一種納米級細菌纖維素膜的制備方法及應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種納米級細菌纖維素膜的制備方法及應用，屬于發(fā)酵副產(chǎn)物綜合利用技術領域。本發(fā)明所提供的方法是以經(jīng)過預處理的廢棄菌液或廢棄菌體為發(fā)酵原料，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分含量后，接種5?20％經(jīng)過活化的木葡糖酸醋桿菌進行靜態(tài)發(fā)酵獲得納米級細菌纖維素膜。本發(fā)明通過對獲得的細菌纖維素膜進行適當處理，添加面膜營養(yǎng)液，低溫封裝，從而獲得高附加值的美容面膜，該面膜服帖性、保濕性較普通的無紡布面膜效果更佳，同時，生產(chǎn)成本大幅度降低，可使面膜原料的制作成本降低99％以上，整個生產(chǎn)成本降低70％以上，具有強大的市場競爭力。
【專利說明】
一種納米級細菌纖維素膜的制備方法及應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種納米級細菌纖維素膜的制備方法及應用，屬于發(fā)酵副產(chǎn)物綜合利 用技術領域。
【背景技術】
[0002] 纖維素是地球上最為豐富的天然生物大分子物質(zhì)，是由葡萄糖分子經(jīng)過beta-1,4 糖苷鍵連接而成的多聚物，其主要來源是樹木、棉花等植物，是植物光合作用的主要產(chǎn)物。 目前，樹木、棉花來源的纖維素是造紙業(yè)、紡織業(yè)、建筑業(yè)以及化工領域中主要的原材料。地 球上每年由植物合成的纖維素達億萬噸，但合成纖維素并不是植物所獨有的功能，某些細 菌，例如木醋桿菌、根瘤菌屬、土壤桿菌屬及假單胞菌屬等能以異養(yǎng)方式更加高效地合成高 純度納米級纖維素，又稱細菌纖維素(bacterial cellulose，BC)。
[0003]植物源纖維素通常被木質(zhì)素、半纖維素等雜質(zhì)包裹，這使得高純度纖維素的提取、 精制成為工業(yè)領域的一項重大技術難題。而細菌纖維素以純纖維素的形式存在，并具有由 超微纖維組成的納米纖維網(wǎng)，纖維素直徑在幾納米到幾十納米之間，比其他植物源纖維或 人工合成纖維直徑低1~2個數(shù)量級。細菌纖維素具有純度高、結晶度高、機械強度及彈性模 量高、吸水性及生物相容性好等特點，并且可以生物降解，使其具有許多獨特的性質(zhì)和功 能，成為一種新型的生物材料，受到科學界的廣泛關注，在食品工業(yè)、醫(yī)療美容、造紙、聲學 器材和石油開采等方面有廣泛的應用潛力。
[0004] 隨著科技及經(jīng)濟水平的不斷發(fā)展，近年來在美容產(chǎn)品上品類逐漸增多，而面膜作 為一種清潔、護膚的大眾消費品，在市場上的需求量極高，并且產(chǎn)品種類也非常之多，主要 分為剝離型、粉末型、膏霜型、泡沫型、成型類面膜五種。成型類面膜較之其他幾類使用方 便，便于保存，與皮膚接觸時清爽舒適，深受消費者的喜愛。傳統(tǒng)成型類面膜的基材一般為 無紡布，通過裁剪、浸泡灌裝適量面膜營養(yǎng)液，密封而成。但由于無紡布持水能力差，容易造 成面膜營養(yǎng)液的浪費，并且服帖性差，拉伸強度低，容易損壞。
[0005] 目前，國內(nèi)外已經(jīng)有相關產(chǎn)品問世，但目前最大的問題在于產(chǎn)品售價昂貴，難以形 成大眾消費產(chǎn)品。產(chǎn)品售價之所以昂貴，主要有如下幾個原因：
[0006] (1)發(fā)酵原料成本高
[0007] 發(fā)酵原料中成本較高的成分主要是有機氮源、維生素及其他微量元素。有機氮源 主要由酵母浸膏、蛋白胨等物質(zhì)提供，按現(xiàn)在市場售價計算，酵母浸膏約為120,000/噸，蛋 白胨約為200,000/噸，配制1噸發(fā)酵液所需的氮源成本就高達2000多元，再加上碳源、其他 微量元素及設備損耗、燃油動力等費用，使納米纖維素的合成成本居高不下。據(jù)調(diào)研發(fā)現(xiàn)， 一片納米纖維素凝膠面膜售價高達1〇〇元人民幣，而用細菌纖維素凝膠膜生產(chǎn)的醫(yī)用敷料 則高達400元/片，如此高昂的產(chǎn)品售價讓很多對此有需求的消費者望而卻步。
[0008] (2)發(fā)酵周期長，機械化程度低
[0009] 細菌纖維素凝膠膜的培養(yǎng)方式為靜態(tài)培養(yǎng)，發(fā)酵周期較長，一般需要7~10才能形 成較為結實的凝膠膜。靜態(tài)培養(yǎng)方式的機械化程度較低，大部分都需要人工操作，無形中增 加了產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。
[0010] 為了解決細菌纖維素凝膠膜生產(chǎn)成本高的問題，本發(fā)明專利提出了利用發(fā)酵廢水 和廢棄微生物細胞裂解液作為一種低成本原料合成細菌纖維素凝膠膜的方法，從而降低其 原料成本;并且本發(fā)明還將獲得的細菌纖維素凝膠膜制作成美容面膜，從而生產(chǎn)出低成本 的納米纖維素凝膠面膜。通過與市場上的現(xiàn)有細菌纖維素面膜產(chǎn)品做對比，其在微觀結構、 拉伸強度、保水特性等方面沒有顯著差異，但納米纖維素凝膠膜的生產(chǎn)成本大幅降低，從而 使終端產(chǎn)品的售價能夠極大降低，滿足大眾消費的要求。
[0011] 發(fā)酵工業(yè)中會產(chǎn)生大量的廢棄菌體，如酵母菌、大腸桿菌、乳酸菌等，以啤酒發(fā)酵 工業(yè)為例，中國每生產(chǎn)1噸啤酒可附帶產(chǎn)生1~1.5kg廢棄酵母菌體。2015年中國啤酒產(chǎn)量約 為506.15億升，約產(chǎn)生50噸酵母菌體，并且啤酒產(chǎn)量還以每年約3.25%的趨勢增長，這說明 廢棄酵母的量也會越來越多，其他工業(yè)上常用的微生物廢棄菌體的產(chǎn)量同樣也在逐年遞 增。廢棄菌體富含蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類、維生素及其他微量元素，營養(yǎng)成分非常豐富，通過 對這些廢棄菌體進行適當處理，使其中的營養(yǎng)成分溶出，接種具有合成細菌纖維素能力的 微生物，能夠獲得具有高附加值的細菌纖維素凝膠薄膜，在醫(yī)用敷料、美容面膜、保健食品 等領域具有巨大的市場需求，經(jīng)濟效益明顯。在本發(fā)明中所述的低成本原料是工業(yè)上的發(fā) 酵廢水或微生物廢棄菌體，幾乎為零成本，用這些廢棄物來代替細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基，能 夠大幅度降低細菌纖維素凝膠膜的生產(chǎn)成本，從而開發(fā)出一系列經(jīng)濟實惠、性價比高的細 菌纖維素基產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種納米級細菌纖維素膜的制備方法，所采取的 技術方案如下：
[0013] 本發(fā)明的目的在于提供一種納米級細菌纖維素膜的制備方法，是以經(jīng)過預處理的 廢棄菌液或廢棄菌體為發(fā)酵原料，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分含量后，接種5-20%經(jīng)過 活化的木葡糖酸醋桿菌進行靜態(tài)發(fā)酵獲得納米級細菌纖維素膜。
[0014] 優(yōu)選地，所述經(jīng)過預處理的廢棄菌體，為經(jīng)過發(fā)酵的細菌或真菌菌體。
[0015] 優(yōu)選地，所述細菌為大腸桿菌;所述真菌菌體，為出芽短梗霉。
[0016] 所述的制備方法的步驟如下：
[0017] 1)制備種子液并活化培養(yǎng)木糖酸醋桿菌；
[0018] 2)對廢棄菌液或廢棄菌體進行預處理，獲得預處理菌液或預處理菌體；
[0019] 3)以步驟2)所得的預處理菌液或預處理菌體為發(fā)酵原料，調(diào)整碳源、氮源、微生 物、脂類和礦物質(zhì)的含量和pH至4~7,高壓滅菌后獲得發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0020] 4)向步驟3)所得的發(fā)酵培養(yǎng)基中接種5-20%步驟1)所得的木葡糖酸醋桿菌在28 ~30°C下進行靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)7~15天，發(fā)酵培養(yǎng)后獲得細菌纖維素膜。
[0021 ] 優(yōu)選地，步驟2)所述預處理菌液，步驟如下：
[0022] 1)收集發(fā)酵廢液，加入乙醇沉淀后，獲得乙醇發(fā)酵液混合物；
[0023] 2) 5000rpm條件下離心步驟1)乙醇發(fā)酵液混合物lOmin，去除菌體細胞，獲得上清 液，再于30~50°C下旋轉蒸發(fā)乙醇，獲得無醇發(fā)酵液后補充蒸餾水，獲得預處理菌液。
[0024] 優(yōu)選地，步驟2)所述預處理菌體，步驟如下：
[0025] 1)將廢棄菌液經(jīng)過離心或沉淀后，利用蒸餾水混勻所得菌泥，調(diào)成10~20% (W/V) 濃度的細胞懸浮液，再通過高壓均質(zhì)、超聲破碎或凍融處理對細胞進行破碎處理，處理后將 菌體裂解液加熱到55~75°C，勻速攪拌，保溫10_15h后獲得細胞碎片溶液；
[0026] 2)調(diào)整步驟2)所得細胞碎片溶液的溫度后加入0.01~5%的蛋白酶，混合均勻后， 水解10-15h，離心取上清液，獲得預處理菌體。
[0027]優(yōu)選地，所述高壓均質(zhì)，條件為：均質(zhì)壓力50~lOOMPa，循環(huán)均質(zhì)3~5次;所述超聲 破碎，條件為:超聲功率200~600W，超聲時間30~90s，循環(huán)次數(shù)10~30次;所述凍融處理， 條件為:將菌液煮沸5~lOmin，迅速置于冰浴中，并不斷攪拌5~lOmin，反復循環(huán)5~20次。
[0028]所述任一制備方法在制備面膜中的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0029]所述應用的步驟如下：
[0030] 1)根據(jù)權利要求1所述制備方法發(fā)酵培養(yǎng)納米細菌纖維素凝膠膜至2~5mm厚；
[0031] 2)將步驟1)所得的納米細菌纖維素凝膠膜從培養(yǎng)基中取出，用蒸餾水沖洗后，置 于1~4%(w/v)的氫氧化鈉堿液中，煮沸30-60min，去除包裹在纖維素凝膠膜表面的菌體及 培養(yǎng)基后，水洗去除堿液后根據(jù)模具將纖維素凝膠膜裁剪成型后與面膜營養(yǎng)液一同灌裝于 密封袋中，控制灌裝溫度為0~4°C，獲得納米級細菌纖維素面膜。
[0032] 優(yōu)選地，步驟2)所述面膜營養(yǎng)液，含有如下成分：
[0033]透明質(zhì)酸鈉、乙醇、吐溫-80、紅沒藥醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆異黃酮、 維生素B、維生素C和對羥基苯甲酸鈉。
[0034]本發(fā)明獲得的有益效果：
[0035] 本發(fā)明將發(fā)酵原料替換成為發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中大量排出的發(fā)酵廢水或廢棄微生物 菌體，通過對發(fā)酵廢水及廢棄菌體進行簡單的預處理，形成良好的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基， 供具有纖維素合成能力的微生物生長繁殖所用。
[0036] 本發(fā)明通過對獲得的細菌纖維素膜進行適當處理，添加面膜營養(yǎng)液，低溫封裝，從 而獲得高附加值的美容面膜，該面膜服帖性、保濕性較普通的無紡布面膜效果更佳，并且生 產(chǎn)成本大幅度降低，具有強大的市場競爭力。
【附圖說明】
[0037] 圖1細菌纖維素凝膠膜的掃描電鏡圖。
[0038] 圖2為細菌纖維素凝膠膜的紅外掃描圖。
[0039] 圖3為細菌纖維素凝膠膜的X衍射圖譜。
【具體實施方式】
[0040] 下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0041] 以下實施例所使用的試劑、材料、儀器和方法，未經(jīng)特殊說明，均為本領域常規(guī)試 劑、材料、儀器和方法，本領域技術人員均可通過商業(yè)渠道獲得。
[0042]種子液的制備：
[0043] a、種子培養(yǎng)所需的營養(yǎng)成分配方如下：
[0044] 以質(zhì)量比(w/v)表示，葡萄糖5~20 %，蛋白胨0.5~2 %，酵母膏0.5~2 %，檸檬酸 0.01 ~0.1%，Na2HP〇4 0.2~0.5%，KH2P〇4 0.1 ~0.2%，MgS〇4 0.025~0.05%，pH 4.8~ 6 ? 8，121 °C滅菌 20min。
[0045] b、種子活化方法如下：
[0046]挑取平板上的一個單菌落接種于新鮮培養(yǎng)基中，并添加0.01 %的纖維素酶，30°C， 180rpm搖床培養(yǎng)4811。5000印1]1離心10min得到菌體沉淀，無菌生理鹽水水洗3次，去除體系內(nèi) 的纖維素酶，并最后用相同體積的無菌水溶解經(jīng)過清洗的菌體，待用。
[0047]實施例1:以普魯蘭多糖發(fā)酵廢水為原料合成細菌纖維素 [0048] 1)收集普魯蘭發(fā)酵液，加入2倍體積的乙醇以使發(fā)酵液中的多糖沉淀析出， 5000rpm離心處理lOmin得到發(fā)酵液與乙醇的混合物。將上述混合物轉移至旋轉蒸發(fā)儀上進 行脫出乙醇的操作，旋蒸儀水浴溫度為40°C，在旋蒸得到的無醇發(fā)酵液中添加適量蒸餾水， 以補足因旋蒸而損失的水分。
[0049] 2)利用生物傳感器分析儀檢測上述發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖含量，調(diào)整發(fā)酵液的糖含量 為2%。如果低于2%(w/v)，則需要添加適量蔗糖，以保證菌體的正常生長;若高于2%，則需 要稀釋處理，以降低高滲透壓對菌體的影響。
[0050] 3)調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.5。
[00511 4)準確量取lOOmL上述發(fā)酵培養(yǎng)基于500mL三角瓶中，以8層紗布覆蓋瓶口，置于高 壓滅菌鍋中，121°C下滅菌15min。冷卻至室溫，接種10%新鮮木葡糖酸醋桿菌種子液，28~ 30°C，靜態(tài)培養(yǎng)9天，得到細菌纖維素凝膠膜。
[0052] 5)將獲得的細菌纖維素凝膠膜上的培養(yǎng)基用蒸餾水沖洗干凈，置于1~4% (w/v) 氫氧化鈉溶液中，煮沸l(wèi)h，以去除菌體、蛋白和粘附在纖維素膜上的殘余培養(yǎng)基;之后，用蒸 餾水反復沖洗數(shù)次，至凝膠膜表面pH為中性。將處理之后的凝膠膜置于面膜模具上，裁剪成 型。將其與面膜營養(yǎng)液一同灌裝于密封袋中，控制灌裝溫度為0~4°C，得到細菌纖維素美容 面膜。
[0053]其中，面膜營養(yǎng)液，含有如下成分：
[0054]透明質(zhì)酸鈉、乙醇、吐溫-80、紅沒藥醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆異黃酮、 維生素B、維生素C和對羥基苯甲酸鈉。
[0055] 實施例2:以普魯蘭多糖發(fā)酵廢棄菌體為原料合成細菌纖維素
[0056] 普魯蘭多糖是由出芽短梗霉經(jīng)過發(fā)酵獲得的一種多糖，出芽短梗霉又名普魯蘭酵 母，自身有細胞壁，需要對細胞進行充分的破壁才能將其中的營養(yǎng)物質(zhì)溶出，本實例采用超 聲破碎的方法進行破壁處理。
[0057] 1)收集發(fā)酵廢棄菌液，離心得菌體沉淀。添加適量蒸餾水，混勻，調(diào)制成10~20% 的菌懸液，至于超聲破碎儀上，對細胞進行物理破碎，破碎功率為400w，破碎時間30s，間隔 5s，反復20個循環(huán)，如果出現(xiàn)大量泡沫，需添加適量消泡劑以提高破碎效果。將超聲破碎之 后得到的菌懸液置于50°C水浴鍋中，添加0.01%蛋白酶以水解細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，形成不同 分子量大小的多肽或氨基酸，酶解處理時間為l〇h。酶解結束后，5000rpm離心處理lOmin，得 到的上清液即為發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0058] 2)利用生物傳感器分析儀檢測上述發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖含量，如果低于5% (w/v)， 則需要添加適量果糖，以保證菌體的正常生長;若高于5%，則需要稀釋處理，以降低高滲透 壓對菌體的影響。
[0059] 3)調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.5。
[0060] 4)準確量取lOOmL上述發(fā)酵培養(yǎng)基于500mL三角瓶中，以8層紗布覆蓋瓶口，置于高 壓滅菌鍋中，121°C下滅菌15min。冷卻至室溫，接種5%新鮮木葡糖酸醋桿菌種子液，29°C， 靜態(tài)培養(yǎng)7天，得到細菌纖維素凝膠膜。
[0061] 5)將獲得的細菌纖維素凝膠膜上的培養(yǎng)基用蒸餾水沖洗干凈，置于1~4% (w/v) 氫氧化鈉溶液中，煮沸l(wèi)h，以去除菌體、蛋白和粘附在纖維素膜上的殘余培養(yǎng)基;之后，用蒸 餾水反復沖洗數(shù)次，至凝膠膜表面pH為中性。將處理之后的凝膠膜置于面膜模具上，裁剪成 型。將其與面膜營養(yǎng)液一同灌裝于密封袋中，控制灌裝溫度為0~4°C，得到細菌纖維素美容 面膜。
[0062]其中，面膜營養(yǎng)液，含有如下成分：
[0063]透明質(zhì)酸鈉、乙醇、吐溫-80、紅沒藥醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆異黃酮、 維生素B、維生素C和對羥基苯甲酸鈉。
[0064] 實施例3:以出芽短梗霉廢棄菌體為原料合成細菌纖維素
[0065] 1)收集發(fā)酵廢棄菌液，離心得菌體沉淀。添加適量蒸餾水，混勻，調(diào)制成15 %的菌 懸液，置于高壓均質(zhì)機上，對細胞進行物理破碎，高壓均質(zhì)機的壓力為l〇〇MPa，處理時間 lOmin，處理次數(shù)3次。將高壓均質(zhì)機處理之后得到的菌懸液置于50°C水浴鍋中，添加0.01% 蛋白酶以水解細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，形成不同分子量大小的多肽或氨基酸，酶解處理時間為 15h。酶解結束后，5000rpm離心處理10min，得到的上清液即為發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0066] 2)利用生物傳感器分析儀檢測上述發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖含量，如果低于5% (w/v)， 則需要添加適量葡萄糖以補充足夠的碳源，保證菌體的正常生長;若高于5%，則需要稀釋 處理，以降低高滲透壓對菌體的影響。
[0067] 3)調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6。
[0068] 4)準確量取lOOmL上述發(fā)酵培養(yǎng)基于500mL三角瓶中，以8層紗布覆蓋瓶口，置于高 壓滅菌鍋中，121°C下滅菌15min。冷卻至室溫，接種20%新鮮木葡糖酸醋桿菌種子液，28~ 30°C，靜態(tài)培養(yǎng)10天，得到細菌纖維素凝膠膜。
[0069] 5)將獲得的細菌纖維素凝膠膜上的培養(yǎng)基用蒸餾水沖洗干凈，置于1~4% (w/v) 氫氧化鈉溶液中，煮沸l(wèi)h，以去除菌體、蛋白和粘附在纖維素膜上的殘余培養(yǎng)基;之后，用蒸 餾水反復沖洗數(shù)次，至凝膠膜表面pH為中性。將處理之后的凝膠膜置于面膜模具上，裁剪成 型。將其與面膜營養(yǎng)液一同灌裝于密封袋中，控制灌裝溫度為0~4°C，得到細菌纖維素美容 面膜。
[0070] 其中，面膜營養(yǎng)液，含有如下成分：
[0071] 透明質(zhì)酸鈉、乙醇、吐溫-80、紅沒藥醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆異黃酮、 維生素B、維生素C和對羥基苯甲酸鈉。
[0072] 實施例4:以出芽短梗霉廢棄菌體為原料合成細菌纖維素
[0073] 1)收集發(fā)酵廢棄菌液，離心得菌體沉淀。添加適量蒸餾水，混勻，調(diào)制成15 %的菌 懸液，煮沸l(wèi)〇min，迅速置于干冰冰浴中，處理時間10min;反復凍融處理次數(shù)10次。將凍融處 理之后得到的菌懸液置于50°C水浴鍋中，添加0.01%蛋白酶以水解細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，形成 不同分子量大小的多肽或氨基酸，酶解處理時間為12h。酶解結束后，5000rpm離心處理 1 Omin，得到的上清液即為發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0074] 2)利用生物傳感器分析儀檢測上述發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖含量，如果低于2% (w/v)， 則需要添加適量葡萄糖，以保證菌體的正常生長;若高于2%，則需要稀釋處理，以降低高滲 透壓對菌體的影響。
[0075] 3)調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7。
[0076] 4)準確量取100mL上述發(fā)酵培養(yǎng)基于500mL三角瓶中，以8層紗布覆蓋瓶口，置于高 壓滅菌鍋中，121°C下滅菌15min。冷卻至室溫，接種10%新鮮木葡糖酸醋桿菌種子液，28~ 30°C，靜態(tài)培養(yǎng)8天，得到細菌纖維素凝膠膜。
[0077] 5)將獲得的細菌纖維素凝膠膜上的培養(yǎng)基用蒸餾水沖洗干凈，置于1~4% (w/v) 氫氧化鈉溶液中，煮沸l(wèi)h，以去除菌體、蛋白和粘附在纖維素膜上的殘余培養(yǎng)基;之后，用蒸 餾水反復沖洗數(shù)次，至凝膠膜表面pH為中性。將處理之后的凝膠膜置于面膜模具上，裁剪成 型。將其與面膜營養(yǎng)液一同灌裝于密封袋中，控制灌裝溫度為0~4°C，得到細菌纖維素美容 面膜。
[0078]其中，面膜營養(yǎng)液，含有如下成分：
[0079]透明質(zhì)酸鈉、乙醇、吐溫-80、紅沒藥醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆異黃酮、 維生素B、維生素C和對羥基苯甲酸鈉。
[0080] 實施例5:以大腸桿菌廢棄菌體為原料合成細菌纖維素
[0081] 大腸桿菌是重要的發(fā)酵工業(yè)用菌，主要用來合成氨基酸、多肽、酶等重要的工業(yè)化 合物，每年會產(chǎn)生大量廢棄菌體。本實施例將采用大腸桿菌廢棄菌體為原料，通過接種木葡 糖酸醋桿菌合成細菌纖維素凝膠膜，并將其制作成美容面膜。具體操作步驟如下：
[0082] 1)收集發(fā)酵廢棄菌液，離心得菌體沉淀。添加適量蒸餾水，混勻，調(diào)制成30%的菌 懸液，煮沸5min，迅速置于干冰冰浴中，處理時間5min;反復凍融處理次數(shù)5次。將凍融處理 之后得到的菌懸液置于55°C水浴鍋中，添加0.01%蛋白酶以水解細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，形成不 同分子量大小的多肽或氨基酸，酶解處理時間為14h。酶解結束后，5000rpm離心處理lOmin， 得到的上清液即為發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0083] 2)利用生物傳感器分析儀檢測上述發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖含量，如果低于2% (w/v)， 則需要添加適量果糖，以保證菌體的正常生長;若高于2%，則需要稀釋處理，以降低高滲透 壓對菌體的影響。
[0084] 3)調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.5。
[0085] 4)準確量取50mL上述發(fā)酵培養(yǎng)基于500mL三角瓶中，以8層紗布覆蓋瓶口，置于高 壓滅菌鍋中，121°C下滅菌15min。冷卻至室溫，接種15%新鮮木葡糖酸醋桿菌種子液，28~ 30°C，靜態(tài)培養(yǎng)7天，得到細菌纖維素凝膠膜。
[0086] 5)將獲得的細菌纖維素凝膠膜上的培養(yǎng)基用蒸餾水沖洗干凈，置于1~4% (w/v) 氫氧化鈉溶液中，煮沸l(wèi)h，以去除菌體、蛋白和粘附在纖維素膜上的殘余培養(yǎng)基;之后，用蒸 餾水反復沖洗數(shù)次，至凝膠膜表面pH為中性。將處理之后的凝膠膜置于面膜模具上，裁剪成 型。將其與面膜營養(yǎng)液一同灌裝于密封袋中，控制灌裝溫度為0~4°C，得到細菌纖維素美容 面膜。
[0087]其中，面膜營養(yǎng)液，含有如下成分：
[0088]透明質(zhì)酸鈉、乙醇、吐溫-80、紅沒藥醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆異黃酮、 維生素B、維生素C和對羥基苯甲酸鈉。
[0089]實施例6:以大腸桿菌廢棄菌體為原料合成細菌纖維素
[0090] 1)收集發(fā)酵廢棄菌液，離心得菌體沉淀。添加適量蒸餾水，混勻，調(diào)制成40 %的菌 懸液，置于高壓均質(zhì)機上，對細胞進行物理破碎，高壓均質(zhì)機的壓力為50MPa，處理時間 20min，處理次數(shù)5次。將高壓均質(zhì)機處理之后得到的菌懸液置于50°C水浴鍋中，添加0.03% 蛋白酶以水解細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，形成不同分子量大小的多肽或氨基酸，酶解處理時間為 llh。酶解結束后，5000rpm離心處理lOmin，得到的上清液即為發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0091] 2)利用生物傳感器分析儀檢測上述發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖含量，如果低于5% (w/v)， 則需要添加適量蔗糖，以保證菌體的正常生長;若高于5%，則需要稀釋處理，以降低高滲透 壓對菌體的影響。
[0092] 3)調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7。
[0093] 4)準確量取lOOmL上述發(fā)酵培養(yǎng)基于500mL三角瓶中，以8層紗布覆蓋瓶口，置于高 壓滅菌鍋中，121°C下滅菌15min。冷卻至室溫，接種10%新鮮木葡糖酸醋桿菌種子液，28~ 30°C，靜態(tài)培養(yǎng)10天，得到細菌纖維素凝膠膜。
[0094] 5)將獲得的細菌纖維素凝膠膜上的培養(yǎng)基用蒸餾水沖洗干凈，置于1~4% (w/v) 氫氧化鈉溶液中，煮沸l(wèi)h，以去除菌體、蛋白和粘附在纖維素膜上的殘余培養(yǎng)基;之后，用蒸 餾水反復沖洗數(shù)次，至凝膠膜表面pH為中性。將處理之后的凝膠膜置于面膜模具上，裁剪成 型。將其與面膜營養(yǎng)液一同灌裝于密封袋中，控制灌裝溫度為0~4°C，得到細菌纖維素美容 面膜。
[0095]其中，面膜營養(yǎng)液，含有如下成分：
[0096]透明質(zhì)酸鈉、乙醇、吐溫-80、紅沒藥醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆異黃酮、 維生素B、維生素C和對羥基苯甲酸鈉。
[0097]實施例7:以大腸桿菌廢棄菌體為原料合成細菌纖維素
[0098] 1)收集發(fā)酵廢棄菌液，離心得菌體沉淀。添加適量蒸餾水，混勻，調(diào)制成30 %的菌 懸液，至于超聲破碎儀上，對細胞進行物理破碎，破碎功率為400w，破碎時間50s，間隔5s，反 復20個循環(huán)，如果出現(xiàn)大量泡沫，需添加適量消泡劑以提高破碎效果。將超聲破碎之后得到 的菌懸液置于50°C水浴鍋中，添加0.01%蛋白酶以水解細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，形成不同分子量 大小的多肽或氨基酸，酶解處理時間為l〇h。酶解結束后，5000rpm離心處理lOmin，得到的上 清液即為發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0099] 2)利用生物傳感器分析儀檢測上述發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖含量，如果低于2% (w/v)， 則需要添加適量蔗糖，以保證菌體的正常生長;若高于2%，則需要稀釋處理，以降低高滲透 壓對菌體的影響。
[0100] 3)調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5。
[0101] 4)準確量取100mL上述發(fā)酵培養(yǎng)基于500mL三角瓶中，以8層紗布覆蓋瓶口，置于高 壓滅菌鍋中，121°C下滅菌15min。冷卻至室溫，接種20%新鮮木葡糖酸醋桿菌種子液，28~ 30°C，靜態(tài)培養(yǎng)7天，得到細菌纖維素凝膠膜。
[0102] 5)將獲得的細菌纖維素凝膠膜上的培養(yǎng)基用蒸餾水沖洗干凈，置于1~4% (w/v) 氫氧化鈉溶液中，煮沸l(wèi)h，以去除菌體、蛋白和粘附在纖維素膜上的殘余培養(yǎng)基;之后，用蒸 餾水反復沖洗數(shù)次，至凝膠膜表面pH為中性。將處理之后的凝膠膜置于面膜模具上，裁剪成 型。將其與面膜營養(yǎng)液一同灌裝于密封袋中，控制灌裝溫度為0~4°C，得到細菌纖維素美容 面膜。
[0103]其中，面膜營養(yǎng)液，含有如下成分：
[0104] 透明質(zhì)酸鈉、乙醇、吐溫-80、紅沒藥醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆異黃酮、 維生素B、維生素C和對羥基苯甲酸鈉。
[0105] 實施例8
[0106] 市場上目前所售的細菌纖維素面膜生產(chǎn)原料大部分是由葡萄糖、酵母浸粉、蛋白 胨、維生素及其他微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)組成的微生物培養(yǎng)基獲得，配制1L微生物發(fā)酵液大 約需要20g葡萄糖，10g酵母浸粉、20g蛋白胨及少量維生素和微量元素，成本大約10-11元人 民幣，而采用廢棄發(fā)酵液或廢棄微生物菌體為原料，所需成本約為0.1-0.5元，因此可大大 降低細菌纖維素的原料成本。面膜質(zhì)量最關鍵的技術指標是拉伸強度，如果拉伸強度低，則 很容易損壞。本實施例對前面實施例1-7所得的細菌纖維素面膜的機械強度、微觀結構進行 了檢測，結果如表1和圖1-3所示。
[0107] 表1細菌纖維素凝膠膜的機械強度
[0109] 從表1可知，與市場上某品牌面膜相比，采用本發(fā)明所述的低成本原料所得到的面 膜，在彈性模量、斷裂伸長率、拉伸斷裂應力、拉伸強度及拉伸屈服應力幾個指標上沒有明 顯的差別。尤其是實施例3所得到的細菌纖維素膜，其彈性模量最大，達到3917.9MPa，這說 明其機械強度大，不易損壞，能夠降低產(chǎn)品的廢品率。
[0110] 圖1-3是對細菌纖維素微觀結構的觀察，通過圖1可以看出采用本發(fā)明所述的方法 得到的細菌纖維素纖維直徑約為〇.〇5wn，并且纖維絲互相交錯，形成了堅固緊密的三圍納 米網(wǎng)狀結構，能夠很好的鎖住水分及其他營養(yǎng)因子，使面膜中的營養(yǎng)成分很好的保留其中。 圖2是本發(fā)明所得細菌纖維素與標準纖維素分子的紅外掃描圖譜對比，從圖中可以看出纖 維素的特征官能團，從而從分子水平確定了產(chǎn)品結構。圖3是細菌纖維素的x衍射圖譜，從圖 中的兩個特征峰也能證明所得的產(chǎn)品為纖維素分子。
[0111] 由此可知，本發(fā)明所提供的制備方法在保證面膜質(zhì)量效果的情況下，大幅降低了 原料成本，可使納米纖維素面膜的原料成本降低99%以上。生產(chǎn)成本降低70%以上。
[0112] 雖然本發(fā)明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此 技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以做各種改動和修飾，因此本發(fā)明的保護 范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種納米級細菌纖維素膜的制備方法，其特征在于，以經(jīng)過預處理的廢棄菌液或廢 棄菌體為發(fā)酵原料，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分含量后，接種5-20%經(jīng)過活化的木葡糖 酸醋桿菌進行靜態(tài)發(fā)酵獲得納米級細菌纖維素膜。2. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述經(jīng)過預處理的廢棄菌體，為經(jīng)過發(fā) 酵的細菌或真菌菌體。3. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述細菌為大腸桿菌;所述真菌菌體，為 出芽短梗霉。4. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟如下： 1) 制備種子液并活化培養(yǎng)木糖酸醋桿菌； 2) 對廢棄菌液或廢棄菌體進行預處理，獲得預處理菌液或預處理菌體； 3) 以步驟2)所得的預處理菌液或預處理菌體為發(fā)酵原料，調(diào)整碳源、氮源、微生物、月旨 類和礦物質(zhì)的含量和pH至4~7，高壓滅菌后獲得發(fā)酵培養(yǎng)基； 4) 向步驟3)所得的發(fā)酵培養(yǎng)基中接種5-20%步驟1)所得的木葡糖酸醋桿菌在28~30 °C下進行靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)7~15天，發(fā)酵培養(yǎng)后獲得細菌纖維素膜。5. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述預處理菌液，步驟如下： 1) 收集發(fā)酵廢液，加入乙醇沉淀后，獲得乙醇發(fā)酵液混合物； 2) 5000rpm條件下離心步驟1)乙醇發(fā)酵液混合物lOmin，去除菌體細胞，獲得上清液，再 于30~50°C下旋轉蒸發(fā)乙醇，獲得無醇發(fā)酵液后補充蒸餾水，獲得預處理菌液。6. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述預處理菌體，步驟如下： 1) 將廢棄菌液經(jīng)過離心或沉淀后，利用蒸餾水混勻所得菌泥，調(diào)成10~20% (W/V)濃度 的細胞懸浮液，再通過高壓均質(zhì)、超聲破碎或凍融處理對細胞進行破碎處理，獲得細胞碎片 溶液； 2) 調(diào)整步驟2)所得細胞碎片溶液的溫度后加入0.01%的蛋白酶，混合均勻后，水解ΙΟ-? 5h ， 離心取上清液 ，獲得預處理菌體。7. 如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述高壓均質(zhì)，條件為：均質(zhì)壓力50~ lOOMPa，循環(huán)均質(zhì)3~5次;所述超聲破碎，條件為:超聲功率200~600W，超聲時間30~90s， 循環(huán)次數(shù)10~30次;所述凍融處理，條件為:將菌液煮沸5~lOmin，迅速置于冰浴中，并不斷 攪拌5~lOmin，反復循環(huán)5~20次。8. 權利要求1-7所述任一制備方法在制備面膜中的應用。9. 如權利要求8所述應用，其特征在于，步驟如下： 1) 根據(jù)權利要求1所述制備方法發(fā)酵培養(yǎng)納米細菌纖維素凝膠膜至2~5mm厚； 2) 將步驟1)所得的納米細菌纖維素凝膠膜從培養(yǎng)基中取出，用蒸餾水沖洗后，置于1~ 4%(w/v)的氫氧化鈉堿液中，煮沸30-60min，去除包裹在纖維素凝膠膜表面的菌體及培養(yǎng) 基后，水洗去除堿液后根據(jù)模具將纖維素凝膠膜裁剪成型后與面膜營養(yǎng)液一同灌裝于密封 袋中，控制灌裝溫度為0~4°C，獲得納米級細菌纖維素面膜。10. 如權利要求9所述應用，其特征在于，步驟2)所述面膜營養(yǎng)液，含有如下成分:透明 質(zhì)酸鈉、乙醇、吐溫-80、紅沒藥醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆異黃酮、維生素 B、維生 素 C和對羥基苯甲酸鈉。
【文檔編號】A61K8/02GK105821094SQ201610250934
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月21日
【發(fā)明人】咸漠, 趙宏偉, 王紀明, 張海波
【申請人】中國科學院青島生物能源與過程研究所