一種陽離子聚氨基酸基因載體材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種陽離子聚氨基酸基因載體材料及其制備方法。本發(fā)明首次通過N-羧基-α-氨基酸酐開環(huán)聚合的方法制備了天冬氨酸芐酯與組氨酸的無規(guī)共聚物，并通過對天冬氨酸側(cè)鏈進(jìn)行胺解反應(yīng)，合成了陽離子聚合物基因載體材料。凝膠滲透色譜結(jié)果顯示，控制引發(fā)劑投料量，可有效控制聚合物的分子量；不同胺解比例下，聚合物溶解性不同，由疏水向親水轉(zhuǎn)變，通過體外基因轉(zhuǎn)染實驗可知，胺解比例從10%至95%的聚合物P(HIS-co-ASP(DET))均具有基因轉(zhuǎn)染效率，通過改變材料與基因的質(zhì)量比，篩選出具有最高轉(zhuǎn)染效率的聚合物；聚合物P(HIS-co-ASP(DET))與均聚的天冬氨酸聚合物相比，細(xì)胞毒性有顯著性降低，所得聚合物是一種低毒、高效且具有良好的生物相容性及生物可降解性的基因載體材料。
【專利說明】一種陽離子聚氨基酸基因載體材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及非病毒基因載體領(lǐng)域，具體地說，涉及一種陽離子聚氨基酸基因載體材料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著以DNA重組技術(shù)為代表的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因治療已成為近20年來生物醫(yī)學(xué)治療技術(shù)研究的熱點之一。基因治療是指將特定的外源基因運載到病灶部位的細(xì)胞內(nèi)，并使其有效地表達(dá)。作為一種從根本上治療疾病的新型醫(yī)療方法，基因治療面臨的首要挑戰(zhàn)是如何把治療基因安全、高效地運到病變部位的靶細(xì)胞或組織中，并且穩(wěn)定地表達(dá)，這在很大程度上取決于基因治療所用的載體系統(tǒng)。目前，應(yīng)用于基因治療的載體主要分為病毒載體和非病毒載體。
[0003]病毒載體高度進(jìn)化后具有一定的感染和寄生特性，在多數(shù)情況下有較高的轉(zhuǎn)染效率，但也存在免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、靶向特異性差、制備復(fù)雜及費用高等缺點，從而導(dǎo)致其在臨床上的應(yīng)用受到了限制，于是人們逐漸將目光轉(zhuǎn)向了非病毒載體。陽離子聚合物是一類重要的非病毒載體，其具有安全、有效、無免疫原性等特點。目前，研究最為廣泛和深入的陽離子聚合物為聚乙烯亞胺(PEI)。聚乙烯亞胺(PEI)分子中每三個相鄰原子中就有一個可以質(zhì)子化的氮原子，較高的電荷密度可以使其與基因有效的結(jié)合并增強了細(xì)胞的攝取，很大程度上提高了基因轉(zhuǎn)染效率。但PEI作為基因載體材料在體內(nèi)生物降解性較差，易導(dǎo)致紅細(xì)胞的聚集而且能夠和血漿的成分相互作用，細(xì)胞毒性也相對較大。因此，開發(fā)一種高效、低毒以及生物相容性較好的非病毒基因載體非常必要。
[0004]聚氨基酸是α-氨基酸之間由肽鍵相連的高分子，具有較好的生物相容性；除此之外，在生理環(huán)境下，聚氨基酸可自發(fā)形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，保證了其作為載體材料的穩(wěn)定性，因而聚氨基酸在眾多高分子材料中獨樹一幟。目前研究及應(yīng)用較多的氨基酸類基因載體為聚賴氨酸。聚賴氨酸(PLL)由于其側(cè)鏈的伯胺基團(tuán)在生理環(huán)境(ρΗ=7.4)下便可質(zhì)子化而帶正電，因此可以有效的提高DNA的包載率，增加細(xì)胞的攝取效率，然而研究表明聚賴氨酸的質(zhì)子緩沖能力欠缺，以其作為載體的復(fù)合微粒難以從內(nèi)含體中逃逸，最終負(fù)載的基因被核酸酶降解，轉(zhuǎn)染效率下降。
[0005] 在眾多氨基酸中，天冬氨酸(Aspartate Acid)具有α-手性中心以及多種官能團(tuán)，無論是自身均聚還是與其他氨基酸共聚，都保留著部分活性基團(tuán)，因此具有結(jié)構(gòu)可控、易于修飾的優(yōu)點，可以制備成效率高、毒性低的高分子基因載體材料。同時，還可以通過在其母體引入不同鏈長、含不同親疏水性基團(tuán)的側(cè)鏈，賦于材料不同的性質(zhì)，如荷電性、親水性、親脂性等，最終使材料具有不同的生物降解性；組氨酸(Histidine)是一種側(cè)基為咪唑基的人體常見非必需氨基酸，PKa約為6.0，聚合物中引入組氨酸可以提高其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含體及溶酶體內(nèi)pH(4.5^6.5)中的質(zhì)子緩沖能力，有利于復(fù)合微粒從內(nèi)含體逃逸，避免微粒在溶酶體中被降解，同時，生理環(huán)境下，組氨酸具有疏水特性，可以提高基因載體的細(xì)胞攝取，從而進(jìn)一步提聞基因轉(zhuǎn)染效率。[0006]因此，在上述相關(guān)基礎(chǔ)上，設(shè)計開發(fā)一類全新的具有可控分子結(jié)構(gòu)的氨基酸陽離子無規(guī)共聚物，其主鏈結(jié)構(gòu)中同時包含生物相容性良好和基因攜載能力高的陽離子天冬氨酸單體，以及能夠有效促進(jìn)載體內(nèi)含體逃逸的疏水性組氨酸單體，并在此基礎(chǔ)上將其進(jìn)一步發(fā)展，制備成為一系列新型的高效、低毒的基因載體，目前還未見有相關(guān)研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種低毒、高效的陽離子聚氨基酸基因載體材料及其制備方法。本發(fā)明的載體材料能夠有效的結(jié)合基因并利用組氨酸在酸性環(huán)境下的強質(zhì)子緩沖能力，幫助自身及基因有效逃離內(nèi)含體，同時，聚天冬氨酸主鏈引入疏水的組氨酸單體后，有效的降低了電荷密度并提高細(xì)胞的攝取效率。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種陽離子聚氨基酸基因載體材料，其結(jié)構(gòu)式如式(I )所述:
【權(quán)利要求】
1.一種陽離子聚氨基酸基因載體材料，其結(jié)構(gòu)式如式(I )所述:
2.權(quán)利要求1所述陽離子聚氨基酸基因載體材料的制備方法，其特征在于包括如下步驟:首先，分別制備天冬氨酸芐酯及組氨酸單體的N-羧基-α -氨基酸酐NCA，并以含有伯胺的物質(zhì)作為引發(fā)劑引發(fā)兩種氨基酸NCA進(jìn)行開環(huán)聚合；再利用脫保護(hù)試劑脫去組氨酸上的保護(hù)基團(tuán)；最后，利用胺解試劑二乙烯三胺進(jìn)行天冬氨酸側(cè)鏈的胺解修飾，從而得到二乙烯三胺修飾的氨基酸類陽離子共聚物。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)組氨酸NCA的合成:以四氫呋喃為溶劑，在氮氣保護(hù)及室溫條件下，組氨酸單體與亞硫酰氯反應(yīng)得到黃色透明溶液后，迅速沉淀于倍8-20倍體積的無水乙醚中，得到淡黃色固體沉淀物，過濾后抽真空干燥，得到初級產(chǎn)物；將初級組氨酸NCA溶于硝基甲烷中，過濾取濾液沉淀于無水乙醚中，抽真空干燥，重復(fù)此提純步驟3-5遍，得到純凈組氨酸NCA ； (2)天冬氨酸NCA的合成:以四氫呋喃為溶劑，在氮氣保護(hù)及40-70°C條件下，天冬氨酸單體與三光氣反應(yīng)得到無色透明溶液后，迅速沉淀于8-20倍體積正己烷中，得到白色固體沉淀，過濾后抽真空干燥，得到天冬氨酸NCA初級產(chǎn)物；將初級天冬氨酸NCA溶于乙酸乙酯中，過濾取濾液冷卻重結(jié)晶，重復(fù)此提純步驟3-5遍，得到純凈天冬氨酸芐酯NCA ； (3)氨基酸NCA開環(huán)聚合:以N，N-二甲基甲酰胺為溶劑，氨基酸NCA在含有伯胺官能團(tuán)的物質(zhì)進(jìn)行引發(fā)，在25-60°C、氮氣保護(hù)條件下，至少反應(yīng)72小時，產(chǎn)物于N，N-二甲基甲酰胺中透析后再于蒸餾水中透析并凍干，得到聚組氨酸-天冬氨酸共聚物P(HiS(DNP)-CO-BLA)； (4)聚合物中組氨酸單體咪唑基團(tuán)脫保護(hù):分別將聚合物P(HIS (DNP)-co-BLA)及脫保護(hù)試劑2-巰基乙醇溶于二甲基亞砜中，室溫下，將巰基乙醇溶液緩慢加入聚合物溶液，反應(yīng)1-3天，反應(yīng)產(chǎn)物于二甲基亞砜中透析后再于水中透析并凍干，得到產(chǎn)物P(HIS-co-BLA)； (5)聚合物天冬氨酸芐酯胺解反應(yīng):取P(HIS-C0-BLA)溶解于N-甲基吡咯烷酮中并加入二乙烯三胺，室溫下反應(yīng)1-24小時，產(chǎn)物于蒸餾水中透析并凍干，得到最終產(chǎn)物P (HIS-co-ASP (DET))。
【文檔編號】C12N15/87GK103755955SQ201410013791
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】劉杰, 蔣慶, 高迪, 陳可欣, 余柏青 申請人:中山大學(xué)