專利名稱：一種利用rp-hplc分析氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于儀器分析技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種利用反相高效液相色譜儀對(duì)樣品 中游離氨基酸進(jìn)行分析的方法。
背景技術(shù)：
迄今為止，自然界中已發(fā)現(xiàn)180多種氨基酸，其中參與蛋白質(zhì)合成的氨基酸只有 20多種，稱為基本氨基酸。由于氨基酸分析在蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)、食品科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等 領(lǐng)域的研究中起著重要的作用，因此，對(duì)氨基酸分析方法的研究與改進(jìn)得到人們高度重視。 1958年，Spackman等首先提出了用陽離子交換色譜與柱后茚三酮衍生結(jié)合的方法分析蛋 白質(zhì)中的氨基酸，實(shí)現(xiàn)了氨基酸分析的自動(dòng)化，該方法就是氨基酸分析儀，但傳統(tǒng)的氨基酸 分析儀結(jié)構(gòu)復(fù)雜，價(jià)格昂貴，而且一般都不能作其他分析使用。氨基酸含量檢測(cè)主要應(yīng)用氨基酸自動(dòng)分析儀和高效液相色譜(HPLC)。隨著HPLC 的發(fā)展，使用HPLC技術(shù)分析氨基酸獲得迅速發(fā)展，由于HPLC技術(shù)無需特殊反應(yīng)裝置，具有 高效、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，已在許多實(shí)驗(yàn)室部分或全部代替了氨基酸自動(dòng) 分析儀，廣泛應(yīng)用于多種生物樣品內(nèi)氨基酸的檢測(cè)。HPLC測(cè)定氨基酸的方法也很多，反相高 效液相色譜(RP-HPLC)檢測(cè)氨基酸的柱前衍生試劑就有近10種。呂艷等在《浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)》2006年第2期的“反相高效液相色譜定量分析多肽中 的氨基酸組成”中公開了蛋白質(zhì)中氨基酸的檢測(cè)方法，部安珍在《安徽大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué) 版)》1991年第3期的“ΟΡΑ柱前衍生法用于反相高效液相色譜分析氨基酸”公開了細(xì)胞色 素C酶解產(chǎn)物中氨基酸的檢測(cè)，上述文獻(xiàn)中公開的方法在定量和定性檢測(cè)氨基酸的時(shí)候都 具有缺陷，呂艷等的方法不能分析全部的氨基酸，對(duì)氨基酸分析的種類具有局限性，而鄔安 珍的方法同樣是不能對(duì)所有的氨基酸進(jìn)行分析，其方法也存在局限性。本發(fā)明為克服現(xiàn)有方法的缺陷，提供了一種新的氨基酸分析方法。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種利用反相高效液相色譜儀對(duì)樣品中游離 氨基酸進(jìn)行定性、定量分析的方法，該方法包括如下步驟首先對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，然后對(duì)樣品中的半胱氨酸的-SH進(jìn)行保護(hù)，然后利用衍 生試劑OPA(鄰苯二甲醛)和FMOC(氯甲酸芴甲酯)分別對(duì)一級(jí)、二級(jí)氨基酸進(jìn)行柱前衍生 化處理，然后進(jìn)行反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析。其中一級(jí)氨基酸是指天門冬氨酸，谷氨酸，天門冬酰胺，絲氨酸，谷氨酰胺，組氨 酸，甘氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，瓜氨酸，精氨酸，丙氨酸，酪氨酸，胱氨酸，纈氨酸，蛋氨酸，正 纈氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，異亮氨酸，亮氨酸或賴氨酸。二級(jí)氨基酸是指羥脯氨酸，肌氨酸 或脯氨酸。上述方法中，對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理的步驟為對(duì)樣品溶液進(jìn)行離心，取上清液加入三氯乙酸，放于低溫靜置，再離心，取上清液過0. 2-0. 45um微孔濾膜，得樣品處理液；上述方法中，對(duì)半胱氨酸的-SH進(jìn)行保護(hù)的步驟為將上述處理液與DTDPA反應(yīng)，得保護(hù)液。更具體地的步驟是將上述處理液1份加 入1-5份的DTDPA溶液，混勻，置60-100°C水浴中加熱反應(yīng)0. 5-2小時(shí)，得保護(hù)液。上述方法中，柱前衍生化處理步驟為用1-5倍保護(hù)液的ΟΡΑ、FMOC對(duì)保護(hù)液進(jìn)行衍生，得柱前衍生處理液。上述方法中，反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析指是指通過流動(dòng)相梯度洗脫，進(jìn) 行雙波長(zhǎng)檢測(cè)柱前衍生處理液，洗脫和檢測(cè)的條件為色譜柱C18或C8反相色譜柱流動(dòng)相A 體積比為92-98 8_2的0. lmol/L醋酸鈉-乙氰溶液流動(dòng)相B 體積比為3-6 2-1的乙氰-水溶液洗脫液流速0.5-2ml/min流動(dòng)相的洗脫如表1 表1 流動(dòng)相梯度洗脫表檢測(cè)波長(zhǎng)338nm ( 一級(jí)氨基酸)，262nm ( 二級(jí)氨基酸)。具體地，上述反相高效液相色譜分析的條件是檢測(cè)是利用二極管陣列檢測(cè)器，OPA是指鄰苯二甲醛，其濃度為2. 5mg/ml,FM0C是 指氯甲酸芴甲酯，其濃度為10mg/ml，DTDPA是指3，3' _2_硫代-2-丙酸，其濃度為0. Ig/ ml, pH 為 10. 0。一級(jí)氨基酸是指如下表3中的1-22號(hào)氨基酸，二級(jí)氨基酸是指23-25號(hào)氨基酸。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種利用反相高效液相色譜儀對(duì)樣品中游離氨基酸進(jìn)行定 性、定量分析的方法，該方法包括如下步驟(1)取樣品溶液適量，以4000r/min離心10-30min，取上清液，加入適量三氯乙酸， 放于0-10°C靜置0. 5-2h，再以離心處理，取上清液適量，過0. 2um-0. 45um微孔濾膜，得樣品
處理液。(2)取上述步驟⑴得到的樣品處理液1份，加入DTDPA溶液1-3份，混勻，置 60-100°C水浴加熱0. 5-2小時(shí)，得保護(hù)液。(3)吸取步驟⑵得到的保護(hù)液1份，吸取1-3份0ΡΑ，混合，再吸取1_3份FM0C， 混合，再吸取50-100份水，混合，得柱前衍生處理液。(4)梯度洗脫和檢測(cè)洗脫液流動(dòng)相A 醋酸鈉乙氰=92-98 8_2，調(diào)pH值至6_10 ；流動(dòng)相B 乙 氰水=3-6 2-1 ；洗脫液流速0·5-2ml/min
色譜柱C18或C8反相色譜柱洗脫時(shí)間和濃度如下表2: 表2 流動(dòng)相梯度洗脫表檢測(cè)采取雙波長(zhǎng)檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為檢測(cè)一級(jí)氨基酸的波長(zhǎng)為338nm，檢測(cè)二級(jí)氨基酸的波長(zhǎng)為262nm，定性、定量分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，定性定量分析樣品液中的游離氨基酸。更具體地，本發(fā)明提供了一種利用反相高效液相色譜儀對(duì)樣品中游離氨基酸進(jìn)行 定性、定量分析的方法，該方法包括如下步驟取樣品溶液50ml，以4000r/min離心lOmin，取上清液25ml，加入25ml三氯乙酸 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% )，放于4°C靜置2h，再以4000r/min離心lOmin，取上清液2ml，過0. 2um微 孔濾膜；取上述處理液0. 5ml，加入濃度為0. lg/ml, pH為10. O的DTDPA溶液0. 5ml，混勻， 置80°C水浴加熱1小時(shí)；配置流動(dòng)相A :0. lmol/L醋酸鈉乙氰=93 7，調(diào)PH值至6. 5 ； 流動(dòng)相B:乙氰水=4 1 ；設(shè)置自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行柱前衍生吸取樣品0.5ul，吸取0.5ul 的濃度為2. 5mg/ml的0ΡΑ，混合，吸取0. 5ul的濃度為10mg/ml的FMOC加入混合，再吸取水 32ul加入混合，進(jìn)樣；梯度洗脫條件為色譜柱C18反相色譜柱；洗脫液流速2ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為338nm和262nm。有益效果本發(fā)明的方法使用的系統(tǒng)配置是標(biāo)準(zhǔn)的液相配置，除氨基酸分析外，還可用于其 他分析工作，且具有檢測(cè)靈敏度高、樣品處理簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、分析結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好等 特點(diǎn)。本方法可對(duì)樣品液中25種游離氨基酸同步檢出，特別是對(duì)半胱氨酸先采用DTDPA 進(jìn)行-SH保護(hù)后再與其他氨基酸一起進(jìn)行同步衍生，檢測(cè)的種類多，效率高。附圖簡(jiǎn)述

圖1 :25種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品分離色譜1是采用實(shí)施例1的方法對(duì)25種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品分離色譜圖，圖1中的1-25個(gè) 數(shù)字代表每種氨基酸的峰號(hào)，具體的峰號(hào)對(duì)應(yīng)的氨基酸及其縮寫如下表3 表3 峰號(hào)、氨基酸和縮寫對(duì)照表
具體實(shí)施例方式
取樣品溶液50ml，以4000r/min離心lOmin，取上清液25ml，加入25ml三氯乙酸 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% )，放于4°C靜置2h，再以4000r/min離心lOmin，取上清液2ml，過0. 2um微 孔濾膜；取上述處理液0. 5ml，加入濃度為0. lg/ml, pH為10. O的DTDPA溶液0. 5ml，混勻， 置80°C水浴加熱1小時(shí)；配置流動(dòng)相A 0. lmol/L醋酸鈉乙氰=93 7，調(diào)PH值至6. 5 ； 流動(dòng)相B:乙氰水=4 1 ；設(shè)置自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行柱前衍生吸取樣品0.5ul，吸取0.5ul 的濃度為2. 5mg/ml的0PA，混合，吸取0. 5ul的濃度為10mg/ml的FMOC加入混合，再吸取水 32ul加入混合，進(jìn)樣；按照如下表4進(jìn)行梯度洗脫
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條件為色譜柱C18反相色譜柱洗脫液流速2ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)338nm、262nm利用本方法分析的氨基酸種類參見說明書附圖1和附圖1的簡(jiǎn)述。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過具體的實(shí)施例進(jìn)行了描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本發(fā) 明的內(nèi)容適當(dāng)改變?cè)稀⒐に嚄l件等環(huán)節(jié)來實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的其它目的，其相關(guān)改變都沒有脫離 本發(fā)明的內(nèi)容，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，都被視為 包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種利用RP HPLC分析氨基酸的方法，該方法包括如下步驟取樣品溶液50ml，以4000r/min離心10min，取上清液25ml，加入25ml三氯乙酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％)，放于4℃靜置2h，再以4000r/min離心10min，取上清液2ml，過0.2um微孔濾膜；取上述處理液0.5ml，加入濃度為0.1g/ml，pH為10.0的DTDPA溶液0.5ml，混勻，置80℃水浴加熱1小時(shí)；配置流動(dòng)相A0.1mol/L醋酸鈉∶乙氰＝93∶7，調(diào)PH值至6.5；流動(dòng)相B乙氰∶水＝4∶1；設(shè)置自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行柱前衍生吸取樣品0.5ul，吸取0.5ul的濃度為2.5mg/ml的OPA，混合，吸取0.5ul的濃度為10mg/ml的FMOC加入混合，再吸取水32ul加入混合，進(jìn)樣；梯度洗脫條件為色譜柱C18反相色譜柱；洗脫液流速2ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為338nm和262nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用RP-HPLC分析氨基酸的方法，該方法包括步驟取樣品溶液50ml，以4000r/min離心10min，取上清液25ml，加入25ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的三氯乙酸，放于4℃靜置2h，再以4000r/min離心10min，取上清液2ml，過0.2μm微孔濾膜；取上述處理液0.5ml，加入DTDPA溶液0.5ml，混勻，置80℃水浴加熱1小時(shí)得保護(hù)液；設(shè)置自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行柱前衍生吸取保護(hù)液0.5μl，吸取0.5μl的OPA，混合，吸取0.5μl的FMOC加入混合，再吸取水32μl加入混合，進(jìn)樣，梯度洗脫和檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N30/89GK101907615SQ201010221070
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月8日
發(fā)明者鄧?yán)? 邢海鵬, 郝學(xué)財(cái) 申請(qǐng)人:天津春發(fā)食品配料有限公司