專(zhuān)利名稱(chēng)：反相高效液相色譜法分離多黏菌素e甲磺酸鈉及其類(lèi)似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種色譜分離分析方法，具體是一種分離分析多黏菌素E甲磺酸鈉及 其異構(gòu)體或類(lèi)似物的高效液相色譜(HPLC)方法，屬于藥物分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
很多嚴(yán)重的感染是由具有很強(qiáng)耐藥性的綠膿假單胞菌引起的，而多黏菌素類(lèi)藥物 對(duì)該類(lèi)感染的致病菌具有較好的抑制效果。自從硫酸多黏菌素類(lèi)化合物于1947年從不同 種類(lèi)的多黏芽孢桿菌提取得到，就被應(yīng)用于體外抗菌實(shí)驗(yàn)中。但由于其毒副作用較大，應(yīng)用 并未得到普遍推廣。而以其作為原料合成的多黏菌素E甲磺酸鈉則較其毒性低，且抑菌效 果不減。而目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)對(duì)該類(lèi)藥物的分析方法，因此，對(duì)該類(lèi)藥物的分析研究成為當(dāng)前 一項(xiàng)具有重要意義的工作。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于填補(bǔ)目前國(guó)內(nèi)對(duì)于多黏菌素E甲磺酸鈉及其異構(gòu)體或類(lèi)似物 的分離及分析方法的空白，提供一種能準(zhǔn)確的分離分析多黏菌素E甲磺酸鈉及其異構(gòu)體或 類(lèi)似物的高效液相色譜方法，從而對(duì)該類(lèi)藥物進(jìn)行分離分析研究。
本發(fā)明方法的特征是液相色譜條件為以烷基鍵合硅膠填充柱為固定相，流動(dòng)相 為有機(jī)溶劑和酸的水溶液組成的混合溶劑。
當(dāng)以烷基鍵合硅膠填充柱為固定相時(shí)，優(yōu)化條件為C18烷基鍵合硅膠填充柱。更 優(yōu)為Optimapak C18烷基鍵合硅膠填充柱。
當(dāng)流動(dòng)相為有機(jī)溶劑和酸的水溶液組成的混合溶劑時(shí)，有機(jī)溶劑可以為乙腈、甲 醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、四氫呋喃、丙酮，或上述兩種及兩種以上有機(jī)溶劑的混合物等，酸 可以為鹽酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、烷基磺酸、苯磺酸、取代苯磺酸、五氟丙酸、 七氟丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、十五氟辛酸或上述兩種及兩種以上酸的混 合物等，混合溶劑組成的體積比為有機(jī)溶劑酸的水溶液3 97 80 20。優(yōu)化條件為 流動(dòng)相中有機(jī)溶劑和酸的水溶液組成的混合溶劑體積比為15 85 50 50。更優(yōu)化條 件為在10 20分鐘內(nèi)，混合溶劑組成的體積比(乙腈三氟乙酸水溶液)在15 85 60 40內(nèi)線性變化，其中三氟乙酸的體積濃度為0.05% 1%。等度洗脫的優(yōu)化條件為混 合溶劑中乙腈三氟乙酸水溶液體積比為20 80 45 55。
下面通過(guò)以下的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
1.分離目標(biāo)
分離目標(biāo)為合成多黏菌素E甲磺酸鹽過(guò)程中所產(chǎn)生的多黏菌素E甲磺酸鹽及其類(lèi) 似物，多肽硫酸鹽結(jié)構(gòu)式見(jiàn)附

圖1，多黏菌素E甲磺酸鹽的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)附圖2。
2.多黏菌素E甲磺酸鈉供試品溶液制備
多黏菌素E甲磺酸鈉極易溶于水，因此確定了標(biāo)準(zhǔn)品的制備首先選用水溶解，然 后以適量的乙腈定容。優(yōu)選流動(dòng)相來(lái)溶解標(biāo)準(zhǔn)品。
3.高效液相色譜條件
(1)色譜柱選擇確定
選用烷基鍵合硅膠固定相為分離介質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，比較了 Agela公司C18、C8、C4烷 基鍵合硅膠填料柱，Agilent公司C18、C8、C4烷基鍵合硅膠填料柱，Waters公司C18、C8、 C4烷基鍵合硅膠填料柱，Shimadzu公司C18、C8、C4烷基鍵合硅膠填料柱，Optimapak公司 C18、C8、C4烷基鍵合硅膠柱等。確定了 C18柱有較好的分離效果，以O(shè)ptimapak公司C18烷 基鍵合硅膠填充柱(150X4. 6mm i. d，5 μ m，pH范圍2. 0 8. 0)為優(yōu)，因此選用Optimapak 公司C18柱。
(2)檢測(cè)方法確定
多黏菌素E甲磺酸鈉具有紫外吸收，因此可用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。樣品分別溶于水、 該方法采用的流動(dòng)相來(lái)測(cè)定其紫外光譜，數(shù)據(jù)見(jiàn)表一。對(duì)比這兩個(gè)波長(zhǎng)檢測(cè)的HPLC譜圖， 以波長(zhǎng)214nm波長(zhǎng)圖譜的吸收更明顯，因此確定用紫外檢測(cè)法波長(zhǎng)選用212 216nm。此 外，還可用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)。
表一多黏菌素E甲磺酸鈉紫外光譜數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種分離多黏菌素E甲磺酸鈉及其異構(gòu)體或類(lèi)似物的高效液相分析方法，其特征是 以烷基鍵合硅膠填充柱為固定相，以有機(jī)溶劑和水組成的混合溶劑為流動(dòng)相，進(jìn)行等度或 梯度洗脫，用紫外檢測(cè)器或蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所說(shuō)高效液相色譜方法，其特征是利用烷基鍵合硅膠填充柱為固定 相，優(yōu)化條件為以已知的各類(lèi)型商品化碳18烷基鍵合硅膠填料為固定相，優(yōu)化的固定相填 料粒徑為1. 5 10 μ m，更優(yōu)為的optimapak碳18烷基鍵合硅膠填料。分析柱柱長(zhǎng)為3 50cm，更為優(yōu)化的柱長(zhǎng)為15 25cm。
3.如權(quán)利要求1所說(shuō)高效液相色譜方法，其特征是有機(jī)溶劑和酸的水溶液組成的混合 溶劑，其中有機(jī)溶劑可以為乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、四氫呋喃、丙酮，或上述兩種 及兩種以上有機(jī)溶劑的混合物；酸可以為鹽酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、烷基磺 酸、苯磺酸、取代苯磺酸、五氟丙酸、七氟丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、十五氟 辛酸或上述兩種及兩種以上酸的混合物。
4.如權(quán)利要求1所說(shuō)高效液相色譜方法，其特征在于流動(dòng)相所用水為脫鹽水，流動(dòng)相 經(jīng)0. 45 μ m的濾膜過(guò)濾。所用高效液相色譜的操作條件為色譜柱=Optimapak碳18烷基 鍵合硅膠填充柱[(150 250) X (2. 1 4. 6)謹(jǐn)i. d，2 10 μ m]，流速為0. 2 1. Oml/ min，檢測(cè)波長(zhǎng)為205 225nm，PH為1. 0 10. 0，溫度為0 60°C。更優(yōu)化為色譜柱 optimapak碳18烷基鍵合硅膠填充柱[(150 250) X O. 1 4. 6)] mm i. d，2 5μπι)，流 速為0. 8ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為:214nm, PH為1. 5 8，溫度為常溫。
5.如權(quán)利要求1所說(shuō)高效液相色譜方法，其特征為梯度洗脫條件為梯度變化時(shí)間為 5 80分鐘，混合溶劑組成的體積比為有機(jī)溶劑酸水溶液3 97 80 20 ；線性洗脫 條件為有機(jī)溶劑酸水溶液15 85 50 50?；旌先軇┲兴岬馁|(zhì)量濃度為0.01% 5%。更為優(yōu)化的洗脫條件為梯度變化時(shí)間為10 20分鐘，混合溶劑組成的體積比為乙 腈三氟乙酸水溶液15 85 60 40，三氟乙酸的濃度為0.05% 1%。
6.如權(quán)利要求3所說(shuō)高效液相色譜方法，其特征為在上述的混合溶劑中也可以添加表 面活性劑，如二乙胺、三乙胺、季銨鹽、磺酸鹽等。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用烷基鍵合硅膠填充柱成功分離及分析多黏菌素E甲磺酸鈉及其異構(gòu)體或類(lèi)似物的方法。本發(fā)明方法的特征是液相色譜條件為以烷基鍵合硅膠填充柱為固定相，流動(dòng)相為有機(jī)溶劑和酸的水溶液組成的混合溶劑。其中以O(shè)ptimapak公司的C18烷基鍵合硅膠填充柱為固定相，乙睛與0.05％三氟乙酸水溶液梯度(體積比20∶80～50∶50)洗脫時(shí)，達(dá)到了好的分離效果。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102033111SQ20091017410
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2009年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月24日
發(fā)明者楊更亮, 楊靜, 白立改, 閆宏遠(yuǎn), 馬正月 申請(qǐng)人:楊更亮