專利名稱：：配體親和性改變的g蛋白偶聯(lián)型受體以及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種配體親和性改變的G蛋白偶聯(lián)型受體以及其用途，更詳細(xì)來說，本發(fā)明涉及一種通過與特定的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物而改變了配體親和性的G蛋白偶聯(lián)型受體以及其用途。
背景技術(shù)：
：生物體內(nèi)的許多反應(yīng)是由細(xì)胞外的信息傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)而引起的。關(guān)于膜受體，G蛋白偶聯(lián)型受體(GProteinCoupledReceptor,GPCR)廣為人知，該G蛋白偶聯(lián)型受體是將細(xì)胞外的信息傳遞到細(xì)胞內(nèi)的入口之一，且具有7個(gè)跨膜區(qū)。GPCR如果與配體(氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、胺類等)結(jié)合，則通過三聚體G蛋白將所述信息傳遞到細(xì)胞內(nèi)。與GPCR偶聯(lián)的G蛋白被分為Gs、Gi、Gq等，各自對應(yīng)的效應(yīng)通路(例如環(huán)磷酸腺苷(cyclicadenosinemonophosphate,cAMP)通路、環(huán)磷酸鳥苷(cyclicguanosinemonophosphate,cGMP)通路、磷脂酶C(PhospholipaseC，PLC)通路等)不同。例如，a,腎上腺素受體主要與Gq偶聯(lián)而促進(jìn)作為效應(yīng)器系統(tǒng)的磷脂酶C系統(tǒng)，使甘油二酯和肌醇三磷酸增加，使細(xì)胞內(nèi)(^2+增加；a2腎上腺素受體與Gi偶聯(lián)而抑制腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，使cAMP減少。另外，(3腎上腺素受體與Gs偶聯(lián)而促進(jìn)作為效應(yīng)器系統(tǒng)的腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，使cAMP增加。GPCR在生物體內(nèi)的局部存在區(qū)域是根據(jù)各受體而不同。例如，a,腎上腺素受體局部存在于血管平滑肌、前列腺等，對它們的收縮發(fā)揮重要作用。另外，也已知曉此cn腎上腺素受體也分布在腦等中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。P腎上腺素受體局部存在于心臟、脂肪組織等中，對心搏加快、脂肪分解發(fā)揮重要作用。已知，通過GPCR的信息傳遞系統(tǒng)控制生物體的恒常性，并且參與多種疾病的發(fā)病。因此，鑒定參與特定疾病的發(fā)病的GPCR，并開發(fā)出調(diào)節(jié)該受體的活性的藥劑(激動(dòng)劑、拮抗劑等)，對于疾病的治療非常有效。[非專利文獻(xiàn)1]Muramatsu,I.etal.Br.J.Pharmacol"99:197(1990)Muramatsu,I.etal.Pharmacol.Commun.,6:23(1995)Morishima,S.etal.J.Urol.117:377-381(2007)[非專利文獻(xiàn)4]Molenaar,P.andParsonage,W.A.TrendsPharmacol.Sci"26:368-375(2005)Samaha，A.N.etal.,J.Neurosci.27:2979-2986(2007)
發(fā)明內(nèi)容與GPCR相關(guān)的研究頗為進(jìn)步，迄今為止已鑒定出了大量的GPCR。但是，也存在雖然知曉表型但實(shí)體不明的GPCR。例如已知，a,腎上腺素受體根據(jù)其基因而被分為a1A、a1B、a,D三種亞型，on腎上腺素受體中，表現(xiàn)出與這些亞型不同表型(藥理學(xué)特性)的亞型(a化)是由相同的基因表達(dá)。具體來說，該a化亞型對具代表性的ai阻斷劑(例如哌唑嗪(pmzosin))的親和性較低，僅利用組織切片結(jié)合法就可以檢測到其活性(參照非專利文獻(xiàn)13)。另外已知，(3,腎上腺素受體中，表現(xiàn)出不同表型的亞型(卩m與(3比)也是由相同的基因表達(dá)(參照非專利文獻(xiàn)4)。這樣的亞型是僅知曉表型，但其實(shí)體不明。多巴胺受體、毒蕈堿受體或者內(nèi)皮素受體也被指出存在同樣的情況(參照非專利文獻(xiàn)5等)。本發(fā)明是鑒于所述問題研發(fā)而成，其目的在于提供一種對實(shí)體不明的G蛋白偶聯(lián)型受體的功能進(jìn)行分析的技術(shù)。本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的特征在于G蛋白偶聯(lián)型受體與以下的多肽相結(jié)合，所述多肽為(1)包含序列號l所記載的氨基酸序列的多肽；(2)包含序列號1所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(3)由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽；(4)由包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(5)由可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；或者(6)由與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70%以上的序列同一性的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽。另外，本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的制作方法的特征在于包括使G蛋白偶聯(lián)型受體與以下的多肽共存于脂質(zhì)膜上的步驟，所述多肽為(l)包含序列號1所記載的氨基酸序列的多肽；(2)包含序列號1所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(3)由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽；(4)由包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(5)由可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；或者(6)由與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70%以上的序列同一性的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽。由于具有所述構(gòu)成，本發(fā)明可以改變G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性。也就是說，本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的制作方法也可以是改變G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性的方法。本發(fā)明的脂質(zhì)膜的特征在于含有所述蛋白復(fù)合物。本發(fā)明的脂質(zhì)膜的制作方法的特征在于包括使G蛋白偶聯(lián)型受體與以下的多肽共存于脂質(zhì)膜上的步驟，所述多肽為(l)包含序列號1所記載的氨基酸序列的多肽;(2)包含序列號1所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(3)由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽；(4)由包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(5)由可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；或者(6)由與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70%以上的序列同一性的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽。并且，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的特征在于表達(dá)所述蛋白復(fù)合物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的制作方法的特征在于包括表達(dá)所述蛋白復(fù)合物的步驟，優(yōu)選的是包括將編碼G蛋白偶聯(lián)型受體的基因以及編碼所述多肽的基因?qū)氲郊?xì)胞中的步驟。由于具有所述構(gòu)成，本發(fā)明使配體親和性改變的G蛋白偶聯(lián)型受體的功能分析變得容易。為了篩選配體親和性改變的G蛋白偶聯(lián)型受體的激動(dòng)劑或者拮抗劑，本發(fā)明的篩選方法的特征在于包括[I]使G蛋白偶聯(lián)型受體與以下的多肽共存于脂質(zhì)膜上而生成蛋白復(fù)合物的步驟，以及[II]將該蛋白復(fù)合物與候選因子一起進(jìn)行培養(yǎng)的步驟；所述多肽為(1)包含序列號1所記載的氨基酸序列的多肽；(2)包含序列號l所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(3)由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽；(4)由包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(5)由可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)12格條件下雜交的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；或者(6)由與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70%以上的序列同一性的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽。本發(fā)明的篩選方法優(yōu)選的是進(jìn)一步包括測定細(xì)胞內(nèi)(^2+濃度的步驟、或者測定細(xì)胞內(nèi)肌醇磷酸的代謝的步驟。為了制作表達(dá)配體親和性改變的G蛋白偶聯(lián)型受體的轉(zhuǎn)化體，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的制作方法的特征在于包括在表達(dá)G蛋白偶聯(lián)型受體的細(xì)胞中抑制以下多肽的表達(dá)的步驟，所述多肽為(1)包含序列號l所記載的氨基酸序列的多肽；(2)包含序列號1所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(3)由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽；(4)由包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(5)由可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；或者，(6)由與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70%以上的序列同一性的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽。由于具有所述構(gòu)成，本發(fā)明可以使配體親和性改變的G蛋白偶聯(lián)型受體的功能分析變得容易，并且可以改變G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性。也就是說，本發(fā)明也可以是改變G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性的方法。在本發(fā)明的制作方法中，所述多肽優(yōu)選內(nèi)源性蛋白質(zhì)，抑制所述多肽的表達(dá)的步驟優(yōu)選的是利用RNAi法進(jìn)行。另外，所述細(xì)胞也可以是表達(dá)外源性G蛋白偶聯(lián)型受體的轉(zhuǎn)化體。為了篩選配體親和性改變的G蛋白偶聯(lián)型受體的激動(dòng)劑或者拮抗劑，本發(fā)明的篩選方法的特征在于包括[I]在表達(dá)G蛋白偶聯(lián)型受體的細(xì)胞中抑制以下多肽的表達(dá)的步驟，以及[II]將該細(xì)胞與候選因子一起進(jìn)行培養(yǎng)的步驟；所述多肽為(1)包含序列號l所記載的氨基酸序列的多肽；(2)包含序列號1所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(3)由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽；(4)由包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(5)由可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；或者(6)由與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70%以上的序列同一性的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽。本發(fā)明的篩選方法優(yōu)選的是進(jìn)一步包括測定細(xì)胞內(nèi)(^2+濃度的步驟、或者測定細(xì)胞內(nèi)肌醇磷酸的代謝的步驟。在本發(fā)明中，構(gòu)成所述蛋白復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體優(yōu)選腎上腺素受體、多巴胺受體、毒蕈堿受體或者內(nèi)皮素受體，所述腎上腺素受體可以是a受體，也可以是P受體。另外，所述多巴胺受體優(yōu)選D2受體。此外，所述a受體優(yōu)選a,受體，更優(yōu)選OHA亞型，在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的蛋白復(fù)合物為腎上腺素受體的a化亞型或者(3化亞型。本發(fā)明的其他目的、特征以及優(yōu)點(diǎn)將根據(jù)以下所示的記載而充分闡明。另外，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將根據(jù)參照隨附圖式的以下說明而明白。圖1是表示各種濃度的^H]-西洛多辛([3H]-silodosin)對a比細(xì)胞的飽和結(jié)合曲線的圖。圖2(a)是表示o^細(xì)胞以及a,A細(xì)胞對哌唑嗪的敏感性的圖。1具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種G蛋白偶聯(lián)型受體(GPCR)與特定多肽的蛋白復(fù)合物。在用于本說明書中的情況下，術(shù)語"復(fù)合物"是指多種物質(zhì)相合而形成一體，"形成復(fù)合物"可以與"形成一體"交換使用。此外，形成復(fù)合物的多種物質(zhì)只要接近而相互作用即可，可以彼此結(jié)合也可以不結(jié)合。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的蛋白復(fù)合物是GPCR與特定的多肽接近而相互作用的狀態(tài)，結(jié)果該蛋白復(fù)合物作為配體親和性改變的GPCR而發(fā)揮功能。在本說明書中，舉出腎上腺素受體(特別是a,A亞型)為例作為與特定的多肽相互作用而改變了配體親和性的GPCR來說明本發(fā)明，但閱讀本說明書的本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，構(gòu)成本發(fā)明的GPCR并不限定于腎上腺素受體。另外，如果是本領(lǐng)域技術(shù)人員，則可以容易地獲取構(gòu)成本發(fā)明的GPCR的序列信息。已知，最初期被鑒定為受體的腎上腺素受體(AR)是生物體中最重要的受體之一，其負(fù)責(zé)自主神經(jīng)系統(tǒng)(交感神經(jīng)系統(tǒng))的作用。腎上腺素受體通過與腎上腺素、去甲腎上腺素等結(jié)合，而在各種部位引起平滑肌的收縮以及代謝的亢進(jìn)，從而引起血壓以及脈搏的上升、瞳孔的擴(kuò)大、血中葡萄糖的上升等生物體反應(yīng)。伴隨著研究的進(jìn)步以及各種新藥物的開發(fā)，腎上腺素受體明確被分為各種類型。以前，根據(jù)對異丙腎上腺素、酚妥拉明等藥物的反應(yīng)性的差異，腎上腺素受體被分為a受體與(3受體，進(jìn)一步分為藥理學(xué)亞型(a,受體、Cl2受體、(3受體)。已知，各受體在每個(gè)組織中表現(xiàn)出不同的分布，發(fā)揮不同的作用。例如，已知a,腎上腺素受體對于血管平滑肌、前列腺等的收縮發(fā)揮特別重要的作用，并且已知該a,腎上腺素受體也分布在腦等中樞神經(jīng)系統(tǒng)中而參與意識以及情感的調(diào)節(jié)。人類基因組分析已完成，許多蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及功能可以用基因水平來表示。a,腎上腺素受體的基因中，也鑒定出了a,A、aIB、am三種亞型。已知，這些基因的亞型分類與藥理學(xué)亞型分類非常一致。這樣一來，基本上可以認(rèn)為是由一種基因生成一種亞型受體蛋白。但是，以前就已指出，(X,腎上腺素受體中存在不屬于藥理學(xué)亞型中的任一種的受體。該未知的a,亞型對具代表性的a,阻斷劑(例如哌唑嗪)的親和性較低，被稱為a化亞型，但其基因尚未被克隆出。將a,腎上腺素受體的分類以及藥物選擇性示于表1。a,腎上腺素受體的分類以及藥物選擇性a,受體亞型親和性(pKb)西洛多辛1,3,4,5坦洛新U,4哌唑嗪,2,3,4,5RS-170532,4BMY73784,5a"aiLamam10.7—9.510.7—9.58.18.610.4—9.910.4—9.99.39.910.6—9.38.3—7.610.6—10.110.1—9.99.1—8.46.37.87.86.9—5.66.9—5.67.49.1另外，以下舉出與表l中所示的各化合物的效果相關(guān)的可靠證據(jù)。1.Muramatsu，I.etal.Pharmacol.Commun.,6:23(1995)2.Ford,AP.etal.Mol.Pharmacol.,49:209(1996)3.Murata,S.etal.J.Urol"164:578(2000)4.Hiraizumi-Hiraoka,Y.etal.J.Pharmacol.Exp.Ther.，310:995(2004)5.Murata,S.etal.Br.J.Pharmacol.,127:19(1999)。近年來，通過藥理學(xué)功能實(shí)驗(yàn)以及藥理學(xué)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，在各種哺乳動(dòng)物的下泌尿系統(tǒng)(人類前列腺等)中檢測到a化亞型的活性。為了使以前將on腎上腺素受體作為目標(biāo)的針對哺乳動(dòng)物的下泌尿系統(tǒng)的治療進(jìn)一步發(fā)展，重要的是査明a化亞型的功能。但是，這種a化亞型活性在使組織勻漿化而進(jìn)行的以前的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中沒有檢測到。從已勻漿化的組織中沒有檢測到a化亞型活性，意味著從組織中純化a化亞型非常困難。除非查明a化亞型的實(shí)體，否則a化亞型的功能分析、特別是調(diào)節(jié)受體活性的藥劑(激動(dòng)劑、拮抗劑等)的開發(fā)非常困難。本發(fā)明人們等想到，實(shí)體不明的C^亞型是通過對OdA亞型分子結(jié)合某些次要分子而構(gòu)成的。也就是說，本發(fā)明人們等想到，通過使組織勻漿化，構(gòu)成a化亞型的onA亞型分子與其次要分子兩者間的相互作用被消除，結(jié)果使a化亞型改變特性而成為c^A亞型。本發(fā)明人們進(jìn)行了努力研究，結(jié)果確認(rèn)到特定的蛋白質(zhì)與a,A亞型結(jié)合；以及如果使該蛋白質(zhì)與a1A亞型一起在培養(yǎng)細(xì)胞中共表達(dá)，則會(huì)表達(dá)a化亞型的表型。也就是說，本發(fā)明人們發(fā)現(xiàn)OUL亞型包含是由蛋白復(fù)合物形成，通過特別指定構(gòu)成該復(fù)合物的蛋白質(zhì)，而完成了本發(fā)明。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種形成腎上腺素受體的c^亞型的蛋白復(fù)合物。也就是說，本實(shí)施方式的蛋白復(fù)合物是腎上腺素受體的OHL亞型。根據(jù)本實(shí)施方式，可以提供對與實(shí)體明確的a,L亞型有關(guān)的所有疾病的治療。構(gòu)成本實(shí)施方式的蛋白復(fù)合物的多肽是作為CRELD(cysteine-richwithEGF-likedomains)la蛋白而已眾所周知，且已暗示其錯(cuò)義突變與房室間隔缺損有關(guān)(Gene293:47-57(2002)，Am.J.Hum.Genet.72:1047-1052(2003))。該多肽的序列信息是作為美國國立生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)登錄號NM—015513而提供，在本說明書是表示為序列號1(氨基酸序列)以及序列號2(堿基序列)。也就是說，構(gòu)成本實(shí)施方式的蛋白復(fù)合物的多肽可以是包含序列號1所記載的氨基酸序列的多肽，也可以是由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽。另外，構(gòu)成本實(shí)施方式的蛋白復(fù)合物的多肽并不限定于包含序列號1所記載的氨基酸序列的多肽，也可以是保持其活性的變異多肽。變異多肽例如可以舉出包含序列號l所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有與GPCR形成復(fù)合物而改變該GPCR的配體親和性的活性的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員如果使用本領(lǐng)域的技術(shù)常識，則可以容易地制作特定多肽的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的變異多肽。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員如果依據(jù)本說明書的記載以及技術(shù)常識，則可以容易地確認(rèn)該變異多肽是否保持與原多肽相同的活性。另外，編碼構(gòu)成本實(shí)施方式蛋白復(fù)合物的多肽的多核苷酸并不限定于包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸，只要是編碼保持以下活性的多肽的變異多核苷酸即可，即，改變形成復(fù)合物的GPCR的配體親和性的活性。變異多核苷酸例如可以舉出(1)包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸，(2)可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸，或者(3)與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選85%、或者85%以上的序列同一性的多核苷酸，但不限定于這些多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員如果使用本領(lǐng)域的技術(shù)常識，則可以容易地制作特定多核苷酸的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的變異多核苷酸，可與特定的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的變異多核苷酸，或者與特定的多核苷酸具有70%以上的序列同一性的變異多核苷酸。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員如果依據(jù)本說明書的記載以及技術(shù)常識，則可以容易地確認(rèn)該變異多核苷酸編碼的多肽是否保持與原多核苷酸編碼的多肽相同的活性。在用于本說明書中的情況下，術(shù)語"嚴(yán)格的雜交條件"是指，在雜交溶液(包含50%的甲酰胺，5XSSC(150mM的NaCl、15mM的檸檬酸三鈉)，50mM的磷酸鈉(pH值為7.6)，5X鄧哈特溶液(Denhardt'ssolution),10%硫酸葡聚糖，以及20叱/ml的變性剪切鮭魚精子DNA)中在42。C下培養(yǎng)一晚后，在約65。C下在0.1XSSC中洗滌濾器。另外，具體的雜交順序只要按照該領(lǐng)域中眾所周知的方法(例如"分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(MolecularCloning:ALaboratoryManual)第3版，J.Sambrook以及D.W.Russll編，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(ColdSpringHarborLaboratory),NY(2001)"(在本說明書中以參考的方式引用)所記載的方法)來進(jìn)行即可。像這樣，舉出腎上腺素受體為例作為構(gòu)成本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的18GPCR來說明了本發(fā)明，但可以說本發(fā)明的蛋白復(fù)合物只要是由GPCR與以下的多肽復(fù)合而成即可，所述多肽為(1)包含序列號l所記載的氨基酸序列的多肽；(2)包含序列號l所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(3)由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽；(4)由包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(5)由可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；或者(6)由與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70%以上的序列同一性的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽。也就是說，構(gòu)成本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的GPCR并不限定于腎上腺素受體，也可以是多巴胺受體、毒蕈堿受體或者內(nèi)皮素受體。另外，如果是本領(lǐng)域技術(shù)人員，則可以從眾所周知的數(shù)據(jù)庫中容易地獲取構(gòu)成本發(fā)明的GPCR的序列信息，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本說明書的記載以及技術(shù)常識來容易地制作所需的蛋白復(fù)合物。而且，本發(fā)明提供一種GPCR與特定多肽的蛋白復(fù)合物的制作方法。本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的制作方法的特征在于包括使GPCR與特定的多肽共存于脂質(zhì)膜上的步驟。也就是說，本發(fā)明提供一種含有蛋白復(fù)合物的脂質(zhì)膜以及其制作方法。本發(fā)明的脂質(zhì)膜的特征在于含有上述蛋白復(fù)合物。本發(fā)明的脂質(zhì)膜可以是源自天然的脂質(zhì)膜，也可以是人工脂質(zhì)膜。當(dāng)脂質(zhì)膜源自天然時(shí)，脂質(zhì)膜是指生物膜，當(dāng)脂質(zhì)膜為人工脂質(zhì)膜時(shí)，脂質(zhì)膜是指脂質(zhì)平面膜或者脂質(zhì)體。在一個(gè)方面，本發(fā)明的脂質(zhì)膜可為轉(zhuǎn)化體的生物膜，該轉(zhuǎn)化體導(dǎo)入了編碼構(gòu)成本發(fā)明蛋白復(fù)合物的多肽的多核苷酸。這樣的轉(zhuǎn)化體是通過將含有所述多核苷酸的表達(dá)載體導(dǎo)入到生物中以能夠?qū)⑺龆嚯谋磉_(dá)成生物膜狀而取得。另外，用于轉(zhuǎn)化體的生物可以是原核生物，也可以是真核生物。在另一方面，本發(fā)明的脂質(zhì)膜可以是含有構(gòu)成本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的多肽的脂質(zhì)雙層。脂質(zhì)雙層是由極性脂質(zhì)(特別是磷脂質(zhì))形成兩層而成的膜狀結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)以二維結(jié)構(gòu)的形態(tài)而穩(wěn)定化時(shí)為球狀，但如果將末端與水分子隔離，則可以成為平面結(jié)構(gòu)。在用于本說明書中的情況下，將人工制作的脂質(zhì)雙層中球狀的脂質(zhì)雙層稱為脂質(zhì)體，將平面狀的脂質(zhì)雙層稱為脂質(zhì)平面膜。在本領(lǐng)域中，人工脂質(zhì)雙層是于在生物體外(invitro)測定膜蛋白(例如通道蛋白)的活性時(shí)使用。像這樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地制作脂質(zhì)平面膜，且可以使目標(biāo)蛋白質(zhì)(多肽)保持于脂質(zhì)平面膜上。另外，脂質(zhì)體是也被稱為囊泡的脂質(zhì)人工膜，可以通過劇烈攪拌脂質(zhì)(例如磷脂質(zhì))的懸浮液，使之分散后實(shí)施超聲波處理而制作。在本領(lǐng)域中，使用脂質(zhì)體的研究正在廣泛地進(jìn)行，該脂質(zhì)體被用作細(xì)胞膜模型，或者被用作藥物傳遞(drugdeliverysystem,DDS)的手段之一。這樣一來，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地制作脂質(zhì)體，且可以使目標(biāo)蛋白質(zhì)(多肽)保持于脂質(zhì)體上。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種含有腎上腺素受體的a化亞型的脂質(zhì)膜。如上所述，腎上腺素受體的a化亞型是腎上腺素受體的OHA亞型與CRELDla蛋白的蛋白復(fù)合物。腎上腺素受體的a1A亞型以及CRELDla蛋白均為膜結(jié)合型的蛋白質(zhì)，如上所述，通過進(jìn)行勻漿化(膜破壞)而消除彼此的相互作用。也就是說，通過將兩者配置且保持在脂質(zhì)膜上，而表達(dá)彼此的相互作用。當(dāng)本實(shí)施方式的脂質(zhì)膜為生物膜時(shí)，本實(shí)施方式的脂質(zhì)膜的制作方法也可以是制作表達(dá)腎上腺素受體的a化亞型的轉(zhuǎn)化體的方法，可以說該制作方法只要包括使腎上腺素受體的0HA亞型與CRELDla蛋白共表達(dá)的步驟即可。腎上腺素受體的OHA亞型的序列信息是作為NCBI登錄號U03866或者NM_000680而提供，在本說明書中是表示為作序列號3(氨基酸序列)以及序列號4(堿基序列)。也就是說，本實(shí)施方式的蛋白復(fù)合物的制作方法只要包括以下步驟即可使用含有包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸的載體以及含有包含序列號4所記載的堿基序列的多核苷酸的載體對宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化。所述載體優(yōu)選以能夠起效的方式連結(jié)了目標(biāo)多核苷酸的表達(dá)載體。于用于本說明書中的情況下，術(shù)語"以能夠起效的方式連結(jié)"是指處于如下形態(tài)編碼目標(biāo)肽(或者蛋白質(zhì))的多核苷酸可以在啟動(dòng)子等的控制區(qū)域的控制下，在宿主中表達(dá)該肽(或者蛋白質(zhì))。將編碼目標(biāo)肽的多核苷酸"以能夠起效的方式連結(jié)"于表達(dá)載體而構(gòu)建所需載體的順序在本領(lǐng)域中為眾所周知。另外，將表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主內(nèi)的方法也在本領(lǐng)域中眾所周知。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地使所需的肽在宿主內(nèi)生成。在用于本說明書中的情況下，術(shù)語"轉(zhuǎn)化體"不僅是指細(xì)胞、組織或者器官，另外也指生物個(gè)體。成為轉(zhuǎn)化對象的生物也無特別限定，可以舉出各種微生物、植物以及動(dòng)物。此外，可以說本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體只要至少導(dǎo)入了編碼構(gòu)成本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的多肽的多核苷酸，且表達(dá)這些多肽即可。也就是說，需留意如下方面利用表達(dá)載體以外的手段生成的轉(zhuǎn)化體也包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體優(yōu)選的是構(gòu)成本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的多肽穩(wěn)定地表達(dá)，但也可以是目標(biāo)多肽短暫地表達(dá)的轉(zhuǎn)化體。此外，如果使用共存有本實(shí)施方式的蛋白復(fù)合物的轉(zhuǎn)化體，則可以通過觀察宿主細(xì)胞內(nèi)的第二信使的動(dòng)態(tài)來篩選該復(fù)合物的激動(dòng)劑或者拮抗劑。當(dāng)本實(shí)施方式的脂質(zhì)膜為人工脂質(zhì)膜時(shí)，本實(shí)施方式的脂質(zhì)膜的制作方法也可以是制作含有腎上腺素受體的a化亞型的脂質(zhì)平面膜或者脂質(zhì)體的方法，更詳細(xì)來說，可以說該制作方法只要包括在人工脂質(zhì)膜上重組腎上腺素受體的0HA亞型與CRELDla蛋白的步驟即可。本領(lǐng)域技術(shù)人員如果依據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)常識，則可以在人工脂質(zhì)膜上容易地重組膜蛋白。如果使用共存有本實(shí)施方式的蛋白復(fù)合物的人工脂質(zhì)膜，則可以測定該復(fù)合物的配體親和性。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，上述脂質(zhì)膜的制作方法可以是蛋白復(fù)合物的制作方法，也可以是改變GPCR的配體親和性的方法。也就是說，本發(fā)21明提供一種改變GPCR的配體親和性的方法。另外，如果使用本發(fā)明的脂質(zhì)膜，則可以篩選配體親和性改變的GPCR的激動(dòng)劑或者拮抗劑。也就是說，本發(fā)明提供一種篩選配體親和性改變的GPCR的激動(dòng)劑或者拮抗劑的方法。本發(fā)明的篩選方法的特征在于包括在脂質(zhì)膜上生成上述蛋白復(fù)合物的步驟，以及將該蛋白復(fù)合物與候選因子一起進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。此外，在用于本說明書中的情況下，"培養(yǎng)"是指置于使多種物質(zhì)共存且可以彼此充分接觸的狀態(tài)下。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的篩選方法包括將含有目標(biāo)GPCR的轉(zhuǎn)化體(例如表達(dá)腎上腺素受體的a化亞型的細(xì)胞)與候選因子一起進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。本實(shí)施方式的篩選方法中，可以通過測定細(xì)胞的第二信使的變動(dòng)(例如G蛋白為Gs或者Gi時(shí)測定cAMP量，G蛋白為Gq時(shí)測定肌醇三磷酸以及C^+濃度)，來篩選目標(biāo)GPCR(例如腎上腺素受體的a化亞型)的激動(dòng)劑或者拮抗劑。腎上腺素受體的a化亞型的激動(dòng)劑可以用作失禁治療藥、擴(kuò)瞳藥、白內(nèi)障治療藥、中樞興奮藥，腎上腺素受體的c^亞型的拮抗劑可以用作排尿障礙治療藥、雷諾氏病治療藥、微循環(huán)障礙治療藥、降壓藥、中樞抑制藥、腎血流改善藥、利尿藥。另外已知曉，腎上腺素受體的P比亞型與心臟病有關(guān)，多巴胺D2受體及毒蕈堿受體與中樞神經(jīng)疾病有關(guān)，因此這些受體的激動(dòng)劑或者拮抗劑也是有用的。另外，本發(fā)明提供一種降低了與GPCR形成蛋白復(fù)合物的多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)化體以及其制作方法。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的制作方法的特征在于包括抑制內(nèi)源性的多肽的表達(dá)的步驟。例如，作為與GPCR復(fù)合而形成蛋白復(fù)合物的多肽之一的CRELDla蛋白在各種細(xì)胞中表達(dá)。因此，抑制了內(nèi)源性的CRELDla蛋白的表達(dá)的轉(zhuǎn)化體作為分析所述蛋白復(fù)合物的功能或者篩選目標(biāo)化合物(例如激動(dòng)劑或者拮抗劑)時(shí)所用的對照細(xì)胞非常有用。本項(xiàng)中所述的表達(dá)降低細(xì)胞可以單獨(dú)利用，優(yōu)選的是與上述蛋白復(fù)合物或者含有蛋白復(fù)合物的脂質(zhì)膜一起利用。此外，在對象細(xì)胞中表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)型受體可以是內(nèi)源性，也可以是外源性。在一個(gè)方面，本發(fā)明可以包括在表達(dá)G蛋白偶聯(lián)型受體的細(xì)胞中抑制內(nèi)源性的CRELDla蛋白的表達(dá)的步驟。借此，可以改變細(xì)胞中表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性。也就是說，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的制作方法可以是表達(dá)配體親和性改變的G蛋白偶聯(lián)型受體的轉(zhuǎn)化體的制作方法，也可以是改變G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明可以包括在表達(dá)腎上腺素受體的a,L亞型的細(xì)胞中抑制內(nèi)源性的CRELDla蛋白的表達(dá)的步驟。借此，可能將表現(xiàn)出a化亞型的表型的細(xì)胞改變成表現(xiàn)出a,A亞型的表型的細(xì)胞。抑制內(nèi)源性的CRELDla蛋白的表達(dá)的方法優(yōu)選的是使用RNAi法。RNAi法是本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)，例如可以通過將包含序列號5所示的堿基序列的寡核苷酸導(dǎo)入到目標(biāo)細(xì)胞中，來順利地抑制內(nèi)源性的CRELDla蛋白的表達(dá)。此外，當(dāng)使用用來將包含序列號5所示的堿基序列的寡核苷酸導(dǎo)入到目標(biāo)細(xì)胞中的載體時(shí)，優(yōu)選的是將包含序列號6所示的堿基序列的寡核苷酸用作反義寡核苷酸，但并不限定于此。本發(fā)明還提供一種篩選配體親和性改變的G蛋白偶聯(lián)型受體的激動(dòng)劑或者拮抗劑的方法，其特征在于使用上述轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明并不限定于上述各實(shí)施方式，可以在權(quán)利要求所示的范圍內(nèi)進(jìn)行各種變更，將不同的實(shí)施方式中分別揭示的技術(shù)手段適當(dāng)組合而獲得的實(shí)施方式也包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。另外，本說明書中所記載的學(xué)術(shù)文獻(xiàn)以及專利文獻(xiàn)在本說明書中全部是以參考的方式引用。使用聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)法，從人類前列腺基因庫中克隆出人類腎上腺素受體alpha-lA基因(ADRA1A)。所克隆出的基因全長1465bp,開放讀碼框(OpenReadingFrame,ORF)序列與以前報(bào)告的人類alpha-lA基因(NCBI登錄號U03866或者NM—000680)完全一致。而且，其前后的序列也與Hirasawaetal.(1993)報(bào)告的序列-一致。從人類前列腺cDNA基因庫中克隆出CRELDla基因。序列測定的結(jié)果為，所克隆出的基因與Ruppetal.(2002)報(bào)告的基因(NCBI登錄號顧一015513)—致。然后，在pIRES(Clontech公司目錄編號PT3266-5)的多克隆位點(diǎn)A的EcoRI限制性酶位點(diǎn)，亞克隆出ADRA1A基因的編碼區(qū)。而且，在pIRES的多克隆位點(diǎn)B的Xbal限制性酶位點(diǎn)，亞克隆出CRELDla的編碼區(qū)。此外，在基因的兩端為了進(jìn)行亞克隆而添加限制性酶的接頭。利用常用方法擴(kuò)增/純化所述載體，使用Lipofectamine2000(Invitrogen公司)，按照制造商的操作說明轉(zhuǎn)染到源自中國倉鼠(ChineseHamster)卵巢的細(xì)胞即CHO-K1細(xì)胞上。轉(zhuǎn)染2天后，將抗生物質(zhì)遺傳霉素(G418)1200ng/ml添加到DMEM培養(yǎng)基中。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、即完全同樣地進(jìn)行Lipofectamine2000等的操作而僅未添加載體的細(xì)胞完全死亡的G418濃度為1000pg/ml。以每1個(gè)孔中有平均0.5個(gè)細(xì)胞進(jìn)入的方式將G418耐性細(xì)胞稀釋懸浮，并分注到96孔板中，選擇單一群落。重復(fù)進(jìn)行該操作3次，借此制作共表達(dá)ADRA1A基因與CRELDla基因的穩(wěn)定克隆(stableclone)(a比細(xì)胞)。另夕卜，作為對照，制作僅穩(wěn)定表達(dá)ADRA1A基因的細(xì)胞(A細(xì)胞)以及僅穩(wěn)定表達(dá)CRELDla基因的細(xì)胞(CRELDla細(xì)胞)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)中所用的藥物及其正式化學(xué)名如下西洛多辛(silodosin)、哌唑嗪(prazosin)、坦洛新(tamsulosin)、RS-17053(N隱[2-(2-cyclopropylmethoxyphenoxy)ethyl]-5-chloro-a,a-dime勿l-lH-indole-3-ethanaminehydrochloride,N-[2-(2-環(huán)丙基甲氧基苯氧基)乙基]-5-氯-a，a-二甲基-1H-B引哚-3-乙胺鹽酸鹽)、BMY7378(8-[2-[4-(2-methoxyphenyl)-l-piperazinyl]ethyl]8-azaspiro[4,5]decane-7,9-dionedihydrochloride，8-[2-[4-(2-甲氧基苯基)-1-哌嗪基]乙基]8-氮雜螺[4,5]癸烷-7,9-二酮二鹽酸鹽)。利用使用放射性配體[3司-西洛多辛的藥理學(xué)結(jié)合法來研究穩(wěn)定克隆。利用全細(xì)胞法wholecellbindingmethod進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。也就是說，在實(shí)驗(yàn)23天前以成為半融合狀態(tài)的方式播種細(xì)胞，用冰冷的磷酸鹽緩沖溶液(PhosphateBufferSolution,PBS)洗滌2次后，用刮刀刮取細(xì)胞。將所回收的細(xì)胞再懸浮于Krebs-HEPES溶液中，與[3司-西洛多辛以及根據(jù)需要而使用的其他藥劑一起在4"C下培養(yǎng)4小時(shí)。此后，使用經(jīng)聚乙烯亞胺進(jìn)行了前處理的WhatmannGC/F濾器對細(xì)胞進(jìn)行過濾/洗滌，利用液體閃爍計(jì)數(shù)器測定放射能。將非特異結(jié)合評價(jià)為30的酚妥拉明存在下的結(jié)合。利用全細(xì)胞法的飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)對a化細(xì)胞研究各種濃度(30500pM)的^H]-西洛多辛的結(jié)合(圖1)。圖1表示利用全細(xì)胞法獲得的飽和結(jié)合曲線。[3司-西洛多辛對0^細(xì)胞的特異結(jié)合的最大結(jié)合量(Bmax)為134fmol/mg蛋白，Kd值為843pM(pKD=9.1)。競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)已知西洛多辛僅與a,A亞型及a化亞型高親和性地結(jié)合。這里，所謂高親和性是指Kd值為lnM以下。為了鑒定o^細(xì)胞中表達(dá)的受體的藥理學(xué)特性，使用全細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)法來進(jìn)行哌唑嗪對300pM的[SH]-西洛多辛的結(jié)合部位的競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)。對照中使用0HA細(xì)胞。如上所述，在該濃度下，[3司-西洛多辛僅能夠與a,A亞型以及a化亞型結(jié)合。如圖2(a)的競爭曲線所示，a,L細(xì)胞中，大部分(88%以上)的受體對哌唑嗪表現(xiàn)出較低的敏感性(pKj=7.6)。另外，對RS-17053也同樣地敏感性較低，且對坦洛新具有較高的敏感性。另外，對BMY7378僅表現(xiàn)出較低的敏感性(表2)。相對于此，用作對照的a,A細(xì)胞對哌唑嗪(圖2)、坦洛新、RS-17053的敏感性(pKi值)值較高，分別為9.5、9.9、8.8，與迄今為止所報(bào)告的ot,A的特性一致(表2)。25表2]新型a化受體表達(dá)細(xì)胞的藥理學(xué)特性<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>此外，表中，將o^細(xì)胞、a化細(xì)胞以及人類前列腺組織切片中競爭藥物對卩H]-西洛多辛結(jié)合的抑制常數(shù)(Ki)表示為-logKj(pKi)的值。其中，^H]-西洛多辛表示根據(jù)飽和結(jié)合曲線求出的pKD值(解離平衡常數(shù))(數(shù)值為34例的平均值)。另外，圖2(b)中表示出使用a化細(xì)胞與a化細(xì)胞的勻槳來研究對哌唑嗪的敏感性的結(jié)果。勻漿中，c^細(xì)胞對哌唑嗪表現(xiàn)出與a,A細(xì)胞同樣的高敏感性。此事實(shí)與如果使前列腺或者腦等的組織勻漿化則觀察不到(X,L受體的事實(shí)一致。表2中，將所述結(jié)果與人類前列腺等中所得的結(jié)果進(jìn)行對比而表示出。使ADRA1A基因與CRELDla基因共表達(dá)的c^細(xì)胞的受體特性與c^受體完全不同，其藥理學(xué)特性與人類前列腺等中報(bào)告的a化受體非常一致。因此，a比細(xì)胞與a,A細(xì)胞不同，可以認(rèn)為其是生物體中表達(dá)a化受體的細(xì)胞系。此外，為了完全消除可能在(x,A細(xì)胞中內(nèi)源性地表達(dá)的CRELDla的影響，使用RNAi法來制作降低了CRELDla的表達(dá)的細(xì)胞(以下稱為KD細(xì)胞)。為了使用RNAi法來抑制基因表達(dá)，對于市售的pSilencerTM4.1-CMVhygro(Ambion公司)，按照其操作說明書來制作插入了包含中國倉鼠CRELDla的mRNA的編碼區(qū)的寡核苷酸(正義序列TCGCCTTTA，序列號5;反義序列GTCGCCTG，序列號6)的載體，利用與上述相同的方法轉(zhuǎn)染到上述a1A細(xì)胞上。使用該KD細(xì)胞，通過利用熒光色素Fura-2的熒光比測光法，研究對去甲腎上腺素的細(xì)胞內(nèi)&2+應(yīng)答。KD細(xì)胞的對去甲腎上腺素的Ca2+應(yīng)答的pECs。值為7.9。另一方面，如果用哌唑嗪10'SM預(yù)先將該細(xì)胞處理2分鐘，則對去甲腎上腺素的C^+應(yīng)答的用量反應(yīng)曲線向右移動(dòng)，算出哌唑嗪的pKB值為9.3。由此表明，KD細(xì)胞中對去甲腎上腺素的Ca"應(yīng)答與cha亞型的特性一致。這樣一來，如果利用RNAi法來抑制表達(dá)cnA亞型的基因的CHO細(xì)胞中的內(nèi)源性的CRELDla的表達(dá)，則完全表現(xiàn)出cha受體特性。此外，使a1A亞型的基因于CHO細(xì)胞中表達(dá)而研究Ca"應(yīng)答等受體功能的實(shí)驗(yàn)迄今為止已存在若干種。但是，關(guān)于這些實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出的受體特性，未必能夠獲得一致的見解。如果使用本發(fā)明，則可以明確實(shí)體不明的G蛋白偶聯(lián)型受體，并提供對與該受體有關(guān)的所有疾病的治療。另外，可以改變G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性。發(fā)明的詳細(xì)說明的項(xiàng)中描述的具體實(shí)施方式或者實(shí)施例始終是用來闡明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容的，而不應(yīng)狹義地解釋為僅限定于這樣的具體例，可以在本發(fā)明的精神以及以下揭示的權(quán)利要求內(nèi)進(jìn)行各種變更而實(shí)施。(工業(yè)上的利用可能性)已査明ohl-AR在下泌尿系統(tǒng)中表達(dá)，可以認(rèn)為本發(fā)明人們所開發(fā)出的a,l-AR表達(dá)細(xì)胞在對前列腺肥大或者失禁等排尿障礙的治療藥的開發(fā)方面極為有用。另外可以認(rèn)為，其作為對與ohl-AR有關(guān)的所有疾病的治療藥的篩選法也極為有用。2權(quán)利要求1、一種蛋白復(fù)合物，其特征在于，所述蛋白復(fù)合物是G蛋白偶聯(lián)型受體與以下的多肽復(fù)合而成，所述多肽為(1)包含序列號1所記載的氨基酸序列的多肽；(2)包含序列號1所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(3)由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽；(4)由包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(5)由可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；或者(6)由與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70％以上的序列同一性的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白復(fù)合物，其特征在于，所述G蛋白偶聯(lián)型受體為腎上腺素受體、多巴胺受體、毒蕈堿受體或者內(nèi)皮素受體。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白復(fù)合物，其特征在于，所述腎上腺素受體為cn受體或者(31受體。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白復(fù)合物，其特征在于，所述oi,受體為aiA受體。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白復(fù)合物，其特征在于，所述多巴胺受體為D2受體。6、一種脂質(zhì)膜，其特征在于，所述脂質(zhì)膜含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白復(fù)合物。7、一種根據(jù)權(quán)利要求6所述的脂質(zhì)膜的制作方法，其特征在于，所述制作方法包括使G蛋白偶聯(lián)型受體與以下的多肽共存于脂質(zhì)膜上的步驟，所述多肽為(1)包含序列號1所記載的氨基酸序列的多肽；(2)包含序列號1所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(3)由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽；(4)由包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(5)由可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；或者(6)由與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70%以上的序列同一性的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽。8、一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化體表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白復(fù)合物。9、一種根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化體的制作方法，其特征在于，所述制作方法包括使G蛋白偶聯(lián)型受體與以下的多肽在細(xì)胞中共表達(dá)的步驟，所述多肽為(1)包含序列號1所記載的氨基酸序列的多肽；(2)包含序列號1所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(3)由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽；(4)由包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(5)由可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；或者(6)由與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70%以上的序列同一性的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽。10、一種改變G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性的方法，其特征在于，所述方法包括使G蛋白偶聯(lián)型受體與以下的多肽共存于脂質(zhì)膜上的步驟，所述多肽為(1)包含序列號1所記載的氨基酸序列的多肽；(2)包含序列號1所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(3)由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽；(4)由包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(5)由可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；或者(6)由與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70%以上的序列同一性的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽。11、一種篩選配體親和性改變的G蛋白偶聯(lián)型受體的激動(dòng)劑或者拮抗劑的方法，其特征在于，所述篩選方法包括使G蛋白偶聯(lián)型受體與以下的多肽共存于脂質(zhì)膜上而生成蛋白復(fù)合物的步驟，以及將該蛋白復(fù)合物與候選因子一起進(jìn)行培養(yǎng)的步驟；所述多肽為(1)包含序列號1所記載的氨基酸序列的多肽；(2)包含序列號1所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(3)由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽；(4)由包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(5)由可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；或者(6)由與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70%以上的序列同一性的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽。12、根據(jù)權(quán)利要求11所述的篩選方法，其特征在于，所述篩選方法進(jìn)一步包括測定細(xì)胞內(nèi)C^+濃度的步驟、或者測定細(xì)胞內(nèi)肌醇磷酸的代謝的步驟。13、一種表達(dá)配體親和性改變的G蛋白偶聯(lián)型受體的轉(zhuǎn)化體的制作方法，其特征在于，所述制作方法包括在表達(dá)G蛋白偶聯(lián)型受體的細(xì)胞中抑制以下多肽的表達(dá)的步驟，所述多肽為(1)包含序列號1所記載的氨基酸序列的多肽；(2)包含序列號1所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(3)由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽；(4)由包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(5)由可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；或者(6)由與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70%以上的序列同一性的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽。14、根據(jù)權(quán)利要求13所述的制作方法，其特征在于，所述多肽為內(nèi)源性蛋白質(zhì)。15、根據(jù)權(quán)利要求13所述的制作方法，其特征在于，抑制所述多肽的表達(dá)的步驟是利用RNAi法進(jìn)行的。16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的制作方法，其特征在于，所述RNAi法是通過導(dǎo)入包含序列號5所示的堿基序列的寡核苷酸而進(jìn)行的。17、根據(jù)權(quán)利要求13所述的制作方法，其特征在于，所述細(xì)胞是表達(dá)外源性的G蛋白偶聯(lián)型受體的轉(zhuǎn)化體。18、一種改變G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性的方法，其特征在于，所述方法包括在表達(dá)G蛋白偶聯(lián)型受體的細(xì)胞中抑制以下多肽的表達(dá)的步驟，所述多肽為(1)包含序列號1所記載的氨基酸序列的多肽；(2)包含序列號1所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(3)由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽；(4)由包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(5)由可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；或者(6)由與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70%以上的序列同一性的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽。19、一種篩選配體親和性改變的G蛋白偶聯(lián)型受體的激動(dòng)劑或者拮抗劑的方法，其特征在于，所述篩選方法包括在表達(dá)G蛋白偶聯(lián)型受體的細(xì)胞中抑制以下多肽的表達(dá)的步驟，以及將該細(xì)胞與候選因子一起進(jìn)行培養(yǎng)的步驟；所述多肽為(1)包含序列號1所記載的氨基酸序列的多肽；(2)包含序列號1所記載的氨基酸序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而成的氨基酸序列，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(3)由包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸編碼的多肽；(4)由包含序列號2所記載的堿基序列中缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基而成的堿基序列的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；(5)由可與包含序列號2所記載的堿基序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽；或者(6)由與包含序列號2所記載的堿基序列的多核苷酸具有70%以上的序列同一性的多核苷酸編碼，且具有將形成復(fù)合物的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體親和性改變的活性的多肽。20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的篩選方法，其特征在于，所述篩選方法進(jìn)一步包括測定細(xì)胞內(nèi)(^2+濃度的步驟、或者測定細(xì)胞內(nèi)肌醇磷酸的代謝的步驟。全文摘要本發(fā)明提供一種通過使G蛋白偶聯(lián)型受體與包含序列號1所記載的氨基酸序列的多肽結(jié)合而改變了配體親和性的G蛋白偶聯(lián)型受體變異體。而且，本發(fā)明使用表達(dá)所述G蛋白偶聯(lián)型受體變異體的轉(zhuǎn)化體來篩選對該G蛋白偶聯(lián)型受體變異體的激動(dòng)劑或者拮抗劑。由此，本發(fā)明提供一種分析實(shí)體不明的G蛋白偶聯(lián)型受體的功能的技術(shù)。文檔編號C07K14/47GK101679500SQ20088001639公開日2010年3月24日申請日期2008年5月22日優(yōu)先權(quán)日2007年5月23日發(fā)明者村松郁延申請人:藥質(zhì)體合同會(huì)社;日本化學(xué)藥品株式會(huì)社