專利名稱：發(fā)酵法合成多粘菌素b的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵法生物合成多粘菌素B的方法。
技術(shù)背景多粘菌素是由多粘芽孢桿菌"a"7/w;w/;^;;xa)產(chǎn)生的，由多種氨基 酸和脂肪酸組成的一族堿性環(huán)多肽類抗生素的總稱。研究到目前為止己發(fā) 現(xiàn)多粘菌素A、 B、 C、 D、 E 、 M等多個組分中，其中只有多粘菌素B (polymyxinB簡稱polymyxin)、多粘菌素E (polymyxinE簡稱Colistin)具 有較低的毒性及良好的抗菌活力。因此對多粘菌素B和多粘菌素E研究相 對較多，且目前已有相應(yīng)的產(chǎn)品在臨床上使用。臨床上常用它們的硫酸鹽 或甲磺酸鹽，其中后者多用于非腸道給藥途徑，在組織中水解出多粘菌素 起作用。可用于治療一些由革蘭氏陰性菌引起的腦膜炎、痢疾等，特別是 它能抑制其他抗生素幾乎沒有作用的綠膿桿菌，且不產(chǎn)生耐藥性，因此它 對防止?fàn)C傷和外科手術(shù)后感染綠膿桿菌及有耐藥性的痢疾菌和由其他革 蘭氏陰性菌引起的疾病等都有一定的臨床意義。目前，多粘菌素B的生產(chǎn)主要采用微生物發(fā)酵法進行生物合成，但發(fā) 酵單位較低，尚未實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。其中，對比文獻The Biosynthesis of Polymyxin B by Growing Cultures of 5a"7/wj / o/;;r"jKxa —文也披露了一種 生物合成多粘菌素B的培養(yǎng)基，由于該培養(yǎng)基不含有機氮源，氮源單一且 含量少，因此產(chǎn)量較低，為1043 U/ml。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提高多粘芽孢桿菌發(fā)酵生物合成多粘 菌素B的產(chǎn)量。為此，本發(fā)明提供一種發(fā)酵法合成多粘菌素B的方法，包括將多粘芽 孢桿菌&cj7hs poJ/ffl^a ATCC10401接種于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的步驟，其特征在于，所述培養(yǎng)基使用的有機氮源的濃度為4% 10%。所述有機氮源的濃度優(yōu)選為5 8%，更優(yōu)選為5.8% 6.2%，最優(yōu)選為 6.0%。本發(fā)明方法中的培養(yǎng)基包括碳源、有機氮源、無機氮源、CaC03以及 微量元素等。優(yōu)選地，該培養(yǎng)基的有機氮源采用大豆分離蛋白、豆粕、玉米漿、花 生粉、棉仔餅粉或黃豆餅粉等。更優(yōu)選地，有機氮源采用大豆分離蛋白。該培養(yǎng)基所使用的碳源包括但不限于玉米粉、淀粉、葡萄糖和蔗糖， 優(yōu)選淀粉；培養(yǎng)基中碳源的濃度為1% 6%，優(yōu)選2% 4%。所述CaCO3在培養(yǎng)基中的濃度為0.5。/o 2.0n/0，優(yōu)選0.8% 1.0%。所述微量元素包括但不限于M^+和Mi^+的可溶性鹽類，其濃度通常為 0.001% 0.005%，優(yōu)選0.002%。本發(fā)明方法中，最優(yōu)選的培養(yǎng)基組分和重量百分比含量為淀粉3%， 大豆分離蛋白6%，硫酸銨0.1%， CaC03 0.8%， MgS04 0.002%, MnS04 0.002%,余量為水。本發(fā)明方法中的培養(yǎng)基由于高含量有機氮源的獨特配方，因此所合成 的多粘菌素B的發(fā)酵單位得以大大提高。本發(fā)明方法發(fā)酵合成多粘菌素B 的最高發(fā)酵單位可達6534.5U/ml。
具體實施方式
實施例1按照以下配方配制培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基a為本發(fā)明的配方，培養(yǎng)基b為對比文獻的配方培養(yǎng)基a:大豆分離蛋白60g,淀粉30g，硫酸銨lg, CaC038 g， MgS04.7H20 0.02 g， MnSO4.H2O0.01 g，蒸餾水定容至1L。培養(yǎng)基b:葡萄糖5g(以50X的濃度單消)，(NH4)2S041.5g, MgS04 '7H20 0.2 g， NaCl O.lg， FeS04.7H20 O.Olg， ZnSO40.01g， MnS04H20 0.0075g， 40ml0.5MK3PO4,生物素0.5pg。其中培養(yǎng)基a和b均接入6ac/〃w po/y/^xa ATCC10401的種子培養(yǎng)物，接種量7%,消前pH值調(diào)至7.2;溫度30。C;裝量30ml/250ml;培養(yǎng)40 小時后放瓶，結(jié)果前者得到6534.5U/ml多粘菌素B，后者得到1043U/ml 多粘菌素B。 實施例2將培養(yǎng)基a中的大豆分離蛋白60 g換成大豆分離蛋白40 g，結(jié)果得到 5652.1U/ml多粘菌素B。 實施例3將培養(yǎng)基a中的大豆分離蛋白60 g換成大豆分離蛋白100 g，結(jié)果得 到6072.3U/ml多粘菌素B。 實施例4將培養(yǎng)基a中的大豆分離蛋白60g換成大豆分離蛋白50 g，結(jié)果得到 6195.2U/ml多粘菌素B。 實施例5將培養(yǎng)基a中的大豆分離蛋白60g換成大豆分離蛋白80 g，結(jié)果得到 6146.3U/ml多粘菌素B。 實施例6將培養(yǎng)基a中的大豆分離蛋白60g換成大豆分離蛋白58 g，結(jié)果得到 6478.6U/ml多粘菌素B。 實施例7將培養(yǎng)基a中的大豆分離蛋白60g換成大豆分離蛋白62 g，結(jié)果得到 6486.4U/ml多粘菌素B。 實施例8將培養(yǎng)基a中的大豆分離蛋白60 g換成花生粉60 g，結(jié)果得到1854.5 U/ml多粘菌素B。 實施例9將培養(yǎng)基a中的大豆分離蛋白60 g換成黃豆餅粉60 g,結(jié)果得到 5456.2 U/ml多粘菌素B。 實施例10將培養(yǎng)基a中的大豆分離蛋白60 g換成豆粕60 g，結(jié)果得到4332.3 U/ml多粘菌素B。^培養(yǎng)基a中的大豆分離蛋白60 g換成棉子餅粉60 g，結(jié)果得到 1003,8 U/ml多粘菌素B。
權(quán)利要求
1. 一種發(fā)酵法合成多粘菌素B的方法，包括將多粘芽孢桿菌bacilluspolymyxa ATCC10401接種于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的步驟，其特征在于，所述培養(yǎng)基使用的有機氮源的濃度為4％～10％。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述有機氮源的濃度為 5% 80/0。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述有機氮源的濃度為 5.8% 6.2%。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述有機氮源的濃度為 6.0%。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述有機氮源為豆粕、大 豆分離蛋白、玉米漿、花生粉、棉仔餅粉和黃豆餅粉中的一種。
6. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基使用的無機氮 源為硫酸銨，其濃度為0.02% 0.2%。
7. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基使用的碳源為 玉米粉、淀粉、葡萄糖或蔗糖，該碳源的濃度為1% 6%。
8. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基使用的微量元 素為Mg^或Mr^+的可溶性鹽類，該微量元素的濃度為0.001% 0.005°/0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)酵法合成多粘菌素B的方法，包括將多粘芽孢桿菌bacillus polymyxa ATCC10401接種于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的步驟，其特征在于，所述培養(yǎng)基使用的有機氮源的濃度為4％～10％。由本發(fā)明培養(yǎng)基發(fā)酵合成多粘菌素B的最高發(fā)酵單位可達6534.5U/ml。
文檔編號C12R1/12GK101235407SQ200710036929
公開日2008年8月6日 申請日期2007年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月29日
發(fā)明者軍 馮, 朱裕輝, 綱 林, 田永輝, 程睛華, 薛春佳, 趙文杰, 雪 陳, 魏曉東, 齊艷艷 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院