一種超氧化物歧化酶脂肪酸包合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種超氧化物歧化酶脂肪酸包合物及其制備方法。該包合物，采用低分子量的脂肪酸對超氧化物歧化酶分子中的氨基酸殘基進行修飾，使超氧化物歧化酶氨基酸殘基修飾率達到10.1-90%，修飾后的超氧化物歧化酶的分子量比未修飾前相應增加了2-25%。經(jīng)超氧化物歧化酶的修飾反應與產(chǎn)品的純化即得粉末狀超氧化物歧化酶脂肪酸包合物。本發(fā)明是以小分子脂肪酸為修飾劑，對超氧化物歧化酶進行共價修飾，所得的超氧化物歧化酶脂肪酸包合物具有體內(nèi)半衰期長、無免疫原性等優(yōu)點，還增強超氧化物歧化酶的穩(wěn)定性和抗蛋白水解的能力，消除對人體的免疫原性，延長了在人體內(nèi)的半衰期，可以廣泛應用于醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域中。
【專利說明】一種超氧化物歧化酶脂肪酸包合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種超氧化物歧化酶脂肪酸包合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]超氧化物歧化酶(SOD:Superoxide Dismutase)是生物體內(nèi)催化氧自由基(O2一.)發(fā)生歧化反應的重要酶，它對超氧的催化速度是化學能的I萬倍，能夠清除氧自由基對人體的毒害，是國際上公認氧自由基的清除劑。自1969年McCord和Fridovich首次從牛血液中發(fā)現(xiàn)超氧化物岐化以來，引起了各國生化界和醫(yī)學界的重視。自90年代，科學界已經(jīng)認識到氧自由基是在人體疲勞、生病時產(chǎn)生的多余的自由基，它們會破壞人體的細胞核內(nèi)DNA物質(zhì)，促使人衰老，或細胞癌變。20世紀，科學家們提出了人體疾病衰老的幾種學說，自由基學說是當中唯一被證實且最為可靠的一種學說，它比較清楚地闡述了機體疾病衰老的過程。由于呼吸，機體組織器官時刻都在進行氧代謝，在正常生理情況下，自由基的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，當某種因素使氧自由基生成過多、或超出清除能力、或清除能力減弱時，過多的氧自由基通過損傷生命大分子，破壞細胞結(jié)構(gòu)與功能，導致疾病的發(fā)生與發(fā)展，從而加速機體老化?，F(xiàn)代醫(yī)學已經(jīng)證實:氧自由基引起的疾病，已超過一百多種，嚴重的威脅著我們的健康與長壽。導致氧自由基產(chǎn)生的因素很多，包括:(I)人體利用氧氣的過程中每日約可產(chǎn)生大量的活性氧(自由基)；(2)衰老:25歲以后，人體內(nèi)的超氧化物歧化酶隨著人體組織的老化而逐漸降低；(3)體力透支；(4)精神壓力:急躁、焦慮，郁悶；(5)過度飲酒；
(6)疾病、手術(shù)；(7)輻射線:核能、日光照射、X光、復印機、計算機；(8)電磁波:微波爐、吹風機、手機；(9)污染:汽車排放的廢氣、工業(yè)廢氣廢水，香煙、二手煙；(10)藥物濫用、食品添加劑；(11)農(nóng)藥殘留、殺蟲`劑。超氧化物歧化酶作為清除人體負氧自由基的清除劑，已成為二十世紀醫(yī)藥學最熱門研究課題。天然超氧化物歧化酶存在著一定抗原性，在人體內(nèi)的半衰期短，只有6-10分鐘，穩(wěn)定性差容易失活，因此限制了它的應用?？朔@些缺點常用的方法之一是利用水溶性大分子對超氧化物歧化酶進行共價修飾，常用的修飾劑有聚乙二醇、聚蔗糖、右旋糖酐、變性淀粉、聚烯屬羥基化合物等。經(jīng)過這些大分子修飾過的超氧化物歧化酶雖然免疫原性降低、體內(nèi)半衰期延長、穩(wěn)定性增加，但是上述修飾超氧化物歧化酶分子量過大(> 10萬道爾頓)無法透過細胞膜，靜脈注射易引發(fā)生毛細血管拴塞，因此只有實驗室意義，應用價值不大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種超氧化物歧化酶脂肪酸包合物及其制備方法。
[0004]本發(fā)明所述超氧化物歧化酶脂肪酸包合物，采用低分子量的脂肪酸對超氧化物歧化酶分子中的氨基酸殘基進行修飾，使超氧化物歧化酶氨基酸殘基修飾率達到10.1-90%,修飾后的超氧化物歧化酶的分子量比未修飾前相應增加了 2-25%。[0005]根據(jù)本發(fā)明，所述脂肪酸為碳原子數(shù)為6-30的脂肪酸。
[0006]優(yōu)選的，所述脂肪酸為12-20的脂肪酸。
[0007]進一步優(yōu)選的，所述脂肪酸為碳原子數(shù)為12或14或16或18的脂肪酸。
[0008]根據(jù)本發(fā)明實施方式之一，所述脂肪酸為一元飽和脂肪酸或不飽合脂肪酸。
[0009]優(yōu)選的，所述一元飽和脂肪酸為8碳的正辛酸或10碳的正癸酸或12碳的月桂酸或14碳的肉豆蘧酸或16碳的棕櫚酸或18碳的硬脂酸。
[0010]優(yōu)選的，所述不飽和脂肪酸為一烯酸的油酸或二烯酸的亞油酸或三烯酸的亞麻酸。
[0011]本發(fā)明所述超氧化物歧化酶脂肪酸包合物的制備方法，主要包括如下步驟:
1)超氧化物歧化酶的修飾反應:將2-5%重量份的超氧化物歧化酶溶于pH值為8-10的緩沖液中，保持溶液溫度20-25°C，一邊攪拌一邊加入1-2.5%重量份的脂肪酸鹵化物，同時用堿液保持溶液的PH值不變，加入脂肪酸鹵化物之后升溫至40-44°C，然后攪拌反應1-1.2小時，再迅速降溫至20-24°C，得到混合溶液；
2)產(chǎn)品的純化:在步驟I)所得混合溶液中加入2.5-3.5重量份的預冷丙酮，收集沉淀物，將沉淀物溶于水中，取其上清液進行提純，經(jīng)冷凍干燥，得到粉末狀超氧化物歧化酶脂肪酸包合物。
[0012]根據(jù)本發(fā)明，所述脂肪酸為碳原子數(shù)為6-30的脂肪酸。
[0013]優(yōu)選的，所述脂肪酸為12-20的脂肪酸。
`[0014]進一步優(yōu)選的，所述脂肪酸為碳原子數(shù)為12或14或16或18的脂肪酸。
[0015]根據(jù)本發(fā)明實施方式之一，所述脂肪酸為一元飽和脂肪酸或不飽合脂肪酸。
[0016]優(yōu)選的，所述一元飽和脂肪酸為8碳的正辛酸或10碳的正癸酸或12碳的月桂酸或14碳的肉豆蘧酸或16碳的棕櫚酸或18碳的硬脂酸。
[0017]優(yōu)選的，所述不飽和脂肪酸為一烯酸的油酸或二烯酸的亞油酸或三烯酸的亞麻酸。
[0018]根據(jù)本發(fā)明實施方式之一，步驟I)中加入脂肪酸鹵化物之后升溫至42°C。
[0019]根據(jù)本發(fā)明實施方式之一，步驟2)所述純化使用層析柱。
[0020]根據(jù)本發(fā)明實施方式之一，步驟2)所述預冷丙酮的溫度范圍為-10 - _30°C。
[0021]本發(fā)明超氧化物歧化酶脂肪酸包合物的制備方法，采用低分子量的脂肪酸對超氧化物歧化酶分子中的氨基酸殘基進行修飾，使超氧化物歧化酶氨基酸殘基修飾率達到
10.1-90%,修飾后的超氧化物歧化酶的分子量比未修飾前相應增加了 2-25%。修飾超氧化物歧化酶產(chǎn)品的活性回收率用連苯三酚自氧化法對反應前后的活性進行測定，超氧化物歧化酶氨基酸殘基的修飾率用聚丙烯酰胺凝膠電泳或氨基酸自動分析儀對反應前后氨基酸殘基進行測定，超氧化物歧化酶的分子量用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定。
[0022]本發(fā)明是以小分子脂肪酸為修飾劑，對超氧化物歧化酶進行共價修飾，得到的超氧化物歧化酶脂肪酸包合物，所得的超氧化物歧化酶脂肪酸包合物具有體內(nèi)半衰期長、無免疫原性、比活性高、穩(wěn)定性強等優(yōu)點，還增強超氧化物歧化酶的穩(wěn)定性和抗蛋白水解的能力，消除對人體的免疫原性，延長了在人體內(nèi)的半衰期，可以廣泛應用于醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域中?！揪唧w實施方式】
[0023]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但這些實施例僅用于說明本發(fā)明而對本發(fā)明沒有限制。
[0024]實施例1:月桂酸修飾
(I)修飾反應:將含量為6035U/mg的天然超氧化物歧化酶1000mg溶于50ml pH 9.0的
0.lmol/L的碳酸鹽緩沖液中，保持溶液溫度20°C。攪拌中加入SOOmg的月桂酰氯，同時用lmol/L的NaOH溶液保持溶液的pH值不變，立即升溫至42°C，攪拌反應I小時，再迅速降至室溫約24 °C。
[0025](2)產(chǎn)品純化:將所得反應物加入3倍體積量的預冷丙酮(_10°C )，離心收集沉淀，將沉淀物溶于蒸餾水中，離心后取上清液，上葡聚糖凝膠S^hadex G-100層析柱純化，凍干，得到月桂酸修飾超氧化物歧化酶LA-SOD。
[0026](3)產(chǎn)品的活性回收率、修飾率與分子量:經(jīng)連苯三酚自氧化法測定SOD活性，1000mg超氧化物歧化酶經(jīng)月桂酰氯修飾后，得到LA-SOD 942mg,比活為5779 U/mg，活性回收率為90.2%。用聚丙烯酰胺凝膠電泳或氨基酸自動分析儀對反應前后氨基酸殘基進行測定，得修飾率約為81%，表明超氧化物歧化酶得到了較好的保護。未修飾前的分子量為34000，用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定修飾后的分子量為41140，僅比未修飾前增加了 21.0%。
[0027]實施例2:肉豆蘧酸修飾
(I)修飾反應:將含量為6035U/mg的天然超氧化物歧化酶1000mg溶于50ml pH 8.5的
0.lmol/L的碳酸鹽緩沖液中`，保持溶液溫度25°C。攪拌中加入1000mg的肉豆蘧酰氯，同時用lmol/L的NaOH溶液保持溶液的pH值不變，立即升溫至42°C，攪拌反應I小時，再迅速降至室溫約20°C。
[0028](2)產(chǎn)品純化:將所得的反應物加入3倍體積量的預冷丙酮(_20°C )，離心收集沉淀，將沉淀物溶于蒸餾水中，離心后取上清液，上葡聚糖凝膠S^hadex G-100層析柱純化，凍干，得到肉豆蘧酸修飾超氧化物歧化酶MA-S0D。
[0029](3)產(chǎn)品的活性回收率、修飾率與分子量:經(jīng)連苯三酚自氧化法測定SOD活性，1000mg超氧化物歧化酶經(jīng)肉豆蘧酰氯修飾后，得到MA-SOD 930mg，比活為5525 U/mg，活性回收率為85.1%。用氨基酸分析儀對反應前后氨基酸殘基進行測定，得修飾率約為74%，表明超氧化物歧化酶得到了較好的保護。未修飾前的分子量為34000，用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定修飾后的分子量為40460，僅比未修飾前增加了 19.0%。
[0030]實施例3:棕櫚酸修飾
(I)修飾反應:將含量為6035U/mg的天然超氧化物歧化酶1000mg溶于50ml pH 8.5的
0.lmol/L的碳酸鹽緩沖液中，保持溶液溫度22°C。攪拌中加入900mg的棕櫚酰氯，同時用lmol/L的NaOH溶液保持溶液的pH值不變，立即升溫至42°C，攪拌反應I小時，再迅速降至室溫約24 °C。
[0031](2)產(chǎn)品純化:將所得的反應物加入3倍體積量的預冷丙酮(_25°C )，離心收集沉淀，將沉淀物溶于蒸餾水中，離心后取上清液，上葡聚糖凝膠S^hadex G-100層析柱純化，凍干，得到棕櫚酸修飾超氧化物歧化酶PA-SOD。
[0032](3)產(chǎn)品的活性回收率、修飾率與分子量:經(jīng)連苯三酚自氧化法測定SOD活性，1000mg超氧化物歧化酶經(jīng)脂肪酸鹵化物修飾后，得到PA-SOD 819mg，比活為5025 U/mg，活性回收率為68.2%。用氨基酸自動分析儀對氨基酸殘基進行測定，得修飾率約為58%。未修飾前的分子量為34000，用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定修飾后的分子量為38760，僅比未修飾前增加了 14.0%。
[0033]實施例4:亞油酸修飾
修飾劑為亞油酸(Linoleic Acid),是18碳二烯不飽和脂肪酸,分子式C18H32O2,相對分子量280.45。將含量為6035U/mg的天然超氧化物歧化酶1000mg溶于pH 9.0的磷酸鹽緩沖液中，保持溶液溫度24°C。攪拌中加入1200mg亞油酰氯，同時用lmol/L的KOH溶液保持溶液的PH值不變，立即升溫至42°C，攪拌反應I小時，再迅速降至室溫約20°C。將所得的反應物加入3倍體積量的預冷丙酮(_30°C )，離心收集沉淀，將沉淀物溶于蒸餾水中，離心后取上清液，上葡聚糖凝膠S^hadex G-100層析柱純化，凍干，得到亞油酸修飾超氧化物歧化酶 LiA-SOD。
[0034]經(jīng)連苯三酚自氧化法測定SOD活性，活性回收率為48.0%。用氨基酸自動分析儀對氨基酸殘基進行測定，修飾率約為40%。用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定修飾后的分子量，僅比未修飾前增加了 9.0%。`
【權(quán)利要求】
1.一種超氧化物歧化酶脂肪酸包合物，其特征在于，采用低分子量的脂肪酸對超氧化物歧化酶分子中的氨基酸殘基進行修飾，使超氧化物歧化酶氨基酸殘基修飾率達到10.1_90%，修飾后的超氧化物歧化酶的分子量比未修飾前相應增加了 2-25%。
2.如權(quán)利要求1所述超氧化物歧化酶脂肪酸包合物，其特征在于，所述脂肪酸為碳原子數(shù)為6-30的脂肪酸。
3.如權(quán)利要求2所述超氧化物歧化酶脂肪酸包合物，其特征在于，所述脂肪酸為12-20的脂肪酸；優(yōu)選的，所述脂肪酸為碳原子數(shù)為12或14或16或18的脂肪酸。
4.如權(quán)利要求1或2所述超氧化物歧化酶脂肪酸包合物，其特征在于，所述脂肪酸為一元飽和脂肪酸或不飽合脂肪酸；優(yōu)選的，所述一元飽和脂肪酸為8碳的正辛酸或10碳的正癸酸或12碳的月桂酸或14碳的肉豆蘧酸或16碳的棕櫚酸或18碳的硬脂酸；優(yōu)選的，所述不飽和脂肪酸為一烯酸的油酸或二烯酸的亞油酸或三烯酸的亞麻酸。
5.如權(quán)利要求1-4任一項所述超氧化物歧化酶脂肪酸包合物的制備方法，主要包括如下步驟: 1)超氧化物歧化酶的修飾反應:將2-5%重量份的超氧化物歧化酶溶于pH值為8-10的緩沖液中，保持溶液溫度20-25°C，一邊攪拌一邊加入1-2.5%重量份的脂肪酸鹵化物，同時用堿液保持溶液的PH值不變，加入脂肪酸鹵化物之后升溫至40-44°C，然后攪拌反應1-1.2小時，再迅速降溫至20-24°C，得到混合溶液； 2)產(chǎn)品的純化:在步驟I)所得混合溶液中加入2.5-3.5重量份的預冷丙酮，收集沉淀物，將沉淀物溶于水中，取其上清液進行提純，經(jīng)冷凍干燥，得到粉末狀超氧化物歧化酶脂肪酸包合物。
6.如權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述脂肪酸為碳原子數(shù)為6-30的脂肪酸；優(yōu)選的，所述脂肪酸為12-20的脂肪酸；進一步優(yōu)選的，所述脂肪酸為碳原子數(shù)為12或14或16或18的脂肪酸。
7.如權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述脂肪酸為一元飽和脂肪酸或不飽合脂肪酸；優(yōu)選的，所述一元飽和脂肪酸為8碳的正辛酸或10碳的正癸酸或12碳的月桂酸或14碳的肉豆蘧酸或16碳的棕櫚酸或18碳的硬脂酸；優(yōu)選的，所述不飽和脂肪酸為一烯酸的油酸或二烯酸的亞油酸或三烯酸的亞麻酸。
8.如權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，步驟I)中加入脂肪酸鹵化物之后升溫至42。。。
9.如權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，步驟2)所述純化使用層析柱。
10.如權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，步驟2)所述預冷丙酮的溫度范圍為-10--30。。。
【文檔編號】C12N9/02GK103805587SQ201410013618
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】李健 申請人:李健