，Ifeptide與不同細(xì)胞毒性試劑綴合后的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖14A、14B和14C顯示了通過與鏈霉抗生物素綴合的mRAPc肽和mRAP抑制RAP 和uPA-PAI-1與LRP1受體結(jié)合的情況。圖15顯示了動(dòng)物靜脈給予RAP環(huán)肽后的生物分布情況。發(fā)明詳述RAP是功能性雙配位基，具有與LDLR內(nèi)的補(bǔ)充性重復(fù)序列的具體串聯(lián)對(duì)以低納摩 爾親和力結(jié)合的第一和第三結(jié)構(gòu)域(dl和d3)。結(jié)構(gòu)域3由約110個(gè)氨基酸組成，與相關(guān)的 CR對(duì)顯示出最高的親和力。為了使免疫原性最小化，使生產(chǎn)效果最大化，同時(shí)改進(jìn)性能，最 小化RAP至那些直接參與受體結(jié)合的序列是有用的。然而，d3的穩(wěn)定折疊顯示出需要RAP 內(nèi)不直接參與形成受體接觸表面的序列。因此，這些發(fā)現(xiàn)在d3的N末端和d2的C末端的 額外序列對(duì)保證穩(wěn)定的折疊和受體結(jié)合的高親和力是必需的。分離的d3并不像上下文中 的全長(zhǎng)RAP的d3—樣與受體緊密結(jié)合。d3的截短形式缺少穩(wěn)定折疊的序列，其同樣與受體 的結(jié)合很低。來自RAP d3和LDLRCR34復(fù)合體的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)揭示RAP d3受體結(jié)合序列被發(fā)
12現(xiàn)位于通過可變形環(huán)連接的大約相同長(zhǎng)度的兩個(gè)反向平行的a螺旋之間。這一對(duì)雙螺旋 集合有著顯著的逆時(shí)針扭轉(zhuǎn)和類似于延伸的扭轉(zhuǎn)“U”。本發(fā)明提供RAPd3的基本上截短形式，該RAPd3通過一個(gè)分子內(nèi)共價(jià)鍵來穩(wěn)定， 如，二硫鍵。沒有分子內(nèi)共價(jià)鍵的截短的非環(huán)化形式對(duì)LRP1的結(jié)合親和力下降。相反，環(huán) RAP肽則與那些全長(zhǎng)的RAPd3相比具有改良的受體結(jié)合親和力。通過一個(gè)非天然的共價(jià)鍵 而不是天然RAP內(nèi)的大的肽區(qū)域來穩(wěn)定RAP d3片段內(nèi)的三維螺旋結(jié)構(gòu)的能力，提供了改善 的親和力并由此產(chǎn)生很多優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明能夠快速生產(chǎn)小分子RAP肽，如，通過固體肽合成， 無需重組生物體，能夠盡可能地減少免疫原性，并更易于與活化劑綴合?；诎惺荏w兩個(gè)一般特性，本發(fā)明的環(huán)RAP肽具有潛在的藥學(xué)應(yīng)用首先，一些受 體在疾病狀態(tài)的穩(wěn)定和發(fā)展中起作用。因此，與這些受體選擇性結(jié)合的藥劑可用于改變這 些受體所支持的活動(dòng)和病理效應(yīng)。第二，一些受體具有獨(dú)特的組織分布。因此，選擇性結(jié)合 這些受體的藥劑可用于選擇性運(yùn)載其他藥物到靶受體突出表達(dá)的那些組織。本發(fā)明也涵蓋 了本發(fā)明所述的組合物在預(yù)防、處理和治療疾病中的用途，其包括但不限于細(xì)胞增殖性疾 病，如，腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、激素異常性疾病、退行性疾病、老化病、中樞神 經(jīng)系統(tǒng)疾病(如，阿爾茨海默病、癲癇癥、高血脂)、精神疾病或病變(如，精神分裂癥、情緒 紊亂如，抑郁和焦慮)、傳染性疾病、自身免疫疾病、酶缺乏疾病、如之前所述的那些溶酶體 貯積癥等等。LDLR家族成員在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞類型包括神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的毛細(xì)血管 內(nèi)皮表達(dá)較多(如，LDL受體、巨蛋白、LRP1)。LDL受體家族內(nèi)吞結(jié)合的配體，并證明在腎、 甲狀腺跨極化的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)胞吞配體，以及在腦的跨毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)胞吞配體。所以， LDLR含有一個(gè)在組成和功能相關(guān)的受體池，該受體在不同組織以不同水平表達(dá)。例子包 括VLDLR在肌肉組織上的表達(dá)，LRP1B在神經(jīng)組織上的表達(dá)，巨蛋白在腎臟和神經(jīng)組織的表 達(dá)，以及LRP1在肝臟和血管平滑肌組織的表達(dá)。本發(fā)明的RAP環(huán)肽可用于靶向這些受體的 任何一個(gè)，也可用于靶向所述的表達(dá)其他含CR蛋白的組織。在更全面的實(shí)施方式中，本發(fā)明的受體選擇性的RAP環(huán)肽，以單獨(dú)、陣列或與治療 劑綴合的方式，構(gòu)建了一種特定性調(diào)節(jié)含CR蛋白質(zhì)的方法(活化或抑制)。至少有四種影 響調(diào)節(jié)的機(jī)制通過RAP環(huán)肽與配體結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性阻斷配體結(jié)合；通過RAP環(huán) 肽誘導(dǎo)配體結(jié)合位點(diǎn)變構(gòu)變化來非競(jìng)爭(zhēng)性阻斷配體結(jié)合；通過RAP環(huán)肽結(jié)合誘導(dǎo)相同或不 同受體間交聯(lián)，來清除細(xì)胞表面的受體或其他含CR的蛋白；或者選擇性的遞送結(jié)合了經(jīng)選 擇的RAP環(huán)肽的活化劑到組織(如，蛋白酶、蛋白酶抑制劑、其他酶、放射性同位素、促凋亡 劑、毒素、治療性分子(藥物)、其他受體結(jié)合部分等等)。A 定義除非另有定義，本發(fā)明所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員通常理解相同的意義。以下參考給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本發(fā)明所用的很多術(shù)語(yǔ)的通常 定義Jingleton，等人，微生物學(xué)和分子生物學(xué)字典(1994年第二版)，劍橋科技字典(1988 年 Walker 編輯)，遺傳學(xué)術(shù)語(yǔ)表 R. Rieger 等人(編輯),Springer Verlag (1991), Hale 和 Marham, THEHARPER COLLINS 生物字典(1991)。每一出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他本文引用的參考文獻(xiàn)均以參考方式將其全文 并入本申請(qǐng)，其并入的程度與本發(fā)明的公開一致。
應(yīng)當(dāng)注意的是本說明書以及附加的權(quán)利要求書中使用的“一”、“一個(gè)”和“所述”包
括其復(fù)數(shù)意義，除非上下文中有明確規(guī)定。本申請(qǐng)所使用的如下術(shù)語(yǔ)具有歸屬于它們的意義，除非另外詳細(xì)說明。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)“RAP環(huán)肽”表示少于100氨基酸長(zhǎng)度，與SEQ IDN0 :98(氨 基酸249-303)至少80%，85%，90%，95%，97%，98%，99%或更多相同或相似的多肽，并 且含有在兩個(gè)非連續(xù)氨基酸之間形成的共價(jià)鍵。在示范的實(shí)施方式中，所述共價(jià)鍵是兩個(gè) 半胱氨酸間形成的二硫鍵。"RAP綴合物”或“綴合物”指含有附著在活化劑上的本發(fā)明RAP環(huán)肽的化合物。正 如本發(fā)明所使用的，所述術(shù)語(yǔ)“綴合物”意指治療劑和RAP環(huán)肽以通過如共價(jià)化學(xué)鍵的物理 作用(如范德華力或氫相互作用、包囊作用、包埋或其結(jié)合)物理連接起來。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“突變”指肽序列中的氨基酸插入、刪除或替代。相對(duì)于天然或 野生型氨基酸序列具有一個(gè)或多個(gè)突變的肽被認(rèn)為是類似物。術(shù)語(yǔ)“衍生物”指經(jīng)共價(jià)修飾的肽，如，通過與治療性或診斷性制劑綴合、結(jié)合標(biāo) 記物(如，使用放射性核素或各種酶)、共價(jià)聚合物連接如，乙二醇化(由聚乙二醇衍化而 來)，以及通過用化學(xué)合成的非天然氨基酸插入或替代的方式。本發(fā)明的衍生物將保留本發(fā) 明非衍生化的分子的結(jié)合特性。用癌癥靶向抗體與細(xì)胞毒性試劑綴合(如，放射性同位素 (如，1131、1125、Y90和Rel86)，化療劑，或毒素)可提高對(duì)癌癥細(xì)胞的破壞性?！把a(bǔ)充重復(fù)序列”或“CR”，也稱為低密度脂蛋白受體A類結(jié)構(gòu)域(LDL-A，Pfam)，除 了其他特性外，其是由六個(gè)半胱氨酸和一簇酸性氨基酸來定義的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域家族的成員 之一。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，很多補(bǔ)充重復(fù)序列折疊成一個(gè)確定的結(jié)構(gòu)，術(shù)語(yǔ)稱LDL受體樣單元(蛋白 結(jié)構(gòu)分類，SCOP)。CR結(jié)構(gòu)域構(gòu)成很多受體的配體結(jié)合決定簇，包括那些屬于LDLR的受體。 每一個(gè)CR的氨基酸線形序列具有基序AxcBxCxD，其中c是保守的半胱氨酸，x是任何一個(gè) 氨基酸，B和D是天冬氨酸、谷氨酸或天冬酰胺，業(yè)已證明其參與鈣的結(jié)合和配體的結(jié)合。具 體CR結(jié)構(gòu)域的直接鄰近對(duì)已顯示與RAP結(jié)合。業(yè)已證明在結(jié)合RAP的CR對(duì)的兩個(gè)CR結(jié) 構(gòu)域上的位置A和C的氨基酸(A、C、A’和C’ )參與RAP結(jié)合。“含有CR的蛋白”是指含有一個(gè)或多個(gè)CR的蛋白。含CR蛋白的非限制性例 子包括LDLR(P01130)，LRP1(P98157), LRP1B (Q9NZR2)，LRP2 (P98164)，LRP3 (075074)， LRP4 (075096)，LRP5 (075197)，LRP6 (075581)，LRP8(Q14114)，選蛋白相關(guān)受體， SorLA(Q92673)， LRP10(Q7Z4F1)， LRP11(Q86VZ4), LRP12(Q9Y561)， FDC-8D6(CD320)， VLDLR(P98155), TADG-15(ST14/matriptase/MT-SPl，Q8WVC1), TMPS3 (P57727)， TMPS4(Q9NRS4)，TMPS6(Q8IU80)，Q6ICC2,Q6PJ72,Q76B61,Q7RTY8,Q7Z7K9,Q86YD5,Q8NAN7, Q8NBJ0, Q8WW88, Q96NT6, Q9BYE1, Q9BYE2, Q9NPF0 和 corin (Q8IZR7)。Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)提供 有關(guān)這些蛋白的每一個(gè)的索引編碼。結(jié)合親和力Kd通過本領(lǐng)域已知方法測(cè)定。“選擇性""結(jié)合選擇性""選擇性結(jié)合”指配體與不同受體間不同的親和力。如果配 體結(jié)合受體的親和力比其他受體高至少3倍，那么配體對(duì)該具體受體是有選擇性的。例如， RAP以幾乎相同的親和力與LRP1，LRP1B, LRP2, SorLA, apoER2和VLDLR結(jié)合，因此，RAP對(duì) 這些受體之一相對(duì)于另一個(gè)沒有選擇型。然而，RAP牢固地結(jié)合LRP1，LRP1B，LRP2，SorLA, apoER2和VLDLR，其解離常數(shù)少于5nM，其與LDLR，LRP5和LRP6結(jié)合較弱，其親和力至少低于 LRP1 的 10 倍。因此，相對(duì)于 LDLR，LRP5 和 LRP6，RAP 對(duì) LRP1，LRP1B，LRP2, SorLA, apoER2 和VLDLR有選擇性。HRV2殼蛋白與VLDLR牢固地結(jié)合，但卻不結(jié)合其他LDLR。因此，相對(duì) 于其他LDLR，HRV2殼蛋白對(duì)VLDLR優(yōu)先選擇，表現(xiàn)出其結(jié)合的選擇性。顫蛋白與apoER2和 VLDLR結(jié)合，但不結(jié)合其他LDLR。因此，相對(duì)于其他LDLR，顫蛋白對(duì)apoER2和VLDLR有選擇 性。本發(fā)明所用的“增加的相對(duì)遞送”指一種效應(yīng)，通過這種效應(yīng)，相對(duì)于非綴合的活 化劑的聚集，含有與本發(fā)明的RAP環(huán)肽結(jié)合的活化劑的綴合物在期望遞送部位(如，腦，或 表達(dá)含CR的蛋白的組織)的聚集增加。?！熬幋a”指多核苷酸中核苷酸具體序列的固有特性，這些多核苷酸如，作為合成生 物學(xué)過程中其他聚合物和大分子的模版的基因、cDNA或mRNA，這些聚合物和大分子具有確 定的核苷酸序列(即，rRNA，tRNA和mRNA)，或確定的氨基酸序列以及由此獲得的生物學(xué)特 性。因此，在細(xì)胞或其他生物系統(tǒng)中，如果通過基因產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯生成蛋白，那么 這個(gè)基因就編碼蛋白質(zhì)。一個(gè)基因或cDNA的編碼鏈(與mRNA序列相同的核苷酸序列并 通常在序列表中提供)和用于轉(zhuǎn)錄模板的非編碼鏈均可指編碼蛋白或其他產(chǎn)物的基因或 cDNA。除非另有指定，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有彼此簡(jiǎn)并形式的核苷酸序 列和編碼同一氨基酸序列的核苷酸序列。編碼蛋白和RNA的核苷酸序列可包括內(nèi)含子?！爸亟M多核苷酸”指含有非天然結(jié)合在一起的序列的多核苷酸。含有所述重組多核 苷酸的宿主細(xì)胞被稱為重組宿主細(xì)胞”?；蛟谒鲋亟M宿主細(xì)胞中的表達(dá)形成，如，“重組 多肽”?！氨磉_(dá)調(diào)控序列”指在調(diào)節(jié)與其可操控性連接的核苷酸序列表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和/或翻 譯)的多核苷酸中的核苷酸序列。“可操控連接”是指兩部分之間的功能關(guān)系，所述兩部分 中的一部分活性(如，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力)導(dǎo)致其他部分的作用(如，序列轉(zhuǎn)錄)。表達(dá)調(diào)控 序列可包括但不限于，如啟動(dòng)子(例，可誘導(dǎo)的或可構(gòu)建的)、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、起始密 碼子(S卩，ATG)，內(nèi)含子剪接信號(hào)以及終止密碼子的序列?！氨磉_(dá)載體”指含有重組核苷酸的載體，該重組核苷酸含有操控性連接待表達(dá)核苷 酸序列的表達(dá)調(diào)控序列。表達(dá)載體包含足夠的表達(dá)順式作用元件；其他表達(dá)元件可由宿主 細(xì)胞提供或由體外表達(dá)系統(tǒng)來提供。表達(dá)載體包括本領(lǐng)域已知的所有表達(dá)載體，如，黏粒， 質(zhì)粒(如，無修飾的或包含在脂質(zhì)體里的)以及整合重組多核苷酸的病毒。“放大”指通過其復(fù)制多核苷酸序列并擴(kuò)展到大量多核苷酸分子的任何手段，如 通過逆轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈反應(yīng)以及連接酶鏈反應(yīng)。上下文核酸雜交試驗(yàn)中“嚴(yán)格雜交”和“嚴(yán)格雜交洗滌條件”是序列依賴性的，并且 在不同環(huán)境參數(shù)下不同。在TijSSen(1993)生化和分子生物學(xué)-核酸探針雜交中的實(shí)驗(yàn)室 技術(shù)的第一部分第二章中對(duì)核苷酸雜交有深入的分析(“雜交原則匯總和核酸探針試驗(yàn)策 略”，Elsevier，紐約)。通常，高度嚴(yán)格雜交和洗滌條件選擇為5°C左右，低于特定離子強(qiáng)度 和PH值下具體序列的熱熔點(diǎn)(Tm)。Tm是50%的目標(biāo)序列與精確匹配的探針雜交的溫度。 選擇非常嚴(yán)格的條件以與具體探針的Tm相等。高度嚴(yán)格的洗滌條件實(shí)施例是72°C下0. 15M NaCl洗滌15分鐘。嚴(yán)格的洗滌條 件實(shí)施例是溫度65°C下0. 2X SSC洗滌15分鐘(見，Sambrook等對(duì)SSC緩沖液的描述)。 通常，高度嚴(yán)格的洗滌前應(yīng)該用低嚴(yán)格的洗滌去除背景探針信號(hào)。，如，多于100個(gè)核苷酸的雙鏈體的培養(yǎng)基嚴(yán)格洗滌實(shí)施例為，45°C溫度下lx SSC洗滌15分鐘。如多于100個(gè)核 苷酸的雙鏈體的低度嚴(yán)格洗滌實(shí)施例為，40°C下4-6x SSC洗滌15分鐘。一般來說，比在具 體雜交試驗(yàn)中對(duì)于不相關(guān)探針觀察到的信噪比高2x(或更高)的信噪比顯示具體雜交的檢 測(cè)?！岸嚯摹被颉半摹敝傅氖且环N通過通過肽鍵相連接的氨基酸殘基組合而成的聚合物， 其天然存在的結(jié)構(gòu)變體以及其非天然存在的類似物。合成多肽可人工合成，如，通過自動(dòng)多 肽合成儀。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”通常指大分子多肽。術(shù)語(yǔ)“肽”通常指短多肽。上下文中的兩個(gè)或更多多核苷酸或多肽序列中的術(shù)語(yǔ)“相同”或“相同百分比”是 指兩個(gè)或更多序列或亞序列，當(dāng)使用如下序列比對(duì)法則之一或通過肉眼檢查的方法測(cè)量來 比較或?qū)Ρ茸畲笙嚓P(guān)性時(shí)，其是相同的或具有一定百分比的相同的核苷酸或氨基酸殘基。 優(yōu)選的，相同百分比存在于兩個(gè)對(duì)比的生物聚合物中的一個(gè)或兩者的至少約50個(gè)氨基酸 的，至少約100個(gè)氨基酸，至少約150個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度的序列的區(qū)域，或其全長(zhǎng)。用于對(duì)照的序列最佳對(duì)比可通過例如，Smith和Waterman的局部相同算法 Adv. Appl. Math. 2 482 (1981)，Needleman 和 ffunsch 的相同對(duì)比算法 J. Mol. Biol. 48 443(1970)，Pearson 和 Lipman 的探索相似方法Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 2444(1988)， 這些法則的計(jì)算機(jī)處理(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics SoftwarePackage, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI)，或肉目艮檢 測(cè)等來實(shí)現(xiàn)。適用于檢測(cè)序列的相同百分比和序列相似百分比的運(yùn)算法則的另一例子是BLAST 運(yùn)算法則，其在 Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215 =403-410(1990)中有描述。當(dāng)通過常規(guī)的序列對(duì)比運(yùn)算法則或用肉眼來對(duì)比和比對(duì)最大相關(guān)性時(shí)，當(dāng)用于多 肽序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)“相似百分比”描述其氨基酸殘基的百分比是(1)相同或⑵僅僅因保守性 置換而不同(即，相似)?！盎炯儭被颉胺蛛x的”意味著目標(biāo)種類是存在的主要種類(即，在摩爾基礎(chǔ)上，組 合物中比任何其他個(gè)別的大分子種類更豐富)，以及基本純化的片段是一種組合物，其中所 述目標(biāo)種類包含存在的全部大分子的至少約50% (在摩爾基礎(chǔ)上)。通常，基本純的組合物 意味著存在的組合物中的約80%、90%、95%、99%或更多是純化的目標(biāo)種類。如果組合物 本質(zhì)上含有一種單一的大分子種類，那么目標(biāo)種類即被純化到達(dá)了基本均一性(通常的檢 測(cè)手段無法檢測(cè)出組合物中的污染物)。本定義的大分子種類不包括溶劑、小分子(<500 道爾頓)、穩(wěn)定劑(如，BSA)以及基本的離子種類。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合 物含有基本純化的或分離的RAP環(huán)肽或其與活化劑綴合的綴合物?！疤烊淮嬖诘摹北挥糜谝环N物質(zhì)時(shí)指的是在自然界中能夠找到該物質(zhì)。例如，存在 于能夠從自然界中分離的生物體中的多肽或多核苷酸序列，并且沒有被人類在實(shí)驗(yàn)室中有 意修飾的，就是天然存在的?！皺z測(cè)”指測(cè)定樣本中被分析物的存在、缺少或者含量，其可包括對(duì)樣本中或樣本 中每一個(gè)細(xì)胞中的被分析物進(jìn)行定量?！翱蓹z測(cè)部分”或“標(biāo)記”指可通過分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手 段可檢測(cè)到的組合物。例如，有用的標(biāo)記包括32P、35S、熒光染料、電密度反應(yīng)物、酶(如，常 用于ELISA的)、生物素-鏈霉抗生物素、地高辛配基(dioxigenin)、半抗原以及可獲得抗血清或單克隆抗體的蛋白，或具有與目標(biāo)互補(bǔ)的序列的核酸分子?？蓹z測(cè)部分通常可以生 成可檢測(cè)的信號(hào)，如放射性、發(fā)光或者熒光性信號(hào)，這可用于定量檢測(cè)樣本中結(jié)合的可檢測(cè) 的部分。所述可檢測(cè)部分可通過共價(jià)鍵或離子鍵、范德華力或氫鍵結(jié)合或附在引物或探針 上，如，與放射性核素結(jié)合或鏈霉抗生物素識(shí)別的生物素化的核苷酸。所述可檢測(cè)部分可被 直接或間接的檢測(cè)。間接檢測(cè)可包括第二直接或間接可檢測(cè)部分與所述可檢測(cè)部分的結(jié) 合。例如，所述可檢測(cè)部分可以是結(jié)合伴侶的配體，如，生物素，其為鏈霉抗生物素的結(jié)合伴 侶，或核苷酸序列，其是互補(bǔ)序列的結(jié)合伴侶，并可以與互補(bǔ)序列特異性雜交。所述結(jié)合伴 侶本身可被直接檢測(cè)，如，其自身標(biāo)記了熒光分子的抗體。所述結(jié)合伴侶也可以是可被間 接檢測(cè)的，例如，具有互補(bǔ)核苷酸序列的核酸可以是分支DNA的一部分，該分支DNA反過來 可通過與其他標(biāo)記的核酸分子雜交來檢測(cè)(見，例如，PD. Fahrlander和A. Klausner，Bio/ Technology (1988) 6 :1165.)。信號(hào)定量可通過如，閃爍計(jì)數(shù)、密度分析或流式細(xì)胞儀等來獲 得。“連接體”指一種通過共價(jià)鍵或離子鍵、范德華力或氫鍵連接兩個(gè)其他分子的分 子，如，與互補(bǔ)序列的5'端雜交和與另一互補(bǔ)序列的3'端雜交的核苷酸分子，這樣就連 接了兩個(gè)非互補(bǔ)序列。本申請(qǐng)中使用的“腫瘤”或“瘤生成”或“癌癥”，包括原發(fā)腫瘤和/或轉(zhuǎn)移瘤。這 樣的腫瘤通常是實(shí)體瘤，或局部堆積擴(kuò)散的腫瘤。已知有很多種這樣的腫瘤和瘤形成。原 發(fā)性的腦腫瘤包括，膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、神經(jīng)鞘瘤、垂體腺瘤、成髓細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、血管瘤、 表皮樣囊腫、肉瘤以及其他。癌癥包括，例如，卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸 癌或胃癌。肝細(xì)胞癌或肝臟腫瘤，是世界上第五大常見癌癥，其發(fā)生率逐漸穩(wěn)步升高。肝細(xì) 胞癌是一種肝細(xì)胞疾病。百分之五十的顱內(nèi)腫瘤是顱內(nèi)轉(zhuǎn)移腫瘤。腦腫瘤和瘤形成可與腦 或神經(jīng)組織相關(guān)，或與腦膜、顱骨、脈管系統(tǒng)或頭頸部的其他組織相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明治療的 腫瘤或瘤生成可以是惡性或良性腫瘤，并可以在之前經(jīng)過化療、放療和/或其他治療手段 治療。術(shù)語(yǔ)“有效劑量”指對(duì)病人的健康條件、病理學(xué)和疾病或?yàn)樵\斷目的足以產(chǎn)生想要 得到的效果的劑量。想要得到的結(jié)果可包括接受這一劑量后主觀或客觀的改善。“治療性 有效劑量”指對(duì)健康有效產(chǎn)生想要的有益效果的試劑的量。“有機(jī)小分子”指其大小與藥學(xué)上常用的那些有機(jī)分子可比較的有機(jī)分子。所述 術(shù)語(yǔ)不包括有機(jī)生物聚合物(如，蛋白質(zhì)、核酸等)。優(yōu)選的有機(jī)小分子的大小范圍高達(dá)約 5，OOODa、高達(dá)約 2，OOODa、或高達(dá)約 1，OOODa。診斷或治療的“個(gè)體”，指人或非人類的動(dòng)物，其包括哺乳動(dòng)物或靈長(zhǎng)類動(dòng)物?！爸委煛笔侵割A(yù)防性治療或治療性治療或診斷性治療?！邦A(yù)防性”治療是指對(duì)沒有疾病跡象或僅僅是有早期跡象的個(gè)體進(jìn)行治療以減少 疾病發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)?？墒┯帽景l(fā)明的綴合物作為預(yù)防性治療以降低疾病發(fā)展的可能性，或如 果疾病發(fā)生后，使其病理發(fā)展的嚴(yán)重性最小化。“治療性”治療是指對(duì)有病理性跡象或癥狀的個(gè)體實(shí)施治療，以減少或消除這些跡 象或癥狀。這些跡象或癥狀可以是生化的、細(xì)胞的、組織的、功能的、主觀的或客觀的?？墒?用本發(fā)明的綴合物進(jìn)行治療性治療或診斷?！霸\斷的”是指鑒別病理性疾病的存在或性質(zhì)。診斷方法依其特異性和選擇性而不同。然而具體的診斷方法不能提供疾病的確定性診斷時(shí)，如果所述方法提供有助于診斷的 陽(yáng)性指征，那么就是支持性的診斷。“藥學(xué)上可接受的載體”指任何一種標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)載體、緩沖液以及賦形劑，如，磷酸鹽 緩沖溶液，5%的葡萄糖水溶液以及乳液(如，油/水或水/油乳液)以及各種類型濕潤(rùn)劑 和/或佐劑，這些藥學(xué)載體已經(jīng)被有資質(zhì)的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)適合于給予人體。合適的藥學(xué)載 體禾口制劑在 Remington' s PharmaceuticalSciences，19th Ed. (Mack Publishing Co.， Easton, 1995)中有描述。優(yōu)選的藥學(xué)載體取決于活化劑預(yù)期的施用方式。典型的施用方式 包括經(jīng)腸的(如，口服)或非腸道的(如，皮下注射、肌肉注射、靜脈注射、腹腔注射或鞘內(nèi) 注射；或局部、透皮，或包括肺內(nèi)施用的)?！八帉W(xué)上可接受的鹽”是指能夠配制成用于治療 用途的化合物的鹽，如，金屬鹽(鈉、鉀、鎂、鈣等等)以及銨鹽或有機(jī)胺鹽。A含CR的蛋白及其作用“LDLR”指包括低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(LRP1)在內(nèi)的低密度脂蛋白受體 家族的成員。LRP1是4525個(gè)氨基酸的大分子蛋白(600kDa)，該蛋白通過弗林蛋白酶切 割為保留非共價(jià)鍵的515_(a)kD和85_(0)kDa的兩個(gè)亞單位。LRP1在大多數(shù)組織類 型中均有表達(dá)，但最早發(fā)現(xiàn)于肝臟。所述低密度脂蛋白(LDL)受體家族的其他成員包括 LDL-R(132kDa) ；LRP2(巨蛋白，gp330) ；LRP/LRP1 和 LRP1B(600kDa) ；VLDL-R(130kDa)； LRP5 ；LRP6 ；apoER-2 (LRP-8,130kDa)；嵌合 LDL_R(LR11，250KDa)；以及其他成員，諸 如，LRP3、LRP6和LRP-7。這一家族的典型特征包括，細(xì)胞表面表達(dá)；胞外配體結(jié)合域重 復(fù)(DxSDE)；配體結(jié)合對(duì)Ca++的需要；RAP和apoE的結(jié)合；EGF前體的同源結(jié)構(gòu)域重復(fù) (YWTD)；單一膜跨越區(qū)域；胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的內(nèi)化信號(hào)(FDNPXY)；以及受體介導(dǎo)的多種配體 的胞吞。這一家族的一些成員，包括LRP1，LRP5，LRP6，apoER2和VLDLR，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通 路。RAP d3折疊成反向平行螺旋發(fā)夾。第一個(gè)螺旋大約在D237-V277，通過轉(zhuǎn)角(由 殘基G278-G280構(gòu)成)連接到第二個(gè)螺旋(殘基E281-R317)。在右臂(螺旋2)交叉左臂 (螺旋1)的構(gòu)象中，這兩個(gè)螺旋是最接近的。LDLR的CR3基本在K270接觸RAP d3，而CR4 形式基本在K256與RAPd3接觸。K256和K270在螺旋2的同一表面。RAP R282和R285被 引入CR3的負(fù)電荷鈣螯合囊中，而RAP K253在結(jié)合CR4中起類似的作用。所述LDLR CR對(duì) 僅僅在RAP d3反向平行螺旋發(fā)夾約H249-T303間與殘基相連。在這一區(qū)域外是螺旋1的 N末端的延伸和螺旋2的C末端的延伸。據(jù)推測(cè)是螺旋1和螺旋2的這些部分幫助穩(wěn)定 螺旋束。此外，在螺旋1前有一個(gè)轉(zhuǎn)角S232-T236，其是一個(gè)短螺旋和一些附加序列，包括 R206-Q231間的殘基。已經(jīng)表明所述短螺旋和附加的序列對(duì)于RAP d3折疊的穩(wěn)定性也起著 非常重要的作用。i.LRPl 選擇的 RAP 肽天然的RAP強(qiáng)有力的結(jié)合LRP1，LRP1在肝細(xì)胞上高度表達(dá)。本發(fā)明一方面預(yù)期化 療藥物或其他治療肝臟疾病的制劑與RAP環(huán)肽綴合，以遞送治療化合物到達(dá)肝臟，從而治 療肝臟疾病。施用RAP綴合物來治療肝臟疾病將解決與肝臟疾病治療相關(guān)的幾個(gè)問題，如， 肝臟對(duì)制劑的清除，因?yàn)榇蟛糠炙幬镌谧⑸浜髱缀趿⒓幢恢苯舆f送到肝細(xì)胞。此外，因?yàn)?RAP綴合物將會(huì)通過LRP1來被胞吞，質(zhì)膜(MDR，P-糖蛋白)中的藥物抵抗機(jī)制將被繞開。i i LRP2 選擇的 RAP 肽
現(xiàn)已表明LRP2在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮表達(dá)，其介導(dǎo)apoj到腦實(shí)質(zhì)的運(yùn)輸(Lundgren， 等人，(1997) J Histochem Cytochem 45，383-392 ;Zlokovic，等人，(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93,4229-4234 ;Shayo，等人，(1997) LifeSci 60，PL115-118)。以比其它 LDLR 更 高的親和力選擇性結(jié)合LRP2的本發(fā)明的RAP環(huán)肽及其綴合物，被期望提高腦內(nèi)的分布。 例如，⑶NF已被證明促進(jìn)帕金森病人黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)(Lin，等人，(1993) Science 260，1130-1132)。然而，⑶NF本身并不能穿過脈管系統(tǒng)進(jìn)入腦部。LRP2選擇的 RAP肽與GDNF融合將預(yù)期提高GDNF在腦內(nèi)的分布。iii. VLDLR 選擇的 RAP 肽相似的，現(xiàn)已表明VLDLR表達(dá)于腦毛細(xì)血管內(nèi)皮，并介導(dǎo)脂蛋白脂肪酶跨過主動(dòng) 脈內(nèi)皮的運(yùn)輸(Wyne，等人，(1996) Arterioscler Thromb VascBiol 16,407-415 ；Obunike, 等人，(2001) J Biol Chem 276，8934-8941)。選擇性與VLDLR結(jié)合的本發(fā)明的RAP環(huán)肽及其 綴合物預(yù)期提高腦內(nèi)的分布。VLDLR也通過介導(dǎo)吸收多余的游離脂肪酸(FFA)到血管巨噬 細(xì)胞來參與泡沫細(xì)胞的形成。(Hiltunen，等人，(1998) Circulation 97，1079-1086 ;Qu，等 人，(2004) J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 24，1_4，8)。本發(fā)明選擇地與 VLDLR 結(jié)合的RAP環(huán)肽及其綴合物被期望用于阻斷脂蛋白顆粒和巨噬細(xì)胞間的聯(lián)系，從而抑制泡 沫細(xì)胞形成。RAP環(huán)肽及其綴合物也被期望限制FFA從循環(huán)脂蛋白進(jìn)入脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)移， 減慢易感個(gè)體肥胖的進(jìn)程(Goudriaan，等人，(2001) Arterioscler Thromb Vase Biol 21， 1488-1493 ；Goudriaan，等人(2004) J Lipid Res 45，1475-1481 ;Tacken，等人，(2001) Curr Op in Lipidol 12，275-279 ;Yagyu，等人，(2002) J Biol Chem 277，10037-10043)。VLDLR 在肌肉內(nèi)皮管腔表面的高水平表達(dá)聯(lián)合VLDLR在肝臟的低水平表達(dá)，被期望在靜脈注射后 驅(qū)動(dòng)RAP環(huán)肽及其綴合物分布到肌肉組織。對(duì)肌肉組織具有治療效果的制劑可結(jié)合VLDLR 選擇性的RAP環(huán)肽上來提高該制劑在肌肉組織的分布。iv.與腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤關(guān)聯(lián)的含CR蛋白至少三個(gè)含CR的蛋白，LRP5、LRP6和ST14(TADG-15)的過量表達(dá)獨(dú)立地與增加的 致瘤性或致癌作用相關(guān)聯(lián)(Li，等人，(2004) Oncogene 23，9129-9135 ;Hoang，等人，(2004) Int J Cancer 109，106—111 ;Tanimoto，等人，(2005) Br J Cancer 92,278-283 ；Santin, 等人，(2004)Int J Cancer 112,14-25 ；Santin,等人，(2003)Cancer 98,1898-1904 ； Tanimoto，等人，(2001)Tumour Biol 22，104-114)。與這些蛋白選擇性結(jié)合的本發(fā)明RAP 環(huán)肽或其綴合物將被期望提供減小這些蛋白致瘤影響的手段。RAP環(huán)肽可直接干擾含CR蛋 白的功能。另外，所述RAP環(huán)肽可與治療癌癥的制劑綴合來靶向遞送其到過量表達(dá)含CR蛋 白的組織。例如，matriptase(MT-SPl，ST14，TADG-15)在多種上皮腫瘤(癌)中過量表達(dá) (25-33)。在肝細(xì)胞活化抑制劑1促進(jìn)的反式激活作用后，matriptase直接或通過激活其 他蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)成分來促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，其他蛋白酶如，尿激酶血漿酶原激 活劑(uPA)，其導(dǎo)致基質(zhì)降解活動(dòng)(26，34，35)。已有提示表明在matriptase (ST14)胞外 結(jié)構(gòu)域中的鄰近CR陣列的蛋白酶結(jié)構(gòu)域提高了過量表達(dá)matriptase (ST14)細(xì)胞的侵潤(rùn) 性和致瘤性。matriptase通過II型跨膜結(jié)構(gòu)域的N末端錨定在上皮細(xì)胞膜的側(cè)面或底 側(cè)面(Pfistermueller，等人(1996)FEBS Lett 396，14-20)。包埋在膜內(nèi)的序列在蛋白 C末端連接一個(gè)細(xì)胞外SEA結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域，四個(gè)CR結(jié)構(gòu)域以及胰蛋白酶結(jié)構(gòu)
19域。Matriptase中的CR序列突變導(dǎo)致所得到的蛋白酶突變體活化失敗(Qiu，等人(2003) Neuroscience 122，291-303)。相似地，結(jié)合到matriptase第三CR結(jié)構(gòu)域的抗體阻斷所述 酶的活化(Basu，等人(2001) Immunity 14，303-13)。與包含第三CR結(jié)構(gòu)域的matriptase 的兩對(duì)CR對(duì)中一對(duì)具有親和力的RAP環(huán)肽被期望用于干擾蛋白水解的活化，其方式與 已觀察到的抗體對(duì)這一區(qū)域的抑制相似。這樣的RAP肽將被期望減小在受影響組織的 matriptase過量表達(dá)的轉(zhuǎn)移和致瘤效應(yīng)。含有matriptase選擇性的RAP環(huán)肽以及蛋白酶 抑制劑的綴合物也期望用于特異地阻斷涉及其蛋白水解活性的matriptase的效應(yīng)。LRP6選擇性的RAP環(huán)肽可被設(shè)計(jì)通過誘導(dǎo)LRP6胞吞或干擾LRP6介導(dǎo)的Wnt信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(dòng)來下調(diào)腫瘤細(xì)胞上的LRP6。相似地，綴合了治療制劑(如，癌癥化療藥物)或診斷 制劑的LRP6選擇性RAP環(huán)肽可用于靶向遞送到過量表達(dá)LRP6的組織。V. LRP5選擇性RAP肽和骨疾病通過LRP5增強(qiáng)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)已被證明增加了造骨細(xì)胞的分化，抑制破骨細(xì)胞的活 動(dòng)，并提高了骨的沉積(Westendorf，等人，(2004) Gene 341，19-39 ；Zhang，等人，(2004)Mo 1 Cell Biol 24,4677-4684)。通過造骨細(xì)胞特異的APC(結(jié)腸腺瘤息肉病)敲除小鼠和對(duì) DKK(Dickkopf)-l和硬骨素(sclerostin)介導(dǎo)的抑制敏感的LRP5突變體，這一信號(hào)傳導(dǎo) 機(jī)制已得到確認(rèn)(Zhang，等人，(2004)Mol Cell Biol 24，4677-4684 ;Holmen，等人，(2005) J Biol Chem)。LRP5特異的RAP環(huán)肽通過結(jié)合抑制劑或通過其他方式增強(qiáng)Wnt信號(hào)傳導(dǎo) (如，不阻斷Wnt結(jié)合而穩(wěn)定LRP5)，將被預(yù)期具有相似的效果。例如，對(duì)兩個(gè)LRP5 CR對(duì)中 任一個(gè)特異的RAP環(huán)肽與0推進(jìn)伴侶蛋白Mesd融合將被期望通過LRP5干擾DKK-1介導(dǎo) 的 Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗作用(Hsieh，等人，(2003) Cell 112，355-367 ;Herz，等人，(2003) Cellll2，289-292)。干擾LRP5抑制的這些RAP環(huán)肽(如，減少DKK-1結(jié)合至或LRP5抑制) 及其綴合物預(yù)期在骨質(zhì)疏松癥或其他與造骨活性減少和/或破骨活性增加相關(guān)的疾病的 治療中具有治療效果。相似地，通過LRP5抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的RAP環(huán)肽預(yù)期在造骨活性增 加相關(guān)的疾病的治療中具有治療效果，如，骨硬化病。vi. FDC-8D6 選擇性 RAP 肽FDC-8D6抗原(⑶320)有一對(duì)這樣的結(jié)構(gòu)域并在淋巴濾泡B細(xì)胞分化中起重要作 用(36，37)。非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括一類稱為B細(xì)胞的免疫細(xì)胞的增殖和結(jié)外遷移。NHL是 年齡為20歲到39歲之間的男性主要致死性癌癥。已有研究表明FDC-8D6抗原蛋白(⑶320) 促進(jìn)腫瘤B細(xì)胞的生長(zhǎng)(36，37)。8D6抗原含有一個(gè)單一的CR結(jié)構(gòu)域?qū)ΑＴ噭?，如RAP環(huán) 肽，其結(jié)合并阻斷8D6的功能，并期望減慢人非霍奇金淋巴瘤的病情發(fā)展。B.治療能夠通過施用本發(fā)明的RAP環(huán)肽或綴合物治療的特定疾病病變，其依據(jù)含CR蛋白 靶向類型和能夠存在于綴合物中的藥物部分變化。因此，疾病病變包括細(xì)胞增殖性疾病， 如，腫瘤疾病、自身免疫疾病、心血管疾病、荷爾蒙異常疾病、退行性疾病、老化病，中樞神經(jīng) 系統(tǒng)疾病(如，阿爾茨海默病、癲癇病、高血脂)、精神疾病和病變(如，精神分裂癥、情緒紊 亂，如抑郁和焦慮)、感染性疾病、酶缺乏癥、之前所述的那些溶酶體貯積癥等等。治療意味著包括使施用綴合物相關(guān)的個(gè)體產(chǎn)生的任何有益效果，包括降低獲得疾 病的可能性，預(yù)防疾病，減慢、停止或逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)程，或改善給宿主帶來痛苦的疾病的相關(guān)癥狀，此處所述的改善或有益廣義上指至少一個(gè)參數(shù)數(shù)值的減小，如，治療的病理病變相關(guān)的癥狀(如，與之相關(guān)的發(fā)炎和疼痛)。同樣地，治療也包括病理狀況或至少相關(guān)癥狀被 完全抑制的情形，如，預(yù)防發(fā)生或停止，如，終止，以使宿主不再遭受病理病變，或至少病理 病變的特征性癥狀。i.溶酶體貯積癥在一些實(shí)施方式中，經(jīng)治療的疾病是溶酶體貯積癥，所述綴合物作為本發(fā)明的藥 物組合物以足以減少所述哺乳動(dòng)物腦組織中貯存的顆粒數(shù)量的有效劑量施用。典型地，這 一疾病的癥狀通過以下監(jiān)測(cè)常規(guī)的病史評(píng)估、身體檢查、超聲心動(dòng)圖、心電圖、磁共振成 像、多道睡眠描記術(shù)、骨骼檢查、活動(dòng)度測(cè)量、角膜照片、皮膚活組織檢查。對(duì)這種疾病施用 RAP環(huán)肽或其綴合物可使所述個(gè)體的發(fā)展延緩或衰退正常化，減輕高壓腦積水，減輕所述個(gè) 體的脊髓壓迫，并減少所述個(gè)體腦血管周圍血管周囊泡的數(shù)量和/或大小。監(jiān)測(cè)和評(píng)估這 一結(jié)果的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。對(duì)這個(gè)結(jié)果的其他描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員 參見美國(guó)專利6，585，971 ；美國(guó)專利6，569，661和美國(guó)專利6，426，208以及美國(guó)專利公開 號(hào) 20040009906。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，動(dòng)物患有I型粘多糖貯積病并有50%或更少的正常 α -L-艾杜糖苷酸酶活性。在這些實(shí)施方式中，預(yù)期如每周一次施用約0. OOlmg/kg體重到 0. 5mg/kg體重之間的有效劑量的人α -L-艾杜糖苷酸酶作為綴合物的一部分給患有這一 疾病的個(gè)體。在其他實(shí)施方式中，每周一次給所述個(gè)體施用哺乳動(dòng)物的約0. 01mg/15cc CSF 到約5.0mg/15CC CSF之間的劑量的所述人α-L-艾杜糖苷酸酶。本文所述的治療包括促進(jìn) 患有溶酶體貯積癥病人的腦細(xì)胞中粘多糖(GAG)的分解。這些腦細(xì)胞可以是神經(jīng)元、神經(jīng) 膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞。典型地，顆粒堆積發(fā)生并可通過使用本發(fā)明的綴合物來改善的腦細(xì) 胞包括神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、血管周細(xì)胞、外皮細(xì) 胞、腦膜細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、蛛網(wǎng)膜顆粒細(xì)胞、蛛網(wǎng)膜、硬膜、軟膜以及脈絡(luò)叢細(xì)胞。優(yōu)選實(shí)施 方式中的治療與沒有施用所述綴合物的相似細(xì)胞中的溶酶體貯積顆粒的數(shù)量相比，其減少 了腦膜細(xì)胞中貯積顆粒的數(shù)量。在一些個(gè)體中這產(chǎn)生了減輕高壓腦積水癥狀的治療效果。 并且，所述的施用減少了所述個(gè)體腦膜組織中CSF液體的量?？捎帽景l(fā)明的綴合物治療的溶酶體貯積癥的非限定性實(shí)施例包括I型粘多糖貯 積病，II型粘多糖貯積病亨特綜合征，IIIA型粘多糖貯積病桑菲利波綜合征，IIIB型粘多 糖貯積病桑菲利波綜合征，IIIC型粘多糖貯積病桑菲利波綜合征，IIID型粘多糖貯積病桑 菲利波綜合征，IVA型粘多糖貯積病莫基奧綜合征，IVB型粘多糖貯積病莫基奧綜合征，VI 型粘多糖貯積病，VII型粘多糖貯積病斯萊綜合征，IX型粘多糖貯積病，天冬氨酰葡萄糖胺 尿癥，膽固醇脂貯積病/沃爾曼病，胱氨酸病，Danon病，法布里病，法伯脂肪肉芽腫病/法伯 病，巖藻糖苷貯積癥，Ι/ΙΙ型半乳糖涎酸貯積病，Ι/ΙΠΙΙ型高切爾病，球形細(xì)胞腦白質(zhì)營(yíng) 養(yǎng)不良/克拉伯(Krabbe)病，II型糖原貯積病/龐皮病，Ι/ΙΙ/ΙΙΙ型GMl-神經(jīng)結(jié)苷脂貯 積病，I型GM2-神經(jīng)結(jié)苷脂貯積病/泰-薩病，II型GM2-神經(jīng)結(jié)苷脂貯積病桑德霍夫病， GM2-神經(jīng)結(jié)苷脂貯積病，Ι/ΙΙ型α -甘露糖苷貯積癥，β -甘露糖苷貯積癥，異染性腦白質(zhì) 營(yíng)養(yǎng)不良，異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，粘脂貯積癥I型/涎酸貯積癥1/11，ΙΙ/ΙΠ型粘脂貯積 癥I型-細(xì)胞病，III型粘脂貯積癥假胡爾勒多種營(yíng)養(yǎng)不良，多發(fā)性硫酸酯酶缺乏癥，神經(jīng) 細(xì)胞蠟樣脂褐素病，CLNl巴滕病，神經(jīng)細(xì)胞蠟樣脂褐素病，CLN2巴滕病，A型尼曼-皮克病/B型尼曼-皮克病，Cl型尼曼-皮克病尼曼-皮克病，C2型尼曼-皮克病尼曼-皮克病，致密成骨不全癥(Pycnodysostosis)，I型施德勒病(Schindler disease)/11型施德勒病 或涎酸貯積癥。ii.神經(jīng)紊亂在其他實(shí)施方式中，接受治療的疾病是神經(jīng)疾病，綴合物作為藥物組合物以足以 預(yù)防、處理或治療這些神經(jīng)疾病的有效劑量施用。神經(jīng)疾病包括但不限于阿爾茨海默病， 帕金森病，多發(fā)性硬化，肌萎縮側(cè)索硬化，其他脫髓鞘相關(guān)疾病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥，創(chuàng)傷性 腦損傷，脊髓損傷，中風(fēng)或腦缺血，斑樣硬化，腦脈管炎，癲癇癥，亨廷頓病，圖雷特綜合征， 吉_巴綜合征，威爾遜病，皮克病，神經(jīng)炎性疾病，腦炎，腦脊髓炎或病毒性、真菌或細(xì)菌性 腦膜炎，或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，朊蛋白疾病，小腦共濟(jì)失調(diào)，小腦變性，脊髓小腦變性綜 合征，弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)，毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)，脊髓肌萎縮，進(jìn)行性核上麻痹，肌張 力異常，肌肉強(qiáng)直，震顫，視網(wǎng)膜色素變性，老年癡呆，皮層下癡呆，動(dòng)脈硬化癡呆，AIDS關(guān)聯(lián) 癡呆，或其他癡呆，紋狀體黑質(zhì)變性，線粒體腦肌病，神經(jīng)細(xì)胞蠟樣脂褐素病，中樞神經(jīng)系統(tǒng) 引起的溶酶體貯積紊亂，腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，尿素循環(huán)缺陷疾病，肝性腦病，腎性腦病，代謝性 腦病，卟啉病，神經(jīng)毒性物質(zhì)中毒，放射誘導(dǎo)的腦損傷，或精神疾病，如，精神異常，焦慮，抑 郁，注意力分散，記憶障礙，認(rèn)知障礙，食欲障礙，肥胖，成癮，傾向或藥物依賴。阿爾茨海默病在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，被治療的疾病是阿爾茨海默病，該病與受影響病人腦 內(nèi)40-42氨基酸肽的淀粉樣β蛋白(Α β)水平增高有關(guān)(Selkoe，等人(1996) J Biol Chem 271,18295-18298)。隨著一系列連續(xù)的蛋白酶水解的2產(chǎn)生，Aβ寡聚化并最終堆積在神 經(jīng)間隙形成不可溶斑塊。體內(nèi)及體外試驗(yàn)證明可溶及不可溶的形式的Αβ均有神經(jīng)毒性 (Zerbinatti，等人，(2004) ProcNatl Acad Sci USA 101，1075-1080 ；Tsai，等人，(2004) Nat Neurosci ；Schmitz，等人(2004) Am J Pathol 164，1495-1502 ;Gong，等人(2003) Proc Natl Acad Sci USA 100，10417-10422 ;Bard，等人(2000)Nat Med 6，916-919 ;Schenk，等人 (1999) Nature 400，173-177 ;Hsia，等人(1999) ProcNatl Acad Sci USA 96,3228-3233)。 可溶Αβ單體及其低聚體被證明通過抑制長(zhǎng)時(shí)程電位可逆地誘導(dǎo)記憶缺陷(Gong，等人 (2003)Proc Natl Acad SciUSA 100，10417-10422)。Αβ是淀粉前體蛋白或APP的蛋白水解片段，一種功能尚未確定的細(xì)胞表面膜蛋 白。Αβ的形成由神經(jīng)分泌途徑或通過LRPl (LDLR受體家族成員之一)的APP胞吞啟動(dòng) (Cam，等人，(2004) J Biol Chem 279,29639-29646)。一旦到達(dá)內(nèi)體系統(tǒng)，APP 即被 β 位點(diǎn) APP裂解酶或BACE (—種膜蛋白酶)裂解。BACE在671位點(diǎn)切割ΑΡΡ，恰好是跨膜結(jié)構(gòu)域的 N末端。然后APP保留下來的部分被三種蛋白的聯(lián)合體(早老蛋白-1，早老蛋白_2和呆蛋 白，構(gòu)成了 Y-分泌酶聯(lián)合體)再次切割(Xia，等人(2003) J Cell Sci 116,2839-2844)。 早老蛋白在脂質(zhì)雙分子層內(nèi)部小葉內(nèi)對(duì)底物進(jìn)行切割。在APP的跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)，γ-分泌 酶切割步驟發(fā)生在711和713位點(diǎn)之間。Y-分泌酶切割釋放Αβ，Αβ保留在神經(jīng)元內(nèi)或 分泌到細(xì)胞外間隙。在任何一個(gè)部位對(duì)神經(jīng)元都是具有毒性的(Casas，等人(2004)Am J Pathol 165,1289-1300)。通過β和γ分泌酶連續(xù)切割A(yù)PP被定義為淀粉樣生成(amyloidogenic)途徑。一交替性途徑控制正常腦組織。通過受體脫落釋放APP的整個(gè)胞外域，蛋白水解過程通過α分泌酶催化。釋放的胞外域被定義為sAPP a，并且已被證明具有保護(hù)神經(jīng)和增強(qiáng)記憶的效 果(Furukawa，等人(1996) JNeurochem67,1882-1896 ；Meziane，等人(1998) Proc Natl Acad Sci USA 95，12683-12688)。在非淀粉樣生成途徑中，APP胞外域釋放是關(guān)鍵的事件。在淀粉 樣生成過程中，蛋白水解發(fā)生在變?yōu)锳 0的APP區(qū)域內(nèi)的688位點(diǎn)(Allinson，等人(2003) J Neurosci Res 74，342-352)。因此，淀粉樣生成和非淀粉樣生成途徑是相互排斥的。sAPP a 的釋放通過a分泌酶ADAM10 (也是一種膜結(jié)合蛋白酶)催化(Fahrenholz，等人(2000) Arm N Y Acad Sci 920，215-222)。ADAM10是解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶，是“脫落酶”酶家族的一 部分，包括Notch裂解酶(Kuzbanian)和TNF-a前體裂解酶(TACE，ADAM17)。ADAM10已被 發(fā)現(xiàn)是造成 BACE 胞外脫落的原因(Hussain，等人(2003)JBiol Chem 278，36264-36268)。像其它ADAM家族成員一樣，ADAM10有N端的前結(jié)構(gòu)域(prodomain)，催化酶結(jié)構(gòu) 域，解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞質(zhì)尾巴。前結(jié)構(gòu)域與催化結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，是酶正 確折疊的必要條件。這一結(jié)合也使前結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸可逆地結(jié)合激活部位的鋅原子， 當(dāng)其轉(zhuǎn)運(yùn)分泌途徑時(shí)屏蔽酶的水解活性。一旦到達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)高爾基體，組成型分泌途徑中的前 蛋白(proprotein)轉(zhuǎn)換酶弗林蛋白酶(Furin)識(shí)別ADAM10的殘基211-214 (RKKR)，切割掉 前結(jié)構(gòu)域，表現(xiàn)出酶的蛋白水解活性。以通過ADAM10釋放sAPP a為代價(jià)來增加通過0和Y分泌酶釋放的A ^，被認(rèn) 為是阿爾茨海默病的基礎(chǔ)。在進(jìn)行大量的程序來開發(fā)BACE的藥理學(xué)抑制劑或Y分泌酶復(fù) 合物，以轉(zhuǎn)移APP使其從淀粉樣生成途徑中被加工清除。一個(gè)補(bǔ)充途徑是通過增加腦間質(zhì) a分泌酶的水平來消耗A0，增加sAPPa產(chǎn)生。動(dòng)物模型中APP蛋白水解過程的不平衡 已經(jīng)通過適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充具體的神經(jīng)蛋白酶(ADAM10)內(nèi)生水平來得到矯正。增加腦內(nèi)ADAM10 水平的好處已經(jīng)在阿爾海默小鼠模型中被證實(shí)(Postina，等人(2004)J Clinlnvest 113， 1456-1464 ;Lichtenthaler，等人(2004) J Clin Invest 113,1384-1387)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)腦內(nèi) ADAM10水平的輕度增加可預(yù)防疾病的表型。本發(fā)明預(yù)期基于靜脈施用RAP環(huán)肽與ADAM10的融合物來治療阿爾茨海默病。一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式是，治療阿爾茨海默病的方法，其包括施用ADAM10-RAP環(huán)肽綴合物病提 高腦a分泌酶的活性，其中所述施用是通過靜脈內(nèi)或頸動(dòng)脈內(nèi)或鞘內(nèi)施用。a分泌酶水平 提高反過來預(yù)期轉(zhuǎn)移淀粉樣生成途徑中的APP加工。sAPPa產(chǎn)量增加及其必然的結(jié)果，產(chǎn) 生的A0減少，被預(yù)測(cè)對(duì)于阿爾茨海默病人有治療效果?；蛘?，本發(fā)明涵蓋了阿爾茨海默病 的治療，其包括施用RAP環(huán)肽與其它作用于APP或A3的蛋白酶，或與3分泌酶的抑制劑， 或與Y分泌酶抑制劑的融合物。在一相關(guān)方面，本發(fā)明涵蓋了通過使用主要附加的ADAM10-RAP融合物來使經(jīng)靜 脈注射的活化的脫落酶的外周效應(yīng)最小化。完整的pro-ADAMlO-RAP可通過弗林蛋白酶抑 制劑和a 1抗胰蛋白酶Portland共表達(dá)，從標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)線分離(Srour，等人(2003)FEBS Lett 554,275-283 ；Benjannet，等人(1997) J Biol Chem 272,26210-26218)。然后在轉(zhuǎn)胞 吞過程中，或在到達(dá)腦間隙時(shí)，通過移除清除至組織之后的前結(jié)構(gòu)域活化所述融合物。在 轉(zhuǎn)胞吞過程中，因?yàn)榕cLRP相關(guān)，因此融合物變得與膜相關(guān)。所述融合受體復(fù)合物則在內(nèi) 涵體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞。早期的體內(nèi)及體外研究表明在轉(zhuǎn)胞吞過程中，轉(zhuǎn)運(yùn)中一些蛋白質(zhì)部分被 蛋白酶水解(Lisi，等人(2003) JEndocrinol Invest 26，1105-1110)。內(nèi)吞的 ADAM10-RAP 綴合物無論是在最初的內(nèi)吞至內(nèi)皮細(xì)胞還是在最終的內(nèi)吞進(jìn)入神經(jīng)元，都會(huì)在早期內(nèi)涵體
23中將融合物暴露至弗林蛋白酶(Mayer，等人(2004) J Histochem Cytochem 52,567-579 ； Bosshart，等人(1994)J Cell Biol 126，1157-1172 ;Rohn，等人(2000) J Cell Sci 113 (Pt 12), 2093-2101)。一種可選擇的延遲ADAM10活化的途徑是，用對(duì)ADAM敏感的肽連接體替換 連接前結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域的對(duì)弗林蛋白酶敏感的肽連接體。達(dá)到修飾的前結(jié)構(gòu)域在生產(chǎn) 線中被裂解的程度時(shí)，該反應(yīng)可通過含氧肟酸抑制劑培養(yǎng)或通過共表達(dá)TIMP1或TIMP3來 抑制(Amour，等人(2000)FEBS Lett 473，275-279)。然而在外周中RAP融合物的半衰期很 短，對(duì)ADAM敏感的pro-ADAMlO-RAP融合物的堆積，將會(huì)導(dǎo)致所述融合物對(duì)空隙中神經(jīng)元表 面內(nèi)生活化的ADAM10的暴露。每一個(gè)活化的ADAM10-RAP融合物隨后活化更多ADAM10-RAP， 那么可預(yù)測(cè)蛋白酶水解連鎖反應(yīng)。用甘露醇頸動(dòng)脈內(nèi)共注射和鞘內(nèi)注射可不需要非活化的 ADAM10。本發(fā)明涵蓋的其他的神經(jīng)疾病描述如下。如，以震顫和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能下降、僵直 和喪失運(yùn)動(dòng)為特征的帕金森病。這些神經(jīng)癥狀主要因黑質(zhì)紋狀體即黑質(zhì)紋狀體束主要傳 出投射的機(jī)能失常導(dǎo)致的。多巴胺能系統(tǒng)中的神經(jīng)元胞體是PD疾病發(fā)展中涉及的主要細(xì) 胞。原發(fā)性帕金森綜合征包括，帕金森病(PD)，進(jìn)行性核上麻痹(PSP)，和紋狀體黑質(zhì)變性 (SND)，其包括橄欖體腦橋小腦變性(0PCD)和夏-德綜合征SDS)(其已知癥狀是多系統(tǒng)萎 縮 MSA)。肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)通常也稱為“洛蓋赫里格”病，是一種攻擊腦和脊髓 的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病。ALS中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的進(jìn)行性退變最終導(dǎo)致其死亡， 使得腦啟動(dòng)和控制肌肉活動(dòng)的能力下降。亨廷頓病(HD)，雖然是一種遺傳性疾病，但導(dǎo)致了紋狀體中間棘狀GABA能神經(jīng)元 的退變(Hickey 等人，Prog Neuropsychopharmacol Biol6Psychiatry. 27 :255_65，2003)。 這一退變引起行動(dòng)失控、智力下降以及情緒障礙。多發(fā)性硬化(MS)是一種多發(fā)于年輕人的致殘的疾病。該病較典型的表現(xiàn)是炎癥 反應(yīng)，可能是自身免疫型炎癥反應(yīng)，以及通常與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓磷脂形 成細(xì)胞缺失關(guān)聯(lián)的脫髓鞘。目前可利用的治療手段集中于MS的炎癥因子，但是對(duì)髓鞘形成 的效果甚微，如果有效果的話。本發(fā)明的組合物用于治療腦部腫瘤。最常見的腦腫瘤是起源于膠質(zhì)組織的膠質(zhì) 瘤。星形細(xì)胞瘤起源于一種被稱為星形膠質(zhì)細(xì)胞的小的星形細(xì)胞，大多數(shù)發(fā)生于成年大腦。 III級(jí)星形細(xì)胞瘤有時(shí)稱為間變型星形細(xì)胞瘤。IV級(jí)星形細(xì)胞瘤通常被稱為多形性膠質(zhì)母 細(xì)胞瘤。腦干膠質(zhì)瘤發(fā)生在腦最低的桿樣部分。腦干控制著很多重要的功能。大部分腦干 膠質(zhì)瘤是高分化星形細(xì)胞瘤。室鼓膜瘤通常發(fā)生在腦室內(nèi)層，也可發(fā)生在脊髓。少突膠質(zhì) 細(xì)胞瘤發(fā)生于產(chǎn)生髓磷脂的細(xì)胞，其包裹的脂肪保護(hù)神經(jīng)。這些腫瘤通常發(fā)生于大腦，它們 生長(zhǎng)緩慢，通常不會(huì)擴(kuò)散到周圍腦組織。成神經(jīng)管細(xì)胞瘤發(fā)生在較原始的神經(jīng)細(xì)胞，這些細(xì) 胞通常在個(gè)體出生后不再保留。因?yàn)檫@一原因成神經(jīng)管細(xì)胞瘤通常被稱為原始的神經(jīng)外胚 層瘤(PNET)。大多數(shù)成神經(jīng)管細(xì)胞瘤發(fā)生于小腦，然后，它們也可發(fā)生于其它區(qū)域。腦膜瘤 發(fā)源于腦膜，它們通常是良性的。因?yàn)檫@些腫瘤生長(zhǎng)非常緩慢，腦組織可調(diào)整適應(yīng)它們的存 在；腦膜瘤在其產(chǎn)生癥狀前通常生長(zhǎng)得較大。神經(jīng)鞘瘤是發(fā)生于施旺氏細(xì)胞的良性腫瘤，施 旺細(xì)胞產(chǎn)生髓磷脂保護(hù)聽神經(jīng)。聽神經(jīng)瘤是神經(jīng)鞘瘤的一種類型。顱咽管瘤發(fā)生于腦垂體 腺靠近視丘下部，通常為良性。然而，有時(shí)認(rèn)為它們是惡性的，因?yàn)樗鼈儠?huì)壓迫或破壞視丘下部，影響重要功能。生殖細(xì)胞瘤起源于原始的性細(xì)胞，或生殖細(xì)胞。腦部最常見的生殖細(xì) 胞腫瘤是生殖細(xì)胞瘤。松果體區(qū)瘤發(fā)生在松果腺或其周圍。這一腫瘤可以是緩慢生長(zhǎng)的松 果體細(xì)胞瘤或快速生長(zhǎng)的成松果體細(xì)胞瘤。松果體部位很難觸及，因此這些腫瘤通常不能 清除。對(duì)腦部腫瘤的治療取決于很多因素。包括類型、部位和腫瘤的大小以及病人的年 齡和健康程度。通常腦部腫瘤通過外科手術(shù)、放療和化療來治療。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供 了一種抑制成神經(jīng)瘤細(xì)胞和神經(jīng)腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展的方法，其包括對(duì)患有成神經(jīng)細(xì)胞瘤或神 經(jīng)腫瘤的病人施用含RAP環(huán)肽的組合物。另一方面，所述RAP環(huán)肽可與對(duì)治療神經(jīng)瘤有用 的制劑綴合。GDNF在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明預(yù)期治療神經(jīng)退行性疾病的方法，其包括施用 與神經(jīng)生長(zhǎng)因子(如，膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF))綴合的RAP環(huán)肽。這些神經(jīng)退 行性疾病包括但不限于帕金森病。GDNF最初從大鼠的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系上清液中純化而來，作 為胚胎中腦多巴胺能神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)因子。在體內(nèi)，⑶NF同型二聚體與其受體GFRa-1 (可 能也是一個(gè)二聚物)結(jié)合，然后⑶NF-GFRa -1復(fù)合物與Ret蛋白結(jié)合，使其二聚體化。Ret 的二聚體化導(dǎo)致酪氨酸1062自磷酸化。研究表明GDNF對(duì)其他神經(jīng)亞群有著顯著的影響。 因?yàn)棰荖F保護(hù)帕金森病動(dòng)物模型中的多巴胺神經(jīng)元，并在體內(nèi)挽救運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，因此⑶NF 期望用來作為治療幾種神經(jīng)退行性疾病的治療制劑。然而，GDNF不能穿過血腦屏障。本發(fā) 明提供了轉(zhuǎn)運(yùn)GDNF跨過血腦屏障的方法，其包括使用綴合至GDNF的RAP環(huán)肽。iii肝臟疾病使用本發(fā)明RAP環(huán)肽或其綴合物治療的肝臟疾病，包括但不限于以下討論的那些 疾病。肝細(xì)胞瘤或肝臟腫瘤是世界第五大最常見的癌癥，其發(fā)生率穩(wěn)步上升。肝細(xì)胞瘤是 一種肝細(xì)胞疾病。致瘤性肝細(xì)胞保持著高水平的LRP1表達(dá)。肝細(xì)胞瘤對(duì)化療反應(yīng)不是很 好，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞表現(xiàn)出高度的抗藥性，并且因?yàn)橄到y(tǒng)性(靜脈給藥)給藥化療有嚴(yán)重的毒 性，尤其對(duì)心臟和腎臟。肝炎是肝臟炎癥的一般術(shù)語(yǔ)。肝炎可是急性或慢性的并包括急性或慢性肝衰竭， 如，因?yàn)椴《?如，肝炎病毒A, B, C，D，或E，或非ABCDE, CMV(巨細(xì)胞病毒)，Epstein-Barr 病毒)，真菌，里克次氏體屬微生物，或寄生蟲感染，酒精，化學(xué)毒素，藥物(如，對(duì)乙酰氨基 酚，胺碘酮，異煙胼，氟烷，氯丙嗪，紅霉素)，代謝性肝病(如，威爾遜病，a 1-抗胰蛋白酶缺 乏癥)，癌癥，先天自身免疫疾病，肝硬化(如，原發(fā)性膽汁肝硬化)，膽道堵塞等引起。肝臟 感染A，B或C型肝炎病毒可引起導(dǎo)致肝衰竭的緩慢進(jìn)展的肝臟疾病。急性肝炎感染最常見 由感染A型肝炎病毒引起。B和C型肝炎病毒可同時(shí)感染身體，演變?yōu)殚L(zhǎng)時(shí)間感染(慢性)。 C型肝炎病毒可引起嚴(yán)重的病變，包括肝硬化和癌癥。本發(fā)明涵蓋的其他肝臟疾病或病變可通過施用綴合至RAP環(huán)肽的組合物治療，其 包括肝脂肪變(美國(guó)專利6，596，762)，膽汁淤積(美國(guó)專利6，069，167)，肝硬化，中毒性肝 損傷，肝切除后的病變，膽管阻塞。能夠與RAP環(huán)肽綴合來治療肝臟疾病的候選藥物包括但不限于5_氟尿嘧啶，多 柔比星(阿霉素)，絲裂霉素C，順鉬，表柔比星，柔紅霉素，依托泊苷以及其他化療表1中 所列的化學(xué)藥物，阿德福韋，拉米夫定，恩替卡韋，利巴韋林，干擾素a，聚乙二醇化干擾素a -2a,，干擾素a -2b及其他抗病毒劑，維生素E，熊去氧膽酸，以及其他用于治療肝臟疾病 的制劑。
表 1
米托坦分化劑氨魯米特視黃酸衍生物細(xì)胞因子激素和拮抗劑干擾素(《，P, 丫) 白介素-2腎上腺皮質(zhì)類固醇/拮抗劑強(qiáng)的松和等同物地塞米松光敏刑氨魯米特血卟啉衍生物(ainoglutethimide)Photofrin 苯并卟啉衍生物Npe6黃體制初卟啉錫(SnET2>己酸羥孕酮pheoboride-a醋酸甲羥孕酮細(xì)菌葉綠素-a醋酸甲地孕酮萘躍箐(naphthalocyanines)雌激素苯二甲藍(lán)染料己烯雌酚(phthalocyanines)乙炔雌二醇/等同物鋅笨二甲藍(lán)染料抗雌激素物質(zhì)放射物他莫昔芬X-射線雄性激素紫外線睪酮丙酸鹽伽瑪輻射氟曱睪酮/等同物可見光紅外線輻射抗雄激素物質(zhì)微波輻射
氟他胺
促性腺激素釋放劑 激素類似物 亮兩端林
非類固酵類抗雄性激素物 氟他胺iv.癌癥Matriptase在上皮癌中過量表達(dá)，如，卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié) 腸癌或胃癌。其他實(shí)施例包括肺間皮瘤、黑色素瘤、非小細(xì)胞性肺癌、膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞(肝)瘤、甲狀腺癌、膀胱癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、腎臟癌癥、胰腺癌、非黑色素皮膚癌。RAP 環(huán)肽可用于抑制matriptase活性，或作為遞送細(xì)胞毒性或其他癌癥治療試劑的靶向制劑。已經(jīng)確定LRP6在結(jié)腸和乳腺癌中過量表達(dá)。RAP環(huán)肽可用于抑制LRP6的活性，或 作為遞送細(xì)胞毒性或其他癌癥治療試劑的靶向試劑?？墒褂帽景l(fā)明的RAP環(huán)肽或其綴合物治療的其他癌癥還包括伯基特淋巴瘤、非霍 奇金氏淋巴瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤以及白血病。V，骨代謝疾病可使用本發(fā)明的RAP環(huán)肽和綴合物治療的骨代謝疾病包括與相關(guān)的骨的疾病 (如，異常骨沉積、異常骨流失或骨弱化(bone weakening))骨質(zhì)疏松癥，骨骼石化癥，骨 發(fā)炎，關(guān)節(jié)炎，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，皮質(zhì)醇增多癥，性腺機(jī)能衰退，原發(fā)或繼發(fā)的甲狀 旁腺功能亢進(jìn)，或甲狀腺亢進(jìn)，血鈣過多，維生素D缺乏狀態(tài)(如，佝僂病/骨軟化，壞血病， 營(yíng)養(yǎng)不良)，吸收障礙綜合征，慢性腎衰(腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良)，慢性肝臟疾病(肝性骨營(yíng)養(yǎng)不 良)，老化，臥床，藥物引起的骨質(zhì)疏松癥(糖皮質(zhì)激素或類固醇，肝磷脂，酒精)或遺傳疾病 (成骨不全癥，高胱氨酸尿癥)，骨轉(zhuǎn)移癌，骨髓瘤，骨折，骨移植，纖維結(jié)構(gòu)不良，和/或佩奇 病。C. RAP環(huán)肽綴合物及活化劑RAP環(huán)肽和活化劑可通過本領(lǐng)域已知的任何方法結(jié)合。它們可生理連接，如，通過 共價(jià)化學(xué)鍵、物理作用力例如，范德華力或氫鍵，包囊作用，包埋或其結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方 式中，所述治療劑與RAP環(huán)肽通過共價(jià)化學(xué)鍵生理結(jié)合。正如，優(yōu)選的化療劑含有官能團(tuán) 如，醇、酸、羰基、硫醇或胺基團(tuán)，用于綴合RAP肽。阿霉素是胺類的，同時(shí)也有可能通過羰基 來結(jié)合。紫杉醇是醇類。不含適合的綴合基團(tuán)的化療劑可添加這種基團(tuán)進(jìn)一步修飾。所有 這些化合物均包括在本發(fā)明之內(nèi)。在有多種治療劑的情況下，可使用各種綴合物的組合。在一些實(shí)施方式中，共價(jià)化學(xué)鍵可直接(沒有干擾原子)或間接(通過連接體，如 共價(jià)連接原子鏈)連接RAP肽和活化劑。在一些實(shí)施方式中，所述RAP肽和所述綴合物的 活化劑部分通過RAP肽原子和活化劑的原子之間的共價(jià)鍵直接連接。在其他實(shí)施方式中， RAP肽與活化劑部分通過連接體相連，該連接體包含能夠?qū)⑺鯮AP肽與所述活化劑部分 相連的共價(jià)鍵或差不多任何氨基酸序列或任何分子或原子的肽。在一些實(shí)施方式中，所述連接體包含長(zhǎng)度從1至約60，或1至30個(gè)原子或更長(zhǎng)，2 至5個(gè)原子，2至10個(gè)原子，5至10個(gè)原子或10至20個(gè)原子的原子鏈。在一些實(shí)施方式 中，所述鏈原子均為碳原子。在一些實(shí)施方式中，所述鏈原子選自C、0、N和S。鏈原子和連 接體可根據(jù)其預(yù)期溶解度(親水性)選擇，以提供更高可溶性的綴合物。在一些實(shí)施方式 中，所述連接體提供經(jīng)受在溶酶體中酶的攻擊的官能團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，所述連接體提 供經(jīng)受在目標(biāo)組織或器官中發(fā)現(xiàn)的酶的攻擊的官能團(tuán)，并且在受攻擊或水解時(shí)在所述活化 劑和所述RAP肽之間起連接體的作用。在一些實(shí)施方式中，所述連接體提供在目標(biāo)位點(diǎn)發(fā) 現(xiàn)的條件下(如，溶酶體的低PH)經(jīng)受水解的官能團(tuán)。連接體可含有一個(gè)或多個(gè)這樣的官 能團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，所述連接體的長(zhǎng)度足以降低所述一個(gè)或兩個(gè)RAP肽結(jié)合位點(diǎn)與 活化劑結(jié)合位點(diǎn)之間的空間位阻電位(當(dāng)活化劑較大時(shí))。如果連接體是共價(jià)鍵或肽，活化劑是多肽，整個(gè)綴合物可是融合蛋白。這樣的肽連 接體可以是任何長(zhǎng)度。示范性連接體為約1-50個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，5至50，3至5，5至10，5至15，或10至30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。這樣的融合蛋白可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的重 組基因工程方法來獲得。在一些實(shí)施方式中，綴合物的RAP肽部分被制成迅速降解或清除 的劑型以便釋放活性化合物。在其他實(shí)施方式中，連接體在細(xì)胞內(nèi)，或更優(yōu)選的，在溶酶體 環(huán)境條件下經(jīng)受裂解，以從所述RAP肽部分釋放或分離活化劑部分。所述綴合物可含有一個(gè)或多個(gè)連接在相同RAP肽的活化劑。例如，綴合反應(yīng)可綴 合約1-5，約5，約1-10，約5-10，約10-20，約20-30，約30，或更多的活化劑分子到RAP肽 上。這些制劑可作為混合物來使用，或它們可純化成為特殊的化學(xué)計(jì)量制劑。本領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員可確定哪一種形式和哪一種化學(xué)計(jì)量比率是優(yōu)選的。進(jìn)一步地，人們期望實(shí)現(xiàn) 超過一種活化劑可與RAP肽連接，遞送一種以上的制劑到所需靶位點(diǎn)或間隔。大多數(shù)的活 化劑種類可附在相同的RAP肽上，例如，阿霉素-順鉬RAP肽綴合物。因此，綴合物可含有 一定化學(xué)計(jì)量比率并結(jié)合超過一種類型的活化劑。這些也可分為純化的混合物或它們以聚 集物使用。本發(fā)明的RAP環(huán)肽，或其綴合物，可根據(jù)需要修飾來提高穩(wěn)定性或藥物動(dòng)力學(xué)特 性(如，通過PEG化)?？梢灶A(yù)見的是本發(fā)明的RAP肽可被融合或連接治療性蛋白，如，膠質(zhì)細(xì)胞來源的 神經(jīng)生長(zhǎng)因子(⑶NF)，腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，以及其他本領(lǐng)域 已知的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，ADAM10，作用于APP或A0的其它蛋白酶，MESD，癌癥化療劑，蛋白酶 抑制劑，自身免疫性抗原，促凋亡分子，溶酶體酶，DNA或siRNA?？梢灶A(yù)見的是，這些制劑與 對(duì)含CR蛋白具有改進(jìn)的親和力和結(jié)合選擇性的RAP環(huán)肽的融合，可促進(jìn)跨血腦屏障的運(yùn)輸 增加或至其他組織位點(diǎn)的運(yùn)輸增加。在一個(gè)方面，可以預(yù)見的是在靜脈內(nèi)、皮下、肌肉、心室 內(nèi)、鞘內(nèi)或腦室內(nèi)給予所述綴合物后與RAP環(huán)肽的綴合引起組織分布的改變或改善綴合物 的遞送。本發(fā)明進(jìn)一步提供綴合至RAP環(huán)肽導(dǎo)致活化劑藥理學(xué)活性改變，其通過一個(gè)或多 個(gè)下述效應(yīng)增加的效力，對(duì)不同于想要的靶受體或組織的受體或組織的結(jié)合減少，對(duì)想要 的靶受體或組織的受體或組織結(jié)合增加，到達(dá)想要的靶受體或組織的受體或組織的通路增 加，改變的體內(nèi)清除率，以及改變的對(duì)蛋白的免疫反應(yīng)特征。本發(fā)明進(jìn)一步提供了 RAP環(huán)肽可綴合治療性核酸，如DNA或siRNA，以改善所 述核酸的組織選擇性分布，促進(jìn)所述核酸胞吞進(jìn)入細(xì)胞(Kim等人，(2004)Bioconjugate Chemistry 15,326-332)。D活化劑根據(jù)本發(fā)明的活化劑包括能夠影響生物學(xué)過程的試劑。本發(fā)明中用于化合物組 合物及方法中的具體優(yōu)選活化劑是治療試劑，包括藥物或診斷試劑。術(shù)語(yǔ)“藥物”或“治療 試劑”指當(dāng)施用有效治療劑量時(shí)，具有藥理學(xué)作用或有益于健康的活化劑。特別首選的試 劑是天然存在的生物學(xué)試劑(如，酶、蛋白、多核苷酸、抗體、多肽、納米顆粒、糖蛋白綴合物 (glyconjugates))。藥物或治療試劑的例子包括用于預(yù)防/診斷/減緩/治療或治愈疾病 或病變的物質(zhì)。特別預(yù)期不引發(fā)疾病的試劑。i.蛋白活化劑所述活化劑可以是非蛋白或蛋白?；罨瘎┛梢允堑鞍谆蛎?，或者仍保持著一些、基 本上全部、或所有治療或生物學(xué)活性的蛋白或酶的任何片段。在一些實(shí)施方式中，蛋白或酶是一種這樣的蛋白如果不表達(dá)或產(chǎn)生，或者表達(dá)或產(chǎn)生的量基本上減少則會(huì)引起疾病，其 包括但不限于，溶酶體貯積癥。所述蛋白或酶優(yōu)選來源或得自人或小鼠。
在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式中，當(dāng)與RAP環(huán)肽綴合的活化劑是蛋白或酶，或其具有這 種蛋白或酶的生物活性的片段時(shí)，這種活化劑具有與人或哺乳動(dòng)物的蛋白或酶相應(yīng)部分氨 基酸序列相同的氨基酸序列。在其他的實(shí)施方式中，這種綴合物的活化劑部分是對(duì)于人類 或哺乳動(dòng)物物種而言是天然的蛋白或酶。在其他實(shí)施方式中，這種蛋白或酶，或其片段對(duì)這 種相應(yīng)的人或哺乳動(dòng)物的蛋白或酶天然序列而言是基本上同源的(即在長(zhǎng)度至少10，25， 50，100，150或200個(gè)氨基酸或活化劑全長(zhǎng)的氨基酸序列上至少80%，85%，90%，95%，更 優(yōu)選98 %，或最優(yōu)選99 %的氨基酸序列相同)。若所述化合物為蛋白，則所述化合物可為酶，或仍保持一些、基本上全部或全部酶 活性的酶片段。在治療溶酶體貯積病中，所述酶優(yōu)選是在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)、且如果不表達(dá)或表達(dá) 或生成大量減少將導(dǎo)致溶酶體貯積病的酶。所述酶優(yōu)選來自或得自人或小鼠。所述酶優(yōu)選 溶酶體貯積酶，如a -L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，類肝素-N-硫酸酯酶， a -N-乙酰葡糖胺糖苷酶，芳基硫酸酯酶A，半乳糖神經(jīng)鞘氨醇酶，酸性a -葡萄糖苷酶，三 肽基肽酶，a-己糖胺酶，酸性神經(jīng)鞘磷脂酶，半乳糖苷酶，或任何其他溶酶體貯積酶。因此，在一些實(shí)施方式中，在治療人溶酶體貯積癥(LSDs)中，所述RAP環(huán)肽綴合 物包括活化劑蛋白或酶，其在待治療的個(gè)體或患者的溶酶體內(nèi)是不足的。這些酶包括例如 a -L-艾杜糖苷酸酶，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，類肝素-N-硫酸酯酶，a _N_乙酰葡糖胺糖 苷酶，芳基硫酸酯酶A，半乳糖神經(jīng)鞘氨醇酶，酸性a -葡萄糖苷酶，硫酯酶，己糖胺酶A，酸 性神經(jīng)鞘磷脂酶，3 _半乳糖苷酶，和任何其他溶酶體貯積酶。溶酶體貯積癥及其缺陷蛋白， 這些蛋白用作活化劑，列表如下 因此，采用本發(fā)明的方法可被治療或預(yù)防的溶酶體貯積病包括但不限于粘多糖貯 積病I (MPS I)，MPS II，MPS IIIA，MPS IIIB，異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(MLD)，克拉伯病，龐 皮病，神經(jīng)細(xì)胞蠟樣脂褐素癥(CeroidLipofuscinosis)，泰-薩病，A型尼曼-皮克病/B型 尼曼_皮克病和其他溶酶體病。因此，根據(jù)上面的表格，就每一疾病而言，所述綴合劑應(yīng)優(yōu)選包含在這種疾病中缺 失的特異性活化劑酶。例如，對(duì)于涉及MPS I的方法，優(yōu)選的化合物或酶是a-L-艾杜糖苷 酸酶。對(duì)于涉及MPS II的方法，優(yōu)選的化合物或酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。對(duì)于涉及 MPS IIIA的方法，優(yōu)選的化合物或酶是類肝素-N-硫酸酯酶。對(duì)于涉及MPS IIIB的方法， 優(yōu)選的化合物或酶是a-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。對(duì)于涉及異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(MLD)I的方法，優(yōu)選的化合物或酶是芳基硫酸酯酶A。對(duì)于涉及克拉伯病的方法，優(yōu)選的化合物或 酶是半乳糖神經(jīng)鞘氨醇酶。對(duì)于涉及龐皮病的方法，優(yōu)選的化合物或酶是酸性a-葡萄糖 苷酶。對(duì)于涉及CLN的方法，優(yōu)選的化合物或酶是三肽基肽酶。對(duì)于涉及Tay-Sachs的方 法，優(yōu)選的化合物或酶是a-己糖胺酶。對(duì)于涉及尼曼-皮克病A和B的方法，優(yōu)選的化合 物或酶是酸性神經(jīng)鞘磷脂酶。RAP環(huán)肽綴合物可包括一個(gè)或多個(gè)與RAP環(huán)肽連接的活化劑部分(如1-10或4-2 或2-3部分)。例如綴合反應(yīng)可為1-4或更多個(gè)a -L-艾杜糖苷酸酶分子綴合到單一 RAP 環(huán)肽。這些制劑可以混合物使用，或它們被純化為特異性RAP環(huán)肽-活化劑化學(xué)計(jì)量制劑。 本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定哪種形式和哪種化學(xué)計(jì)量比是優(yōu)選的。此外，為了促進(jìn)被貯積的底 物更加完全降解，一個(gè)或多個(gè)不同的活化劑可連接到任何給定的RAP環(huán)肽分子。這些綴合 活化劑的RAP環(huán)肽可包括化學(xué)計(jì)量比的范圍。它們也可分成純化的混合物或以聚集物使 用。在融合體內(nèi)RAP環(huán)肽和LSD的次序可能是重要的。因此，在一些實(shí)施方式中，所述RAP 環(huán)肽為N-端結(jié)合LSD酶，而在另一些實(shí)施例中，所述RAP環(huán)肽為C-端結(jié)合LSD酶。這些綴合活化劑的RAP環(huán)肽可進(jìn)入或被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入或最終定位于屬于或不屬于CNS 的細(xì)胞的溶酶體中。這種綴合試劑的遷移效率可由調(diào)控受體轉(zhuǎn)運(yùn)活性的任何化合物或蛋白 調(diào)節(jié)。這類細(xì)胞可來自受溶酶體貯積癥影響的任何組織或器官系統(tǒng)。例如這些細(xì)胞可為內(nèi) 皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、肺細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、腎細(xì)胞或肝細(xì)胞。在一 些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞優(yōu)選為在BBB內(nèi)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為神經(jīng) 元或腦細(xì)胞。在其他實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為外周的細(xì)胞或不能通過內(nèi)皮組織從全身循環(huán) 分離的細(xì)胞，如BBB中的細(xì)胞。ii.藥物活化劑通常，藥物活化劑可為任何大小。優(yōu)選的藥物為能結(jié)合于目的靶點(diǎn)的有機(jī)小分子。 這種綴合物的藥物部分為小分子時(shí)，常有至少約50D的分子量，通常為至少約100D分子量， 其中分子量可為500D大或更大，但通常不超過約2000D。在上述治療方法的實(shí)施中，所述藥物部分可與被給藥的宿主內(nèi)的靶點(diǎn)相互作用。 這種靶點(diǎn)為許多種不同類型夫的天然存在的結(jié)構(gòu)，其中目的靶點(diǎn)包括細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的靶 點(diǎn)，其中這些靶點(diǎn)可為蛋白、磷脂、核酸等，其中蛋白是優(yōu)選的目標(biāo)。特定的蛋白性的目的靶 點(diǎn)包括但不限于酶，如激酶、磷酸酶、還原酶、環(huán)氧合酶、蛋白酶等，靶點(diǎn)包含涉及蛋白-蛋 白相互作用的結(jié)構(gòu)域，如SH2，SH3，PTB和PDZ結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)蛋白，如肌動(dòng)蛋白、微管蛋白等， 膜受體，免疫球蛋白，如IgE，細(xì)胞黏合受體，如整聯(lián)蛋白等，離子通道，膜轉(zhuǎn)運(yùn)泵，轉(zhuǎn)錄因子， 信號(hào)蛋白等。在一些實(shí)施方式中，所述活化劑或藥物具有羥基或氨基基團(tuán)以與異氰酸酯試劑反 應(yīng)或活化劑被化學(xué)修飾以便引入羥基或氨基基團(tuán)以與異氰酸酯試劑反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，所述活化劑或藥物包括可被修飾和/或參與共價(jià)連接的區(qū) 域，優(yōu)選活化劑沒有所需的生物活性的喪失。所述藥物部分通常包括帶有一個(gè)或多個(gè)的上 述官能團(tuán)取代的碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香或多芳香族結(jié)構(gòu)。另外目的藥物部分是可在生 物分子、蛋白、酶、多糖和多聚核酸中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)，包括肽、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、 衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或其組合。合適的活化劑包括但不限于精神藥理學(xué)試劑，如(1)中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制藥物，例如，全身麻醉藥(巴比妥類，苯二氮萆類，類固醇類，環(huán)己酮衍生物和雜項(xiàng)試劑)，鎮(zhèn)靜 催眠藥(苯二氮萆類，巴比妥類，哌啶二酮類和三酮類，喹唑啉衍生物，氨基甲酸酯，醛及 衍生物，酰胺，無環(huán)酰脲，苯丙氮(benzazepines)和相關(guān)藥物，吩噻嗪等)，中央隨意肌 張力調(diào)節(jié)藥物(抗驚厥藥如乙內(nèi)酰脲，巴比妥類，噁唑烷二酮，丁二酰亞胺類，無環(huán)酰脲 (acylureides)，戊二酰亞胺，苯二氮萆類，仲醇和叔醇，二苯阿嗪吡丁(dibenzaz印ine) 衍生物，丙戊酸及其衍生物，GABA類似物等)，止痛劑(嗎啡及衍生物，東罌粟堿衍生物， 嗎啡南衍生物，苯基哌啶，2，6-甲烷3-苯雜坐卡因(benzazocaine)衍生物，二苯基丙胺 (diphenylpropylamines)和等排物，水楊酸，對(duì)氨基苯酚衍生物，5_吡唑啉酮衍生物，芳基 乙酸(arylaceticacid)衍生物，芬那酸(fenamates)和等排物等)，以及止吐藥(抗膽堿 能藥物，抗組胺藥物，抗多巴胺能藥物等)，(2)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，例如，蘇醒藥(呼吸 興奮劑，驚厥興奮劑，精神運(yùn)動(dòng)興奮劑)，麻醉藥拮抗藥(嗎啡衍生物，東罌粟堿衍生物，2， 6-甲烷3-苯并噁嗪(benzoxacine)衍生物，嗎啡南衍生物)促智藥(3)精神藥理學(xué)藥物， 例如，抗焦慮鎮(zhèn)靜藥物(苯二氮革類，丙二醇氨基甲酸酯)抗精神病藥(吩噻嗪衍生物，硫 代黃嘌呤(thioxanthine)衍生物，其他三環(huán)類化合物，丁酰苯衍生物和等排物，二苯基丁 胺衍生物，取代的苯甲酰胺類，芳基哌嗪衍生物，吲哚衍生物等)，抗抑郁藥(三環(huán)類化合 物，MA0抑制劑等)，⑷呼吸道的藥物，例如，中樞性鎮(zhèn)咳藥(鴉片類生物堿及其衍生物)； 藥效動(dòng)力學(xué)制劑，如(1)周圍神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，如局部麻醉劑(酯衍生物，酰胺衍生物)， (2)作用于突觸或神經(jīng)感受器接觸位點(diǎn)的藥物，如膽堿能劑，膽堿能阻斷劑，神經(jīng)肌肉阻斷 劑，腎上腺素能劑，抗腎上腺素劑，(3)平滑肌活性藥物，如解痙藥(抗膽堿能藥物，向肌性 解痙藥(musculotropic spasmolytics)，血管擴(kuò)張劑，平滑肌興奮劑，(4)組胺和抗組胺 藥，如組胺和其衍生物(倍他唑)，抗組胺藥(HI受體拮抗劑，H2受體拮抗劑)，組胺代謝藥 物，(5)心血管藥物，如強(qiáng)心劑(植物提取物，丁烯羥酸內(nèi)酯，戊二烯醇(pentadienolids)， 來自格木(erythrophleum)屬的生物堿，離子載體，腎上腺素受體興奮劑等)，抗心律失常 藥物，抗高血壓藥，降血脂劑(氯貝酸衍生物，煙酸衍生物，激素及類似物，抗生素，水楊酸 及衍生物)，抗靜脈曲張藥，止血?jiǎng)?6)血液和造血系統(tǒng)藥物例如，抗貧血藥品，血液凝固 的藥物(止血?jiǎng)鼓獎(jiǎng)?，抗血栓劑，溶栓劑，血液蛋白及其成?，(7)胃腸道藥物，如助 消化劑(健胃藥，利膽劑)，抗?jié)兯幬?，止瀉劑，(8)局部作用藥物；化療藥物，如(1)抗感 染藥，例如，殺體外寄生蟲藥(氯化烴，除蟲菊素(pyrethins)，硫化化合物)，驅(qū)蟲藥，抗原 蟲劑，抗瘧疾藥物，抗阿米巴藥，抗利什曼蟲藥，抗毛滴蟲劑，抗錐體蟲劑，磺胺藥，抗分支桿 菌藥物，抗病毒化療藥等，(2)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，即抗腫瘤藥物或細(xì)胞毒類藥物，如烷化劑， 如氮芥鹽酸鹽(氮芥，Mustargen，HN2)，環(huán)磷酰胺(Cytovan，Endoxana)，異磷酰胺(IFEX)， 苯丁酸氮芥(留可然)，美法侖(苯丙氨酸芥，L-溶肉瘤素，愛克蘭，L-PAM)，白消安(馬 利蘭)，噻替哌(三亞乙基硫化磷酰胺)，卡氮芥(BiCNU，BCNU)，洛莫司汀(CeeNU，CCNU)， 鏈佐星(Zanosar)等，植物生物堿，如長(zhǎng)春新堿(安可平)，長(zhǎng)春堿(Velban，Velbe)，紫杉 醇(泰素)等，抗代謝藥物，如甲氨喋呤(MTX)，巰基嘌呤(巰嘌呤，6-MP)，鳥嘌呤(6-TG) 和氟尿嘧啶(5-FU)，阿糖胞苷(Cytosar-U，Ara_C)，氮雜胞苷(Mylosar，5-AZA)等；抗生 素，如更生霉素(放線菌素D，Cosmegen)，多柔比星(阿霉素)，柔紅霉素(duanomycin， Cerubidine)，去甲氧柔紅霉素(Idamycin)，博萊霉素(Blenoxane)，普卡霉素(光神霉素， 光輝霉素)，絲裂霉素(自力霉素)等，以及其他抗細(xì)胞增殖劑，如羥基脲(羥基脲)，甲基芐胼(Mutalane)，達(dá)卡巴嗪(DTIC-Dome)，順鉬(鉬)，卡鉬(碳鉬)，門冬酰胺酶(Elspar)，依 托泊苷(VePesid，VP-16-213)，安吖啶(Amsarcrine) (AMSA，m_AMSA))，米托坦(Lysodren), 米托蒽醌(Novatrone)等等。首選化療藥物是那些藥物，其以游離形式在所需劑量下表現(xiàn) 不可接受的全身毒性。通過與RAP環(huán)肽連接，與這些藥物的治療水平相關(guān)的總體全身毒性 可降低。特別優(yōu)選的是用于治療但劑量受心臟毒性限制的心臟毒性化合物。一個(gè)典型的例 子是阿霉素(也稱為多柔比星)及其類似物，如柔紅霉素。RAP環(huán)肽與這種藥物連接可以防 止活化劑和相關(guān)的心臟毒性在心臟積累。合適的活化劑包括但不限于抗生素如氨基糖苷類抗生素，如阿米卡星，安普霉 素，阿貝卡星，班貝霉素，布替羅星，地貝卡星，雙氫鏈霉素，福提霉素，慶大霉素，異帕米星， 卡那霉素，小諾米星，新霉素，奈替米星，巴龍霉素，核糖霉素，西索米星，壯觀霉素，鏈霉素， 妥布霉素，丙大觀霉素；酰胺醇類(amphenicols)，如疊氮氯霉素，氯霉素，氟苯尼考和甲砜 霉素(theimaphenicol)；安莎霉素類，如利福酰胺，利福平，利福霉素，利福噴丁，利福昔 明4 -內(nèi)酰胺類，如碳頭孢烯類，碳青霉烯類抗生素，頭孢菌素，頭孢霉素(cehpamycins)， 單環(huán)內(nèi)酰胺類，氧頭孢烯(oxaphems)，青霉素；林可酰胺類抗生素，如氯林肯霉素 (clinamycin)，林可霉素；大環(huán)內(nèi)酯類，如克拉霉素，地紅霉素，紅霉素等；多肽，如安福霉 素，桿菌肽，卷曲霉素等；四環(huán)素，例如阿哌環(huán)素，金霉素，氯莫環(huán)素等；合成抗菌劑，如2， 4- 二氨基嘧啶，硝基呋喃類藥物，喹諾酮類及其類似物，磺胺類藥，砜；合適的活化劑包括但不限于抗真菌劑，如多烯，如兩性霉素B，克念菌素，制皮 菌素，菲利平，制霉色基素，曲古霉素，哈霉素，魯斯霉素，甲帕霉素，納他霉素，制霉菌素，培 西洛星，表霉素；合成抗真菌藥物如烯丙基胺類，如布替萘芬，萘替芬，特比萘芬；咪唑類， 如聯(lián)苯芐唑，布托康唑，氯海因，氯芐甲咪唑等，硫代氨基甲酸酯類，例如甲苯硫萘酯，三唑 類，如氟康唑，伊曲康唑，特康唑；合適的活化劑包括但不限于驅(qū)蠕蟲藥，如檳榔堿，綿馬素，綿馬酚，雙氯酚，酸藤 子酚，苦蘇素，萘(napthalene)，氯硝柳胺，石榴皮堿，奎納克林，土木香內(nèi)酯，阿莫卡嗪，硝 硫氰胺，驅(qū)蛔素，芐酚寧，雙硫氰苯，四氯化碳，香芹酚，環(huán)苯達(dá)唑，乙胺嗪等；合適的活化劑包括但不限于抗瘧藥，如二乙酰氨苯砜，酚喹，蒿乙醚，蒿甲醚， 青蒿素，青蒿琥酯，阿托伐醌，比比林(bebeerine)，黃連素，基拉策，氯胍，氯喹，氯丙胍，金 雞納，辛可尼定，辛可寧，環(huán)氯胍，龍膽苦苷，氯氟菲醇，羥基氯喹，甲氟喹鹽酸鹽，3-甲基對(duì) 乙酰氨基苯胂酸(methylarsacetin)，撲瘧喹啉，甲氧胺喹，伯氨喹，乙胺嘧啶，阿的平，奎尼 丁，奎寧，喹西特，喹啉，砷酸二鈉；合適的活化劑包括但不限于抗原蟲劑，如氯甲氧吖胺，替硝唑，異丙硝噠唑，乙 睇胺，噴他脒，乙酰胂胺，醋胺硝唑，茴香霉素，硝呋噁酮，替硝唑，聯(lián)苯唑(benzidazole)，蘇 拉明等等。作為活化劑的合適藥物也已被列舉在Goodman and Gilman ‘ s， ThePharmacological Basis of Therapeutics (第 9 版本)(Goodman 等編)(McGraw-Hill) (1996)；以及 1999 Physician' s Desk Reference (1998)。合適的活化劑包括但不限于如下美國(guó)專利公開的抗腫瘤藥5，880，161,5，877，206, 5，786，344, 5，760，041, 5，753，668, 5，698，529, 5，684，004,5，665，715,5，654，484,5，624，924,5，618，813,5，610，292,5，597，831,5，530;,026, 5,,525，633,5，525，606,5，512，678, 5，508;,277,5，463:,181,5,,409，893，5，358;，952，5，318，965, 5，223，503,5，214，068,5，196;,424,5:’ 109;,024,5，106，996，5，101;,072,5，077，404,5，071，848，5，066，493,5，019,,390, 4;,996,,229,4,996，206，4，970,,318,4,968，800,4，962，114，4，927，828,4，892，887,4;,889,,859,4，886，790，4，882，334,4,882，333,4，871，746，4，863，955,4，849，563,4;,845，216,4,833，145，4，824，955,4，785，085,4，684，747，4，618，685,4，611;,066,4，550;,187,4,,550，186，4，544;,501,4,541，956,4，532，327，4，490，540,4,399;,283,4:’ 391;,982,4，383，994，4，294;,763,4,283，394,4,246，411，4，214，089,4，150,,231,4:’ 147;,798,4,056，673，4，029，661,4, 012，448 ；
如下美國(guó)專利公開的精神藥理學(xué)的/丨治療精神病藥物
5，192，799, 5，036，070, 4，778，800, 4，753，951, 4，590，180，4，690，930，4，645;,773,4,427，694,4，424，202，4，440，781，5，686;,482, 5:’ 478;,828, 5，461，062，5，387;,593，5，387，586,5，256，664,5，192，799,5,120;,733,5，036;,070,4,,977，167，4，904;,663,4，788，188,4,778，800，4，753，951,4，690;,930, 4:’ 645;,773,4,,631，285，4，617;,314,4,613，600,4，590，180，4，560，684,4，548,,938,4:’ 529;,727,4,459，306，4，443,,451,4,440，781,4,427，694，4，424，202,4，397,,853,4;,358,,451,4,324，787，4，314,,081,4,313，896,4，294，828，4，277，476,4，267，328,4;,264，499,4，231，930，4，194，009,4，188，388,4,148，796，4，128，717,4,062，858,4;,031，226,4，020，072，4，018，895, 4,,018，779,4，013，672, 3，994，898, 3，968;,125,3，939;,152,3,,928，356，3，880，834，3，668，210 ；
如下美國(guó)專利公開的心血管藥物
4，966，967, 5，661，129, 5，552，411,5，332，737, 5，389，675,5，198，449，5，079;,247,4,966，967,4，874，760，4，954，526,5，051;,423,4:’ 888;,335,4，853，391，4，906;,634,4,775，757,4,727，072，4，542，160,4,522,,949,4;,524,,151,4,525，479，4，474,,804,4,520，026,4，520，026，5，869，478，5，859，239, 5;,837，702,5,807，889，5，731，322，5，726，171,5,723，457，5，705，523,5，696;,111,5，691:，3 3 2，5，,679，672，5，661;,129,5,654，294,5,646，276，5，637，586，5，631;,251, 5:’ 612;,370，5，612，323，5，574;,037, 5，563，170，5，552，411，5，552，397,5，547,,966, 5:,482,,925，5，457，118，5，414,,017,5,414，013，5，401，758，5，393，771,5,362,,902, 5;,332,,737,5,310，731，5，260,,444,5,223，516,5,217，958，5，208，245,5，202，330, 5;,198，449，5，189，036，5，185，362，5，140，031, 5，128，349，5，116，861, 5，079，247, 5;,070，099,5，061，813，5，055;,466,5,,051，423,5，036，065，5，026，712，5，OIL,931,5，006;,542,4,,981，843，4，977;,144,4,971，984,4，966，967，4，959，383,4,954;,526,4:’ 952;,692,4，939，137，4，906;,634,4,889，866,4，888，335，4，883，872,4，883,,811, 4;,847,,379,4,835，157，4，824,,831,4,780，538,4,775，757，4，774，239,4，771，047,4;,769,,371,4,767，756，4，762，837,4，753，946,4，752，616，4，749，715,4,738，978,4;,735，962,4,734，426，4，734，425,4，734，424,4,730，052，4，727，072,4，721，796,4’ 707;,550,4,,704，382，4，703;,120,4,681，970,4,681，882，4，670，560,4,670;,453,4，668,787,4,,663，337，4，663;,336,4，661，506,4，656，267，4，656，185,4,654;,357,4:’ 654;,356,4，654，355，4，654;,335,4，652，578,4,652，576,4，650，874,4;,650;,797,4，649:,139,4,,647，585，4，647;,573,4,647，565,4，647，561,4，645，836,4;,639;,461,4:’ 638;,012,4,638，011，4，632;,931,4,631，283,4,628，095,4，626，548,4,,614,,825, 4;,611,,007,4,611，006，4，611,,005,4，609，671,4,608，386,4,607，049,4,,607，048,4;,595,,692,4，593，042，4，593，029,4,591，603,4，588，743,4，588，742,4，588，741,4;,582，854,4,575，512，4，568，762,4,560，698,4，556，739,4，556，675,4;,555;,571,4，555;,570,4,,555，523，4，550;,120,4,542，160,4,542，157,4,542，156,4;,542;,155,4:’ 542;,151,4,537，981，4，537;,904,4,536，514,4,536，513,4,533，673,4;,526,,901,4:’ 526,900,4，525，479，4，524,,151,4,522，949,4，521，539,4，520，026,4,,517,,188,4;,482,,562,4,474，804，4，474,,803,4，472，411,4,466，979,4，463，015,4,456，617,4;,456，616,4,456，615，4，418，076,4,416，896,4，252，815,4,220，594,4,190，587,4;,177,280,4，164，586，4，151，297,4，145，443,4，143，054,4，123，550,4;,083;,968,4，076:,834,4,,064，259，4，064;,258,4，064，257,4，058，620,4，001，421,3;,993;,639,3:’ 991;,057, 3，982，010，3，980;,652,3,968，117,3,959，296，3，951，950, 3,,933,,834, 3:’ 925,,369,3，923，818，3，898,,210，3，897，442,3，897，441,3,886，157，3,,883,,540, 3;,873,,715,3,867，383，3，873，715，3，867，383，3，691，216，3，624，126
如下美國(guó)專利公開的抗微生物劑
5，902，594, 5，874，476, 5，874，436, 5，859，027, 5，856，320,5，854，242，5，811;,091, 5，786，350，5，783，177,5,773，469, 5;,762;,919，5’ 753;,715,5,,741，526，5，709;,870,5，707，990,5，696，117,5,684，042,5;,683;,709, 5:’ 656;,591,5,643，971，5，643;,950,5，610，196,5,608，056，5，604，262, 5,,595,,742，5:,576,,341,5,554，373，5，541,,2 3 3，5，534，546，5，534，508，5，514，715，5,,508，417，5;,464,,832, 5，428，073，5，428，016，5，424，396,5，399，553, 5，391，544,5，385，902,5;,359，066,5，356，803，5，354，862,5，346，913,5,302，592,5,288，693，5，266，567,5’ 254,685, 5,,252，745，5，209;,930,5，196，441,5,190，961, 5，175，160，5:,157;,051,5,096;,700, 5,,093，342，5，089;,251,5，073，570,5，061，702,5，037，809, 5;,036;,077,5:’ 010;,109,4,970，226，4，916;,156,4,888，434,4，870，093,4，855，318,4,,784,,991, 4;,746,,504,4,686，221，4，599,,228,4,552，882,4，492，700,4,489，098,4，489，085,4;,487,776,4,479，953，4，477，448,4,474，807,4，470，994,4，370，484,4,337，199,4;,311，709,4,308，283，4，304，910,4,260，634,4，233，311,4,215，131,4;,166;,122,4’ 141;,981,4,,130，664，4，089;,977,4,089，900,4，069，341,4,055，655,4;,049;,665,4:,044;,139,4,002，775，3，991;,201，3，966，968，3，954，868,3，936，393, 3;,917,,476, 3:,915;,889, 3，867，548，3，865，748，3，867，548，3，865，748，3，783，160，3，764，676，3，764，677 ；
如下美國(guó)專利公開的抗炎藥
5，872，109, 5，837，735, 5，827，837, 5，821，250, 5，814，648,5，780，026，5，776;,946,5，760，002,5，750，543, 5，741，798, 5;,739;,279, 5:’ 733;,9 3 9 j 5，723，481，5，716;,967, 5，688，949,5，686，488,5，686，471, 5;,686;,434,5，684:,204,5,,684，041，5，684;,031, 5，684，002, 5，677，318,5,674，891,5;,672;,620,5:’ 665;,752，5，656，661，5，635;,516,5,631，283，5，622，948，5，618，835, 5,,607,,9 5 9 j 5.,593,,980, 5，593，960，
385580888, 5552424, 5552422, 5516764, 5510361，5508026, 5500417，5498405, 5494927, 5476876,5472973,5470885,5470842,5464856，5464849,5462952,5459151，5451686, 5444043, 5436265, 5432181，RE034918，5，393，756,5，380，738,5，376，670, 5，360，811,5，354，768, 5348957，5347029, 5340815，5338753, 5324648, 5319099,5318971, 5312821，5302597, 5298633, 5298522,5298498,5290800,5290788,5284949，5280045,5270319,5266562，5256680, 5250700,5250552, 5248682，5244917，5240929，5234939，5234937, 5232939, 5225571, 5225418，5220025, 5212189，5212172，5208250,5204365,5202350,5196431，5191084,5187175,5185326,5183906, 5177079, 5171864, 5169963，5155122，5143929，5143928，5143927, 5124455, 5124347, 5114958，5112846,5104656, 5098613，5095037, 5095019，5086064,5081261，5081147，5081126,5075330,5066668,5059602, 5043457, 5037835，5037811,5036088, 5013850，5013751, 5013736，5006542,4992448，4992447,4988733,4988728,4981865,4962119,4959378,4954519，4945099,4942236,4931457,4927835,4912248,4910192,4904786，4904685,4904674,4904671,4897397,4895953,4891370,4870210，4859686,4857644,4853392,4851412,4847303,4847290,4845242，4835166,4826990,4803216,4801598,4791129,4788205,4778818，4775679,4772703,4767776,4764525,4760051,4748153,4725616，4721712,4713393,4708966,4695571,4686235,4686224,4680298，4678802,4652564,4644005,4632923,4629793,4614741,4599360，4596828,4595694,4595686,4594357,4585755,4579866,4578390，4569942,4567201,4563476,4559348,4558067,4556672,4556669，4539326,4537903,4536503,4518608,4514415,4512990,4501755，4495197,4493839,4465687,4440779,4440763,4435420,4412995，4400534,4355034,4335141,4322420,4275064,4244963,4235908，4234593,4226887,4201778,4181720,4173650,4173634,4145444，4128664,4125612,4124726,4124707,4117135,4027031,4024284，4021553,4021550,4018923,4012527,4011326，3998970，3998954，3993763，3991212，3984405, 3978227, 3978219，3978202, 3975543，3968224, 3959368, 3949082, 3949081, 3947475,3936450,3934018，3930005, 3857955,3856962,3821377,3821401, 3789121，3789123，3726，978，3，694，471，3，691，214，3，678，169，3，624，216 ；
如下美國(guó)專利公開的免疫抑制劑
4，450，159, 4，450，159, 5，905，085, 5，883，119,5,880，280,5，877，184，5874594，5843452, 5817672, 5，817，661, 5817660, 5801193，5，776，974，5763478, 5739169，5723466,5，719，176,5696156,5695，753,5，693，648，5，693645,5691346,5686，469，5，686，424, 5，679，705, 5679，640，5，670，504，5，665;,774,5，665，772, 5，648，376,5，639，455, 5,633;,277,5,624,930, 5,,622，970，5，605;,903, 5:’ 604，229,5，574，041,5，565，560,5,,550;,2 3 3，5 ■’ 545;,734,5,540，931，5，532;,248, 5;,527，820,5，516，797，5，514，688，5，512,,687, 5;,506,,2 3 3，5，506，228，5，494,,895, 5;,484，788，5，470，857,5，464，615，5，432，183，5;,431,,896,5，385，918，5，349，061, 5;,344，925, 5，330，993, 5，308，837,5，290，783,5;,290，772,5,284，877，5，284，840,5,,273，979,5，262，533,5，260，300,5;,252;,732,5，250;,678,5,,247，076，5，244;,896,5:’ 238，689,5，219，884，5，208，241, 5,,208;,228, 5:’ 202;,3 3 2，5，192，773，5，189;,042, 5;,169，851, 5，162，334,5，151，413，5,,149,,701，5:’ 147;,877,5,143，918，5，138,,051, 5;,093，338,5，091，389,5，068，323,5，068,,247, 5;,064,,835,5，061，728，5，055,,290,4;,981，792,4,810，692,4，410，696,4，346，096,4;,342，769,4,317，825，4，256，766，4，180，588，4，000，275，3，759，9219
如下美國(guó)專利公開的免疫調(diào)節(jié)劑
4，446，128, 4，524，147, 4，720，484, 4，722，899, 4，748，018,4，877，619，4，998;,931, 5:’ 049，387,5，118，509,5，152，980, 5,,256;,416, 5:’ 468;,729,5,583，139，5，604;,234, 5;,612，060,5，612，350,5,658，564,5,672,,605, 5;,681,,571,5,708，002，5，723,,718, 5;,736,143，5，744，495,5，753，687, 5，770，201, 5;,869，057, 5，891，653，5，939，455, 5;,948，407,6，006，752,6，024，957,6，030，624,6,037，372,6,037，373，6，043，247,6,,060，049,6，087，096,6，096，315,6,099，838,6,,103，235,6，124，495，6，153;,203,6’ 169，087,6，255，278,6，262，044,6;,290;,950,6，306;,651,6,,322，796，6，329;,153,6:’ 344，476,6，352，698,6，365，163,6,,379;,668,6:’ 391;,303,6，395，767，6，403;,555,6,,410，556,6,412，492,6，468，537,6，489,,330, 6;,521,,232,6,525，035，6，525，242，6，558，663，6，572，860 ；
如下美國(guó)專利公開的止:痛劑
5，292，736, 5，688，825, 5，554，789, 5，455，230, 5，292，736,5，298，522，5，216;,165，5:’ 438，064,5，204，365,5，017，578,4,,906,655,4:’ 906,655,4，994，450，4，749;,792，4，980，365,4，794，110,4,670，541,4;,737,493,4,622;,326,4,,536，512，4，719;,231,4:’ 533，671,4,552，866,4，539，312,4,,569,942,4’ 681;,879,4,511，724，4，556;,672,4;,721，712,4,474，806,4，595，686,4，440,,779,4,434,,175,4,608，374，4，395,,402, 4;,400，534,4，374，139,4,361，583,4，252，816,4;,251,,530,5，874，459，5,688，825, 5;,554，789,5，455，230,5，438，064,5，298，522,5;,216，165,5,204，365，5，030，639,5,,017，578,5,008，264,4,994，450,4，980，365,4,,906;,655,4,,847，290，4，844;,907,4:’ 794，110,4,791，129,4,774，256,4;,749;,792,4,737;,493,4,,721，712，4，719;,231,4:’ 681，879,4，670，541,4,667，039,4,,658;,037,4:’ 634;,708,4,623，648，4，622;,326,4;,608，374,4，595，686,4，594，188,4,569,,942,4,556,,672,4,552，866，4，539,,312, 4;,536，512,4,533，671,4,511，724,4，440，779,4,434,175,4,400，534，4，395，402,4;,391，827,4，374，139,4,361，583,4，322，420,4;,306，097,4，252，816，4，251，530,4,,244，955,4，232，018,4,209，520,4;,164;,514,4’ 147;,872,4,,133，819，4，124，713,4,L17, 012,4, 064，272,4, 022，836，3，966，944 ；
如下美國(guó)專利公開的擬膽堿劑
5，219，872, 5，219，873, 5，073，560, 5，073，！560，5，346，911,5，424，301，5，073;,560,5，219，872,4，900，748,4，786，648，4，798’841,4’ 782,071,4,710，508，5，482;,938,5，464，842, 5，378，723,5，346，911，5，318:’ 978,5:’ 219;,873,5，219，872，5，084;,281,5,073，560,5,002，955,4，988，710，4，900;,748, 4;,798,,841,4,786，648，4，782，071,4, 745，123,4, 710，508 ；
如下美國(guó)專利公開的腎上腺素能劑
5，091，528, 5，091，528, 4，835，157, 5，708，丨315，5，594，027,5，580，892，5，576:’ 3 3 2，5，510，376，5，482，961, 5，334，601，5，202，347,5，135;,926, 5,,116，867，5，091;,528,5，017，618,4,835，157,4,829，086，4，579，867,4，568;,679,4,469，690，4，395;,559,4，381，309,4，363，808,4，343，800，4，329:’ 289,4:’ 314;,943,4,311，708，4，304;,721,4,296，117,4,285，873,4，281，189，4，278;,608, 4;,247,,710,4,145，550，4，145,,425,4,139，535,4，082，843,4，011，321，4，001;,421, 3;,982,,010，3，940，407，3，852，468，3，832,470 ；
如下美國(guó)專利公開的抗組胺劑
5，874，479, 5，863，938, 5，856，364, 5，770, I312,5,702，688,5，674，912，5，663;,208,5，658，957,5，652，274, 5，648，380，5，646，190，5，641:,814,5,633，285，5，614;,561，5，602，183,4,923，892,4，782，058，4，393:’ 210,4:’ 180;,583,3，965，257，3，946，022，3，931，197 ；
如下美國(guó)專利公開的留體試劑
5，863，538, 5，855，907, 5，855，866, 5，780，！592，5，776，427,5，651，987，5，346;,887,5，256，408,5，252，319，5，209，926，4，996，335,4,927,807,4,910，192，4，710:’ 495,4,049，805,4，004，005, 3，670，079，3,,608，076,5,892:’ 028,5,,888，995，5，883:’ 087, 5，880，115,5,869，475,5，866，558，5，861，390,5，861:,388, 5，854，235，5，837;,698,5，834，452, 5，830，886，5，792，758，5，792:’ 757，5:’ 763;,361, 5，744，462，5，741;,787,5,741，786，5，733，899,5，731，345，5，723:’ 638, 5:’ 721;,226,5,712，264，5，712;,263,5,710，144,5,707，984,5，705，494，5，700;,793, 5;,698,,720,5,698，545，5，696,,106,5,677，293,5,674，861，5，661，141，5，656;,621, 5;,646:’ 136, 5,,637，691，5，616:’ 574,5,614，514，5，604，215，5，604，213，5,,599，807,5，585:’ 482, 5,,565，588，5，563;，2 5 9，5，563，131，5，561，124，5，556，845，5，547，949,5，536;,714,5,527，806，5，506;,354,5，506，221,5,494，907,5，491，136，5，478:’ 956, 5:’ 426;,179,5,422，262，5，391;,776,5,382，661, 5，380，841, 5，380，840，5，380;,839, 5:’ 373,,095, 5，371，078，5，352,,809,5，344，827, 5，344，826,5，338，837，5，336;,686, 5;,292,,906,5，292，878，5，281,,587,5，272，140,5,244，886,5，236，912，5,,232，915,5，219:’ 879, 5,,218，109，5，215:’ 972,5，212，166，5，206，415，5，194，602，5，166，201,5’ 166:,055, 5,,126，488，5，116;,829, 5，108，996,5，099，037, 5，096，892，5，093，502,5，086;,047,5,084，450，5，082;,835, 5，081，114,5,053，404,5，041，433，5，041:’ 432,5:’ 034;,548,5，032，586，5，026;,882,4，996，335,4，975，537,4，970，205，4，954;,446,4,950,,428,4,946，834，4，937,,237,4,921，846,4，920，099,4，910，226，4，900;,725, 4;,892,,867,4,888，336，4，885，280,4,882，322,4，882，319,4,882，315，4,,874，855,4，868:’ 167,4,,865，767，4，861，875,4，861，765,4，861，763,4，847，014,4，774，236,4，753，932,4，711，856, 4，710，495,4，701，450,4，701，449,4，689，410,4，680，290,4，670，551,4，664，850, 4，659，516,4，647，410,4，634，695,4，634，693,4，588，530,4，567，000,4，560，557, 4，558，041,4，552，871,4，552，868,4，541，956,4，519，946,4，515，787,4，512，986, 4，502，989，4，495，102 ；上述所有公開內(nèi)容以參考方式并入本申請(qǐng)。所述綴合物的藥物部分可為整個(gè)藥物或其結(jié)合片段或部分，該結(jié)合片段或部分保 持其親和力和對(duì)目的靶點(diǎn)特異性，同時(shí)具有一連接位點(diǎn)以便共價(jià)連接載體蛋白配體或連接 體。這些藥物的綴合物可與藥物自身一樣用于相同的失調(diào)癥、疾病和適應(yīng)證。iii.優(yōu)選的腫瘤化療性化學(xué)的活化劑優(yōu)選用于本發(fā)明的RAP環(huán)肽綴合物的腫瘤化療劑包括可以其游離形式用于治療 在腦內(nèi)或腦附近的腦瘤或其他瘤形成，或如果其游離形式對(duì)這些腫瘤沒有效果，而當(dāng)連接 RAP環(huán)肽時(shí)有效果的所有的藥物。這些化療劑優(yōu)選為細(xì)胞毒性化療劑，包括但不限于對(duì)阿霉 素(也稱為多柔比星)，順鉬，紫杉醇及其類似物，以及體內(nèi)外表現(xiàn)抑癌活性的其他化療劑。 這種化療劑還包括烷化劑，抗代謝藥物、天然產(chǎn)物(如長(zhǎng)春花生物堿，表葉毒素，抗生素，酶 和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑)、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，微管抑制劑，紡錘體毒素，激素及拮抗劑，以及雜 項(xiàng)藥劑如鉬配位絡(luò)合物，蒽二酮，取代的尿素等，本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解其他化療劑。用于治療癌癥或瘤形成的細(xì)胞毒性放射性同位素包括但不限于，mI (碘)，125I, 111In (銦)，9°Y(釔)，67Cu (銅)，127Lu (镥)，212Bi (鉍)，213Bi，255Fm(鐨)，149Tb (鋱)，223Rd(鐳)， 213Pb (鉛),212Pb, 211At (砹),89Sr(鍶),153Sm (釤)，166Ho (鈥)，225Ac(錒)，186Re (錸)， 67Ga (鎵)，68Ga和99mTc (锝)，可綴合到本發(fā)明所述的RAP環(huán)肽。為此目的使用本領(lǐng)域常用的 金屬螯合劑，該放射性同位素可與多肽連接，該金屬螯合劑包括但不限于1，4，7，10_四氮 雜環(huán)-11-十二烷州力，』”，^”-四乙酸(0(7^)，1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷州力'，N"， N"‘-四乙酸(TETA)，二乙烯三胺戊-乙酸酯(diethylene triamine penta-acetate) (DTPA)，二巰基琥珀酸(DMSA)，四氮雜環(huán)十三燒(tetraazacyclotridecane)-N，N'，N"， N"‘-四乙酸(TRITA)，以及 1，5，9，13-四氮雜環(huán)十六燒(tetraazacyclohexadecane)-N， N ‘，N 〃，N 〃 ‘-四乙酸(HETA)，羥基亞乙基二 膦酸酯(hydroxyethylidene diphosphonate) (HEDP)，HEXA，和乙二胺四乙酸(EDTA)的，它們?cè)试S將放射性同位素“裝 載”在多肽上。優(yōu)選的化療劑是那些以其游離形式在所需劑量下表現(xiàn)出不可接受的全身毒性的 藥物。其通過與RAP環(huán)肽連接，與這種藥物的治療水平相關(guān)的總體全身毒性降低。特別優(yōu) 選的是用于治療但劑量受心臟毒性限制的心臟毒性化合物。一個(gè)典型的例子是阿霉素(也 稱為多柔比星)及其類似物，如柔紅霉素。這些藥物連接RAP環(huán)肽可減少在心臟的積聚和 伴隨的心臟毒性。。iv.復(fù)合糖復(fù)合糖是其中包括碳水化合物部分的任何分子。例子包括但不限于，糖蛋白、寡糖、糖脂質(zhì)和蛋白多糖。這些分子具有如提高治療劑的生物利用度的有益功能，或如阻止發(fā) 病機(jī)制的能力。例如，α-L-艾杜糖苷酸酶是一復(fù)合糖(糖蛋白)，由于低聚甘露糖7-二磷 酸鹽決定子吸附這種酶，它可廣泛地分布在全身。硫酸肝素是一蛋白多糖的碳水化合物部 分，其在人體內(nèi)用于阻止凝血途徑。合適的RAP環(huán)肽與帶有治療活性復(fù)合糖的連接可通過影響生物分布提供一種增加這種復(fù)合糖效力的手段。或者，RAP環(huán)肽的復(fù)合糖融合體可被 設(shè)計(jì)成作為雙特異性受體結(jié)合的分子，該分子在特定組織具有直接影響一個(gè)或多個(gè)受體分 子功能的能力。v.納米粒 納米粒是生物可降解的和非生物可降解聚合物構(gòu)成的或其他材料如脂類構(gòu)成的 大分子集合。這些集合可被設(shè)計(jì)為在顆粒內(nèi)的空腔里包含治療分子。通過這種方式，納米 粒提供了改變藥物的生物分布、藥代動(dòng)力學(xué)、免疫原性和效力的手段。連接適宜的RAP環(huán)肽 將反過來提供增加這些分子組織分布特異性的手段。E.制備RAP環(huán)肽的方法RAP環(huán)肽優(yōu)選通過共價(jià)鍵的形成而環(huán)化，這些共價(jià)鍵可通過本領(lǐng)域所描述任何方 法形成。在一些實(shí)施方式中，所述共價(jià)鍵在肽的N端氨基酸和C端氨基酸之間形成。在一 些實(shí)施方式中，所述共價(jià)鍵在兩末端氨基酸的支鏈之間形成。在其他實(shí)施中，所述共價(jià)鍵在 一末端氨基酸的支鏈和另一末端氨基酸的末端基團(tuán)之間形成，或每個(gè)末端氨基酸的末端基 團(tuán)之間形成。如，頭_尾、支鏈_支鏈、支鏈-頭、支鏈_尾均有可能。自然環(huán)化的RAP肽可以通過在目的位點(diǎn)插入2個(gè)半胱氨酸并容許這些半胱氨酸自 然形成二硫鍵很容易地設(shè)計(jì)。甘氨酸或脯氨酸可插入到半胱氨酸內(nèi)(如C端到最遠(yuǎn)N端-半 胱氨酸和N端到最遠(yuǎn)C端-半胱氨酸)以使因RA蛋白天然三維結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵導(dǎo)致的任何 結(jié)構(gòu)扭曲最小化。末端氨基和末端羧基基團(tuán)偶聯(lián)的頭_尾環(huán)化可采用許多方法進(jìn)行，如采用P-硝基 苯基酯、疊氮化合法、2，4，5-三氯苯酯和五氟代苯酯，混合酸酐法，碳二亞胺伴有催化劑如 HOBt或HONSu或HoAt或HATU，DIC, DCC,或在樹脂上的環(huán)化。此外，這種環(huán)化結(jié)構(gòu)可用橋連基團(tuán)、肽的氨基酸殘基的支鏈或肽的末端氨基酸殘 基形成。橋連基團(tuán)是一種讓肽的兩部分得以環(huán)化的化學(xué)部分。橋連基團(tuán)的非限定性實(shí)例包 括酰胺、硫醚、硫酯、二硫化合物、脲、氨基甲酸酯、磺胺類物質(zhì)等。本領(lǐng)域公知合并具有這些 橋連基團(tuán)的單元的各種方法，。例如，內(nèi)酰胺橋(例如環(huán)酰胺)可通過具有氨基和羧酸的氨 基酸的支鏈而形成，如賴氨酸、鳥氨酸和谷氨酸或門冬氨酸。硫酯可在半胱氨酸殘基的C端 和支鏈之間形成?；蛘?，硫酯可通過具有巰基和羧酸的氨基酸的支鏈之間形成?；蛘撸刹捎媒Y(jié)合羊毛硫氨酸(硫二丙氨酸)殘基連接通過硫醚鍵共價(jià)連接在一 起的丙氨酸殘基形成交聯(lián)。另一種方法中，交聯(lián)劑，諸如二羧酸，例如軟木酸(辛二酸)等， 可引入二個(gè)氨基酸支鏈的官能團(tuán)之間的連接，如游離氨基、羥基、巰基及其組合。也可采用酶催化的環(huán)化。例如，據(jù)報(bào)道短桿菌酪肽合成酶的硫酯酶結(jié)構(gòu)域可用于 環(huán)化硫酯前體，枯草桿菌蛋白酶突變體可用于環(huán)化肽苯丙氨酰胺羥乙酸酯，以及抗體連接 酶16G3可用于催化對(duì)硝基苯酯的環(huán)化。就肽的環(huán)化綜述，參見Davies，J. Peptide Sci., 9 471-501 (2003)，通過引用將其全文結(jié)合到本文中。F. RAP肽的制備i.合成本發(fā)明的肽可按照常規(guī)技術(shù)采用液相固相或液相肽合成技術(shù)而合成。多種自動(dòng) 化合成儀是市售的，可按照已知方法使用。參見例如Stewart和Young，固相肽合成，第2 片反，Pierce chemical co. ， (1984) ；Tam J. Am. Chem. soc. 105 6442,1983 ；Merrifield,Science 232 :341_347，1986 ；以及 Barany 和 Metrifield， The Peptides, Gross 和 Meienhofer 編輯，Academic Press, New York, 1284 ；Barany 等，Int.J. PeptideProtein Res. 30 :705-739,1987 ；Bodanszky, The Principles of PeptideSynthesis, 第 2 版， Springer, New York(1993)；以及 Molina 等，P印t. Res. 9 151-5，1996，美國(guó)專利 5，424，398，和Fischer 等，Journal of PeptideScience 8 :529_542，2002，所述每個(gè)文獻(xiàn)都 通過引用結(jié)合到本文中。
例如，可采用液相技術(shù)如疊氮化物法，酸氯化法，酸酐法，混合酸酐法，活性酯法 (如對(duì)硝基苯酯，N-羥基丁二酰亞胺酯，或氰甲基酯)，碳二亞胺法，氧化還原法，或二環(huán)己 基碳二亞胺(DCXD)/添加法。固相肽合成方法使用含有0. 1-1. OmMol胺/g聚合物的苯乙烯-二乙烯基苯共聚 物。這些用于肽合成的方法使用α -氨基的丁氧基羰基(t-B0C)或9-芴甲氧基羰基(FMOC) 保護(hù)。兩種方法都涉及分步合成，其中在每個(gè)步驟由肽的C端開始加入單個(gè)氨基酸(參見 coligan 等，current Protocols inlmmunology, wiley Interscience, 1991,第 9 單兀)。 在完成化學(xué)合成后，通過用酸在降低的溫度處理(例如液態(tài)HF-10%苯甲醚，在0°C約0. 25 至約1小時(shí))，所述肽脫去t-B0C或FMOC氨基酸封閉基團(tuán)，從聚合物上切下。在蒸發(fā)試劑 后，用1 %乙酸溶液將肽從聚合物中萃取出來，然后凍干，得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物一般可通過例 如在Sephadex G-15上使用5%乙酸作為溶劑進(jìn)行凝膠過濾的技術(shù)來純化。柱子的適宜餾 分凍干將得到均一的肽或肽衍生物，然后其可通過諸如氨基酸分析、薄層層析、高效液相層 析、紫外吸收分光光度法、摩爾旋光法、溶解性等標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來鑒定，并通過固相Edman降解 定量。液相技術(shù)包括可逆地連接聚乙二醇的多肽鏈的合成裝配，是傳統(tǒng)的溶液化學(xué)和固 相化學(xué)的混合體。這種方法采用常用于固相肽合成中N-芴甲氧羰基技術(shù)和在反復(fù)的氨基 脫保護(hù)步驟中氟離子替代傳統(tǒng)的有機(jī)堿哌啶而進(jìn)行。參見Fischer等，Journal of Peptide Science 8 :529_542，2002。ii.宿主細(xì)胞用于制備嵌合蛋白的宿主細(xì)胞可是細(xì)菌、酵母、昆蟲、非哺乳類脊柱細(xì)胞或哺乳動(dòng) 物細(xì)胞。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于倉(cāng)鼠、猴子、黑猩猩、狗、貓、牛、豬、小鼠、大鼠、兔、 綿羊或人細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可是永生化細(xì)胞(細(xì)胞系)或非永生化(原代或二代)細(xì)胞， 以及可是任何類型的細(xì)胞種類，諸如，但不限于成纖維細(xì)胞，角質(zhì)化細(xì)胞，上皮細(xì)胞(如，哺 乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞)，卵巢細(xì)胞(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢或CHO細(xì)胞)，上皮細(xì)胞，膠質(zhì) 細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，血液的有形成分(如淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞)，肌肉細(xì)胞，肝細(xì)胞和這些體細(xì) 胞類型的前體。宿主細(xì)胞可包括不表達(dá)LRP的CHO細(xì)胞的突變體，如CH013-5-1 (FitzGerald 等人，J. Biol. Chem.，129(6) :1533_41，1995)。包含和表達(dá)編碼所述嵌合蛋白的DNA或RNA的細(xì)胞在此處是指遺傳基因修飾細(xì) 胞。包含和表達(dá)編碼所述嵌合蛋白的DNA或RNA的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在此處是指基因修飾的哺 乳動(dòng)物細(xì)胞。這些DNA或RNA導(dǎo)入細(xì)胞可采用公知的轉(zhuǎn)染方法，如電穿孔，顯微注射，微粒 轟擊，磷酸鈣沉淀，改良磷酸鈣沉淀，陽(yáng)離子脂質(zhì)體處理，光穿孔(photoporation)，融合方 法，受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，或1，5-二甲基-1，5-二氮i^一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)沉淀。 或者，這些DNA或RNA可采用病毒載體感染導(dǎo)入。表達(dá)編碼嵌合蛋白的DNA或RNA的細(xì)胞的制備方法，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，正如美國(guó)專利號(hào)6，048，729，5，994，129和6，063，630中所 描述。這些申請(qǐng)的每一篇的教導(dǎo)以其全文作為參考結(jié)合到本文中。iii.核酸構(gòu)建體用來表達(dá)嵌合蛋白的核酸構(gòu)建體可為在轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體外(游離 基因的)表達(dá)的核酸構(gòu)建體或?yàn)橐噪S機(jī)地或通過同源重組預(yù)定的靶點(diǎn)整合進(jìn)入接受細(xì)胞 的基因組內(nèi)的核酸構(gòu)建體。染色體外表達(dá)的構(gòu)建體包含，除了嵌合蛋白編碼序列外，還包含在細(xì)胞內(nèi)足以表達(dá)所述蛋白的序列和任選足以復(fù)制這些構(gòu)建體的序列。它典型地包括啟動(dòng) 子、嵌合蛋白編碼DNA和聚腺苷酸化位點(diǎn)。編碼嵌合蛋白的DNA采用它的表達(dá)處于啟動(dòng)子 的控制之下這樣的方式放置于構(gòu)建體中。任選地，這種構(gòu)建體可包含額外的諸如一個(gè)或多 個(gè)下列成分剪切位點(diǎn)、增強(qiáng)子序列、在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制下的選擇標(biāo)記基因，和在適當(dāng)?shù)?啟動(dòng)子控制下的可擴(kuò)增標(biāo)記基因。在那些DNA構(gòu)建體整合至細(xì)胞基因組的實(shí)施方式中，它僅需要包含編碼嵌合蛋白 的核酸序列。任選地，它包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列、聚腺苷酸化位點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)剪切位點(diǎn)、 編碼一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記的核酸序列、編碼一個(gè)或多個(gè)的可擴(kuò)增標(biāo)記基因和/或接受細(xì) 胞基因組DNA的DNA同源序列，以靶向所述DNA整合至基因組選定的位點(diǎn)(靶向DNA或DNA 序列)。iv.細(xì)胞培養(yǎng)方法含有編碼嵌合蛋白的DNA或RNA的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在適宜所述細(xì)胞生長(zhǎng)和DNA或 RNA表達(dá)的條件下培養(yǎng)。那些表達(dá)所述嵌合蛋白的細(xì)胞可采用公知技術(shù)和本文所述的技 術(shù)而鑒定，可采用公知技術(shù)和本文所述的技術(shù)分離和純化所述嵌合蛋白，或利用或不利用 嵌合蛋白產(chǎn)物的擴(kuò)增。鑒定可通過如下方法進(jìn)行，如通過篩選基因修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞顯示出編碼嵌合蛋白的DNA或RNA存在的的表型跡象，諸如PCR篩選， Southern印跡分析的篩選，或嵌合蛋白表達(dá)分析的篩選。具有合并編碼嵌合蛋白的DNA的 細(xì)胞的選擇可通過以下完成DNA構(gòu)建體中包含選擇性標(biāo)記和在僅適宜表達(dá)選擇性標(biāo)記基 因的細(xì)胞能存活的條件下培養(yǎng)包含選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)染的或感染的細(xì)胞。進(jìn)而這種導(dǎo)入 的DNA構(gòu)建體的擴(kuò)增可通過在適宜擴(kuò)增的條件下培養(yǎng)基因修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞而被影響 (如在存在僅使包含多拷貝可擴(kuò)增標(biāo)記基因的細(xì)胞存活的藥物濃度的條件下培養(yǎng)包含可擴(kuò) 增標(biāo)記基因的基因修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。如本文所描述，表達(dá)嵌合蛋白的基因修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可通過表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè) 而被鑒定。例如，其中所述載體為為RAP環(huán)肽的表達(dá)嵌合蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可采用夾心 酶免疫方法來鑒定。抗體可直接導(dǎo)向RAP部分或所述綴合物的活化劑部分。v. RAP肽的純化采用本領(lǐng)域公知技術(shù)RAP肽可通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化。參見， 如，“The Handbook of Analysis and Purification of Peptides andProteins by Reversed-Phase HPLC，，，第 3 版，Grace Vydac, W. R. Grace &Co.，Columbia, MD (2002)。乙 腈和含三氟乙酸的水的梯度混合液常作為洗脫液。通常采用制備的RP-HPLC純化毫克和克 級(jí)合成肽，和純化毫克級(jí)到公斤級(jí)的用于治療的重組制備的多肽，。RAP肽也可如WO 2006/138343 (Zankel等人)所述制備和純化，以其全文作為參考 結(jié)合到本文中。
RAP肽也可在偶聯(lián)適當(dāng)?shù)腃R對(duì)的瓊脂糖珠上采用親合層析法來純化。這個(gè)技 術(shù)可單獨(dú)采用或作為RP-HPLC后的下一步驟。包含CR對(duì)或三聯(lián)體的含有CR的蛋白片段 按照下列描述制備。編碼每CR對(duì)或三聯(lián)體的DNA片段可采用HotStart PfuTurbo 聚 合酶和試劑(Stratagene)從人 cDNA(BDBiosciences Marathon-ready )PCR 擴(kuò)增得 至IJ。每種擴(kuò)增片段連續(xù)地采用BamHI和HindIII相繼酶切，然后與相似的消化的pET30 (+) a (EMDBiosciences)連接。得到的質(zhì)粒編碼由融合至CR片段的N-端六聚組氨酸和S-肽組 成的蛋白片段。對(duì)所有的表達(dá)構(gòu)建體測(cè)序以確定植入片段的完整性。然后將每一質(zhì)粒用于 轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) CodonPlus- RIPL 細(xì)胞(Stratagene)。正，所述CR片段如前所述表達(dá)和 再折疊，并按照制造商的手冊(cè)(Qiagen)采用Ni-NTA層析純化?；罨沫傊侵锳fTiGel 15，Bio-Rad)被移入一 IOmL玻璃化的塑料柱(Pierce)內(nèi)。小珠采用3倍體積的含5mMCaC12 緩沖液的IOmM HEPES, IOOmM NaCl溶液清洗2次。然后加入CR片段(2. 5mg/mL填充珠，含 在5倍柱體積相同緩沖液中)，然后混合物在室溫下混合孵育過夜。小珠接著用緩沖液清洗 直至用Bradford方法檢測(cè)在洗脫液中沒有蛋白存在。小珠儲(chǔ)存在20%乙醇中直至使用。 TBS中的RAP肽加到已平衡的CR交聯(lián)珠中l(wèi)mg/mL填充珠)，然后室溫下混合孵育2小時(shí)。 小珠用相同緩沖液清洗，然后結(jié)合肽被含IOOmM EDTA的TBS洗脫。G. RAP綴合物的鑒定 i.標(biāo)記在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記RAP環(huán)肽或它的綴合物以便于檢測(cè)?！皹?biāo)記”或“可檢測(cè)的 部分”是為可通過分光的、光化學(xué)的、生化的、免疫化學(xué)的、化學(xué)的或其他物理方法檢測(cè)的組 合物。例如，適合用于本發(fā)明的標(biāo)記包括，如放射性標(biāo)記(如32P)，熒光團(tuán)(如熒光素)，高 電子密度試劑，酶(如常用于ELISA)，生物素，地高辛配基，或可制成可檢測(cè)的半抗原或肽， 如通過將放射性標(biāo)記結(jié)合到半抗原或肽，或用于檢測(cè)與半抗原或肽特異性反應(yīng)的抗體。如上所述，依靠所采用的篩選方法，可標(biāo)記綴合物的活化劑、連接體或RAP環(huán)肽部 分。只要不顯著地干擾綴合物的生物活性，所用的特定的標(biāo)記或可檢測(cè)的基團(tuán)不是本發(fā)明 關(guān)鍵性的部分?？蓹z測(cè)的基團(tuán)可為任何具有能被檢測(cè)的物理或化學(xué)上的特性的物質(zhì)。因而 標(biāo)記為可被分光的、光化學(xué)的、生化的、免疫化學(xué)的、電學(xué)的、光學(xué)的或化學(xué)的方法檢測(cè)的任 何組合物。適于用于本發(fā)明的標(biāo)記例子包括但不限于熒光染料(如異硫氰酸熒光素，德克薩 斯紅，羅丹明等)，放射性標(biāo)記(如3H, 125L35S, 14C,或32P)，酶(如辣根過氧化物酶，堿性磷酸 酶，和常用于ELISA的其它酶)，以及比色標(biāo)記諸如膠體金或有色玻璃或塑料珠(如聚苯乙 烯，聚丙烯，橡膠等)。依據(jù)本領(lǐng)域的公知方法，標(biāo)記可與檢測(cè)的所需成分直接地或間接地偶聯(lián)。優(yōu)選地， 根據(jù)本發(fā)明，在一實(shí)施方式中的標(biāo)記采用異氰酸鹽試劑與生物聚合物共價(jià)結(jié)合以綴合活性 劑。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的雙功能異氰酸鹽試劑可用于將標(biāo)記綴合到生物聚合物， 以形成不附著活化劑的標(biāo)記生物聚合物綴合物。這種標(biāo)記生物聚合物綴合物可用作合成本 發(fā)明的標(biāo)記綴合物的中間體或可用于檢測(cè)所述生物聚合物綴合物。如上所述，可使用廣泛 的標(biāo)記，標(biāo)記的選擇取決于要求的敏感性，與檢測(cè)方法所需成分易于綴合，穩(wěn)定性要求可用 的儀器和處理規(guī)定。非放射性標(biāo)記常采用間接方法連接。通常，配體分子(如生物素)與 所述分子共價(jià)結(jié)合。這種配體結(jié)合另一分子(如鏈霉抗生物素)，所述另一分子是固有可檢測(cè)的或是共價(jià)結(jié)合到一信號(hào)系統(tǒng)，如可檢測(cè)的酶、熒光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物。所述綴合物也可直接與信號(hào)生成化合物綴合，如通過與酶或熒光團(tuán)綴合。適于 用作標(biāo)記的酶包括但不限于水解酶，尤其磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化酶，尤其過氧化物 酶。適于用作標(biāo)記的熒光化合物，即熒光團(tuán)，包括但不限于熒光黃和它的衍生物，羅丹明和 它的衍生物，丹酰，傘形花內(nèi)酯等。適合的熒光團(tuán)的其他實(shí)施例包括但不限于伊紅，四甲 基異硫氰基羅丹明-胺，奎寧，熒光素W，吖啶黃，麗絲胺羅丹明，B磺酰氯紅(B sulfonyl chlorideerythroscein)，釕(三，聯(lián)吡啶)，德克薩斯紅，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，黃素腺嘌 呤二核苷酸等。適于用作標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光化合物包括但不限于蟲熒光素和2，3_ 二氫酞嗪 二酮，如魯米諾。可用于本發(fā)明方法中的不同標(biāo)記或信號(hào)生成系統(tǒng)的綜述，參見美國(guó)專利號(hào) 4，391，904。檢測(cè)標(biāo)記的工具是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。因此，比如，當(dāng)所述標(biāo)記為放射性標(biāo) 記，檢測(cè)工具包括閃爍計(jì)數(shù)器或放射自顯影術(shù)中的照相膠片。當(dāng)所述標(biāo)記為熒光標(biāo)記，它可 通過合適波長(zhǎng)的光激發(fā)熒光并檢測(cè)得到的熒光而檢測(cè)。所述熒光可通過采用電子探測(cè)器如 電荷偶聯(lián)器件(CCDs)或光電倍增器等而在視覺上檢測(cè)。類似地，酶標(biāo)記可通過提供酶合適 的底物并檢測(cè)得到的反應(yīng)產(chǎn)物而檢測(cè)。比色法的或化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記可簡(jiǎn)單地通過觀察與標(biāo) 記相關(guān)的顏色而檢測(cè)。用于本發(fā)明方法中的其它標(biāo)記或檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言 是顯而易見的。這些標(biāo)記的調(diào)節(jié)劑和配體可用于疾病或健康狀況的診斷。ii.綴合物篩選實(shí)驗(yàn)和它們的遞送調(diào)節(jié)劑本發(fā)明提供RAP環(huán)肽綴合物篩選實(shí)驗(yàn)，其中檢測(cè)所述綴合物影響特異性受體可測(cè) 量的活性的能力，這種特異性受體可位于全細(xì)胞、細(xì)胞抽提物、允許其活性檢測(cè)的部分純化 的、純化的或其它任何形式。這種活性可為含CR蛋白在表達(dá)、功能或降解方面的活性，其包 括，如這些活性的總量或時(shí)限。這些活性包括，如，受體基因序列或mRNA轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn) 錄加工、翻譯或轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性。這些活性包括，如，新受體的合成、受體的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定位 和受體生物活性的激活。這些活性包括，如，受體結(jié)合物質(zhì)、采用構(gòu)型、催化反應(yīng)、結(jié)合已知 配體等方面的能力。這些活性包括，如，受體的數(shù)量和穩(wěn)定性、受體加工和移除或降解等。在 一優(yōu)選實(shí)施方式中，采用的RAP環(huán)肽是被修飾的或自然具有對(duì)靶向受體的親和力高于其它 受體的RAP環(huán)肽。本發(fā)明預(yù)期許多種不同的篩選形式?？紤]到一些設(shè)計(jì)的低通量，以系列或平行方 式僅測(cè)試一個(gè)或幾個(gè)化合物。高通量篩選實(shí)驗(yàn)適于在數(shù)周或數(shù)月內(nèi)篩選數(shù)萬或幾十萬個(gè)化 合物。“計(jì)算機(jī)”篩選形式應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助推理設(shè)計(jì)技術(shù)以鑒定生物活性的潛在調(diào)節(jié)劑。
H.藥物組合物及其給藥綴合物和調(diào)節(jié)劑可采用多種途徑給予。對(duì)于口服制劑，所述綴合物可單獨(dú)使用或 與適當(dāng)?shù)奶砑觿┞?lián)合以制成片劑、粉劑、顆粒劑或膠囊，如，與常用的添加劑，例如乳糖、甘 露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉，粘合劑如微晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米淀粉或 明膠；與崩解劑，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羥甲基纖維素鈉；與潤(rùn)滑劑，如滑石或硬脂酸 鎂；以及如果需要的話，還可含稀釋劑、緩沖劑、濕潤(rùn)劑、防腐劑或調(diào)味劑。所述綴合物和調(diào)節(jié)劑可按配制成注射制劑，通過使它們?cè)谒軇┗蚍撬軇┲腥?解、懸浮或乳化，如植物油或其它類似油、合成脂肪酸甘油酯，高碳脂肪酸酯或丙二醇；以及 如果需要的話，還可含有常規(guī)添加劑如助溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。
所述綴合物、調(diào)節(jié)劑和LDLR配體可以吸入法給藥的氣溶膠形式使用。本發(fā)明的化 合物配制成增壓可接受的推進(jìn)劑如二氟二氯甲烷、丙烷、氮?dú)獾?。此外，所述綴合物和調(diào)節(jié)劑可通過與不同的基質(zhì)如乳化基質(zhì)或水溶性基質(zhì)混合制 成栓劑。本發(fā)明的化合物可通過栓劑經(jīng)直腸給藥。所述栓劑可包含載體如可可脂、碳蠟和 聚乙二醇，其在體溫下融化而在室溫下呈固體狀?？商峁┮钥诜蛑蹦c給藥如糖漿劑、酏劑和懸浮液時(shí)綴合物、調(diào)節(jié)劑和LDLR配體 的單位劑型，其中每一劑量單位，如，一茶匙容量、一湯匙容量、片或栓，包含預(yù)定數(shù)量的含 活化劑的組合物。類似地，注射或靜脈給藥的單位劑型可包含在作為無菌水、生理鹽水或其 它藥學(xué)上可接受的載體溶液中的組合物的綴合物。
在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)常規(guī)藥劑配制技術(shù)，將本發(fā)明所述的綴合物、調(diào)節(jié)劑和LDLR 配體作為均勻混合物中的活性成分與藥學(xué)載體混合。根據(jù)所需給藥如口服或非胃腸(包含 靜脈內(nèi))的制劑形式，載體可采取許多形式。在制備口服劑型的組合物中，可采用任何常用 的藥學(xué)介質(zhì)，例如，如在口服液體制劑情況下，例如，如懸浮液、酏劑和溶液，可采用水、乙二 醇、油脂、乙醇、調(diào)味劑、防腐劑、著色劑等；或例如，在口服固體制劑如粉劑、硬和軟膠囊以 及片劑的情況下，載體如淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、造粒劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、崩解劑等， 所述固體口服制劑優(yōu)于液體制劑。關(guān)于透皮途徑給藥，藥物透皮給藥方法已在Remington，sPharmaceutical Sciences，第 17 版，(Gennaro 等人 Eds. Mack PublishingCo.，1985)公開。真皮或皮膚貼 劑是本發(fā)明所述綴合物、調(diào)節(jié)劑和LDLR配體透皮遞送給藥的優(yōu)選方式。貼劑優(yōu)選提供吸收 促進(jìn)劑如DMSO以增加化合物的吸收。透皮藥物輸送的其它方法已在美國(guó)專利5，962，012、 6，261，595和6，261，595中公開。每一專利以其全文作為參考納入本文中。在具體的實(shí)施方式中，預(yù)期本文所述綴合物的給藥方式為鞘內(nèi)給藥至腦脊液。本 發(fā)明的鞘內(nèi)給藥可包括將藥物組合物引導(dǎo)入腦室。或者，所述鞘內(nèi)給藥可包括將所述藥物 組合物引導(dǎo)入腰椎區(qū)域。在另一個(gè)備選方案，所述鞘內(nèi)給藥包括將藥物組合物引導(dǎo)入大池。 任何這樣的給藥方式優(yōu)選通過推注注射(bolus injection)。根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度和個(gè)體 對(duì)治療的反應(yīng)性，這種推注注射可每周一次，每月一次，每6個(gè)月一次或一年一次給藥。在 其他的實(shí)施方式中，所述鞘內(nèi)給藥是通過使用輸液泵進(jìn)行。藥物當(dāng)然可在至少數(shù)天的時(shí)間 內(nèi)被連續(xù)地鞘內(nèi)給藥，或者，鞘內(nèi)給藥在至少四周的時(shí)間內(nèi)連續(xù)給予。當(dāng)然，當(dāng)給藥是通過 不斷的注入，相比推注注射給藥，酶替代療法的給藥劑量的比率可大大降低。在優(yōu)選的實(shí)施 方式中，所述綴合物的活化劑是艾杜糖苷酸酶，按接受MPS治療的哺乳動(dòng)物每20公斤體重 約1毫克艾杜糖苷酸酶的量給予。在具體的實(shí)施方式中，上述劑量遞送到15cc腦脊液中。 在這樣的濃度下，可預(yù)期這種酶的濃度將達(dá)到每毫升腦脊液18，000單位。應(yīng)該理解，上述 劑量?jī)H僅是一示范劑量和本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到劑量是可變動(dòng)的。本發(fā)明所述方法和組合物在酶替代療法之前可與誘導(dǎo)抗原特異性耐受的方法和 組合物聯(lián)合。這些方法包括誘導(dǎo)抗原特異性耐受，其包括給予免疫抑制劑如環(huán)孢霉素A的 給予，進(jìn)一步包括給予抗增殖藥物，其包括但不限于核苷酸類似物或抗代謝藥?？乖鲋乘幬?可為硫唑嘌呤。更多的方法已在以下文獻(xiàn)中描述美國(guó)專利申請(qǐng)10/141，668，以美國(guó)專利
發(fā)明者C·M·斯塔, T·C·贊克爾 申請(qǐng)人:雷普特藥品公司