專利名稱：：羥甲基取代的rna寡核苷酸和rna復(fù)合物的制作方法羥曱基取代的RNA寡核苷酸和RNA復(fù)合物背景RNA干擾(RNAi)近年吸引了大量注意，因為它提供沉默耙基因表達(dá)的手段。它為基礎(chǔ)研究提供研究遺傳和生化途徑、和單獨(dú)基因和基因產(chǎn)物功能的方法。因此，RNA干擾已成為在制藥行業(yè)中驗證靶的關(guān)鍵工具。而且，本著開發(fā)可用作藥物的能夠介導(dǎo)RNA干擾復(fù)合物的RNA復(fù)合物的目標(biāo)，已進(jìn)行了大量的研究。RNAi用于治療的吸引力在于其敏感性和序列特異性。然而，已經(jīng)產(chǎn)生了關(guān)于序列特異性的擔(dān)憂，如由于RNA復(fù)合物的錯誤鏈可能指導(dǎo)對錯誤的靶核酸響應(yīng)。而且，某種大小的RNA復(fù)合物誘導(dǎo)非特異性干擾素依賴性響應(yīng)，這也是不期望的。專利申請US2003/0108923描述能夠介導(dǎo)RNAi的包含反義鏈和信使鏈的RNA復(fù)合物，其中各鏈長度是21-23個核苷酸。提議將該RNA復(fù)合物用于治療應(yīng)用。類似地，專利申請US2005/0234007描述能夠介導(dǎo)RNAi的包含反義鏈和信使鏈的RNA復(fù)合物，其中復(fù)合物包括3'-懸端(3，-overhang)。提議將該RNA復(fù)合物用于治療應(yīng)用。WO2005/073378描述含有化學(xué)修飾的核苷酸、能夠介導(dǎo)RNAi、包含反義鏈和信使鏈的RNAi復(fù)合物。該說明書中所述的RNA復(fù)合物包括LNA殘基，且指出在靠近一條鏈5'末端處并入LNA殘基可控制哪條鏈并入RISC復(fù)合物，因為在5-末端形成最弱堿基對的鏈并入RISC復(fù)合物。RNAi只是使用包括本發(fā)明的RNA復(fù)合物的寡核苷S吏介導(dǎo)基因表達(dá)抑制的許多策略之一。包括RNA酶H介導(dǎo)的RNA裂解、立體封閉RNA結(jié)合、DNA酶或核酶介導(dǎo)的RNA裂解和siRNA方法的這些不同策略已連同與生物活性相容的所選的化學(xué)修飾的核普酸的性質(zhì)描述于文獻(xiàn)中[丄Kurreck，五wk/S/oc/7ew.2003,270,1628〗。本發(fā)明的羥甲基取代的單體B-E已經(jīng)被并入DNA鏈，且因此已報道制備其用于自動DNA/RNA合成的亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元的程序[K.D.Nielsen等人，MedC&w.1995,3,1493;H.Thrane等人，7^ra/^^wz1995，57，10389;RNielsen等人，MW.CTzem.1995,3，19]。已被并入DNA鏈的胸腺嘧啶單體是獨(dú)有的。這些羥曱基取代的單體此前都還未被并入RNA鏈。在一項報道中，一個或兩個2'-開環(huán)尿苷被并入DNA寡核苷酸并觀察到對RNA酶H介導(dǎo)的RNA降解的積極效應(yīng)(MangosMM，MinKL,ViazovkinaE,GalarneauA,ElzagheidMl,ParniakMA,DamhaMJ.,J"爿wG/zem2003Jan22;125(3):654匿61.)。概述本發(fā)明提供具有并入RNA鏈的一個或多個羥曱基取代的單體、將在關(guān)于RNA-引導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)或基因分析、尤其是RNA干擾的情況下使用的RNA復(fù)合物。因此，本發(fā)明的一個目的是提供與通常使用的RNA復(fù)合物相比具有減少的脫靶效應(yīng)的RNA復(fù)合物。另一目的是提供誘導(dǎo)減少的干擾素應(yīng)答的RNA復(fù)合物。又另一目的是提供在細(xì)胞培養(yǎng)物中或體內(nèi)關(guān)于對酶促降解的穩(wěn)定性具有改善特性的RNA復(fù)合物。又另一目的是提供相對于未修飾的RNA復(fù)合物，在細(xì)胞培養(yǎng)物中或體內(nèi)展示增強(qiáng)的基因調(diào)節(jié)功能如基因沉默效應(yīng)的RNA復(fù)合物。又另一目的是提供靶向特定器官或組織并能夠穿透細(xì)胞膜的RNA復(fù)合物。本發(fā)明還提供適于將羥曱基取代的單體并入寡核芬酸的單體和其合成方法。附圖簡述圖1顯示并入RNA復(fù)合物的羥曱基取代的核芬酸的不同構(gòu)造的示例。為6了比較顯示單體A，其是具有其核糖支架的天然RNA單體。包括在本發(fā)明的RNA復(fù)合物中的單體B-E的特征是其包含為羥曱基基團(tuán)("自由羥甲基基團(tuán)")的取代基，且因此本發(fā)明題為"羥曱基取代的RNA寡核苷酸和RNA復(fù)合物"。自由羥曱基基團(tuán)例如連接在環(huán)狀核糖支架的C4'原子或基于無環(huán)的核糖的支架的Cl'原子。本發(fā)明的羥曱基取代的核苷酸含有各自連接于磷原子并因此參與形成核苷酸間4建合的其它氧原子(參見圖1)。這些其它氧原子中的一個或多個可為羥基基團(tuán)的一部分，這是當(dāng)本發(fā)明的RNA復(fù)合物的羥曱基取代的核苷酸中的一個或多個位于RNA鏈的3'-或5'-末端時的情形。當(dāng)本發(fā)明的RNA復(fù)合物的羥曱基取代的核苷酸中的一個位于RNA鏈的3'-末端和/或5'-末端時，該單體的羥基基團(tuán)可凈皮磷酸化，如對任何位于末端的天然RNA單體的情形一樣。向本發(fā)明的羥曱基取代的核苷酸連接核堿基如尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-曱基胞嘧啶、腺嘌呤、鳥。票呤或任何其它已知的天然或合成的核堿基或核堿基類似物(圖1中標(biāo)為"堿基")。圖2顯示羥曱基取代的單體的衍生化、官能化和共軛變體。作為實例顯示羥曱基取代的2',3'-開環(huán)-RNA單體D的衍生化、官能化和共軛變體(參見圖1)。單體F含有經(jīng)由醚鍵合連接的基團(tuán)R。單體G含有經(jīng)由硫醚鍵合連接的基團(tuán)R。單體H含有經(jīng)由酰胺鍵合連接的基團(tuán)R。單體I含有經(jīng)由氨基鍵合連接的基團(tuán)R。單體J含有經(jīng)由哌嗪基單元連接的基團(tuán)R。通過將這種單體中的一個或若干個并入本發(fā)明的RNA復(fù)合物，可調(diào)節(jié)RNA復(fù)合物的特性。例如可引入增加的生物穩(wěn)定性、增加的RNA靶向能力或特異性遞送特性、并為了檢測目的可連接熒光基團(tuán)。圖3兩個羥曱基取代的單體(單體C和單體D)的結(jié)構(gòu)，它們可為寡核苷酸或RNA復(fù)合物的單體。圖4含有"單體x"(即2'，3'-開環(huán)-RNA單體D)的本發(fā)明的siRNA復(fù)合物的基因沉默結(jié)果。結(jié)果以含有具有尿嘧啶作為核堿基的單體D(顯示為W130有義鏈中的'X，)的W130有義鏈(參見圖4的核苷酸序列)獲得。用于本研究的反義鏈的核酸序列列在該圖下部(反義序列中所有X單體是具有尿嘧啶作為核堿基的單體D)。具有上標(biāo)"L"的單體代表鎖核酸(例如，T^表示胸腺嘧啶鎖核酸或LNA)。圖5含有"單體x，，(即2',3'-開環(huán)-RNA單體D)的本發(fā)明的siRNA復(fù)合物的基因沉默結(jié)果。結(jié)果以含有具有尿嘧咬作為核堿基的單體D(顯示為W131有義鏈中的'X，)的W131有義鏈(參見圖5的核苷酸序列)獲得。用于本研究的反義鏈的核酸序列列在圖4下部(反義序列中所有X單體是具有尿嘧啶作為核堿基的單體D)。圖6含有"單體x"(即2'，3'-開環(huán)-RNA單體D)的本發(fā)明的siRNA復(fù)合物的基因沉默結(jié)果。這些結(jié)果以含有具有胞嘧啶(sC,從W282序列5'-末端的第一個X)、腺。票呤(sA，從W282序列5'-末端的第二個X)和胞嘧啶(sC,從W282序列3'-末端的最后一個X)作為核堿基的單體D的W282有義鏈(參見圖6的核普酸序歹'j)獲得。用于本研究的反義鏈的核酸序列列在圖4下部(反義序列中所有X單體是具有尿嘧咬作為核堿基的單體D)。圖7含有"單體x"(即2',3'-開環(huán)-RNA單體D)的本發(fā)明的siRNA復(fù)合物的基因沉默結(jié)果。這些結(jié)果以W194有義鏈(參見圖7的核芬S吏序列)獲得。用于本研究的反義鏈的核酸序列列在圖4下部(反義序列中所有X單體是具有尿嘧咬作為核堿基的單體D)。具有上標(biāo)"L"的單體代表鎖核酸(例如，f表示胸腺嘧啶鎖核酸或LNA)。圖8含有"單體x"(即2',3'-開環(huán)-RNA單體D)的本發(fā)明的siRNA復(fù)合物的基因沉默結(jié)果。這些結(jié)果以W181有義鏈(參見圖8的核香酸序列)獲得。用于本研究的反義鏈的核酸序列列在圖4下部(反義序列中所有X單體是具有尿嘧啶作為核堿基的單體D)。具有上標(biāo)"L"的單體代表鎖核酸(例如，TL表示胸腺嘧啶鎖核酸或LNA)。圖9含有"單體x"(即2',3'-開環(huán)-RNA單體D)的本發(fā)明的siRNA復(fù)合物的基因沉默結(jié)果。這些結(jié)果以含有具有尿嘧啶作為核堿基的單體D(顯示為W129有義鏈中的'X，)的W129有義鏈(參見圖9的核苷S臾序列)獲得。本研究中包括的反義鏈列在圖4下部(反義序列中所有X單體是具有尿嘧啶作為核堿基的單體D)。具有上標(biāo)"L"的單體代表鎖核酸(例如，T^表示胸腺嘧咬鎖核酸或LNA)。詳述在本發(fā)明一方面描述的具體特征也適用于本發(fā)明的其它方面。例如，在適當(dāng)時，關(guān)于第一方面的RNA復(fù)合物描述的特征也適用于第九方面的寡核苷酸和第十方面的RNA雙鏈體。第一方面，RNA復(fù)合物siRNA雙鏈體或單鏈RNA形式的RNA復(fù)合物可介導(dǎo)細(xì)胞中對耙核酸的各種修飾。這個過程中，復(fù)合物的反義鏈作為向?qū)?，因為反義鏈可雜交于具有與該反義鏈互補(bǔ)的序列段的靶核酸。耙向耙核酸之前，反義鏈通常被并入RNA引導(dǎo)的蛋白復(fù)合物(RGPC)，這可對靶核S交起作用。RNA引導(dǎo)的蛋白復(fù)合物的一個實例是RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)。認(rèn)為存在其它這種RGPC且本發(fā)明的RNA復(fù)合物將也有益處，當(dāng)與這些其它RGPC—起使用或甚至不與任何RGPC相互作用時。本發(fā)明的一個目的是使RNA復(fù)合物對生物介質(zhì)(血清、體內(nèi)、細(xì)胞培養(yǎng)物中)中的溶核降解穩(wěn)定。本發(fā)明的另一個目的是改善雙鏈RNA復(fù)合物的基因沉默效應(yīng)。該改善可例如涉及增加的效力、減少的脫靶效應(yīng)、減少的免疫刺激、增加的儲存穩(wěn)定性、在生物介質(zhì)如血清等中增加的穩(wěn)定性、增加的作用持續(xù)時間和改善的藥代動力學(xué)特征，所有這些均是相對于天然未修飾的RNA復(fù)合物而言。本發(fā)明的又另一個目的是改善單鏈RNA寡核苷酸的基因沉默效應(yīng)。該改善可例如涉及增加的效力、減少的脫靶效應(yīng)、減少的免疫刺激、增加的儲存穩(wěn)定性、在生物介質(zhì)如血清等中增加的穩(wěn)定性、增加的作用持續(xù)時間和改善的藥代動力學(xué)特征，所有這些均是相對于天然未修飾的RNA復(fù)合物而言。本發(fā)明的一個目的是確保只有本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈而不是信使鏈將介導(dǎo)對把核酸的修飾。這一目的的實現(xiàn)將提供具有較少脫靶效應(yīng)的RNA復(fù)合物。本發(fā)明的另一個目的是確保RNA復(fù)合物在生物介質(zhì)中的足夠的穩(wěn)定性。因此一個目的是提供相對于未修飾的RNA復(fù)合物，在細(xì)胞培養(yǎng)物中或體內(nèi)展示增強(qiáng)的基因調(diào)節(jié)功能如基因沉默效應(yīng)的RNA復(fù)合物。本發(fā)明的基本理念是將一個或多個羥曱基取代的單體并入本發(fā)明的RNA復(fù)合物。在siRNA的情況中，這可導(dǎo)致優(yōu)先將復(fù)合物的僅一條鏈并入RISC。將一個或多個羥曱基取代的單體并入RNA復(fù)合物的一條(或多條)RNA鏈將改善RNA復(fù)合物在生物介質(zhì)中和體內(nèi)的壽命，并因此將導(dǎo)致改善的生物活性，例如改善的基因調(diào)節(jié)活性。本發(fā)明RNA復(fù)合物的RNA鏈可包括天然的RNA核苷酸、已知與基因沉默活性相容的脂A修飾[Nawrot和Sipa,Cwm7b^"MW.C7zew.2006,《913-9M]和羥曱基取代的單體(圖1)。磷酸二酯鍵合(Phosphordiesterlinkage)可連接單獨(dú)單體，但可改為使用修飾的鍵合如硫代磷酸酯鍵合和本領(lǐng)域才支術(shù)人員已知的其它4建合[Nawrot和Sipa,CwwTop/"C/zem.2006,6,913-925]。RNA復(fù)合物可包括兩條鏈，它們一起構(gòu)成包括反義鏈(反義鏈本文中也稱為引導(dǎo)鏈)和信使鏈(信使鏈本文中也稱為有義鏈)的siRNA雙鏈體，但單鏈微RNA模擬分子在本文也被認(rèn)為是本發(fā)明的RNA復(fù)合物，如例如可用于靶向微RNA的單鏈反義分子。在本發(fā)明實施方案中，RNA復(fù)合物包括一個或多個羥曱基修飾的核苷酸單體(參見圖1)。依此作為一個這種實例的是無環(huán)的核苷酸單體，更優(yōu)選地選自單體D-J組成的組的無環(huán)的單體。因此，在第一方面關(guān)于羥甲基修飾的核苷酸單體所述的實施方案將適用于關(guān)于無環(huán)的核苷酸單體的其它實施方案。出于多種原因，使用羥曱基修飾的核苷酸單體可為有利的。羥曱基修飾的核苷酸單體可例如用于增加RNA復(fù)合物的基因沉默效應(yīng)，且將一個或多個羥曱基修飾的核苷酸單體并入例如RNA復(fù)合物末端誘導(dǎo)對溶核降解的顯著穩(wěn)定性。羥甲基修飾的核苷酸單體還可用于減少siRNA復(fù)合物信使鏈的基因沉默效應(yīng)，從而減少脫靶效應(yīng)的數(shù)目。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，包含一個或多個羥曱基^f奮飾的核苷酸單體的RNA復(fù)合物是單鏈RNA構(gòu)建體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，包含一個或多個羥曱基修飾的核苷酸單體的RNA復(fù)合物是能夠通過作為單鏈反義分子抑制基因表達(dá)的單鏈RNA構(gòu)建體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，包含一個或多個羥曱基》務(wù)飾的核苷酸單體的RNA復(fù)合物是功能上模擬微RNA的單鏈RNA構(gòu)建體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，包含一個或多個羥甲基^f務(wù)飾的核苷酸單體的RNA復(fù)合物是siRNA構(gòu)建體。因此，在一個實施方案中，siRNA構(gòu)建體的反義鏈包括一個或多個羥曱基修飾的核苷酸單體。在另一個實施方案中，siRNA構(gòu)建體的信使鏈包括一個或多個羥曱基修飾的核苷酸單體。在又另一個實施方案中，siRNA構(gòu)建體的帶切口的信使鏈的第一和第二RNA分子各含有一個或多個羥曱基修飾的核香酸單體。在本發(fā)明一個實施方案中，反義鏈中羥甲基修飾的核苷酸單體的數(shù)目是10。在本發(fā)明其它實施方案中，反義鏈中羥曱基修飾的核苷酸單體的數(shù)目分別是9、8、7、6、5、4、3、2或1。在另一個實施方案中，反義鏈的所有核苷酸是羥曱基修飾的核苷酸單體。在優(yōu)選實施方案中，反義鏈中所有羥曱基修飾的核苷酸單體存在于位置"8,其中位置從5'末端計數(shù)。甚至更優(yōu)選地，反義鏈中羥曱基修飾的核苷酸單體存在于對應(yīng)于孩iRNA的所謂種子區(qū)(seedregion)的位置2-7。因此，在前述區(qū)域中存在鞋曱基修飾的核苷酸單體將阻止反義鏈作為微RNA起作用，這減少當(dāng)反義鏈意為作為siRNA起作用時的脫靶效應(yīng)。在優(yōu)選實施方案中，至少一個羥曱基修飾的核苷酸單體存在于位置9-16之一，其中位置從5'末端計數(shù)。甚至更優(yōu)選地是，2、3、4、5或6個羥曱基修飾的核苷酸單體存在于位置9-16，且在另一實施方案中，反義鏈中的羥曱基修飾的核苷酸單體存在于位置9-16的所有位置。在一個實施方案中，羥曱基修飾的核苷酸單體僅存在于區(qū)域9-16且不存在于反義鏈的其余部分。甚至更優(yōu)選地，反義鏈中羥曱基修飾的核苷酸單體存在于位置9-11，且優(yōu)選地不存在于寡核苷酸的其余部分。在前述區(qū)域中存在羥曱基修飾的核香酸單體將誘導(dǎo)反義鏈作為微RNA起作用，即確保siRNA效應(yīng)將最小且微RNA效應(yīng)更高。該效應(yīng)可能來自于因存在無環(huán)的羥曱基取代的單體例如單體D導(dǎo)致親和力減少而向全長結(jié)合的趨勢的減少。類似地，在本發(fā)明另一實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物信使鏈中羥曱基修飾的核苷酸單體的數(shù)目是10。在本發(fā)明其它實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物信使鏈中羥曱基修飾的核苷酸單體的數(shù)目分別是9、8、7、6、5、4、3、2或1。在另一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物信使鏈的所有核苷酸是羥曱基修飾的核苦酸單體。在一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈和信使鏈含有一個或多個羥曱基修飾的核苷酸單體。一方面，本發(fā)明提供能夠介導(dǎo)對靶核酸的核酸修飾的RNA復(fù)合物。這種RNA復(fù)合物可例如為siRNA、微RNA或微RNA前體(前-微RNA，pre-microRNA)。12本發(fā)明siRNA復(fù)合物的RNA復(fù)合物包括含有反義鏈和雜交于反義鏈的信使鏈的核心雙鏈區(qū)。本文上下文中所指的靶核酸是對復(fù)合物反義鏈具有顯著的互補(bǔ)性的核酸。優(yōu)選地，互補(bǔ)性對若干個核苦酸的段是完全的。因此，在一個實施方案中，互補(bǔ)性對25個核苷酸的段是完全的。在其它實施方案中，互補(bǔ)性分別對24個核苷酸、23個核苷酸、22個核苦酸、21個核苷酸、20個核苷酸、19個核苷酸、18個核苷酸、17個核苦酸、16個核苷酸、15個核苷酸、14個核苷酸、13個核苷酸、12個核苷酸、ll個核苷酸、IO個核苷酸、9個核苷酸、8個核苷酸、7個核苷酸或6個核苷酸的段是完全的。在一個實施方案中，互補(bǔ)性段包括l個錯配。在其它實施方案中，互補(bǔ)性段分別包括2個錯配、3個錯配或4個錯配。1個錯配是互補(bǔ)性段中的一個區(qū)域，其中不能形成堿基對，例如當(dāng)G面對A時。當(dāng)存在更多錯配時，它們可能彼此相鄰或它們可在互補(bǔ)性段的不同區(qū)域中間隔開。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的RNA復(fù)合物包括核心雙鏈區(qū)，其是大致雙鏈的區(qū)。RNA復(fù)合物中的單鏈區(qū)主要與復(fù)合物的懸端相關(guān)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的雙鏈區(qū)包括1個錯配。在其它實施方案中，雙鏈區(qū)分別包括2個錯配、3個錯配和4個錯配。本文所用的術(shù)語"靶核酸"包涵將經(jīng)受反義鏈引導(dǎo)的調(diào)節(jié)諸如靶向裂解或空間阻塞(stericblockage)的任何RNA/DNA。靶RNA/DNA可例如是基因組DNA、基因組病毒RNA、mRNA、前-mRNA或非編碼RNA。本文所用的術(shù)語"靶核酸修飾"是指對靶核酸的任何修飾，包括影響耙核酸活性而不影響靶核酸結(jié)構(gòu)的》務(wù)飾。本發(fā)明優(yōu)選的靶核酸是mRNA。因此，在一個實施方案中，RNA復(fù)合物介導(dǎo)的核酸修飾是RNA干擾(RNAi)。在優(yōu)選實施方案中，RNAi介導(dǎo)mRNA的降解。在另一優(yōu)選實施方案中，RNAi介導(dǎo)mRNA的翻譯抑制。在另一個實施方案中，RNAi介導(dǎo)mRNA的翻譯抑制和降解。在其它優(yōu)選實施方案中，耙核酸是非編碼RNA,例如tRNA、miRNA、snRNA、snoRNA或rRNA。在又一個實施方案中，靶核酸是基因組DNA。在這種實施方案中，優(yōu)選的核酸修飾包括DNA曱基化和DNA缺失。本發(fā)明RNA復(fù)合物的大小可改變而仍實現(xiàn)本發(fā)明的一個或多個目的。這在例如當(dāng)具體目的是減少的脫耙效應(yīng)時適用。因此，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)可包括選自下組的許多堿基對IO個堿基對、ll個堿基對、12個堿基對、13個堿基對、14個堿基對、15個堿基對、16個堿基對、17個堿基對、18個堿基對、19個堿基對、20個堿基對、21個石威基對、22個i威基對、23個石威基對、24個石威基對和25個堿基對、26個》成基對、27個堿基對、28個堿基對、29個堿基對、30個堿基對、35個堿基對、40個堿基對、42個石威基對、45個石威基對、50個堿基對、55個》威基對、60個》威基對或62個》威基對。在一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)包括15至40個堿基對。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)包括18-22個堿基對。在一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)甚至長于40個堿基對，盡管知道在一些細(xì)胞引入較長雙鏈函A復(fù)合物可誘導(dǎo)干擾素依賴性非特異性應(yīng)答。在一個這種實施方案中，預(yù)期復(fù)合物與RGPC接合之前被加工為較短的雙鏈RNA復(fù)合物。RNA酶III樣酶諸如切丁斷Dicer)可進(jìn)行加工。切丁酶還加工短于40個堿基對的雙鏈RNA，且這種RNA復(fù)合物(稱為切丁酶底物)與不經(jīng)加工進(jìn)入RISC的siRNA相比具有多種益處。因此在一個實施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物是切丁酶底物。在另一個實施方案中，RNA復(fù)合物是單鏈，并且沒有雙鏈區(qū)。在又另一個實施方案中，RNA復(fù)合物是單鏈但折疊以使其含有一個或多個雙鏈區(qū)。這種實施方案可用于例如才莫擬樣iRNA和其功能。在又另一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的核心雙《連區(qū)短于10個堿基對且因此包括一到九個堿基對。在本發(fā)明一個實施方案中，RNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)被多于兩條RNA鏈包括。在本發(fā)明一個實施方案中，RNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)被三條RNA鏈包括。在本發(fā)明另一實施方案中，RNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)被四條或更多脂A鏈包括。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物包括懸端。本文上下文中所用的懸端是指跟隨雙鏈區(qū)之后的短單鏈區(qū)。在一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈包括3'-懸端。在另一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的信使鏈包括3'-懸端。在又另一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈包括5'-懸端。在又另一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的信使鏈包括5'-懸端。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈和信使鏈都包括3'-懸端。本發(fā)明siRNA復(fù)合物的懸端可為不同長度，而不干擾復(fù)合物的基本功能。因此在一實施方案中，懸端選自長度為1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苦酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸和8個核苷酸的懸端的組。本發(fā)明siRNA復(fù)合物的最優(yōu)選的懸端是長度分別為1、2和3個核苷酸的懸端。在一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈的懸端具有與信使鏈懸端相同的長度。在另一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈的懸端不具有與信使鏈懸端相同的長度。在本發(fā)明siRNA復(fù)合物的又另一實施方案中，RNA復(fù)合物包括至少一個平端。"平端"是指雙鏈核酸不具有任何突出的核苷酸的末端，即雙鏈核酸的兩條鏈在相同位置終止。在另一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物在兩個末端均是平端的。本發(fā)明的優(yōu)選RNA復(fù)合物總體結(jié)構(gòu)上類似于切丁酶加工較長的雙鏈RNA復(fù)合物的產(chǎn)物。在另一個實施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物是如上述的切丁酶底物。本發(fā)明的其它優(yōu)選的RNA復(fù)合物是其中核心雙鏈區(qū)包括18-22個堿基對，且其中反義鏈和信使鏈各包括1-3個核普酸的3'-懸端的復(fù)合物。本發(fā)明RNA復(fù)合物的反義鏈可具有不同長度，而不干擾復(fù)合物的功能。因此在優(yōu)選實施方案中，反義鏈分別是8-mer、9-mer、10-mer、ll-mer、12-mer、13-mer、14-mer、15-mer、16國mer、17隱mer、18-mer、19-mer、20-mer、21-mer、22-mer、23-mer、24-mer、25-mer、26-mer、27-mer、28-mer、29-mer、30-mer、31-mer、32-mer、33-mer、34-mer、35-mer、36-mer、37-mer、38-mer、39-mer、40-mer、41-mer、42-mer、43-mer、44-mer、45-mer、46-mer、47-mer、48-mer、49-mer、50-mer、51-mer、52-mer、53-mer、54-mer、55-mer、56-mer、57-mer、58-mer、59-mer、60-mer、61-mer或62-mer。應(yīng)理解,例如19-mer是19個單體即19個核苷酸的反義鏈。在另一優(yōu)選實施方案中，RNA復(fù)合物的反義鏈選自下組反義鏈15-mer、16-mer、17-mer、18-mer、19-mer、20-mer、21-mer、22-mer和23-mer。在一實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的信使鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的。在本發(fā)明siRNA復(fù)合物的一實施方案中，信4吏鏈包括若干個分開的RNA分子。RNA分子的數(shù)目可為1、2、3、4、5或6。在一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物信使鏈的單獨(dú)RNA分子的長度是多于4個單體。在其它實施方案中，信使鏈的單獨(dú)RNA分子的長度分別是多于5個單體、6個單體、7個單體、8個單體、9個單體、10個單體、11個單體和12個單體。在其它實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物信使鏈的單獨(dú)RNA分子的長度分別是低于5個單體、6個單體、7個單體、8個單體、9個單體、10個單體、li個單體和12個單體。在本發(fā)明一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的不連續(xù)的信使鏈包括第一和第二RNA分子，它們一起形成不連續(xù)的信使鏈，其中第一RNA分子雜交于反義鏈的下游部分，而第二RNA分子雜交于反義鏈的上游部分。在一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的。反義鏈的優(yōu)選的不連續(xù)性與信使鏈的優(yōu)選的不連續(xù)性相同。本發(fā)明siRNA復(fù)合物的一條鏈的不連續(xù)性可以是切口。切口應(yīng)理解為雙鏈核酸的一條鏈中因缺少磷酸二酯鍵但雙鏈核酸卻沒有缺少核苷酸而導(dǎo)致的不連續(xù)性。因此，面對切口的堿基仍將雜交于帶切口的鏈上的堿基。本發(fā)明siRNA復(fù)合物的一條鏈的另一種不連續(xù)性是可選的切口，這理解為雙鏈核酸的一條鏈中因糖-磷酸酯主鏈上缺少除了磷酸二酯鍵以外的一個鍵或多于一個鍵但雙鏈核酸卻沒有缺少核堿基而導(dǎo)致的不連續(xù)性。因此，面對切口的石成基仍可雜交于帶切口的鏈上的堿基。當(dāng)本發(fā)明RNA復(fù)合物的RNA鏈可被描述為具有其中雙鏈核酸中缺少至少一個核普酸或核苦或核堿基的不連續(xù)性時，缺口用作命名。優(yōu)選地，RNA復(fù)合物的5'-末端是磷酸化的或可用于磷酸化。可用于磷酸化是指5'-羥基基團(tuán)還未被例如通過直接共軛或通過與接近5'-羥基基團(tuán)的其它基團(tuán)的其它共軛封閉，這種封閉將阻止5'-羥基基團(tuán)被磷酸化。因此在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，RNA復(fù)合物的RNA分子包括5'-末端磷酸酯和3'-羥基基團(tuán)。在另一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的第二RNA分子包括5'-末端磷酸酯和3'-羥基基團(tuán)。在又另一個實施方案中，反義鏈包括5'-末端磷酸酯和3'-羥基基團(tuán)。在本發(fā)明一些實施方案中，RNA復(fù)合物包括羥曱基修飾的核苷酸以外的核苷酸類似物是優(yōu)選的。這種羥曱基^f奮飾的核苷酸以外的核苷酸類似物以下稱為"另外修飾的核苷酸，，。出于多種原因，另外修飾的核苷酸的使用可為有利的。它們可例如用17于增加本發(fā)明siRNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)的解鏈溫度。另外修飾的核苷酸的使用可有利于增加反義鏈和靶核酸之間形成的雙《連結(jié)構(gòu)的解《連溫度。因此在一個實施方案中，反義鏈包括另外修飾的核苷酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的信使鏈包括另外修飾的核苦酸。在又另一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的信使鏈的第一和第二RNA分子各含有另外修飾的核普酸。在本發(fā)明一個實施方案中，RNA復(fù)合物中另外修飾的核苷酸的數(shù)目是10。在本發(fā)明其它實施方案中，RNA復(fù)合物中核苷酸類似物的數(shù)目分別是9、8、7、6、5、4、3、2或1。在本發(fā)明一個實施方案中，反義鏈中另外修飾的核苷酸的數(shù)目是10。在本發(fā)明其它實施方案中，反義鏈中核苷酸類似物的數(shù)目分別是9、8、7、6、5、4、3、2或1。在另一個實施方案中，反義鏈的所有核苷酸是另外修飾的核苷酸或是另外修飾的核苦酸與輕曱基取代的核香酸的組合。類似地，在本發(fā)明另一實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物信使鏈中核苦酸類似物的數(shù)目是IO。在本發(fā)明其它實施方案中，信使鏈中核苷酸類似物的數(shù)目分別是9、8、7、6、5、4、3、2或1。在另一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物信使鏈的所有核苷酸是核苷酸類似物或是另外修飾的核苷酸與羥甲基取代的核苷酸的組合。在一個實施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈和信使鏈都含有另外修飾的核苷酸。在一個實施方案中，RNA復(fù)合物的另外修飾的核苷酸是相同的，即它們例如都是LNA或都是2'-0-Me-RNA。在另一個實施方案中，各種不同的另外修飾的核普酸用于同一RNA復(fù)合物中。在一個實施方案中，RNA復(fù)合物包括硫代磷酸酯鍵(或稱為硫代磷酸酉旨4建合，phosphorothioatelinkage)。在另一個實施方案中，RNA復(fù)合物包括天然磷酸二酯(phosphordiester)和硫代磷酸酯鍵合的混合物。本發(fā)明的優(yōu)選的核苷酸類似物是選自下組的核苷酸類似物2'-0-烷基-RNA單體、2'-氨基-DNA單體、2'-氟-DNA單體、LNA單體、HNA單體、ANA單體、FANA單體、DNA單體、PNA單體和INA單體，但還可使用其它單體[Nawrot和Sipa,Cwr%//<^Me<i.CTzew.2006，6，913-925]。在一實施方案中，本發(fā)明的羥曱基取代的單體的羥曱基取代基被共軛基團(tuán)官能化。共軛基團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的改變、擴(kuò)大或改善本發(fā)明RNA復(fù)合物的特性的基團(tuán)。這種基團(tuán)可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞分布、器官分布、組織分布、雙鏈體解鏈溫度、靶親和力、生物穩(wěn)定性、雜交信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。在一實施方案中，本發(fā)明的羥曱基取代的單體的羥曱基取代基被共軛的基團(tuán)與羥甲基取代基的亞曱基基團(tuán)之間的醚鍵合官能化。參見圖2(單體F)。在一實施方案中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，本發(fā)明的羥曱基取代的單體的羥甲基取代基在并入本發(fā)明RNA復(fù)合物之前轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛎压倌芏?。參見圖2(單體G)。在另一實施方案中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，本發(fā)明的羥曱基取代的單體的羥曱基取代基在并入本發(fā)明RNA復(fù)合物之前轉(zhuǎn)變?yōu)閹€曱基官能度。參見圖2(單體G,R=H)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，該巰基官能度在RNA合成期間被適當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)，例如作為其乙?；苌?。在一實施方案中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，本發(fā)明的羥曱基取代的單體的羥曱基取代基在并入本發(fā)明RNA復(fù)合物之前轉(zhuǎn)變?yōu)榘饭倌芏?。參見圖2(單體I，R=H)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，該胺官能度在RNA合成期間被適當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)，例如作為其三氟乙酰基或Fmoc衍生物。在一實施方案中，本發(fā)明的羥曱基取代的單體的羥曱基取代基作為柄(handle)起作用以連接酰胺-連接的共軛基團(tuán)。這包括羥曱基取代基的羥基單元向胺單元的轉(zhuǎn)變，例如如上所述的，以及^f吏用本領(lǐng)域，技術(shù)人員已知的方法通過例如共軛基團(tuán)經(jīng)由酰胺鍵形成的該氨基基團(tuán)的進(jìn)一步衍生化。使用本領(lǐng)域-技術(shù)人員已知的方法，這可發(fā)生在RNA合成之前或RNA合成之后(圖2，單體H)。在一實施方案中，本發(fā)明的羥曱基取代的單體的羥曱基取代基作為柄起作用以連接氨基-連接的共軛基團(tuán)。這包括羥曱基取代基的羥基單元向胺單元的轉(zhuǎn)變，例如如上所述的，以及使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法通過例如共輒基團(tuán)經(jīng)由胺鍵形成的該氨基基團(tuán)的進(jìn)一步衍生化。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，這可發(fā)生在RNA合成之前或RNA合成之后(圖2，單體I)。在另一實施方案中，用于共軛的胺基團(tuán)是氨基基團(tuán)、哌喚基基團(tuán)或二氨基烷基基團(tuán)。這種單體稱為胺-衍生化的單體。這些基團(tuán)各自可被進(jìn)一步衍生化或共軛(圖2，單體J)。在一個實施方案中，與天然RNA復(fù)合物相比，本發(fā)明RNA復(fù)合物具有減少的脫把效應(yīng)。在一優(yōu)選實施方案中，RNA復(fù)合物在反義鏈中具有至少一個本發(fā)明的鞋曱基取代的單體。在另一優(yōu)選實施方案中，RNA復(fù)合物具有至少一個并入或圍繞反義鏈的所謂種子區(qū)的本發(fā)明的羥曱基取代的單體，即該單體在從反義鏈5'-末端的第l-12號位置的至少一個中。在又另一優(yōu)選實施方案中，RNA復(fù)合物具有至少一個從反義鏈5'-末端的第2-10號位置的至少一個中并入的本發(fā)明的羥曱基取代的單體。在又另一優(yōu)選實施方案中，RNA復(fù)合物具有一個從反義鏈5'-末端的第3-8號位置之一中并入的本發(fā)明的羥甲基取代的單體。在又另一優(yōu)選實施方案中，RNA復(fù)合物具有一個從反義鏈5'-末端的第7號或第8號位置之一中并入的本發(fā)明的羥甲基取代的單體。在又另一優(yōu)選實施方案中，RNA復(fù)合物具有一個從反義鏈5'-末端的第7號位置中并入的本發(fā)明的羥曱基取代的單體。在又另一優(yōu)選實施方案中，RNA復(fù)合物具有一個/人反義鏈5'-末端的第9-16號位置中并入的本發(fā)明的羥曱基取代的單體。在又另一優(yōu)選實施方案中，RNA復(fù)合物具有一個/人反義鏈5'-末端的第9-11號位置中并入的本發(fā)明的羥曱基取代的單體。在又另一優(yōu)選實施方案中，RNA復(fù)合物具有一個從反義鏈'-末端的第9-10號位置中并入的本發(fā)明的羥曱基取代的單體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物與天然RNA復(fù)合物相比產(chǎn)生減少的免疫應(yīng)答。在更另一個實施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物與天然RNA復(fù)合物相比具有延長的效應(yīng)。在又另一個實施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物與天然RNA復(fù)合物相比具有增加的效應(yīng)。因此在優(yōu)選實施方案中，RNA復(fù)合物比天然RNA復(fù)合物更有效地介導(dǎo)RNAi,例如通過耙mRNA的更有效地降解或通過把mRNA的更有效地翻i奪抑制。在又另一個實施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物有效地遞送于人類或動物的特定器官或組織。在又另一實施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物能夠有效地穿透細(xì)胞膜。在又另一實施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物能夠比(that)天然RNA復(fù)合物更有效地穿透細(xì)胞膜。在一個實施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物能夠結(jié)合血漿蛋白，這增加RNA復(fù)合物在人體中的滯留。第二方面，RNA復(fù)合物的制備本發(fā)明的另一方面是制備本發(fā)明雙鏈RNA復(fù)合物的方法，所述方法包括在其中形成包含核心雙鏈區(qū)的RNA復(fù)合物的條件下溫育反義鏈與信使鏈，所述RNA復(fù)合物能夠介導(dǎo)相應(yīng)細(xì)胞RNA的RNA干擾。在該方面的替代實施方案中，RNA復(fù)合物被本發(fā)明的RNA雙鏈體代替(第十方面)。第三方面，介導(dǎo)核酸修飾的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的又另一方面是介導(dǎo)細(xì)胞或生物體中靶核酸的核酸修飾的方法，其包括以下步驟a.在其中可發(fā)生靶核酸修飾的條件下將細(xì)胞或生物體與本發(fā)明的RNA復(fù)合物4妄觸，b.從而介導(dǎo)靶核酸的修飾。在優(yōu)選實施方案中，介導(dǎo)耙核酸的核酸修飾的方法在體外進(jìn)行。在優(yōu)選實施方案中，介導(dǎo)耙核酸的核酸修飾的方法在體內(nèi)進(jìn)行，即在動物、人類或非人類動物中。在優(yōu)選實施方案中，介導(dǎo)靶核酸的核酸修飾的方法在細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行。在又另一個實施方案中，該方法對分離的細(xì)胞進(jìn)行。在優(yōu)選實施方案中，該方法的核酸修飾是RNA干擾，優(yōu)選的是靶mRNA的降解或靶mRNA的翻i奪抑制或其它類型RNA例如非編碼RNA的抑制。在另一個實施方案中，該核S吏修飾是DNA曱基化。在該方面的替代實施方案中，該RNA復(fù)合物被本發(fā)明的寡核苷酸(第九方面)或本發(fā)明的RNA雙鏈體(第十方面)代替。第四方面，檢查基因功能的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的另一方面是檢查細(xì)胞或生物體中基因功能的方法，其包括a.將對應(yīng)于所述基因的本發(fā)明的RNA復(fù)合物引入細(xì)胞或生物體，從而產(chǎn)生測試細(xì)胞或測試生物體，b.將測試細(xì)胞或測試生物體保持在其中可發(fā)生靶核酸修飾的條件下，c.觀察測試細(xì)胞或生物體在步驟b中產(chǎn)生的表型并任選地將觀察到的表型與合適的對照細(xì)胞或?qū)φ丈矬w的表型比較，從而提供關(guān)于基因功能的信息。例如使用所附實施例中列出的轉(zhuǎn)染，本發(fā)明的RNA復(fù)合物可引入細(xì)胞?？捎^察生物體或細(xì)胞的表型，例如使用蛋白組學(xué)來評價蛋白水平或使用微陣列來評價脂A水平。還可使用更精細(xì)的表型，例如一種特定基因的表達(dá)。所獲得的關(guān)于基因功能的信息可用于確定基因產(chǎn)物是否是與特定疾病相關(guān)的治療干預(yù)的適合的靶。因此，如果證實某一基因產(chǎn)物在已知在例如具體亞型癌癥中受影響的某一生化途徑中起作用，那么該基因產(chǎn)物可能是治療前述亞型癌癥的治療干預(yù)的適合的靶。在檢查細(xì)胞或生物體中基因功能的方法的優(yōu)選實施方案中，該方法中的核酸修飾是RNA干擾，優(yōu)選的是靶mRNA的降解或靶RNA的翻譯抑制。在另一個實施方案中，該核酸修飾是DNA曱基化。在檢查細(xì)胞或生物體中基因功能的方法的優(yōu)選實施方案中，該方法在細(xì)胞培養(yǎng)物中、體外或體內(nèi)進(jìn)行。在又另一個實施方案中，該方法對分離的細(xì)胞進(jìn)行。在該方面的替代實施方案中，該RNA復(fù)合物被本發(fā)明的寡核苷酸(第九方面)或本發(fā)明的RNA雙鏈體(第十方面)代替。第五方面，評價藥劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的另一方面是評價一種藥劑是否作用于基因產(chǎn)物的方法，其包括以下步驟a.將對應(yīng)于所述基因的本發(fā)明的RNA復(fù)合物引入細(xì)胞或生物體，從而產(chǎn)生測試細(xì)l包或測試生物體，b.將測試細(xì)胞或測試生物體保持在其中發(fā)生靶核酸修飾的條件下，c.將藥劑引入測試細(xì)月包或測試生物體，d.觀察測試細(xì)胞或生物體在步驟c中產(chǎn)生的表型，并任選地將觀察到的表型與合適的對照細(xì)胞或?qū)φ丈矬w的表型比較，從而提供關(guān)于藥劑是23否作用于基因產(chǎn)物的信息。步驟d中優(yōu)選的對照是不具有步驟a中引入的RNA復(fù)合物的測試細(xì)胞或測試生物體。在評價藥劑是否作用于基因或基因產(chǎn)物的方法的優(yōu)選實施方案中，該方法的核酸修飾是RNA干擾，優(yōu)選的是靶RNA的降解或靶RNA的翻譯抑制。在另一個實施方案中，核酸修飾的修飾是DNA曱基化。在評價藥劑是否作用于基因產(chǎn)物的方法的優(yōu)選的實施方案中，該方法在細(xì)胞培養(yǎng)物中、體外或體內(nèi)進(jìn)行。在又另一個實施方案中，該方法對分離的細(xì)胞進(jìn)行。在該方面的替代實施方案中，該RNA復(fù)合物被本發(fā)明的寡核普酸(第九方面)或本發(fā)明的RNA雙鏈體(第十方面)代替。第六方面，藥物組合物本發(fā)明的又另一方面是RNA復(fù)合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔助劑。對技術(shù)人員明顯的是，本發(fā)明的RNA復(fù)合物可設(shè)計為靶向特定基因和基因產(chǎn)物。應(yīng)理解的是，該RNA復(fù)合物將輩巴向DNA序列或RNA序列而不是蛋白。然而，基因產(chǎn)物諸如蛋白的水平可被間接影響，如果其mRNA或非編碼RNA纟皮例如RNA降解或翻譯抑制所修飾。還可影響編碼該蛋白的基因的表達(dá)，例如因為DNA曱基化。在該方面的替代實施方案中，該RNA復(fù)合物被本發(fā)明的寡核苷酸(第九方面)或本發(fā)明的RNA雙鏈體(第十方面)代替。第七方面，使用藥物因此另一方面是本發(fā)明的RNA復(fù)合物用作藥物。驗證治療靶后，技術(shù)人員可設(shè)計影響靶水平和活性的RNA復(fù)合物，因為RNA復(fù)合物的特異性專門地存在于反義鏈序列中。對于具有連續(xù)信使鏈的天然RNA復(fù)合物，由于信使鏈作為^1導(dǎo)序列起作用，因而仍存在脫靶效應(yīng)的問題。在該方面的替代實施方案中，該RNA復(fù)合物被本發(fā)明的寡核苷酸(第九方面)或本發(fā)明的RNA雙鏈體(第十方面)代替。第八方面，單體本發(fā)明的一個方面是適于并入本發(fā)明的羥曱基取代的單體的單體和從易于獲得的起始物料制備其的方法。本發(fā)明的羥曱基取代的單體的胸腺嘧啶-l-基衍生物已被并入DNA鏈，且制備其用于自動DNA/RNA合成的亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元的程序已被報道[K.D.Nielsen等人，C7ze肌1995,3,1493;H.Thrane等人，7fe/ra/z^/raw1995，57,10389;P.Nielsen等人,B/owg.MedC/zem.1995,3,19]。最通常地，本發(fā)明的RNA復(fù)合物將由如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的自動寡核苦酸合成制備。將本發(fā)明的羥曱基取代的單體并入本發(fā)明的RNA復(fù)合物遵循用于a)在自動RNA合成儀上的RNA合成、b)RNA檢查、c)RNA純4b和d)RNA分離的才示準(zhǔn)方法[F.Eckstein,OligonucleotidesandAnalogues(寡核苦酸和類似物)，IRLPress,OxfordUniversityPress,1991]。羥曱基取代的RNA寡核苦酸(二RNA鏈)和RNA復(fù)合物可使用亞磷酰胺衍生物，使用RNA合成的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成。在優(yōu)選實施方案中，制備本發(fā)明的輕曱基取代的單體的亞磷酰胺衍生物的方法開始于核糖核苷，例如核糖核苷的05'-DMT保護(hù)的衍生物，對于堿基，腺噤呤、鳥噤呤、胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶含有堿基保護(hù)基團(tuán)，如例如，苯曱?；惗□；⒁阴；?、苯氧乙酰基、叔丁基苯氧乙酰基或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它標(biāo)準(zhǔn)堿基保護(hù)基團(tuán)。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括制備具有2',3'-斷開的碳-碳鍵(核糖核苷命名法)的適于并入單體D和E的單體結(jié)構(gòu)單元的方法。在其它優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括制備具有2',3'-斷開的碳-碳鍵、適于并入單體如F-J且另外在例如其2'-碳原子(核糖核苷命名法)攜帶羥基基團(tuán)以外的官能度或基團(tuán)的單體結(jié)構(gòu)單元的方法。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，制備單體D的亞磷酰胺衍生物的方法的關(guān)鍵步驟中包括2',3'-二醇裂解、所得的中間產(chǎn)物的還原、選擇性02'-保護(hù)和03'-磷酸化(phosphitylation)。在優(yōu)選實施方案中，以例如高碘酸鈉為試劑使用氧化裂解進(jìn)行2',3'-二醇裂解。在另一優(yōu)選實施方案中，高碘酸鈉裂解后中間產(chǎn)物的還原被還原為相應(yīng)的二醇，以例如硼氫化鈉實現(xiàn)。為了將單體D并入本發(fā)明的RNA復(fù)合物，保護(hù)2'-羥基基團(tuán)(核糖核苷命名法)是必須的。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，這通過苯曱?；M(jìn)行。為了優(yōu)化保護(hù)的選擇性，即02'-苯曱酰化相對于03'-苯曱?；牧浚瑑H使用略多于一當(dāng)量的苯曱?；噭?苯曱酰氯或例如苯曱酸酐(benzoylanhydride))可為有益的。在一個優(yōu)選的實施方案中，苯甲?；谑覝匾韵逻M(jìn)行。在另一有用的實施方案中，苯曱?；?。C以下或甚至-50。C以下進(jìn)行。在另一優(yōu)選實施方案中，02'-保護(hù)通過乙酰化或通過使用有機(jī)合成領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?；噭┻M(jìn)行酰化來完成。在另一優(yōu)選實施方案中，02'-保護(hù)通過使用有機(jī)合成領(lǐng)域技術(shù)人員已知的硅烷化試劑和方法硅烷化來進(jìn)行。優(yōu)選的硅烷化保護(hù)基團(tuán)是叔丁基二甲基曱硅烷基。在優(yōu)選實施方案中，隨后的磷酸化(phosphitylation)反應(yīng)使用所謂"PC1"試劑[PCl(OCH2CH2CN)(N(iPr)2)]或所謂"bis-amidite"試劑[P(OCH2CH2CN)(N(iPr)2)2]進(jìn)行。在制備單體D的亞磷酰胺衍生物的方法的優(yōu)選實施方案中，起始物料是核糖核苦，例如核糖核苷的05'-DMT保護(hù)的衍生物，對于堿基，腺。票呤、鳥。票呤、胞嘧啶和5-曱基胞嘧啶含有堿基保護(hù)基團(tuán)如例如苯曱酰基、異丁?；⒁阴；⒈窖跻阴；?、叔丁基苯氧乙?；虮绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它標(biāo)準(zhǔn)堿基保護(hù)基團(tuán)。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供制備單體E的亞磷酰胺衍生物的方法。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，制備單體E亞磷酰胺衍生物的方法的關(guān)鍵步驟中包括2'，3'-二醇裂解、所得的中間產(chǎn)物的還原、選擇性03'-保護(hù)和02'-磷酸化(phosphitylation)。03'-保護(hù)可例如通過珪烷化或?；M(jìn)行，或通過組合如首先02'-苯曱?；?、然后03'-硅烷化、之后02'-脫苯甲酰化進(jìn)行。如本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的，還可施加其它保護(hù)基團(tuán)。在另外優(yōu)選實施方案中，制備具有2',3'-斷開的碳-碳一建、適于并入單體如F-J且另外在其2'-碳原子(核糖核苷命名法)攜帶羥基基團(tuán)以外的官能度的單體結(jié)構(gòu)單元的方法的關(guān)鍵步驟中包括開始于核糖核苷(例如05'-DMT保護(hù)的核糖核苦(ribonucleosde))2',3'-二醇裂解、所得的中間產(chǎn)物的還原、選擇性03'-保護(hù)、2'-羥基基團(tuán)的轉(zhuǎn)化、03'-脫保護(hù)和03'-磷酸化(phosphitylation)。03'-保護(hù)可例如通過硅烷化或?；M(jìn)行，或如首先02'-苯曱?；?、然后03'-硅烷化、之后02'-脫苯曱?；慕M合進(jìn)行。如本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的，還可施加其它保護(hù)基團(tuán)。轉(zhuǎn)化2'-羥基基團(tuán)為另一基團(tuán)如氨基、?；被?、烴化氨基、二烴化氨基、氨曱?；被?、哌溱基、?；咪诨?、烴化哌溱基、氨曱?；哙夯€基、?；瘞€基、烴化巰基、二硫化物、?；u基、烴化羥基、氨曱?；u基等，或通過這些基團(tuán)的取代和/或保護(hù)的衍生物，可使用有機(jī)合成領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和程序進(jìn)行。這種方法和程序包括對2'-羥基基團(tuán)的活化書f生物的取代反應(yīng)或?；虬睍貂；磻?yīng)。這種方法和程序還包括02'-烴化反應(yīng)和并入其它C2'連接基團(tuán)如氨基或巰基后的烴化反應(yīng)。又另一種可能性是2'-羥基基團(tuán)氧化獲得醛官能度，其可通過例如與親核試劑反應(yīng)進(jìn)一步修飾，或獲得羧基官能度，其可在羧基官能度轉(zhuǎn)化為活化的衍生物如活化酯后通過例如與親核試劑反應(yīng)進(jìn)一步修飾。在本發(fā)明另一實施方案中，制備適于并入單體如F-J、但為"倒置的，，(如單體D和E可認(rèn)為是"倒置的")以使02'原子被磷酸化(phosphitylated)且3'-羥基基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪换鶊F(tuán)以使C3'原子連接于羥基基團(tuán)以外的官能度的單體結(jié)構(gòu)單元的方法的關(guān)鍵步驟中包括開始于核糖核普(例如05'-DMT保護(hù)的核糖核苷(ribonucleosde))2',3'-二醇裂解、所得的中間產(chǎn)物的還原、選擇性02'-保護(hù)、3'-羥基基團(tuán)的轉(zhuǎn)化、02'-脫保護(hù)和02'-磷酸化(phosphitylation)。02'-保護(hù)可例如通過硅烷化或?；?、或兩者的組合來進(jìn)行。如本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的，還可施加其它保護(hù)基團(tuán)。3'-羥基基團(tuán)轉(zhuǎn)化為另一基團(tuán)如氨基、?；被N化氨基、二烴化氨基、氨曱?；被⑦哙夯?、?；哙夯?7烴化哌。秦基、氨曱?；哙夯?、巰基、酰化巰基、烴化巰基、二硫化物、?；u基、烴化羥基、氨曱?；u基等，或通過這些基團(tuán)的取代和/或保護(hù)的衍生物，可使用有機(jī)合成領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和程序進(jìn)行。這種方法和程序包括對3'-羥基基團(tuán)的活化衍生物的取代反應(yīng)或酰化或氨曱?；磻?yīng)。這種方法和程序還包括03'-烴化反應(yīng)和并入其它C3'連接基團(tuán)如氨基或巰基后的烴化反應(yīng)。又另一種可能性是3'-羥基基團(tuán)氧化獲得醛官能度，其可通過例如與親核試劑反應(yīng)進(jìn)一步修飾，或獲得羧基官能度，其可在羧基官能度轉(zhuǎn)化為活化的衍生物如活化酯后通過例如與親核試劑反應(yīng)進(jìn)一步修飾。在一個實施方案中，2'-C-旅。秦基衍生物通過轉(zhuǎn)化2'-羥基基團(tuán)為離去基團(tuán)(例如曱磺酸酯衍生物)、隨后與大量過量哌。秦反應(yīng)而制備。這例如可作為朝向結(jié)構(gòu)AmiditeJ的亞磷酰胺(參見下圖)合成的步驟進(jìn)行。在又另一個實施方案中，本發(fā)明包括制備適于并入本發(fā)明的羥曱基取代的單體、在cr原子(核糖核苷命名法)攜帶不同于天然核堿基的基團(tuán)或官能度的單體結(jié)構(gòu)單元的方法?？珊斜Ｗo(hù)基團(tuán)的這種基團(tuán)或官能度包括例如天然核堿基以外的芘、菲、焚光團(tuán)、氫、烷基、反應(yīng)性基團(tuán)和雜環(huán)。在又另一個實施方案中，本發(fā)明包括制備適于并入本發(fā)明的羥曱基取代的單體的單體結(jié)構(gòu)單元的方法，該羥甲基取代的單體構(gòu)造為H-膦酸酯衍生物而不是亞磷酰胺衍生物。以下顯示本發(fā)明關(guān)于亞磷酰胺(二amidite)結(jié)構(gòu)單元的一些優(yōu)選的實施方案的結(jié)構(gòu)實例(DMT=4,4'-二曱氧基三苯曱基；堿基=天然核堿基；CEtO=氰基乙氧基)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>R^烷基、膽固醇基衍生物、熒光團(tuán)、聚胺、脂肪酸、氨基酸、糖類或多肽等。第九方面，包含無環(huán)的寡核苷酸的寡核苷酸本發(fā)明的第九方面是包含無環(huán)的核苷酸單體的寡核苷酸。如根據(jù)說明和實施例部分明顯的，這種寡核苷酸具有多種應(yīng)用和益處。在優(yōu)選實施方案中，該無環(huán)的核苷酸單體是2'-3'-開環(huán)-核苷酸單體。已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)包含無環(huán)的核苷酸單體的本發(fā)明的寡核苷酸是RNAi機(jī)制的細(xì)胞酶底物，且在一些情形中，這些寡核苷酸是甚至比無無環(huán)的核苷酸單體的相同寡核苷酸更好的底物。優(yōu)選地，該無環(huán)的核苷酸單體選自單體E、F、G、H、I或J(參見圖l)組成的組。如技術(shù)人員清楚的，G、F、H、I和J都可從單體D的合成的前體制備。如圖2所示，無環(huán)的單體可轉(zhuǎn)化為攜帶共軛基團(tuán)的衍生物，)衍生物、烷基、熒光團(tuán)、聚胺、氨基酸、糖類、多肽等。當(dāng)寡核苦酸用于調(diào)節(jié)細(xì)胞、器官或生物體中的靶mRNA的活性時，這種共軛基團(tuán)例如對于更好的生物穩(wěn)定性和/或生物分布可以是有用的。寡核苷酸的長度優(yōu)選地從10到40個核苷酸單體。甚至更優(yōu)選的是從18到30個核苦酸單體的長度。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸包括少于5個無環(huán)的核苷酸單體。在另一優(yōu)選實施方案中，該寡核苷酸包括每5個核苷酸單體(不同于無環(huán)的核苷酸單體)不多于1個的無環(huán)的核苷酸單體。甚至更優(yōu)選的是每8個核苷酸單體(不同于無環(huán)的核苷酸單體)不多于1個的無環(huán)的單體。如果無環(huán)的核苷酸單體的數(shù)目達(dá)到高，那么本發(fā)明的寡核苷酸對互補(bǔ)核酸的結(jié)合親和力會受危害。因此在另一個實施方案中，該寡核苷酸包括從1到5個無環(huán)的核苷酸單體。在優(yōu)選實施方案中，無環(huán)的核苷酸單體僅存在于寡核苷酸位置1-8的一個或多個且更優(yōu)選地位置2-7。位置是從寡核苷酸的5'末端計數(shù)。這些區(qū)域的無環(huán)的核苷酸單體將減少或阻止寡核香酸作為微RNA起作用，因為這些位置對應(yīng)孩1RNA的所謂的種子區(qū)。這是相關(guān)的，例如當(dāng)寡核苷酸意為作為siRNA引導(dǎo)鏈起作用時。在優(yōu)選實施方案中，反義鏈中所有羥曱基修飾的核苷酸單體存在于位置9-16，其中位置是從5'末端計數(shù)的。甚至更優(yōu)選地，反義鏈中羥曱基修飾的核苷酸單體存在于位置9-11。因此，前述區(qū)域中羥曱基修飾的核苷酸單體的存在將誘導(dǎo)反義鏈作為微RNA起作用，即確保siRNA效應(yīng)將最小且微RNA效應(yīng)更高。這種效應(yīng)很可能源于因存在無環(huán)的羥曱基取代的單體例如單體D導(dǎo)致的親和力減少而對全長結(jié)合的趨勢的減少。在優(yōu)選實施方案中，該寡核苷酸不包括多于8個連續(xù)的DNA單體的DNA序列。甚至更優(yōu)選的是不多于6個連續(xù)的DNA單體且最優(yōu)選地不多于4個連續(xù)的DNA單體。連續(xù)的DNA單體通常將使得寡核苷酸當(dāng)結(jié)合于互補(bǔ)RNA時激活RNA酶H，這導(dǎo)致RNA降解。在本發(fā)明一些實施方案中，這是不期望的。因此在進(jìn)一步實施方案中，該寡核苷酸根本不含有任何DNA單體。在其它實施方案中，RNA酶H激活是期望的且該寡核苷酸包括多于4個連續(xù)的DNA單體，更優(yōu)選地多于6個DNA單體且最優(yōu)選地多于8個DNA單體是優(yōu)選的。在又另一個實施方案中，該寡核苷酸包括多于50%的RNA單體。高程度的RNA單體將^^于與RNA-相互作用蛋白相互作用，例如通過作為對細(xì)胞酶諸如RISC的底物或指導(dǎo)(或輔因子)起作用。因此在另一個實施方案中，多于80。/。的寡核苷酸單體是RNA單體是優(yōu)選的。在又另一個實施方案中，多于900/。的寡核苷酸單體是RNA單體是優(yōu)選的。如將明顯的，該寡核苷酸還可包括核苦酸單體類似物。在一個這種實施方案中，無環(huán)的核苷酸單體和RNA單體構(gòu)成多于所有核苷酸單體中的80%。在另一個實施方案中，無環(huán)的單體和RNA單體構(gòu)成多于所有核普酸單體中的卯％。當(dāng)該寡核苦酸包括核苷酸單體類似物時，該核普酸單體類似物選自2'-0-烷基-RNA單體、2'-氨基-DNA單體、2'-氟-DNA單體、LNA單體、PNA單體、HNA單體、ANA單體、FANA單體、CeNA單體、ENA單體、DNA單體和INA單體組成的組是優(yōu)選的。核苷酸類似物通常用于調(diào)節(jié)結(jié)合親和力、增加生物穩(wěn)定性且通常給予寡核苦酸更多的藥物樣性質(zhì)。在一個實施方案中，該寡核苷酸包括至少2個LNA核香酸類似物。無環(huán)的核苷酸單體通常減少本發(fā)明的寡核苷酸與互補(bǔ)核酸堿基配對的解鏈溫度(即結(jié)合親和力)，并且LNA核苷酸單體可用于抵消解鏈溫度的這種減少。即在一個實施方案中，無環(huán)的核苷酸單體的數(shù)目與LNA核苷酸單體的數(shù)目相同。在優(yōu)選實施方案中，該寡核苷酸僅包括無環(huán)的單體和RNA單體。在另一優(yōu)選實施方案中，該寡核苷酸僅包括無環(huán)的核苷酸單體、RNA單體和LNA核香酸類似物。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸包括選自硫代磷酸酯鍵合(phosophorothioatelinkage)、硼代磷酸酯鍵合(或稱為硼代磷酸酯鍵，boranophosphatelinkage)、乙基膦臥炎酉旨4建合(ethylphosphonatelinkage)、氨基石粦酉臾酉旨4建合(phosphoramidatelinkage)和石岸酉吏三西旨4定合(phosphortriesterlinkage)組成的組的一種或多種鍵合。最優(yōu)選的是硫代磷酸酯鍵合和/或硼代磷酸酯鍵合。這些鍵合改善寡核苷酸的生物穩(wěn)定性并且還已顯示對寡核苷酸的生物分布有積極影響。在優(yōu)選實施方案中，該寡核苦酸包括多于50%的前述核苷酸間一睫合，甚至更優(yōu)選地多于75%。在一個實施方案中，所有核苷酸間鍵合是前述類型。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的寡核芬酸不與互補(bǔ)寡核苷酸堿基配對，即本發(fā)明的寡核苷酸是單鏈。在又另一個實施方案中，該寡核苷酸能夠介導(dǎo)與該寡核苷酸互補(bǔ)的靶mRNA的RISC依賴性翻譯阻遏或降解。技術(shù)人員將認(rèn)識到RISC作為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物并理解在該實施方案中，該寡核香酸將作為RISC的引導(dǎo)序列起作用并從而將RISC引導(dǎo)向RNA寡核苦酸，通常是對本發(fā)明的寡核苷酸具有部分或完全互補(bǔ)性的mRNA。當(dāng)寡核普酸將RISC引導(dǎo)向部分互補(bǔ)性的mRNA靶時，該寡核普酸可一皮一見為微RNA才莫擬物，且當(dāng)寡核普酸將RISC引導(dǎo)向完全互補(bǔ)性的mRNA靶時；其可被視為單鏈或雙鏈si認(rèn)A?？赏ㄟ^卩吏用針對編碼RISC組件的mRNA的siRNA敲除RISC的組件并評價寡核苷酸在敲除細(xì)胞系中的活性，來在細(xì)胞系中評價RISC依賴性。這種試驗是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。第十方面，包含本發(fā)明寡核苷酸的RNA雙鏈體本發(fā)明的第十方面是包含根據(jù)本發(fā)明的第一寡核苷酸和第二寡核芬酸的RNA雙鏈體。在優(yōu)選實施方案中，RNA雙鏈體的第二寡核苷酸也是本發(fā)明的寡核普酸。如將清楚的，在第一方面關(guān)于本發(fā)明的RNA復(fù)合物描述的許多特征也適用于第十方面的RNA雙鏈體。優(yōu)選地，本發(fā)明的RNA雙鏈體包括/人15到40個數(shù)目的石咸基對，且在優(yōu)選實施方案中，包括選自下組數(shù)目的石咸基對18個堿基對、19個石威基對、20個堿基對、21個》成基對、22個;成基對和23個;威基對。在又另一個實施方案中，該RNA雙鏈體包括從25到30個數(shù)目的堿基對，更優(yōu)選地從26到28個且最優(yōu)選地27個堿基對。這種RNA雙鏈體可被稱為切丁酶底物RNA。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的RNA雙鏈體包括懸端。在另一個實施方案中，RNA雙《連體包括兩個懸端。在又另一個實施方案中，第一寡核苷酸包括3'-懸端。在又另一個實施方案中，第二寡核苷酸包括3'-懸端。優(yōu)選地，懸端的長度從1到8個核苷酸且甚至更優(yōu)選地，懸端的長度選自具有1個核苦酸、2個核苷酸和3個核苷酸的長度的懸端組成的組。在另一個實施方案中，RNA雙《連體包括至少一個平端。在另一個實施方案中，RNA雙鏈體兩個末端都是平端的。在優(yōu)選實施方案中，該RNA雙鏈體包括18-22個石成基對的雙鏈區(qū)，其中第一寡核苦酸和第二寡核苷酸各包括1-3個核苷酸的3'-懸端。這種RNA雙鏈體將被認(rèn)可為規(guī)范的siRNA(短干擾RNA)。在一個實施方案中，RNA雙鏈體的一條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的，如第一方面詳述的。在一個實施方案中，RNA雙鏈體能夠介導(dǎo)與RNA雙鏈體的第一或第二寡核苷酸互補(bǔ)的靶mRNA的翻譯阻遏或降解。即RNA雙鏈體將作為例如siRNA、微RNA或前-微RNA起作用。在一個實施方案中，RNA雙鏈體與具有RNA單體而不是無環(huán)的單體的相同RNA雙鏈體相比，能夠介導(dǎo)靶mRNA的翻譯阻遏或降解，同時誘導(dǎo)減少的脫靶效應(yīng)。減少的脫耙可因為減少的結(jié)合親和力而實現(xiàn)，還可因為第一或第二寡核苷酸可被修飾諸如以使不能夠作為RISC的引導(dǎo)鏈起作用而實現(xiàn)。即可以控制RNA雙鏈體的哪條寡核苷酸作為信使鏈(有義鏈)起作用，哪條將作為《I導(dǎo)鏈(反義鏈)起作用。在另一個實施方案中，RNA雙鏈體能夠介導(dǎo)靶mRNA的翻譯阻遏或降解，同時誘導(dǎo)減少的脫耙效應(yīng)，當(dāng)特別地?zé)o環(huán)的單體位于siRNA雙鏈體引導(dǎo)(反義)鏈的位置5-10時，其中位置從寡核苷酸5'末端計數(shù)。在另一個實施方案中，RNA雙鏈體能夠介導(dǎo)靶mRNA的翻譯阻遏或降解，同時誘導(dǎo)減少的脫靶效應(yīng)，當(dāng)特別地?zé)o環(huán)的單體位于siRNA雙鏈體的引導(dǎo)(反義)鏈的位置6-8時。不意為理論所限制，相信在這些位置無環(huán)的單體的存在誘導(dǎo)減少的結(jié)合親和力，所述無環(huán)的單體導(dǎo)致引導(dǎo)鏈誘導(dǎo)微RNA-型效應(yīng)的能力減少。即無環(huán)的單體在正確的位置時減少所謂的種子區(qū)結(jié)合，假定這種結(jié)合對于微RNA活性比siRNA活性更重要。在一個實施方案中，RNA雙鏈體能夠介導(dǎo)RNA靶向，例如基因沉默或RNA干擾，與具有RNA單體而不是無環(huán)的單體的相同RNA雙鏈體相比有增加的效力。增加的效力可因為RISC反應(yīng)裂解產(chǎn)物的脫除率(off-rate)增加而實現(xiàn)。脫除率可因為結(jié)合親和力減少而增加。增加的底物柔性還可增加水解率。而且增加的柔性可便于RNA雙鏈體在將引導(dǎo)鏈裝進(jìn)RISC之前解旋。在一個實施方案中，RNA雙鏈體能夠介導(dǎo)靶mRNA的翻譯阻遏或降解，與具有RNA單體而不是無環(huán)的單體的相同RNA雙鏈體相比有延長的效力。延長的效力可例如因為RNA雙鏈體的寡核苷酸和雙鏈體本身是外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶的較差的底物并從而增加寡核苷酸和雙鏈體的穩(wěn)定性而實現(xiàn)。在一個實施方案中，RNA雙鏈體能夠介導(dǎo)靶mRNA的翻i,阻遏或降解，其中RNA雙鏈體與具有RNA單體而不是無環(huán)的單體的相同RNA雙鏈體相比具有改善的生物穩(wěn)定性。在又另一個實施方案中，RNA雙鏈體能夠介導(dǎo)靶mRNA的翻i奪阻遏或降解，其中RNA雙鏈體與具有RNA單體而不是無環(huán)的單體的相同RNA雙鏈體相比具有減少的免疫刺激。免疫刺激的一個原因是與識別外來寡核苷酸的Toll-樣受體相互作用。由于本發(fā)明的RNA雙鏈體是非天然的，它們將更難被Toll-樣受體檢測。參考文獻(xiàn)US2003/0108923US2005/0234007WO2005/073378J.Kurreck,歷oc/z纖.2003，276>,1628K.D.Nielsen等人，1995，3，1493H.Thrane等人，7^ra/zWra"1995,57,10389RNielsen等人，Met/.C/zew.1995,3,19Nawrot和Sipa,C匿7bp/csMedC/z諷2006,6,913-925F.Eckstein,OligonucleotidesandAnalogues(寡核香酸和類似物),IRLPress,OxfordUniversityPress,1991M.Petersen和J.Wengel,r腦A腸to^o/,2003,27,74-81Pfundheller,S0rensen,Lomholt,Johansen,Koch和Wengel,J."LockedNucleicAcidSynthesis(鎖核酸合成)"，MeAo^Mo/.歷o/.2004，第288巻(OligonucleotideSynthesis(寡核苦酸合成))，127-145.，P.Herdewijn編輯,Hum肌aPressInc.Furniss,Hannaford,Smith和Tatchell,Vogel，sTextbookofOrganicChemistry(Vogel有機(jī)化學(xué)教科書)，1989,JohnWiley&SonsBryld,H0jland和Wengel,CTzew.Co附m肌2004,1064Mokhir,Tetzlaff,Herzberger,Mosbacher禾口Richart，《/CbmZ.CT^w.2001:3,374MangosMM,MinKL，ViazovkinaE，GalarneauA，ElzagheidMI，Parniak35MA,DamhaMJ.，/^附C7zew5bc.2003Jan22;125(3):654-61實驗程序和實施例實施例1.本發(fā)明的RNA復(fù)合物的合成。用于自動DNA/RNA合成本發(fā)明的RNA復(fù)合物的羥曱基取代的單體的亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元的制備程序已被報道[胸腺嘧咬衍生物；K.D.Nielsen等人，5zoorg,MedOzem.1995，3,1493;H.Thrane等人，7^ra/z^raw1995，57,10389;P.Nielsen等人，MW.C/zem.1995,3,19]。請參見實施例ll公開的腺噪呤、鳥噤呤、胞嘧啶和尿嘧啶的示例亞磷酰胺衍生物的制備程序。將這些羥曱基取代的單體并入本發(fā)明的RNA復(fù)合物遵循用于a)在自動RNA合成儀上的RNA合成、b)RNA檢查、c)RNA純化和d)RNA分離的才示準(zhǔn)方法[REckstein,OligonucleotidesandAnalogues(寡才亥芬酸禾口類似、物)，IRLPress,OxfordUniversityPress,1991]。這證實使用已知的亞磷酰胺衍生物、使用RNA合成標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可合成羥甲基取代的RNA寡核苷酸(=RNA鏈)和RNA復(fù)合物。LNA是含有一個或多個2'-(9，4'-C-亞曱基-連接的核糖核苷酸(LNA核苷酸)的寡核香酸[M.Petersen和J.Wengel，7>ew&5/o&c/z"o/.2003，2/，74-81]。LNA-修飾的siRNA是含有一個或多個LNA單體的siRNA構(gòu)建體。通過使用可購買獲得的LNA亞磷酰胺，已知方法已被用于將LNA核苷酸并入本發(fā)明的RNA復(fù)合物[Pflmdheller，S0rensen,Lomholt,Johansen,Koch和Wengel,J."LockedNucleicAcidSynthesis(鎖核酸合成)"，MeAo(isMo/,傷o/.2004,第288巻(OligonucleotideSynthesis(寡核苷酸合成))，127-145"P.Herdewijn編輯，HumanaPressInc.]。羥曱基取代的siRNA("羥曱基取代的小干擾RNA)是含有一個或多個羥曱基取代的核苷酸單體的siRNA構(gòu)建體(參見圖1的羥曱基取代的核苷酸單體的結(jié)構(gòu))。示例單體如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage37</formula>-o-p=o單體C(￡,I)單體D(^)寡核苷酸-siRNA構(gòu)建體中選擇的反義鏈天然RNA5'畫ACUUGUGGCCGUUUACGUCGCUJW11035,-ACUUGUGGCCGUUUACGUCGLCMeLUJW11865,畫ACUUGIGGCCGUUUACGUCGLCMeLUJW11875，-ACIUGIGGCCGUU^ACG工CGLCMeLUW1235，-ACUUG$GGCCGUUUACGUCGLCMeLUW1245，-AC$UGUGGCCGUUUACGUCGLCMeLUW1255,-ACUUGUGGCCGUUUACG^CGLCMeLUW1265，-ACUUGUGGCCG亙UUACGUCGLCMeLUWl275,-ACUUGUGGCCGUUUACGTCG^UW1285，-ACXUGUGGCCGUUUACGTCG^U寡核苷酸-siRNA構(gòu)建體中選擇的有義鏈天然RNA5'-GACGUAAACGGCCACAAGUUCUJW11045，-GACGUAAACGGCCACAAGUTLCMeLUJW11065，-GACMeLGUAAACMeLGGCCACMeLAAGUTLCMeLUJW11885，-GACGUAAACGGCCACAAGJJCW0435，-GACGUAAACGGCCACAAGUTCUW0445，-GA￡GIAAA￡GGCfA￡AAGUJ￡UJW11895，-GACGIAAACGGCCACAAGUCW1295，-GACG^AAACGGCCACAAGUTLCMeLUW1305，-GACG^AAAC^GGCCACAAGUTLCMeLUWl315，-GACGUAAACGGCCACAAGUU^UW1325，-GACG^AAACGGCCACAAGUU^U已經(jīng)合成的其它羥曱基取代的RNA鏈5，-ACUUGUGGCCGUUUACGU￡G￡U5，-GA￡GIAAA￡G5，-GC￡A￡AAGUTCU-上標(biāo)中的"L"指示該殘基是LNA核苷酸。-上標(biāo)中的"MeL"指示該殘基是具有5-曱基胞嘧咬堿基的LNA核苷酸。-粗體下劃線的21是羥曱基取代的核普酸單體。該實施例中它是C4'-分支-RNA單體C的胸腺嘧啶-l-基衍生物(參見圖1)。-粗體下劃線的^是羥曱基取代的核苷酸單體。該實施例中它是C4'-分支-RNA單體C的5-曱基胞嘧啶-l-基衍生物(參見圖1)。-粗體下劃線的i是羥曱基取代的無環(huán)的核苷酸單體。以上序列中它是2'，3'-開環(huán)-RNA單體D的尿嘧啶-l-基衍生物(參見圖1)。在其它實施例和附圖中包括尿嘧咬以外的其它堿基變體。所研究的其他序列參見實施例9和10。已進(jìn)行細(xì)胞研究(表達(dá)EGFP的肺癌細(xì)胞系)。作為示例本發(fā)明的例子，使用了含有兩個或三個核苷酸懸端的siRNA雙鏈體。該示例設(shè)計僅是示意，而且許多其它構(gòu)建體包括在本發(fā)明中并類似地起作用。因此，例如包括平端的siRNA雙鏈體、比示例的雙鏈體短或長的siRNA雙鏈體、和單鏈反義鏈。類似地包括含有反義鏈和不連續(xù)信使鏈("信使鏈"還可稱為"有義《連")的RNA復(fù)合物。實施例2.本發(fā)明的siRNA復(fù)合物的退火和轉(zhuǎn)染程序。將細(xì)胞鋪板到6-孔板并生長到40-60%匯合。就在轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞重新鋪板到每孔lml完全生長培養(yǎng)基。有義和反義鏈以各20iuM濃度在退火緩沖液(IOmMTris-HCl，pH7.3，50mMNaCl)中混合并在95。C溫育1min、在37。C溫育1h。在6-孔板的每孔中準(zhǔn)備以下溶液150pl無血清的RPMI培養(yǎng)基中4piTransIT-TKO。力口入退火的si脂A復(fù)合物，小心混合，在室溫溫育20min，并倒在細(xì)胞上。最終RNA復(fù)合物濃度是50nM。在37。C溫育24h后，更換培養(yǎng)基并將細(xì)胞在37。C再溫育24h。通過胰蛋白酶處理除去細(xì)胞，并分成兩份用于隨后的RNA和流式分析。由于實現(xiàn)了基因沉默(參見下文)，證實含有羥甲基取代的單體的本發(fā)明的RNA復(fù)合物在標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染條件下可穿透細(xì)胞膜。實施例3.基因沉默mRNA和蛋白定量的程序。由流式細(xì)胞計數(shù)分析來分析eGFP蛋白的表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡法如下進(jìn)行細(xì)胞在PBS中洗滌兩次，將等量細(xì)胞在2xSDS樣品緩沖液[4。/。十二烷基硫酸鈉(SDS)、20%甘油、125mMTris/HClpH6.8，0.01mg/ml溴酚藍(lán)、10%2-巰基乙醇]在90。C裂解2x10min，之間輕柔抽吸。在8%SDS-丙烯酰胺凝膠中分離蛋白，并電印跡到PVDF膜(Immobilon)上過夜。濾液以含有10%w/v奶的PBS封閉1h。使用兔多克隆EGFP抗體(SantaCruzBiotechnology)的1:1000稀釋液檢測EGFP蛋白。小鼠hn脂PCl抗體是SeraphinPinol-Roma的贈品。辣根過氧化物酶(hrp)共輒的二抗(DAKO)與ECL試劑(AmershamBiosciences)—起用于顯像。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序以RNA印跡法分析eGFPmRNA。以下是在50mMsiRNA復(fù)合物濃度進(jìn)行的基因沉默實驗結(jié)果的列表。結(jié)果以相對于錯配的對照siRNA雙鏈體獲得的基因表達(dá)水平(設(shè)為100%)的百分比提供條目有義/反義平均GFPEGFPmRNA1RNA/RNA13%16%2JW1104/JW110313%28%393JW1188/JW11037%13%4JW1189/JW11036%15%W043/JW1103~13%6W044/JW1103~19%7JW1104/JW118622%31%8JW1104/JW118762%90%9W131/W12727%10W132/W12886%11W131/W12868%12W132/W12747%13W129/JW110336%14W130/JW110339%15JW1106/W12324%16JW1106/W12751%17JW1106/W12534%18JW1106/W12622%條目1顯示未修飾的siRNA復(fù)合物有效地沉默GFP基因。條目2顯示LNA-修飾的siRNA復(fù)合物有效地沉默GFP基因。該構(gòu)建體有兩個朝向兩條RNA鏈的3'-末端的LNA修飾。在條目3-8的示例基因沉默實驗中研究了含有結(jié)構(gòu)T/C的C4'-分支(branced)-脂A羥曱基取代的單體的siRNA復(fù)合物(圖3)。條目3顯示在從有義鏈3'-末端的位置2和3具有羥曱基取代的單體的本發(fā)明siRNA復(fù)合物對沉默GFP基因是高度功能性的。條目3的示例和條目4、5、6、13和14的示例是反義4連作為LNA-修飾的RNA鏈的示例，但未》務(wù)飾的RNA反義鏈或完全或部分修飾的RNA反義鏈也將是功能性的。獲得的結(jié)果顯示另外修飾的單體如LNA單體與本發(fā)明的羥曱基取代的單體完全相容。條目4證實在有義鏈中具有羥曱基取代的單體T/C的本發(fā)明siRNA復(fù)合物對介導(dǎo)基因沉默是高度有效的。條目5和6證實有義鏈中具有羥曱基取代的單體T/C的本發(fā)明siRNA復(fù)合物對介導(dǎo)基因沉默是高度有效的。復(fù)合物實現(xiàn)了非常有效的基因沉默。數(shù)據(jù)顯示了令人驚訝地發(fā)現(xiàn)當(dāng)與以未修飾的siRNA或LNA-修飾的siRNA實現(xiàn)的基因沉默相比時，以本發(fā)明的這些RNA復(fù)合物實現(xiàn)了大體上甚至改善的基因沉默。而且，甚至以包含在中心雙鏈體形成核心區(qū)中有若干個鞋曱基取代的單體的有義RNA鏈的RNA復(fù)合物，沉默也是有效的(條目，W(M4為實例)。條目7和8揭示，在復(fù)合物反義鏈中具有羥曱基取代的單體T/C的本發(fā)明siRNA復(fù)合物能夠介導(dǎo)基因沉默?？雌饋聿⑷敕戳x鏈的輕曱基取代的單體T/C越多，基因沉默活性就越低。條目7、8、15、16、17和18的實例中LNA-修飾的有義鏈用作示例，但未修飾的RNA有義鏈或完全或部分修飾的RNA有義鏈也將是功能性的。獲得的結(jié)果顯示另外修飾的單體如LNA單體與本發(fā)明的羥曱基取代的單體完全相容。條目9-18的示例基因沉默實驗中研究了含有圖3上所示結(jié)構(gòu)X的2'，3'-開環(huán)-RNA羥曱基取代的單體的本發(fā)明siRNA復(fù)合物。條目9證明在兩條RNA鏈的每一條中具有一個羥曱基取代的單體X(朝向兩條鏈的3'-末端)的本發(fā)明siRNA復(fù)合物介導(dǎo)非常有效的基因沉默到與未修飾的siRNA相當(dāng)?shù)乃??？紤]到羥曱基取代的單體X的核糖單位的非環(huán)狀性質(zhì)，這是令人驚訝的。如果RNA復(fù)合物兩條鏈的每一條中具有另外的X單體，基因沉默效力是無效的(條目10)。條目ll與條目10—起揭示靠近反義鏈5'-末端并入羥曱基取代的單體X減少siRNA復(fù)合物的基因沉默效力。條目12揭示靠近有義鏈5'-末端并入羥曱基取代的單體X減少siRNA復(fù)合物的基因沉默效力，當(dāng)另一單體X并入有義鏈3'-末端時。條目13和14證實靠近有義鏈5'-末端并入羥曱基取代的單體X減少siRNA復(fù)合物的基因沉默效力。結(jié)果指示在siRNA構(gòu)建體有義鏈的中心部分并入羥甲基取代的單體X既不提高基因沉默活性也不減少。條目15-18展示以包含LNA-修飾的RNA有義鏈和具有一個羥曱基取代的單體x的反義鏈的本發(fā)明的siRNA復(fù)合物的基因沉默實驗結(jié)果。結(jié)果顯示在反義鏈中心區(qū)含有羥曱基取代的單體X例如W126和W123的本發(fā)明的siRNA復(fù)合物介導(dǎo)非常有效的基因沉默。令人驚訝的是W127與W131—起介導(dǎo)非常有效的基因沉默，但W127與LNA-修飾的RNA有義鏈JW1106—起僅誘導(dǎo)中度基因沉默。這強(qiáng)調(diào)了觀察結(jié)果的令人驚訝的方面(條目9):在兩條RNA鏈的每一條中具有一個羥曱基取代的單體X(朝向兩條鏈的3'-末端)的本發(fā)明siRNA復(fù)合物介導(dǎo)非常有效的基因沉默到與未修飾的siRNA相當(dāng)?shù)乃?。以含有具有尿嘧啶、胸腺嘧啶?-曱基胞嘧啶以外的核堿基的羥曱基取代的單體的本發(fā)明的RNA復(fù)合物可獲得類似上述結(jié)果的結(jié)果。例如對含有具有腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤作為核堿基的羥曱基取代的單體的本發(fā)明的RNA復(fù)合物使用類似程序(protecol)可獲得相當(dāng)?shù)幕虺聊钚?。實施?.免疫刺激。因為含有羥曱基取代的單體的本發(fā)明的RNA復(fù)合物相對于相應(yīng)未修飾的RNA復(fù)合物是化學(xué)修飾的，所以它們將展示比相應(yīng)未修飾的RNA復(fù)合物更少的免疫刺激活性。實施例5.脫扭效應(yīng)。因為含有羥甲基取代的單體的本發(fā)明的RNA復(fù)合物可被調(diào)節(jié)以使反義鏈修飾的siRNA復(fù)合物失活，所以本發(fā)明使得具有較少脫靶效應(yīng)的基因沉默成為可能。關(guān)鍵是以羥曱基取代的單體修飾有義鏈以使有義鏈不能作為反義鏈起作用。這可例如通過朝向有義鏈5'-末端并入羥曱基取代的單體而實現(xiàn)。以無環(huán)的單體X，通過將單體X并入反義鏈，最優(yōu)選從反義鏈5'-末端大約位置6-8，例如在從反義鏈5'-末端的位置7中，可實現(xiàn)減少的脫靶效應(yīng)。實施例6.含有官能化和共軛的羥曱基單體的本發(fā)明RNA復(fù)合物的合成'本發(fā)明的羥曱基取代的單體的羥曱基取代基通過共軛基團(tuán)被官能化。共軛基團(tuán)在本文定義為調(diào)節(jié)、擴(kuò)大或改善本發(fā)明RNA復(fù)合物的化學(xué)、生物物理學(xué)或生物學(xué)特征的基團(tuán)。這種基團(tuán)可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞分布、器官分布、組織分布、解鏈溫度、靶親和力、生物穩(wěn)定性、雜交信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。已知方法可用于轉(zhuǎn)化羥曱基取代基為多種化學(xué)衍生物[Furniss,Hannaford,Smith和Tatchell,Vogel，sTextbookofOrganicChemistry(Vogel有機(jī)化學(xué)教科書)，1989，JohnWiley&Sons]。這可在核苷水平實現(xiàn)，即轉(zhuǎn)化甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)化為可用的衍生物后，使用標(biāo)準(zhǔn)方法合成自動RNA合成所需RNA寡核苷酸(鏈)(參見實施例1)。經(jīng)由醚鍵合共軛。本發(fā)明的羥曱基取代的單體的羥曱基取代基通過共軛基團(tuán)與羥曱基取代基的亞曱基基團(tuán)之間親核取代反應(yīng)的醚鍵合而官能化。該反應(yīng)包括羥曱基取代基的羥基基團(tuán)向良好的離去基團(tuán)的轉(zhuǎn)化，通過例如曱石黃酰化或轉(zhuǎn)化為卣化物，和隨后經(jīng)由醇或醇鹽^f汙生物的親核連接。經(jīng)由硫醚鍵合共扼。本發(fā)明的羥曱基取代的單體的羥曱基取代基通過共軛基團(tuán)與羥曱基取代基的亞曱基基團(tuán)之間親核取代反應(yīng)的硫醚鍵合而官能化。該反應(yīng)包括羥曱基取代基的羥基基團(tuán)向良好的離去基團(tuán)的轉(zhuǎn)化，通過例如曱磺酰化或轉(zhuǎn)化為囟化物，和隨后經(jīng)由烷基硫醇或硫醇鹽衍生物的親核連接。如果替代地親核試劑是SIT,以例如乙?；Ｗo(hù)產(chǎn)生可用于將巰基(SH)基團(tuán)引入本發(fā)明的RNA復(fù)合物的亞磷酰胺衍生物。作為將巰43基(mearcapto)官能度引入RNA復(fù)合物的替代方案，可使用與含有二硫化物的部分的共軛。還原含有二硫化物的RNA復(fù)合物后，獲得巰基基團(tuán)官能化的RNA復(fù)合物。衍生化為氨甲基基團(tuán)。本發(fā)明的羥曱基取代的單體的羥曱基取代基可轉(zhuǎn)變?yōu)榘睍趸鶊F(tuán)。該反應(yīng)包括羥曱基取代基的羥基基團(tuán)向良好的離去基團(tuán)的轉(zhuǎn)化，通過例如曱石黃?；蜣D(zhuǎn)化為卣化物，和隨后經(jīng)由氨或保護(hù)的胺衍生物(如例如苯鄰二曱酰亞胺)的親核連接，其中所述保護(hù)的胺衍生物隨后被脫保護(hù)(例如在RNA合成后)以產(chǎn)生期望的氨基衍生物。三氟乙酰基或Fmoc保護(hù)基團(tuán)是自動RNA合成期間氨基保護(hù)的其它選擇，在標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸脫保護(hù)后釋出自由氨基基團(tuán)。經(jīng)由酰胺鍵合共軛。本發(fā)明的羥曱基取代的單體的羥曱基取代基作為柄起作用以連接酰胺-連接的共軛基團(tuán)。這包括羥曱基取代基的羥基單元向胺單元的轉(zhuǎn)化，例如如上所述的，和使用已知方法通過例如共軛基團(tuán)經(jīng)由酰胺鍵形成而對該氨基基團(tuán)的進(jìn)一步衍生化。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，這可發(fā)生在RNA合成之前或RNA合成之后[Bryld,H0jland和Wengel:CTz纖.C蘭臓".2004,1064;Mokhir,Tetzlaff,Herzberger，Mosbacher和Richart，■/Com6.C/zem.2001,3，374]。經(jīng)由氨基鍵合共軛。本發(fā)明的羥曱基取代的單體的羥曱基取代基還作為柄起作用以連接氨基-連接的共軛基團(tuán)。這包括羥曱基取代基的羥基單元向胺單元的轉(zhuǎn)化，例如如上所述的，和通過是已知反應(yīng)的還原性氨化反應(yīng)由含有例如醛官能度的共軛基團(tuán)對該氨基基團(tuán)的進(jìn)一步衍生化[Fumiss，Hannaford,Smith和Tatchell,Vogel，sTextbookofOrganicChemistry(Vogel有機(jī)化學(xué)教科書)，1989，JohnWiley&Sons]。這可發(fā)生在RNA合成之前或RNA合成之后。經(jīng)由哌。秦基基團(tuán)或線性二氨基烷基基團(tuán)共軛。通過進(jìn)行如所述的反應(yīng)，哌嗪基基團(tuán)或線性二氨基烷基基團(tuán)也用于衍生化[Bryld,H0Jland和Wengel，C7ze肌Comm柳.2004,1064-5]。這些基團(tuán)將是有用的，由于其它共軛基團(tuán)可在RNA寡核苷酸合成之前或之后，通過例如酰胺4建形成或通過還原性氨化反應(yīng)連接在例如哌嗪基基團(tuán)的遠(yuǎn)端氮原子(參見圖2,單體》[Bryld，H0Jland和Wengel,C7zem.Cbmwww.2004,1064;Mokhir,丁etzlaff,Herzberger,Mosbacher禾口Richart，《/CcwZ).C7zem.2001，3，374]。以這種方式，例如膽固醇基或脂肪酸單元可經(jīng)由哌溱基-甲基取代基連接到本發(fā)明的RNA復(fù)合物。使用這些程序，可制備含有例如膽固醇基單元、烷基單元、脂肪酸單元、聚胺衍生物、硫代衍生物、氨基酸、多肽、單糖類衍生物、多糖類衍生物或熒光團(tuán)的本發(fā)明的RNA復(fù)合物，它們都經(jīng)由羥曱基取代基的亞曱基基團(tuán)連接于本發(fā)明的RNA復(fù)合物。此處列出的基團(tuán)僅是使用上述示例的程序可連接的基團(tuán)的實例。參見圖2的共軛的單體的結(jié)構(gòu)實例。實施例7.經(jīng)由含有官能化和共軛的羥曱基單體的本發(fā)明的RNA復(fù)合物的基因沉默。以含有官能化和共軛的羥曱基單體的本發(fā)明的RNA復(fù)合物，基因沉默是有效的(參見例如圖2或?qū)嵤├?)。當(dāng)這些官能化和共軛的羥曱基單體位于或靠近siRNA復(fù)合物兩條鏈的3'-末端時，實現(xiàn)有效的基因沉默。此外，當(dāng)這些官能化和共軛的羥曱基單體位于或靠近siRNA復(fù)合物有義鏈的3'-末端和5'-末端時，實現(xiàn)有效的基因沉默。尤其是當(dāng)這些官能化和共軛的鞋曱基單體位于或靠近siRNA復(fù)合物有義鏈的3'-末端時，實現(xiàn)有效的基因沉默。此外，當(dāng)這些官能化和共軛的羥曱基單體位于單鏈反義RNA寡核苷酸中時，實現(xiàn)有效的基因沉默。當(dāng)本發(fā)明RNA復(fù)合物的基團(tuán)(圖2中的R)是膽固醇基衍生物時，實現(xiàn)藥代動力學(xué)特征的調(diào)節(jié)和有效的基因沉默。這導(dǎo)致例如改善的組織分布和細(xì)胞攝取，還有增加的生物穩(wěn)定性。當(dāng)本發(fā)明RNA復(fù)合物的基團(tuán)(圖2中的R)是硫代衍生物時，實現(xiàn)藥代動力學(xué)特征的調(diào)節(jié)和有效的基因沉默。這導(dǎo)致人體中的循環(huán)時間增加，即減少的經(jīng)腎的清除。45當(dāng)本發(fā)明RNA復(fù)合物的基團(tuán)(圖2中的R)含有氨基基團(tuán)時，實現(xiàn)藥代動力學(xué)特征的調(diào)節(jié)和有效的基因沉默。這導(dǎo)致改善的組織分布。實施例8.羥曱基取代的RNA復(fù)合物的生物穩(wěn)定性。穩(wěn)定性測定的實驗程序。將羥曱基取代的RNA復(fù)合物在37。C溫育在D-MEM(Gibco)中稀釋的10。/。胎牛血清(Gibco)。在所示時間點收集5pl樣品并立即在干冰上冷凍于15|il1.33xTBE/10。/o甘油上樣緩沖液，進(jìn)行15%凝膠上的非變性的PAGE。以SYBR金(Invitrogen)使得RNA可見。這項實驗顯示在生物介質(zhì)中羥曱基取代的RNA復(fù)合物的穩(wěn)定性相對于天然(或"未修飾的，，)對照RNA復(fù)合物展示改善的穩(wěn)定性。因此在10%血清中，羥曱基取代的siRNA比普通siRNA顯著更穩(wěn)定。因此可預(yù)想，經(jīng)過多于一小時的溫育時期只觀察到羥曱基取代的siRNA大小的很小的下降。我們推斷，含有羥曱基取代的單體的本發(fā)明的RNA復(fù)合物在細(xì)胞、動物和人類中非常穩(wěn)定，這一特性有助于其非常有效的基因沉默特征。由于該顯著的生物穩(wěn)定性，含有羥曱基取代的單體的本發(fā)明的RNA復(fù)合物比其未修飾的相應(yīng)物展示更長時間的基因沉默。實施例9.證明結(jié)構(gòu)D的單體對基因沉默的強(qiáng)效力的一系列基因沉默實驗。使用現(xiàn)有實驗中描述的程序，使用此前描述序列以及另外的序列的siRNA雙鏈體進(jìn)行基因沉默研究(本實施例研究中包括的序列參見圖4-9)。這些實驗包括含有并入的一個或多個單體X的序列(參見實施例1對單體X的描述)。單體X在本文僅作為示例結(jié)構(gòu)使用，并且對衍生物如例如單體E、單體F、單體G、單體I和單體J(參見圖1和圖2)預(yù)測類似結(jié)果。帶有上標(biāo)L的粗體和下劃線單體是LNA單體。在該實施例包括圖4-9中，CL=CMeL=5-曱基胞嘧咬-1-基LNA單體。結(jié)果繪于圖4的實驗都包括具有并入的兩個單體X的有義鏈(W130)。其顯示了-設(shè)計包括含有羥曱基取代的和LNA單體的鏈并展示基因沉默功能性的siRNA雙鏈體是可能的；-設(shè)計包括有義鏈中具有錯配的單體x的鏈并展示基因沉默功能性的siRNA雙鏈體是可能的；-全RNA反義鏈(除了朝向3'-末端的兩個LNA單體)是良好耐受的；-反義鏈中單個X單體是良好耐受的(W123、W125或W126);-以W186和W187作為反義鏈比以W123、W125或W126作為反義鏈，觀察到若干個X單體是耐受的但較不有效的基因沉默；-以W188觀察到顯著的基因沉默活性，盡管該反義鏈含有六個LNA單體，這顯示單體X位于反義鏈中間相對于單體X被相應(yīng)RNA單體取代的情況能夠改善基因沉默。結(jié)果繪于圖5的實驗都包括具有位于朝向鏈3'-末端的一個單體X的有義鏈(W131)。其顯示了-全RNA反義鏈(除了朝向3'-末端的兩個LNA單體)是良好耐受的；-反義鏈中單個X單體可為良好耐受的(W123);-單個X單體可能導(dǎo)致相對于未修飾的對照(siRNA-EGFP)同樣好的或甚至改善的基因沉默(W125或W126);-若干個X單體是相當(dāng)良好耐受的(W186、W187或W281作為反義鏈)；-以W188觀察到顯著的基因沉默活性，盡管該反義鏈含有六個LNA的情況能夠改善基因沉默；-在沒有LNA單體共存在的情況中，反義鏈中單體X的若干個取代觀察到顯著的基因沉默(W281)。結(jié)果繪于圖6的實驗都包括具有沿著有義鏈散布的三個X單體的有義鏈(W282)。其顯示了-全RNA反義鏈(除了朝向3'-末端的兩個LNA單體)是良好耐受的；-反義鏈中單個X單體可是良好耐受的，最明顯的是朝向3'-末端的，相對于未修飾的對照(siRNA-EGFP)觀察到同樣好的或甚至改善的基因沉默(W123、W125、W126);-若干個X單體是相當(dāng)良好耐受的(W186、W187或W281作為反義鏈)；-以W188觀察到顯著的基因沉默活性，盡管該反義鏈含有六個LNA單體，這顯示單體X位于反義鏈中間，以及當(dāng)有義鏈含有若干個X單體時，相對于單體X被相應(yīng)RNA單體取代的情況能夠改善基因沉默；-在沒有LNA單體共存在的情況中，反義鏈中單體X的若干個取代也觀察到基因沉默(W281)。結(jié)果繪于圖7的實驗都包括無單體X的有義鏈(W194)。其顯示了-反義鏈中單個X單體可為良好耐受的(W123);-單個X單體可能導(dǎo)致相對于未〗務(wù)飾的對照(siRNA-EGFP)同樣好的或甚至改善的基因沉默(W125或W126);-若干個X單體是相當(dāng)良好耐受的(W186、W187或W281作為反義鏈)；-以W188觀察到顯著的基因沉默活性，盡管該反義鏈含有六個LNA單體，這顯示單體X位于反義鏈中間相對于單體X被相應(yīng)RNA單體取代的情況能夠改善基因沉默；-在沒有LNA單體共存在的情況中，反義鏈中單體X的若干個取代也觀察到顯著的基因沉默(W281)。結(jié)果繪于圖8的實驗都包括無單體X的有義鏈(W181)但具有并入雙鏈體形成區(qū)段的四個LNA單體(加3'-末端中的兩個LNA單體)。其顯示了-反義鏈中單個X單體為良好耐受的(W123、W125或W126);-若干個X單體是相當(dāng)良好耐受的(W186、W187或W281作為反義鏈)；-以W188觀察到顯著的基因沉默活性，盡管該反義鏈含有六個LNA48單體，這顯示單體X位于反義鏈中間相對于單體X被相應(yīng)RNA單體取代的情況能夠改善基因沉默；-在沒有LNA單體共存在的情況中，反義鏈中單體X的若干個取代也觀察到顯著的基因沉默(W281)。結(jié)果繪于圖9的實驗都包括具有位于朝向鏈5'-末端的一個單體X的有義鏈(W129)。其顯示了畫全認(rèn)A反義鏈(除了朝向3'-末端的兩個LNA單體)是良好耐受的；-反義鏈中單個X單體可為良好耐受的，并可能導(dǎo)致相對于未修飾的對照(siRNA-EGFP)改善的基因沉默(W123、W125或W126);-若干個X單體是相當(dāng)良好耐受的(W186、W187或W281作為反義鏈)；畫以W188觀察到顯著的基因沉默活性，盡管該反義鏈含有六個LNA單體，這顯示單體X位于反義鏈中間相對于單體X被相應(yīng)RNA單體取代的情況能夠改善基因沉默；-在沒有LNA單體共存在的情況中，反義鏈中單體X的若干個取代觀察到顯著的基因沉默(W281)。以下顯示的數(shù)據(jù)指示，羥曱基取代的單體與sisiRNA方法相容。作為實例，W123反義鏈+(W004+W005)有義鏈的三分子組合的使用導(dǎo)致有效的基因沉默(即，"siRNA效應(yīng)"具有低值，在siRNA效應(yīng)是0.24的情形)，這顯示單體x可位于sisiRNA復(fù)合物的反義鏈中(與對照相比；讀為1.0)。還顯示未修飾的siRNA的數(shù)據(jù)。反義鏈的設(shè)計是重要的，因為W186反義鏈+(W004+W005)有義鏈的組合不能誘導(dǎo)基因沉默效應(yīng)。這顯示，羥曱基取代的單體(例如單體D)的數(shù)目應(yīng)當(dāng)?shù)停钣欣叵抻谝粋€單體(除了反義鏈懸端中任選的羥曱基取代的單體之外)。圖9所示研究中包括的其它RNA復(fù)合物關(guān)于基因沉默是等效的。反義鏈siRNA效應(yīng)W1230.24W1250.26W1260.23W1861.12SiRNA0.11對照1.0實施例10.種子修飾減少脫靶效應(yīng)。^f吏用反義鏈W124和W207(5'-GACGUAAACGGCCACAAGUTLCMeL)(SEQIDNO:)作為50nM濃度的siRNA雙鏈體中的有義鏈，我應(yīng)，這將導(dǎo)致較少脫靶效應(yīng)。因此實驗設(shè)定允許區(qū)別siRNA效應(yīng)(以鏈裂解沉默基因)和miRNA效應(yīng)(翻譯阻遏；基于質(zhì)粒的具有四個包括僅種子區(qū)匹配的耙區(qū)的脫輩巴感受子(sensor))。使用上述組合，siRNA效應(yīng)如同未修飾的siRNA對照，而miRNA效應(yīng)顯著減少。對siDharma(具有從反義鏈5'-末端第2號位置并入的2'-OMe-RNA單體的商品)獲得類似效應(yīng)。如上所述，這顯示存在于反義鏈的所謂種子區(qū)的羥曱基取代的單體(例如單體D)導(dǎo)致有利的效應(yīng)(即，減少的脫耙效應(yīng)或脫耙效應(yīng)的消除)。因此，減少或消除RNA復(fù)合物脫靶效應(yīng)的方法，該方法包括將一個或多個羥曱基取代的單體(例如單體D)并入RNA復(fù)合物或制備含有一個或多個羥曱基取代的單體(例如單體D)的RNA復(fù)合物。參見下表基因沉默(即，"siRNA效應(yīng)")和脫耙效應(yīng)(即，"miRNA效應(yīng))的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)指示，含有一個或多個幾曱基取代的單體(例如，單體D)的RNA復(fù)合物減少靶的表達(dá)同時使脫靶效應(yīng)最小。反義鏈siRNA效應(yīng)miRNA效應(yīng)W1240.120.38W1250.040.19Si脂A0.060.15siDharma0.080.37對照1.01.0對于進(jìn)一步的種子步移研究，我們已經(jīng)制備了包括RNA單體(rA、rC、rG和rU)和羥曱基修飾的單體(單體D;對腺嘌呤-9-基、胞嘧啶-l-基、鳥嘌呤—9-基和尿嘧啶-l-基衍生物分別標(biāo)為sA、sC、sG和sU)的如下序列。單體X代表具有核堿基的單體D:以下顯示的前九個寡核苷酸的編號如下^人上端的第1號-第9號)W313;W314;W315;W316;W317;W123;W318;W319和W320rCrUrUrGrUrGrGrCrCrGrUrUrUrArC<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>通過使用此前實施例中描述的類似實驗技術(shù)，以寡聚體W313;W314;W315;W316;W317;W123;W318;W319和W320作為基因沉默實-瞼中的反義鏈和寡聚體JW1104作為有義鏈顯示，含有羥曱基取代的單體D的siRNA構(gòu)建體的效力相對于未修飾的siRNA或在從反義鏈5'-末端第2號位置中具有2'-O-Me-RNA單體的市售化學(xué)修飾的siRNA產(chǎn)品(Dharma)可被改善。進(jìn)一步，含有2',3'-開環(huán)-RNA單體D的siRNA復(fù)合物顯示該單體可并入siRNA構(gòu)建體以使脫靶效應(yīng)(miRNA效應(yīng))相對于參照未修飾的siRNA(SiRNA)減少。1nM、10nM和100nMRNA復(fù)合物的結(jié)果描述于以下表4各形式(對照；數(shù)據(jù)調(diào)整到1.0)。在所示的不同siRNA雙鏈體的各種濃度，研究經(jīng)siRNA和miRNA(微RNA)效應(yīng)的基因沉默。對類似以上顯示的專門地含有RNA和無環(huán)的2'，3'-開環(huán)-RNA單體的九條鏈的鏈，預(yù)計類似結(jié)果。輕甲基修飾的單體D作為反義鏈修飾減少脫靶效應(yīng)并增加基因沉默的效力。SiRNA效應(yīng)miRNA效應(yīng)該設(shè)計是重要的，并且上述系列寡聚體中對siRNA效應(yīng)最有效的是W318,其在從反義鏈5'-末端第7號位置處具有羥曱基取代的單體D。相對于未修飾的siRNA或商業(yè)產(chǎn)品(Dharma)，W318還導(dǎo)致有利地低的脫耙(miRNA)效應(yīng)。一般而言，具有并入的羥曱基取代的單體D的以上列出的反義鏈的使用導(dǎo)致有利地低的脫靶(miRNA)效應(yīng)。重要和令人驚訝地，使用具有含有羥曱基取代的單體D的反義鏈的構(gòu)建體可同時實現(xiàn)高效力和低脫靶效應(yīng)(參見上表)。尤其是W318的設(shè)計是有利的，其顯示羥曱基取代的單體D可有利地并入反義鏈所謂種子區(qū)邊界(boarder)附近，最有利地/人反義鏈5'-末端第5-10號位置附近，如例如從反義鏈5'-末端第7號位置。另外，一個或多個羥曱基取代的單體D的并入可在兩條鏈中實現(xiàn)。此外可注意到，效應(yīng)可被逆轉(zhuǎn)，如果單體X位于反義鏈位置9-16附近，其中該位置從5'末端計數(shù)。如果例如反義鏈中單體X存在于從反義鏈5'-末端的第9號位置中，那么反義鏈和雙鏈體作為微RNA起作用(siRNA效應(yīng)將最小，而微RNA效應(yīng)更高)。該效應(yīng)可能來自于因存在無環(huán)的羥曱1nm10nm湖nmW3130.450.760.81W3140.580.960,88W3150.480.820.85W3160.460.750.78W3170.260.320.92W3180.170.180.45W3190.340.500.66W3200.870.960.97Dh3rm30.520.470,89SiRNA0.230.240.54對照1.01.01.010nm0.670.640.640.970.520.620.290.120.400.141.0nl222557686337242131ooooooooooo52基取代的單體X(=單體D)導(dǎo)致親和力減少而向全長結(jié)合的趨勢的減少實施例11.亞磷酰胺單體結(jié)構(gòu)單元的合成以下路線展示已經(jīng)進(jìn)行的程序以舉例說明單體amidite^亞磷酰胺)結(jié)構(gòu)單元的合成DMTO-1)NalOd,H70,二噁烷，lh,rt.2)NaBH4，H20,二噁烷，30min,rt.OHOH則DMTO1)BzCl，DCM，堿基，l-3h，-70°COHOHDMTO1)P-C1,:無水Me.CN中2(n"的[)IPEAOHOBz對亞磷酰胺的總產(chǎn)率開環(huán)11=37%開環(huán)八=44%開環(huán)0=20%開環(huán)G^14%DMTOBPr:尿香，82%N6-Bz腺苷-86%N4匿Ac胞嘧夂-71。/^N2-異丁基烏苷=68%*DMTODMTOOH，服BPf:尿芬=80%N6-Bz腺芬=73%N4-Ac月包嘧咬-640/。N2-異丁基鳥苷=63%BPri-Pr'i扁Pr104尿普=57%N6-Bz腺芬=71%N4-Ac胞嘧咬"50/)N2-異丁基鳥苷=33%*獲得開環(huán)G和開環(huán)C的開環(huán)步驟在DMT保護(hù)后不經(jīng)純化即進(jìn)行，因此所寫的產(chǎn)率是這兩步驟的總產(chǎn)率。化合物100是核糖核香起始物料。化合物102是由氧化裂解反應(yīng)隨后還原制備的二醇?；衔?03是通過化合物102的02'-羥基基團(tuán)的選擇性苯曱酰化制備的02'-苯曱?；苌铩；衔?04是通過化合物103的03'-羥基基團(tuán)的03'-磷酸化制備的amidite(二亞磷酰胺)。包括以下的詳細(xì)程序和表征數(shù)據(jù)作為示例程序。5'-O-(4,4'-二曱氧基三苯曱基)-2',3'-開環(huán)尿苷(102-U)將核香100-U(5'-6K4,4'-二甲氧基三苯曱基)尿苷；10.35g，18.94mmol)溶解在二噁烷(250mL)和水(50mL)中。將NaI04(4.47g，20.90mmol)溶解在水(50mL)中并加入到溶解的核苷。攪拌混合物1h,在此期間形成白色沉淀。加入另外的二噁烷(200mL)并攪拌懸浮液15min，然后經(jīng)玻璃濾器過濾懸浮液，并以二噁烷(100mL)洗滌濾餅。合并濾液，加入NaBHt(797mg，21.1mmol)并攪拌反應(yīng)混合物30min。以緩沖液(吡咬AcOH1:1，v/v，10mL)中和反應(yīng)混合物。蒸發(fā)混合物到大約150mL后加入CH2Cl2(100mL)，并以飽和NaHC03水溶液(2x100mL)洗滌混合物。分離有機(jī)相，以Na2S04干燥，蒸發(fā)至干燥，并由柱色譜法(石油醚中40%丙酮)純化所得的殘余物，溶劑蒸發(fā)后獲得期望的核苷102-U,為白色泡沫。產(chǎn)量8.53g(82%).Rf:0.2(CH2C12中10%MeOH).力匪R(DMSOO:511.34(brs,麗)，7.62(d,1H,J=8.05Hz，H6),7.45-7.15(m，9H,ar),6.85(d，4H,ar),5.80(t，1H,/=6.2Hz,Hl'),5.52(d,1H,7=8.05Hz，H5),5.12(t,1H，《/=5.86Hz,2'OH)，4.74(t，1H,Hz,3'OH),3.72(s，6H,OCH3),3.55-3.47(m,3H,H2VH4')，3.40(t,2H,/=5.13Hz，H3'),3.01-2.90(m,2H,H5').13C匪R(DMSO-rf6):5163.2，157.9,151.4,144.8，141.1(C5),135.4,129.5(ar),127.7,127.5(ar),126.5(ar),113.0，101.6(C6)，85.3,83.6(Cl'),79.3(C2'/C4'),63.5(C5')，61.1,60.5(C2VC4'),54.9(-OCH3).54ESI畫HiRes(mNa+):m/z:571.1743計算值571.2051.2'-(9-苯曱?；?5'-6K4,4'-二曱氧基三苯曱基)-2'，3'-開環(huán)尿苷(103-U)將核苷102-U(3.01g，5.50mmol)與無水曱苯(15mL)共蒸發(fā)。將所得的殘余物溶解在無水DCM(150mL)以及無水吡啶(Pyr.)(4.4mL)，并將混合物冷卻到-70。C。向反應(yīng)混合物緩慢加入苯曱酰氯(700^L,6mmol)，且在-70。C攪拌1h。將EtOH(5mL)加入到溶液并隨后允i午達(dá)到室溫。以飽和NaHC03水溶液(3x100mL)和鹽水(100mL)洗滌反應(yīng)混合物。以CH2Cl2(100mL)反萃取合并的水相。合并有機(jī)相并蒸發(fā)。由柱色譜法(DCM中3.5%MeOH)純化所得的殘余物，溶劑蒸發(fā)后獲得產(chǎn)物103-U為白色泡沫。產(chǎn)量3.44g(790/。).Rf:0.3(CH2C12中5%MeOH).力NMR(DMSO畫A):511.43(s,1H,NH,ex)，7.93-7.87(m,2H,ar)，7.80(d，1H，J=8.05Hz,H6),7.70-7.63(m,1H)，7.56-7.48(m,2H,ar),7.35-7.17(m,IOH，ar),6.89-6.81(m,4H,ar)，6.20(t,1H，J=5.49Hz，Hl')，5.56(d,1H,J=8.05Hz，H5),4.83(t，1H，OH-3',ex),4.58(dq,2H,H2'),3.73(s,7H,-OCH3)，3.70-3.62(m,1H,H4')，3.45(t,2H,H3'),3.11-2.96(m,2H,H5')."CNMR(DMSO-A):S164.92,162.98，157.89，151.00,144.67,140.51,135.45,135.35,133.54,129.49，129.45,129.13，129.02，128.92,128.74，128.61,127.65,127.51,126.49,113.16,113.01,102.06,85.35,80.84，79.57,71.8，71.8，63.4,60.5,54.9,54.8.ESI-HiRes(mNa+):m/z:675.1949計算值675,2313.2'-(9-苯曱?；?3'-(9-(2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦基)-5'-0-(4,4'-二曱氧基三苯曱基)-2'，3'-開環(huán)尿苷(104-U)將核苦103-U(679mg,1.04mmol)與DCE(3x6mL)共蒸發(fā)并在真空干燥12h。將殘余物溶解在20%DIPEA的MeCN(6.5mL)中，并攪拌混合物。將2-氰基乙基-W7V-二異丙基氯亞磷酰胺[P(Cl)(OCH2CH2CN)(N(iPr)2):0.66mL,3.02mmol]加入反應(yīng)混合物，并繼續(xù)攪拌40min。將反應(yīng)混合物倒入DCE(IOmL)，以飽和NaHC03水溶液(10mL)洗滌并以DCE(IOmL)反萃取水相。匯集有機(jī)相并蒸發(fā)以獲得白色泡沫。由柱色譜法(曱苯中0-20%EtOAc)純化粗產(chǎn)物以在溶劑蒸發(fā)后獲得核苷104-U，為白色固體物質(zhì)。產(chǎn)量600mg(68%).Rf:0.6(曱苯中50%EtOAc).31PNMR(MeCN):S147.8.ESI-HiRes(mNa+):m/z:875.2946計算值875.3391.6-,苯曱酰基-5'-O(4,4'-二曱氧基三苯曱基)-2',3'-開環(huán)腺苷n02-A)將6-琴苯曱?；?5'-(9-(4,4'-二曱氧基三苯曱基)腺苷(100-A;7.02g，10.42mmol)溶解在二噁烷(150mL)和水(25mL)中。將NaI04(2.73g,11.77mmol)溶解在水(25mL)中并加入溶解的核苷中。攪拌混合物1h，在此期間形成白色沉淀。加入另外的二噁烷(100mL)并攪拌懸浮液15min，然后經(jīng)玻璃濾器過濾懸浮液，以二噁烷(50mL)洗滌濾餅。合并濾液，加入NaBH4(435mg,11.5mmo1)，并攪拌反應(yīng)混合物30min。然后加入丙酮以淬滅殘留NaBH4。以緩沖液(吡啶:AcOH1:1，v/v，~10mL)中和反應(yīng)混合物。減少反應(yīng)混合物到大約100mL，加入CH2Cl2(100mL)，并以飽和NaHC03水溶液(2x100mL)洗滌混合物。分離有才幾相，以Na2S04干燥，蒸發(fā)至干燥，并且通過使用DCM和i-PrOH的柱色譜法純化所得的殘余物以在溶劑蒸發(fā)后獲得產(chǎn)物，為白色固體物質(zhì)。產(chǎn)量6.07g(86%).Rf:0.22pCM中5%i畫PrOH).NMR(DMSO畫A):S11.23(brs,1H,N6H)，8.76(s，1H,腺噤呤C8/C2),8.68(s,1H，腺嘌呤C8/C2)，8.07(d，2H,J=6.96Hz，Ar),7.69-7.50(m,3H，Ar)，7.25-6.91(m,9H,Ar)，6.79(dd,4H，Ar),6.06(t,1H，Hl'),5.29(t,1H,2'OH),4.84(t,1H，3'OH),4.19-4.02(m，2H，H2')，3.90-3.80(m,1H，H4'),3.69(s，6H,2x-OCH3),3.49(t,2H，H3'),2.93-2.74(m，2H,H5').13CNMR(DMSO-^6):55165.6，157.9,152.8，151.6(腺噤呤CH)，150.2:144.6，143.1(腺嘌呤CH),135.7,135.4,132.4(Ar)，129.4(Ar),128.5(Ar)，128.4(Ar),127.7(Ar)，127.5(Ar),126.4(Ar),125.2,113.0(Ar)，85.0,84.5(rC)，79.6(4'C),63.6(5'C),61.4(2'C),60.9(3'C)，54.9(-OCH3).6-iV-苯曱?；?2'-0-苯曱?；?5'-(9-(4，4'-二曱氧基三苯曱基)-2',3'-開環(huán)腺苷(103-A)NHBz<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula>OHOBz將核苷102-A(2.01g，2.98mmol)與無水MeCN(2x30mL)共蒸發(fā)并過夜干燥。將所得的殘余物溶解在無水DCM(150mL)以及無水DBU(900mg，5.96mmol),并且將混合物冷卻到-7(TC。向反應(yīng)混合物緩慢加入0.5M苯曱酰氯溶液(6.56mL，3.28mmol)。在-70。C攪拌反應(yīng)混合物1h，隨后允許達(dá)到室溫然后加入EtOH(5mL)。以飽和NaHC03水溶液(3x150mL)和鹽水(150mL)洗滌反應(yīng)混合物。以CH2C12(100mL)反萃取合并的水相。合并有機(jī)相并蒸發(fā)。由柱色譜法(石油醚中0-100%EtOAc)純化所得的殘余物，在溶劑蒸發(fā)后獲得產(chǎn)物核苷103-A,為白色泡沫。產(chǎn)量1.69g(73%).Rf:0.49(EtOAc).ifi[NMR(DMSO畫^):511.28(s,1H，NH)，8.82(s,1H,腺噪呤CH),8.76(s,1H,腺噤呤CH)，8.06(d,2H,Ar)，7.79(d,2H,Ar),7.55-7.40(m，6H，Ar),7.25-6.89(m,10,Ar),6.77(dd,4H,Ar),6.51(t，1H，Hl'),4.99(m,2H，H2')，4.91(t,1H，3'OH),3.89(ap.s,1H,H4'),3.72(s,6H,2x_OCH3),3.54(m，2H,H3'),2.81(m，2H，H5').13CNMR(DMSO-A):5165.0，157.9,152.4，150.5,144.6,142.9(腺。票呤CH),135.6,133.6(Ar),132.4(Ar),129.0(Ar),128.8(Ar)，128.4(Ar)，127.5(Ar)，125.2(Ar),113.0(Ar)，85.1，81.5(C1'),79.9(C4'),63.8CC2')，63.5，54.9(-OCH3).ESI-HiRes(mNa+):m/z:802.2848計算值802.2847.6-iV-苯曱?；?2'-(9-苯曱?；?3'-CK2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦基V5，-O-(4,4L二曱氧基三苯曱基V2',3'-開環(huán)腺苷(104-A)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage59</formula>將核香103-A(1.69g,2.17mmol)與無水MeCN(2x20mL)共蒸發(fā)并在真空干燥12h。將殘余物溶解在20。/。DIPEA的MeCN(40mL)中，且攪拌所得的混合物。加入2-氰基乙基-MTV-二異丙基氯亞磷酰胺[P(Cl)(OCH2CH2CN)(N(iPr)2);1.0mL]到反應(yīng)混合物，攪拌反應(yīng)混合物40min。加入另外的2-氰基乙基-7V,7V-二異丙基氯亞磷酰胺(0.2mL)并攪拌所得的混合物3小時。加入EtOH(5mL)，以飽和NaHC03水溶液(3x50mL)洗滌混合物，并以DCM(50mL)反萃取水相。匯集有才幾相并蒸發(fā)。由柱色譜法(石油醚中0-100%EtOAc)純化粗產(chǎn)物以在溶劑蒸發(fā)后獲得白色泡沫。產(chǎn)量1.52g(71%).Rf:0.75(DCM中5%MeOH).31PNMR(MeCN):5148.9.ESI-HiRes(mNa+):m/z:1002.3885計算值1002.3926.4-,乙?；?-CM4，4'-二曱氧基三苯曱基)-2',3'-開環(huán)胞苷(102-C)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage59</formula>將H乙?；?11.75g,41.18mmol)與無水吡啶(50mL)共蒸發(fā)。將所得的殘余物溶解在無水吡啶(160mL)中。將DMT-Cl(4,4，-二曱氧基三苯甲基氯；16.76g,49.42mmol)作為固體物質(zhì)加入，且在室溫攪拌所得的混合物2小時。以飽和NaHC03水溶液(3x50mL)洗滌反應(yīng)混合物，并蒸發(fā)有機(jī)相以產(chǎn)生白色泡沫，將其干燥。將該殘余物溶解在二噁烷(500mL)和水(IOOmL)中。將NaI04(10.62g,49.5mmol)溶解在水(100mL)中并加入到溶解的核苷中。攪拌混合物1h,在此期間形成白色沉淀。加入另外400mL二噁烷并繼續(xù)攪拌15min。過濾沉淀并以二噁烷(200mL)洗滌。合并濾液，加入NaBH4(1720mg，45.5mmol),并繼續(xù)攪拌30min。為了中和反應(yīng)混合物，加入緩沖液(10mL，l:l-AcOH:吡咬)直到達(dá)到pH7。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)到300mL,并以EtOAc(150mL)萃取。以飽和NaHC03水溶液(3x200mL)洗滌有機(jī)相并蒸發(fā)。由以EtOAc中的梯度MeOH的柱色譜法純化殘余物，以便在溶劑蒸發(fā)后獲得產(chǎn)物，為白色固體物質(zhì)。產(chǎn)量17.24g(71%).Rf:0.19(CHC13中5%MeOH).，HNMR(DMSO畫f4):510.94(s，1H，NH),8.08(d,1H，J=7.32Hz,胞苷CH)，7.31-7.12(m，12H,Ar/胞苷CH),6.85(d，4H,Ar),5.96(t，1H，Hl'),5.13(t，1H,2'OH)，4.74(t，1H,3'OH),3.73(s，6H，2x—OCH3)，3.63(m，3H，H2VH4'),3.43(m,2，H3'),3.00(m,2H,H5'),2.13(s,3H,-CH3).13CNMR(DMSO-^):S170.9,162.3，158.0，155.4，146.1(胞苷C5/C6),144.6，135.6，129.6(ar)，127.7(ar)，126.6(ar)，113.1(ar),95.4(胞苷C5/C6),85.5，84.7(Cl')，79.4(C2'/C4')，63.8(C5')，61.7(C2'/C4'),60.5(C3'),55.0(-OCH3),24.3(-CH3).ESI-HiRes(mNa+):m/z:612.2298計算值612.2316.4-7V-乙?；?2'-(9-苯曱?；?5'-0-〖4,4'-二曱氣基三苯曱基V2'.3'-開環(huán)胞苷師-C)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula>將核苷102-C(3.03g，5.14mmol)與無7jC曱笨(2x30mL)共蒸發(fā)并在真空干燥12h。將所得的殘余物溶解在無水DCM(150mL)以及無水DBU(1.5mL，10.3mmol)并將所得的混合物冷卻到-70°C。向反應(yīng)混合物緩慢加入苯曱酰氯(6.56mL，5.65mmol)。在-70。C攪拌反應(yīng)混合物1h，隨后允許達(dá)到室溫，然后加入EtOH(4mL)。以飽和NaHC03水溶液(2x150mL)洗滌反應(yīng)混合物。合并有機(jī)相并蒸發(fā)。由柱色譜法(CHCl3中0-5。/。MeOH)純化所得的殘余物，在溶劑蒸發(fā)后獲得產(chǎn)物核苷103-C,為白色泡沫。產(chǎn)量2.08g(64%).Rf:0.24(CHC13中5%MeOH).NMR(DMSO-^):510.97(s,1H,NH),8.25(d，1H，胞芬CH),7.91(d，2H，Ar),7.65(ap.t，1H,Ar)7.32-7.12(m,12H,Ar/胞苷CH),6.83(d，4H,Ar)，6.34(t，1H，Hl')，4.84(t，1H,3'OH),4.58(dq,2H，H2')，3.74(s,6H,2x-OCH3)，3.70-3.64(m，1H，H4'),3.48(m，2H，H3')，3.07(m，2H,H5'),2.14(s，3H,-CH3).13CNMR(DMSO-A):S171.0,165.0，162.5,157.1，145.5(胞苦C5/C6)，144.6,135.48,.133.6,129.6(Ar)，128.8(Ar),127.7(Ar),127.6(Ar)，126.6(Ar)，113.1(Ar),95.8(胞苷C5/C6),85.6,82.0(Cl'),79.6(C4'),79.263.9(C2'),63.7，60.5(C3'),54.9(-OCH3),24.3(-CH3).ESI畫HiRes(mNa+):m/z:716.2589計算值716.2759.4-AA-乙?；?2'-(9-苯甲?；?3'-(9-(2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦基)-5'-6>-(4,4'-二曱氣基三苯曱基V2',3'-開環(huán)胞苷n04-C)將核香103-C(1.49g,2.15mmol)與無水MeCN(2x20mL)共蒸發(fā)。將殘余物溶解在MeCN中的20%DIPEA(20mL)并攪拌混合物。將2-氰基乙基-W—二異丙基氯亞磷酰胺[p(Cl)(OCH2CH2CN)(N(iPr)2);0.8mL]加入到混合物，并繼續(xù)攪拌40min。加入另外2-氰基乙基-A^V-二異丙基氯亞磷酰胺(0.4mL)并繼續(xù)攪拌3h。加入EtOH(5mL)，以飽和NaHC03水溶液(3x50mL)洗滌所得的混合物，并以DCM(50mL)反萃取水相。匯集有機(jī)相并蒸發(fā)。由柱色譜法(石油醚中0-100%EtOAc)純化殘余物以在溶劑蒸發(fā)后獲得核苷104-C，為白色泡沫。產(chǎn)量940mg(44%).Rf:0.42(DCM中5%MeOH).31P薩R(MeCN):5148.8.ESI國HiRes(mNa+):m/z:916.3622計算值916.3657.5'-0"4,4'-二曱氣基三苯甲基)-2-7V-異丁?；?2',3'-開環(huán)鳥苷(102-G)將2-7V-異丁?；B苷(11.68g，17.8mmol)與無水吡啶(50mL)共蒸發(fā)。將所得的殘余物溶解在無水吡啶(100mL)中。將DMT-Cl(4，4'-二曱氧基三苯曱基氯；7.26g,21.46mmol)作為固體物質(zhì)加入，并在室溫攪拌反應(yīng)混合物lh。加入DMAP(50mg,0.40mmo1),且再攪拌所得的混合物12h。然后以飽和NaHC03水溶液(3x50mL)洗滌反應(yīng)混合物，并蒸發(fā)有機(jī)相以產(chǎn)生白色泡沫。將該殘余物溶解在二噁烷(250mL)和水(50mL)中。將NaI04(4.57g,21.3mmol)溶解在水(50mL)中并加入到溶解的核苷中。攪4半混合物1h,在此期間形成白色沉淀。加入另外200mL二噁烷并繼續(xù)攪拌15min。過濾沉淀并以二噁烷(IOOmL)洗滌。收集濾液，加入NaBH4(748mg,19.77mmol),并在室溫攪拌所得的混合物30min。為了中和，加入緩沖液(10mL，l:l-AcOH:吡啶)直到達(dá)到pH7。減少所得的混合物的體積到150mL,并使用EtOAc(150mL)進(jìn)行萃取。以飽和NaHC03水溶液(3x100mL)洗滌有機(jī)相并蒸發(fā)，由使用DCM中0-10%梯度(1:1MeOH:i-PrOH)的柱色i普法純化殘余物，以在溶劑蒸發(fā)后產(chǎn)生產(chǎn)物，為白色固體物質(zhì)。產(chǎn)量8.02g(68%).Rf:0.24(CH2C12中7%MeOH).13C薩R(DMSOO:S180.2,157.9,154.9,147.8，144.7,135.4，129.3(Ar)，127.5(Ar),127.4(Ar),126.4(Ar)，120.4,113.0(Ar)，85.2,85.1(C1'),79.9(C4')，63.5(C5')，61.7(C2'),61.1(C3')，54.9(-OCH3),34.7(季i-Pr)，18.9(i-Pr)，18.8(i-Pr).MALDI-HiRes(mNa+):m/z:680.2679計算值680.2691.2'-0-苯曱酰基-5'-(9-(4，4'-二甲氧基三苯曱基)-2-7V-異丁?；?2',3'-開環(huán)鳥苷(103-G)將核苷102-G懸浮在無水甲苯(2x30mL)中并蒸發(fā)。將所得的殘余物在真空干燥12h。將殘余物溶解在無水DCM(100mL)以及無水DBU(0.9mL，6.1mmol)中，并將所得的混合物冷卻到-70。C。緩慢加入苯曱酰氯(390pL，3.36mmol)到反應(yīng)混合物。在-70。C攪拌反應(yīng)混合物1h，隨后允許達(dá)到室溫，然后加入EtOH(4mL)。以飽和NaHC03水溶液(2x100mL)洗滌所得的混合物，合并有機(jī)相并蒸發(fā)。由柱色譜法(CHCl3中0-5。/。MeOH)純化所得的殘余物，溶劑蒸發(fā)后獲得核苷103-G，為白色泡沫。產(chǎn)量1.49g(63%).Rf:0.47(CH2C12中7%MeOH).&醒R(DMSO國^):512.10(s,1H，NH)，11.72(s，1H,NH)，8.32(s,1H:胍H8),7.85-7.79(m,2H,Ar),7.65-7.63(m,1H,Ar)，7.51-7.45(m,2H，Ar),7.26-6.97(m,11H,Ar),6.79(m，4H,Ar)，6.18(t,1H,Hl')，5.04-4.82(m，3H，H2'/3'OH)，3.82(m，1H，H4'),3.72(s,6H,2x—OCH3)，3.49(t,2H，H3'),3.03-2.74(m,3H,H57季i-Pr),1.11(ap.t，6H，2x—CH3).13C醒R(畫SO-A):S180.1,164.9，157.8，154.8，148.6，147.9，144.6,138.4,135.5，135.3,133.6,129.3(Ar),129.0(ar)，128.8(ar),128.7(ar),127.6(ar)，127.4(ar),126.3(ar),120.6,112,9(ar)，85.1，82.0(Cl，)，80.1(C4'),63.7,63.3(C5')，61.0(C3')，54.8(-OCH3),34.6(季i-Pr),18.8(-CH3)，18.6(-CH3).ESI-HiRes(mNa+):m/z:784.2943計算值784.2953.2'-(9-苯曱酰基-3'-0-(2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦基V5'-(9-(4,4'-二曱氣基三苯曱基)-2-7V-異丁?；?2',3'-開環(huán)鳥苷(104-G)將核苷103-G(1.45g，1.9mmol)與無水MeCN(2x20mL)共蒸發(fā)。將殘余物溶解在MeCN中的20%DIPEA(20mL)并攪拌所得的混合物。將2-氰基乙基-7V,7V-二異丙基氯亞磷酰胺[P(Cl)(OCH2CH2CN)(N(iPr)2);0.65mL]加入反應(yīng)混合物并繼續(xù)攪拌40min。加入EtOH(5mL)并以飽和NaHC03水溶液(3x50mL)洗滌所得的混合物，以DCM(50mL)反萃取水相。匯集64有機(jī)相并蒸發(fā)。從石油醚(從EtOAc中的溶液)沉淀殘余物以提供amidite104-G，干燥后為白色固體物質(zhì)。產(chǎn)量607mg(33%).Rf:0.3(l:3丙酮曱苯).31PNMR(MeCN):S148.6.ESI-HiRes(mNa+):m/z:984.4028計算值984.4031.實施例12.派溱基-官能化的單體結(jié)構(gòu)單元的合成該實施例描述已經(jīng)進(jìn)行的程序以舉例說明具有連接在單體C2'-位置的氨基官能度的單體amidite結(jié)構(gòu)單元的合成，即從核苷103-U開始經(jīng)化合物、105、106、107、108、109和110的C2'-哌"泰基-官能化單體結(jié)構(gòu)單元111(AmiditeJ;堿基=尿嘧咬)的合成。2'-(9-苯曱?；?3'-(9-叔丁基二曱基(methel)曱硅烷基-5'-6K4,4'-二曱氣基三苯曱基)-2',3'-開環(huán)尿苷n05)將核普103-U(328mg，0.50mmol)溶解在無水吡啶(2mL)并在室溫攪拌。將TBDMSC1(113mg，0.75mmol)加入反應(yīng)混合物，攪拌19h。然后加入水(lmL)并再繼續(xù)攪拌15min，然后以DCM(50mL)稀釋反應(yīng)混合物，并以飽和NaHC03水溶液(2x25mL)和鹽水(25mL)洗滌。將有機(jī)相在Na2S04上干燥，過濾并在減壓下蒸發(fā)至干燥。由硅膠柱色譜法純化殘余物，使用DCM中的MeOH(0-8。/。)為洗脫劑，從而獲得核苷105,為白色固體物質(zhì)。產(chǎn)量294mg(78%).)HNMR(300MHz，DMSO-^)311.46(s，1H,NH),7.95-7.79(m,3H)，7.71-7.63(m,1H),7.57-7.48(m,2H)，7.37-7.13(m，9H),6.84(d,8.8Hz,4H)，6.22(t，《/=5.7Hz,1H,Hl'),5.58(d,/=8.0Hz,1H,H5)，4.69-4.45(m，2H，H2'),3.80-3.64(m，8H,2xOme和H4'),3.54(t,>/=4.7Hz,1H,H3'),3.09-2.97(m,2H,H5'),0.73(s,9H,3xMe)，-0,07和畫0，09(2xs,6H,2xMe).13C畫R(75.5固z，DMSO-^):3165.0，163.1，158.0,151.1，144.7，140.6，135.5，135.4,133.7，129.6，129.1,129.0，128.8，127.8,127.6,126.6，113.1，102.3,85.5,81.1,79.2，63.4,63.1，62.1,55.0,25.6,17.7,2x-5.7.ESI-HRMS:m/z789.3147([M+Na]+,C43H5。N209Si.Na計算值789.3178)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>3'-6>-叔丁基二甲基(methel)曱硅烷基-5'-0-(4,4'-二曱氧基三苯曱基)-2',3'-開環(huán)尿苷n06)將NaOH(845mg,21.1mmol)與無水MeOH(200mL)混合，并將所得的混合物冷卻到0°C。將核香105(3.10g,4.05mmol)溶解在無水MeOH(40mL)中，將所得的混合物加入到上述混合物，并攪拌所得的反應(yīng)混合物2.5h。加入飽和NH4C1水溶液(10mL)并再繼續(xù)攪拌10min，然后加入水(100mL),并使用DCM(4x200mL)進(jìn)行萃取。將有機(jī)相在減壓下蒸發(fā)至干燥，然后將殘余物與無水吡啶(10mL)共蒸發(fā)。由硅膠柱色譜法純化殘余物，使用DCM中的MeOH(5-10%)為洗脫劑，從而獲得核苷106，為白色固體物質(zhì)。產(chǎn)量2.54g(95%).畫R(300MHz,DMSO-c/6):<511.35(s，1H,NH),7.66(d,/=7.6Hz，1H,H6)，7.33-7.14(m,9H),6.88-6.82(m,4H),5.82(t,/=6.0Hz，1H,Hl')，5.53(d，《/=8Hz，1H，H5),5.11(t，《/=5.8Hz,1H，2'-OH),3.73(s,6H，2xOMe),3.69-3.45(m，5H,H2',H4'和H3'),3.01-2.93(m,2H,H5'),0.76(s,9H，3xMe),-0.03和-0.05(2xs,6H，2xMe).13C畫R(75.5MHz,DMSO-d6):(5163.2,158.0，151.6，144.8,135.6,135.4,129.6，127.7,127.6,126.6，113.1,101.8，85.4,83.5,78.5,63.3，61.8,61.0，55.0,25.6，17.7,2x-5.6.ESI-HRMS:m/z685.2885([M+Na]+，C36H46N208Si'Na計算值685.2916)。3'-6>-叔丁基二曱基曱硅烷基-5'-(9-(4,4'-二曱氧基三苯曱基V2'-(9-曱烷磺?；?2',3'-開環(huán)尿苷(107)將核苷106(927mg,1.40mmol)溶解在無水吡啶(20mL)中，并在0°C攪拌所得的混合物。逐滴加入MsCl(220pL，2.83mmol)，并在室溫攪拌所得的混合物3h。加入EtOH(2mL)并再繼續(xù)攪拌10min。然后將混合物蒸發(fā)至干燥，并由硅膠柱色譜法純化殘余物，4吏用DCM中的MeOH(0-7%)為洗脫劑，從而獲得核苷107，為白色泡沫。產(chǎn)量834mg(81%).&NMR(300MHz，DMSO-^):311.49(s，1H，NH)，7.77(d，J=8.2Hz,1H,H6)，7.35-7.14(m,9H)，6.86(d,/=8.5Hz,4H),6.11(t，/=5.7Hz，1H，Hl')，5.60(d，/=8.1Hz，1H，H5),4,49(d,/=5.5Hz，2H,H2')，3.77-3.48(m，9H,2xOMe,H4'和H3')，3.22(s，3H,Me)，3,10-2.89(m，2H,H5'),0.77(s,9H,3xMe),-0.02和-0.04(2xs，6H,2xMe).13CNMR(75.5MHz,DMSO-^):c5163.1，158,0，151.7,144.7，140.5,135.5，135.3,129.6,127.8,127.6,126.6，113，1,102.4,85.5,80.6，79.1,67.8,63.1,61.8,55.0,36.8，25.6，17.7,-5.6，-5.7.ESI-HRMS:m/z763.2662([M+Na]+,CwH^NzChoSSi.Na計算值763.2692)。3'—(9-叔丁基二甲基曱硅烷基-2'-脫氧-5'-0-(4,4'-二曱氧基三苯曱基)-2'-哌嗪基—2',3'-開環(huán)尿苷(108)將核苷107(276mg,0.373mmol)溶解在無水吡啶(3mL)中，并在室溫攪拌下加入哌溱(3.21g,37.3mmol)。然后將反應(yīng)混合物加熱到15(TC并攪拌lh,隨后冷卻到室溫。以飽和NaHC03水溶液(200mL)稀釋反應(yīng)混合物，然后使用氯仿(7xl00mL)進(jìn)行萃取。有機(jī)相在Na2S04上干燥、過濾并蒸發(fā)至干燥。由硅膠柱色譜法純化殘余物，首先使用DCM中的MeOH(0-5%)，然后是DCM中半飽和曱醇氨(5%)為洗脫劑體系，從而獲得核苷108,為白色固體物質(zhì)。產(chǎn)量182mg(67%).NMR(300MHz，DMSO-^):37.64(d,/=8.1Hz，1H,H6),7.34-7.13(m,9H)，6.85(d,J=7.8Hz,4H)，5.98(t，/=6.0Hz，1H,Hl'),5.53(d,J=8.1Hz,1H,H5)，3.72(s,6H，2xOMe):3.68-3.51(m,3H,H4'和H3'),3.04-2.90(m，2H，H5')，2.77-2.54(m,6H,H2'，哌口秦基)，2.48-2.27(m，4H，哌嗪基)，0.77,(s,9H,3xMe),-0.02和-0.04(2xs,6H,2xMe).13C薩R(75.5MHz,DMSO-^):<5163.2，158.0,151,3，144.8，141.1(C6)，135,6,135.4,129.5,127.7,127.6，126.6，113.1，113.1，101.8(C5),85.4，81.3(CI'),78.3,63.1,62.1，60.1,55.0(OMe),55.0(OMe),53.8,45.3，25.7(Me),17.8，-5.5(Me),-5.6(Me).ESI陽HRMS:m/z731.3859([M+H]+,C40H54N4O7Si.H計算值731.3834)。3'-(9-叔丁基二曱基曱硅烷基-2'-脫氧-5'-(9-(4,4'-二曱氧基三苯曱基)_2'-(4-,三氟乙?；?哌嗪基-2',3'-開環(huán)尿苷(109)將核苷108(102mg,0.14mmol)溶解在無水MeOH(2mL)中，并在室溫攪拌所得的混合物。加入DMAP(10mg,0.08mmol)和三氟醋酸乙酯(22pL，0.184mmol)并繼續(xù)攪拌16h。然后將混合物在減壓下蒸發(fā)至干燥，并由硅膠柱色譜法純化殘余物，使用DCM中的MeOH(0-2%)為洗脫劑，從而獲得核苦109,為白色固體物質(zhì)。產(chǎn)量100mg(86%).NMR(300MHz,DMS0-4):<511.37(s，1H，NH)，7.66(d，J=7.8Hz，1H，H6)，7.38-7.12(m，9H)，6.93-6.80(m,4H),6.00(t，J=5.9Hz,1H，Hl，)，5.54(d，J=7.8Hz,1H，H5)，3.73(s，6H,2xOMe),3.70-3.40(m，7H,H3'，H4'和哌漆基)，3.08-2.92(m2H,H5')，2.卯-2.52(m,6H，H2'和哌嗪基),0.77(s，9H，3xMe),0.00和-0.0468(2xs，6H，2xMe)."CNMR(75.5MHz,DMSO-^):<5163.2,158.0,151.3，144.8，140.8,135.6,135.4，129,5，127.7,127.6,126.6，113.1，102.0,85.5，81.0，78.2,63.1,62.0,58.9，55.0，52.6，52.0,45.4,43.0,25.6,17.8，-5.6,-5.6.ESI-HRMS:m/z849.3452([M+Na]+，C42H53F3N408Si'Na計算值849.3477)。2'-脫氧-5'-(9-(4,4'-二曱氧基三苯曱基)-2'-(7V-三氟乙?；?哌嗪基-2',3'-開環(huán)尿香(iio)將核苦109(251mg，0.304mmol)與無水THF(2x5mL)共蒸發(fā)，然后溶解在無水THF(10mL)中。在室溫攪拌下，經(jīng)1h向該混合物逐滴加入THF中的lMTBAF(606|iL,0.606mmol),然后在室溫繼續(xù)攪拌21h。在減壓下將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干燥，然后將殘余物溶解在EtOAc(40mL)中。以飽和NaHC037jc溶液(3x10mL)和水(3x10mL)洗滌所得的混合物，將分離的有機(jī)相在Na2S04上干燥，過濾并在減壓下蒸發(fā)至干燥。由石圭月交柱色譜法純化殘余物，使用石油醚中的EtOAc(60-100%)為洗脫劑，從而獲得核香110,為白色固體物質(zhì)。產(chǎn)量111mg(51%).'HNMR(300MHz,DMSO-^4):"1.36(s，1H,NH),7.66(d,/=8.1Hz,1H,H6),7.34-7.27(m，4H),7.24-7.14(m,5H),6.92-6.82(m,4H),5.98(t,■/=6.1Hz，1H，Hl，)，5.53(d,/=7.3Hz,1H,H5)，4.80(t,/=5.3Hz,1H，3'畫OH)，3.73(s,6H,2xOMe),3.63-3.38(m,8H,H4'，H3'和哌,基),3.07-2.89(m，2H,H5，)，2.77(t，/=5.8Hz，2H,H2，),2.66-2.54(m，3H,口底漆基).13C薩R(75.5MHz,DMSO-^4):3163.2，158.0，151.2,144.8,140.9,135.6,135.5,129.6,129.6,127.8，127.6，126.6,113.1，101.9,85.4,81.3,79.2，63.5,60.7,59.1，55.0,52.7,52.1，45.4,42.9.ESI-HRMS:m/z735.2585([M+Na]+，C36H39F3N408.Na計算值735.2612)。3'-(2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦基)-2'-脫氣-5'-6>-(4,4'-二曱氧基三笨曱基V2W-三氟乙?；?哌嗪基-2',3'-開環(huán)尿苷(111)將核苷110(91mg，0.128mmol)與無7jcDCM(2x5mL)共蒸發(fā)，然后溶解在無水DCM(2.5mL)中。在室溫攪拌下向該混合物加入DIPEA(lll0.64mol)，然后逐滴加入2-氰基乙基7V;7V-二異丙基氯代亞磷醜胺(2-cyanoethyl7V'7V匿diisopropylphosphoramidochloridite)(57jiL,0.256mmol)。在室溫攪拌繼續(xù)lh,然后加入EtOH(0.5mL)隨后再攪拌10min。加入DCM(40mL)隨后以飽和NaHC03水溶液(20mL)洗滌。將分離的有機(jī)相在Na2S04上干燥，過濾并在減壓下蒸發(fā)至干燥。由硅膠柱色譜法純化殘余物，使用石油醚中的EtOAc(60-80。/。)為洗脫劑，從而獲得amidite111,為白色固體物質(zhì)。產(chǎn)量106mg(91%).31P麗R(CDC13)<5150.0和149.5.ESI-HRMS:m/z913.3841([M+H]+,C45H56F3N609P.H計算值913.3871)。實施例13.含有哌溱基-官能化單體結(jié)構(gòu)單元的寡核苷酸的合成。通過使用實施例1所述的方法，使用RNAamidite和amidite111實現(xiàn)在哌。秦基部分中具有自由末端NH的單體J的有效并入。該amidite的偶合產(chǎn)率高于95%。70權(quán)利要求1.一種寡核苷酸，其包含無環(huán)的核苷酸單體。2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸，其中所述無環(huán)的核苷酸單體是2'-3'-開環(huán)-核苷酸單體。3.根據(jù)權(quán)利要求l-2任一項所述的寡核苷酸，其中所述無環(huán)的核苷酸單體選自單體D、F、G、H、I和J組成的組，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>單體H單體lOR單體J其中R選自H、烷基、膽固醇衍生物、熒光團(tuán)、聚胺、脂肪酸、氨基酸、糖類和多肽組成的組。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的寡核苷酸，其包含15至40個核苷酸單體。5.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的寡核苷酸，其包含1至5個無環(huán)的核苷酸單體。6.根據(jù)權(quán)利要求l-5任一項所述的寡核苷酸，其包含少于4個連續(xù)的DNA單體。7.根據(jù)權(quán)利要求l-6任一項所述的寡核芬酸，其包含多于50%的RNA單體。8.根據(jù)權(quán)利要求l-7任一項所述的寡核苦酸，其還包含選自2'-0-烷基-RNA單體、2'-氨基-DNA單體、2'-氟-DNA單體、LNA單體、PNA單體、HNA單體、ANA單體、FANA單體、CeNA單體、ENA單體、DNA單體和INA單體組成的組中的核苷酸類似物。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的寡核苷酸，其包含至少兩個LNA核苷酸類似物。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的寡核苷酸，其包含硫代磷酸酯鍵或硼代磷酸酯鍵。11.根據(jù)權(quán)利要求l-10任一項所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能夠介導(dǎo)與所述寡核普酸互補(bǔ)的靶mRNA的RISC依賴性翻譯阻遏或降解。12.—種RNA雙鏈體，其包含至少一個權(quán)利要求1-11任一項所述的寡核苷酸。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的RNA雙鏈體，其包含15至40個堿基對。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的RNA雙鏈體，其包含14至26個堿基對。15.根據(jù)權(quán)利要求12-14任一項所述的RNA雙鏈體，其包含至少一個懸端。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的RNA雙鏈體，其中所述懸端的長度是1至14個核脊酸。17.根據(jù)權(quán)利要求12-15任一項所述的RNA雙鏈體，其包含至少一個3'-懸端。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的RNA雙鏈體，其中所述至少一個3'-懸端的長度是l至14個核苷酸。19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的RNA雙鏈體，其包含至少一個平端。20.根據(jù)權(quán)利要求12-19任一項所述的RNA雙鏈體，其中所述RNA雙鏈體包含如下所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸含有與耙mRNA互補(bǔ)的核苷酸序列，其中所述RNA雙鏈體減少了所述靶mRNA的表達(dá)。21.根據(jù)權(quán)利要求12-20任一項所述的RNA雙鏈體，其中所述RNA減少的脫耙效應(yīng)。22.根據(jù)權(quán)利要求12-21任一項所述的RNA雙鏈體，其中所述RNA雙鏈體與具有天然RNA單體而不是無環(huán)單體的相同RNA雙鏈體相比具有增加的或延長的效力。23.根據(jù)權(quán)利要求12-22任一項所述的RNA雙鏈體，其中所述RNA雙鏈體與具有天然RNA單體而不是無環(huán)單體的相同RNA雙鏈體相比具有改善的穩(wěn)定性。24.根據(jù)權(quán)利要求12-23任一項所述的RNA雙鏈體，其中所述RNA雙鏈體與具有天然RNA單體而不是無環(huán)單體的相同RNA雙鏈體相比具有減少的免疫刺激。全文摘要本發(fā)明涉及RNA寡核苷酸或RNA寡核苷酸的復(fù)合物，本文統(tǒng)稱為RNA復(fù)合物，其含有至少一個、但任選地多于一個羥甲基取代的核苷酸單體。羥甲基取代的核苷酸單體理解為含有羥甲基基團(tuán)(其可為未取代的、O-取代的例如以共軛基團(tuán)O-取代的、或轉(zhuǎn)變?yōu)槿芜x地取代的或共軛的氨甲基基團(tuán))的核苷酸單體。該羥甲基基團(tuán)不參與形成核苷酸間鍵合且不是天然RNA單體的羥甲基基團(tuán)(含有5’-羥基基團(tuán))。本發(fā)明的RNA復(fù)合物可用在治療應(yīng)用、診斷應(yīng)用或研究應(yīng)用。該復(fù)合物包括含有反義鏈和連續(xù)或不連續(xù)信使鏈(“有義鏈”)的能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)的短干擾RNA復(fù)合物(siRNA雙鏈體)。這些鏈中至少一條、可能這些鏈中多于一條被一個或多個本發(fā)明的羥甲基取代的核苷酸單體修飾，所述核苷酸單體可位于3′-末端、5′-末端或內(nèi)部。本發(fā)明的RNA復(fù)合物還可為以至少一個、但任選地多于一個羥甲基取代的核苷酸單體修飾的單鏈RNA寡核苷酸(“RNA鏈”)。無論何時在本專利申請中使用該術(shù)語RNA復(fù)合物，均認(rèn)為包括這種單鏈RNA鏈。本發(fā)明的復(fù)合物相對于包括完全天然RNA單體的相應(yīng)復(fù)合物展示對溶核降解增強(qiáng)的穩(wěn)定性。文檔編號C07H21/00GK101679978SQ200880016977公開日2010年3月24日申請日期2008年5月21日優(yōu)先權(quán)日2007年5月22日發(fā)明者耶斯佩·溫格爾申請人:Mdrna有限公司