專利名稱：：惡臭假單胞菌kt2440高效電轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一種惡臭假單胞菌KT2440CP"wc/owo"oypw"V/aKT2440)高效電轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
：生物技術(shù)的基石之一是利用微生物產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì)并去除有害的成分，PKT2440是這類微生物的一個(gè)代表。因?yàn)樗哂写x多樣性，強(qiáng)的抵壓力性，在遺傳修飾上較為簡單，在環(huán)境和工業(yè)應(yīng)用中具有巨大的潛力。？KT2440也是典型的模式環(huán)境微生物菌株，其基因組在2002年被解析，6.18Mb的基因組序列分析揭示了該菌株的傳輸和代謝系統(tǒng)的多樣性。雖然其基因組序列與化膿性肺炎的病源菌銅綠假單胞菌有85%的相似性，但戶j^^foKT2440不致病，并且有著許多重要的生理、生態(tài)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)功能。在生理功能方面，P;w/W"KT2440生活在土壤和水體環(huán)境中，不可避免的接觸到各種有機(jī)溶劑，菌株獨(dú)特的細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和運(yùn)輸系統(tǒng)構(gòu)成其獨(dú)特的有機(jī)溶劑耐受性，使其可以在含有高達(dá)50。/。(V/V)的甲苯或更高濃度的環(huán)己胺、二甲苯、苯乙烯和庚醇培養(yǎng)基中可以存活，這就為研究提高工業(yè)微生物尤其是溶劑生產(chǎn)菌和毒性有機(jī)物降解菌的工業(yè)適應(yīng)性，提供了極其重要的材料。在生態(tài)功能方面，Pjro"WaKT2440具有強(qiáng)大的降解能力，它能降解100多類不同結(jié)構(gòu)的化合物.包括難降解的烴類化合物和芳香族化合物；具有脫氮(硝化)和脫硫效果，在氨、硫元素的地球化學(xué)循環(huán)中扮演重要的角色；對植物具有促生作用，對植物致病菌具有拮抗作用等等。在生物修復(fù)、煤炭脫硫、生物催化、生物肥料和生物防治等方面也具有廣闊的應(yīng)用前景。尸.p^W"KT2440的基因組學(xué)研究表明其存在廣泛的代謝途徑，可以將大部分常見的芳香族化合物代謝成三羧酸循環(huán)中間物質(zhì)為菌體生長利用，其代謝過程中產(chǎn)生的大量酶在生物催化方面起了重要作用，其中包含多聚體(如多羥基抗生3素類)的高產(chǎn)相關(guān)的酶以及環(huán)氧化物、苯磷二酚和雜環(huán)化合物的產(chǎn)生相關(guān)的酶系。P戸WaKT2440是唯一的全基因組解析的惡臭假單胞菌，因此對研究其它惡臭假單胞菌的轉(zhuǎn)錄和蛋白組學(xué)其基因組數(shù)據(jù)庫可以作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的參照。P;油^KT2440全基因組、高密度的寡聚核苷酸微陣列的應(yīng)用和轉(zhuǎn)錄學(xué)研究正在進(jìn)行。P/w^/aKT2440是第一個(gè)被美國衛(wèi)生部重組DNA委員會(huì)認(rèn)定對環(huán)境安全的革蘭氏陰性菌株，并許可作為基因工程的宿主菌。由于其遺產(chǎn)操作系統(tǒng)簡單清晰，是首選的基因克隆、表達(dá)的革蘭氏陰性菌株之一，也是常用的引入外源基因的模式菌株，該菌株已被廣泛的應(yīng)用在生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。細(xì)菌遺傳分析方面的進(jìn)步依賴于轉(zhuǎn)化方法的發(fā)展和利用。發(fā)展高效率轉(zhuǎn)化的方法對于不能自行吸收外源DNA的細(xì)菌尤其重要，一般化學(xué)轉(zhuǎn)化的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于電轉(zhuǎn)化，所以提高電轉(zhuǎn)化的效率就更為重要。高效的電轉(zhuǎn)化可以保證外源基因高效的轉(zhuǎn)化至菌株；保證了大分子量質(zhì)粒DNA也可以高效電轉(zhuǎn)化；在需要高效率轉(zhuǎn)化時(shí)，如隨機(jī)文庫的轉(zhuǎn)化時(shí)尤為關(guān)鍵。電轉(zhuǎn)化的方法已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌，酵母細(xì)胞等。如上所說Ppi^VfeKT2440是最具特征性的模式環(huán)境微生物菌株，也是利用引入外源基因來產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì)的模式菌株，所以研究該菌株高效率的電轉(zhuǎn)化方法對于該菌株和其他假單胞菌引入外源DNA具有重大的應(yīng)用意義。1995年Cho等報(bào)道了P;w/WaKT2440高效率電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的方法以LB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，lmM4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，pH=7.0)緩沖液作洗滌液洗滌菌體，電轉(zhuǎn)化條件12KV/cm，2.5msec,10(VF，電轉(zhuǎn)化后用L5ml離心管培養(yǎng)菌體，在對8-llkb的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，最高效率可達(dá)1.0xlO"嗎DNA，即每微克DNA得到1.0xl(^個(gè)轉(zhuǎn)化克隆。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種為更高效地轉(zhuǎn)化P戸W"KT2440的方法，我們通過一系列條件的研究建立了高效的P;^ri^/KT2440電轉(zhuǎn)化方法，電轉(zhuǎn)化效率最高達(dá)到3.0x108轉(zhuǎn)化子/嗎DNA，比Cho等報(bào)道的高出30倍。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是以EM培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)菌體至OD6oo為0.6-0.75，用3mM、pH=7.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液洗滌并懸浮菌體；在1.2KV，200Q,25)^F條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化；電轉(zhuǎn)化后加lmlSOC培養(yǎng)基，在15ml聚丙烯離心管中，溫育30°C培養(yǎng)2h。本發(fā)明中所說的EM培養(yǎng)基的配方，以每升計(jì)蛋白胨20.0g，酵母膏5.0g，氯化鈉5.0g，葡萄糖5.0g，pH=7.0。其中葡萄糖配成質(zhì)量百分濃度10%的儲(chǔ)存液，單獨(dú)滅菌，每升培養(yǎng)基加50ml。本發(fā)明方法中，經(jīng)4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液洗滌并懸浮菌體后，菌體濃縮300倍，5(VI分裝并用于一次電轉(zhuǎn)化。本發(fā)明中所說的SOC培養(yǎng)基的配方以每升計(jì)蛋白胨20.0g，酵母膏5.0g，氯化鈉10mM，氯化鉀2.5mM，氯化鎂10mM，硫酸鎂10mM和葡萄糖20mM。其中葡萄糖配成2M儲(chǔ)存液，單獨(dú)滅菌，每升培養(yǎng)基加10ml)本發(fā)明方法相對于現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)之處在于1.以EM培養(yǎng)基Pp""'c/aKT2440，3mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液代替了lmM4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液，效率提高1-2倍。2.電轉(zhuǎn)化后SOC培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體效率比LB培養(yǎng)基提高2-3倍。3.電轉(zhuǎn)化后15ml離心管培養(yǎng)菌體比1.5ml離心管培養(yǎng)菌體效率提高4-9倍。本發(fā)明具有以下應(yīng)用1.基因克隆，可以高效率的引入外源DNA,高的效率保證了大分子量質(zhì)粒DNA也可以高效的轉(zhuǎn)化。比如聚酮化合物生物合成基因簇載體的高效轉(zhuǎn)化，為聚酮化合物的異源表達(dá)提供了平臺(tái)。2.篩選特定表型的克隆，即鳥槍法克隆基因。如將酶切基因組DNA與載體相連后轉(zhuǎn)化至？KT2440。3.廣譜宿主性載體的高效率的轉(zhuǎn)化，基因的高效表達(dá)。4.高效轉(zhuǎn)化有拓?fù)洚悩?gòu)酶I處理的松弛型質(zhì)粒和五coRI酶切的線性化載體至尸.戶/油。5.這種P;w^/aKT2440轉(zhuǎn)化方法可為其它假單胞菌的電轉(zhuǎn)化方法借鑒。6.該方法的建立為該菌株和其它假單胞桿菌菌株的改造也有重要的應(yīng)用意義比如通過外源基因的引入，改造P，"d"KT2440，擴(kuò)大其降解譜和降解能力，使其成為降解多種環(huán)境污染物的"超級(jí)工程菌"，這對環(huán)境保護(hù)和防治具有重要意義。圖1是電轉(zhuǎn)化7.2kb的pJB861至fKT2440的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)隨DNA量的增加而增加的結(jié)果。圖2是電轉(zhuǎn)化11.2kb的pCM132至P;w//<iaKT2440的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)隨DNA量的增加而增加的結(jié)果。具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例中所用到的菌株和質(zhì)粒，均為已公開的菌株和質(zhì)粒/7"/,V/flKT2440。文獻(xiàn)NelsonKE,WeinelC,PaulsenITetal.CompletegenomesequenceandcomparativeanalysisofthemetabolicallyversatilePseudomonasputidaKT2440.EnvironMicrobiol2002;4(12):799-808。來自美國TheInstituteforGenomicResearchNelson博士。2.pJB861。文獻(xiàn)BlatnyJM,BrautasetT，Winther-LarsenHC,KarunakaranP,VallaS.Improvedbroad-host-rangeRK2vectorsusefulforhighandlowregulatedgeneexpressionlevelsingram-negativebacteria.Plasmid1997;38:35-51。來自挪威UniversityofScienceandTechnology的SveinValla教授。3.pCM132。文獻(xiàn)MarxCJ,Lids加mME.Developmentofimprovedversatilebroad-host-rangevectorsforuseinmethylotrophsandotherGram-negativebacteria.Microbiology2001;147:2065-75。來自美國UniveristyofWashinton,Seattle,的MaryLidstrom教授。本發(fā)明以pJB861為實(shí)驗(yàn)材料來建立最優(yōu)化的點(diǎn)轉(zhuǎn)化條件。pJB861是中等大小(7.2kb)含oriV復(fù)制子的質(zhì)粒，其廣泛運(yùn)用于外源基因在尸.戶/z'由KT2440的表達(dá)。以之作為轉(zhuǎn)化材料，在本發(fā)明中有代表意義。pm硫KT2440菌體的培養(yǎng)從-80。C冰箱里取出尸.pw/c/aKT2440菌種在無抗的EM固體培養(yǎng)基上劃線，在30°C倒置培養(yǎng)16-20h，挑取單菌落至3mlEM液體培養(yǎng)基30°C，220rpm搖床過夜培養(yǎng)；將一次培養(yǎng)物以l:100轉(zhuǎn)接至含50mlEM液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于30°C，220rpm搖床培養(yǎng)至OD6(xr0.6-0.75。取出搖瓶立即冰浴20分鐘。2.洗滌液的選擇用4T離心機(jī)以5000rpm，IO分鐘收集菌體。菌體先用滅菌的超純水洗滌2次，再換用7種(l-3-5-10-15mM4-羥乙基哌嗉乙磺酸，10%甘油+0.3M蔗糖，水)不同的洗滌液洗滌菌體3次。菌體濃縮300倍每50ul分裝。制備好的感受態(tài)和50ng的pJB861質(zhì)?；靹蚝箪o置2-5分鐘，將其混合液轉(zhuǎn)移至預(yù)先遇冷的lmm內(nèi)徑的電轉(zhuǎn)杯(Bio-Rad)中，迅速以1.2KV,200ohm，25|iF的電轉(zhuǎn)化條件轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化后將lml的SOC加到電轉(zhuǎn)杯將電轉(zhuǎn)化液體沖洗干凈轉(zhuǎn)移至1.5mleppendorf管中，以30。C，220rpm搖床培養(yǎng)2h。2h后將菌體稀釋105、104倍分別涂布在含3(Vg/ml卡那霉素的的EM固體培養(yǎng)基上，在30°C倒置過夜培養(yǎng)。第二天對菌落數(shù)計(jì)數(shù)，根據(jù)后面的計(jì)算感受態(tài)效率的公式計(jì)算出7種洗滌液制備的感受態(tài)效率，見表l。表l:不同洗滌液對制備感受態(tài)效率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從表1中可以得出以下結(jié)論相同條件下3mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸洗滌液制備的感受態(tài)效率最高，比其他洗滌液的效率高2-3倍。3.質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化后菌體培養(yǎng)條件的選擇菌體培養(yǎng)同上，洗滌液選擇效率最高的3mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸其它制備條件同上，轉(zhuǎn)化條件同上，轉(zhuǎn)化后菌體培養(yǎng)選擇1.5mleppendorf管和15ml聚丙烯離心管，培養(yǎng)基均為lml的LB。計(jì)算兩種培養(yǎng)條件下的感受態(tài)效率，見表2。表2:質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后菌體培養(yǎng)條件對感受態(tài)效率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表2中可以得出下列結(jié)論同等條件下采用15ml聚丙烯離心管的效率是1.5ml離心管的4-9倍左右。4.質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化后菌體培養(yǎng)用培養(yǎng)基條件的選擇其它條件同上，滌液選擇效率最高的3mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸制備感受態(tài)，電轉(zhuǎn)化后用含lml的LB和lml的SOC同時(shí)用15ml聚丙烯離心管培養(yǎng)菌體。計(jì)算兩種培養(yǎng)條件下的感受態(tài)效率，見表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表2中可以得出下列結(jié)論同等條件下采用SOC培養(yǎng)菌體其感受態(tài)效率是LB培養(yǎng)基效率的2-3倍。將上述的三個(gè)條件結(jié)合起來就是本發(fā)明所建立的一種制備P.;Wf^KT2440高效電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的方法EM培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體OD6wr0.6-0.75，3mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液洗菌體，濃縮300倍，50ul分裝，電轉(zhuǎn)化條件L2KV,200ohm,25uF。電轉(zhuǎn)化后用含有l(wèi)mlSOC培養(yǎng)基的15ml聚丙烯離心管培養(yǎng)2h。效率最高達(dá)到3.0xl0g，比文獻(xiàn)報(bào)道的約高出30倍。5.感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率計(jì)算公式_平板菌落數(shù)X1xlCfagX轉(zhuǎn)化體和、X稀釋倍數(shù)pJBS61DNA的轉(zhuǎn)化量ng賜涂平板體枳實(shí)施例l:pJB861電轉(zhuǎn)化尸.KT2440如前所述，pJB861具有典型代表意義。菌體的培養(yǎng)、感受態(tài)細(xì)胞的制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方法以EM培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)菌體至OD6oo為0.6-0.75，3mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，pH-7.0)緩沖液洗滌并懸浮菌體，菌體濃縮300倍，5(Vl分裝并用于一次電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化條件1.2KV，200Q，25nF。力nlmlSOC培養(yǎng)基后，在15ml聚丙烯離心管中，30°C培養(yǎng)2h。分別轉(zhuǎn)化10，20，50和200ng的pJB861質(zhì)粒DNA，將其轉(zhuǎn)化子計(jì)數(shù)，將轉(zhuǎn)化DNA量和尸./n/"daKT2440轉(zhuǎn)化子數(shù)目之間的關(guān)系做曲線圖，見圖1。從圖中可知電轉(zhuǎn)化出的轉(zhuǎn)化子數(shù)目與電轉(zhuǎn)化用的DNA的量呈線性關(guān)系。計(jì)算pJB861的電轉(zhuǎn)化效率是2.94xl()S/Vg。實(shí)施例2:pCM132DNA電轉(zhuǎn)化尸./w"cfoKT2440pCM132DNA是較大的(11.2kb)的，含oriV復(fù)制子，能夠在一系列革蘭氏陰性菌中復(fù)制的質(zhì)粒，以之進(jìn)行電轉(zhuǎn)化條件的驗(yàn)證也具有典型代表意義。菌體的培養(yǎng)、感受態(tài)細(xì)胞的制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方法以EM培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)菌體至OD6oo為0.6-0.75，3mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES,pH-7.0)緩沖液洗滌并懸浮菌體，菌體濃縮300倍，50W分裝并用于一次電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化條件1.2KV，200Q,25pF。力卩l(xiāng)mlSOC培養(yǎng)基后，在15ml聚丙烯離心管中，30°C培養(yǎng)2h。分別轉(zhuǎn)化10，20，50和200ng的pCM132質(zhì)粒DNA，將其轉(zhuǎn)化子計(jì)數(shù)，將轉(zhuǎn)化DNA量和尸.；油WaKT2440轉(zhuǎn)化子數(shù)目之間的關(guān)系做曲線圖，見圖2。從圖中可知電轉(zhuǎn)化出的轉(zhuǎn)化子數(shù)目與電轉(zhuǎn)化用的DNA的量呈線性關(guān)系。計(jì)算pCM132的電轉(zhuǎn)化效率是2.2xl0%ig。9權(quán)利要求1一種惡臭假單胞菌KT2440高效電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，以EM培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)菌體至OD600為0.6-0.75，用3mM、pH＝7.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液洗滌并懸浮菌體；在1.2KV，200Ω，25μF條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化；電轉(zhuǎn)化后加1mlSOC培養(yǎng)基，在15ml聚丙烯離心管中，溫育30℃培養(yǎng)2h。2.如權(quán)利要求1所說的惡臭假單胞菌KT2440高效電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，其中所說的EM培養(yǎng)基的配方是，以每升計(jì)蛋白胨20.0g，酵母膏5.0g，氯化鈉5.0g，葡萄糖5.0g，pH=7.0。3.如權(quán)利要求1所說的惡臭假單胞菌KT2440高效電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，經(jīng)4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液洗滌并懸浮菌體后，菌體濃縮300倍，5(Vl分裝并用于一次電轉(zhuǎn)化。4.如權(quán)利要求1所說的惡臭假單胞菌KT2440高效電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，其中所說的SOC培養(yǎng)基的配方以每升計(jì)蛋白胨20.0g，酵母膏5.0g，氯化鈉10mM，氯化鉀2.5mM，氯化鎂10mM，硫酸鎂10mM和葡萄糖20mM。全文摘要本發(fā)明涉及惡臭假單胞菌KT2440(PseudomonasputidaKT2440)高效電轉(zhuǎn)化方法。該方法是以EM培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)菌體至OD₆₀₀為0.6-0.75，3mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，pH＝7.0)緩沖液洗滌并懸浮菌體，電轉(zhuǎn)化條件1.2KV，200Ω，25μF；電轉(zhuǎn)化后加1mlSOC培養(yǎng)基，在15ml聚丙烯離心管中，30℃培養(yǎng)2h。利用本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化效率可達(dá)3.0×10⁸/μg，比現(xiàn)有技術(shù)效率高出30倍左右。高效的電轉(zhuǎn)化效率可以保證外源基因高效的轉(zhuǎn)化至菌株；保證大分子量質(zhì)粒DNA也可以高效電轉(zhuǎn)化；在需要高效率轉(zhuǎn)化時(shí)，如隨機(jī)文庫的轉(zhuǎn)化時(shí)尤為關(guān)鍵。本發(fā)明也可為高效轉(zhuǎn)化其它假單胞桿菌提供借鑒。文檔編號(hào)C12N15/78GK101597618SQ20091003246公開日2009年12月9日申請日期2009年7月8日優(yōu)先權(quán)日2009年7月8日發(fā)明者尚廣東,楊圣勇,陳莎莎申請人:南京師范大學(xué)