提高棉纖維長(zhǎng)度的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】提高棉纖維長(zhǎng)度的方法
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[0003] 發(fā)明背景
[0004] 本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及棉花WRINKLED1樣（WRIL)基因， 其編碼的蛋白質(zhì)作為參與脂肪酸生物合成的基因的轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明還涉及提高棉花的棉 纖維長(zhǎng)度的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些方法包括調(diào)節(jié)參與宿主棉花細(xì)胞中脂肪酸生物 合成的酶的活性水平和/或培養(yǎng)宿主棉花細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些方法涉及操縱 轉(zhuǎn)錄因子，所述轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)編碼參與脂肪酸生物合成的酶的基因。
[0005] 本文中用于說(shuō)明本發(fā)明的背景或者提供額外的關(guān)于實(shí)施的細(xì)節(jié)的出版物和其他 材料，通過(guò)引用納入本申請(qǐng)中，并且為方便起見(jiàn)，分別被列于參考文獻(xiàn)中。
[0006] 棉花（Gossypiumspp.)是世界上最重要的纖維植物，也是重要的油料種子作物， 在80多個(gè)國(guó)家種植，世界產(chǎn)量的最高紀(jì)錄為2006/2007年種植季的1. 22億包（480鎊/ 包）（美國(guó)農(nóng)業(yè)部海外農(nóng)業(yè)服務(wù)局（UnitedStatesDepartmentofAgriculture-Foreign AgriculturalService))。在1994/1995年，已經(jīng)發(fā)生生產(chǎn)相對(duì)于消費(fèi)的不足，據(jù)預(yù)計(jì)，在 2009/2010生長(zhǎng)季該不足將繼續(xù)擴(kuò)大至250萬(wàn)包（480鎊/包）（美國(guó)農(nóng)業(yè)部海外農(nóng)業(yè)服務(wù)局 (UnitedStatesDepartmentofAgriculture-ForeignAgriculturalService[USDA-FAS]) 2009)。棉花生產(chǎn)為大約1億個(gè)家庭提供收入，大約有150個(gè)國(guó)家參與了棉花的進(jìn)口 和出口。據(jù)估計(jì)，它的全世界經(jīng)濟(jì)影響為大約為每年5千億美元。此外，在糧食短缺的經(jīng)濟(jì) 體系中，改良棉花種子用于食品和飼料能深度提高數(shù)百萬(wàn)人民的營(yíng)養(yǎng)和生計(jì)。棉花也是可 再生生物燃料的潛在候選植物。棉纖維幾乎是由純的纖維素組成。相比于木質(zhì)素，纖維素 能夠容易地轉(zhuǎn)變?yōu)樯锶剂?。?yōu)化的棉纖維的生產(chǎn)和加工將會(huì)確保這種天然可再生產(chǎn)品具 備與石油衍生的合成的非再生纖維競(jìng)爭(zhēng)的能力，以確保更好的可持續(xù)發(fā)展。
[0007] 目前，種子總是作物用于人類(lèi)和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的最重要的部分。主要的種子貯藏化合 物包括例如三?；视停═AG)、蛋白質(zhì)和碳水化合物，其典型地構(gòu)成成熟種子的質(zhì)量的大 部分，并且這些組分的比例有物種特異性的較大變化。由于種子的組成和產(chǎn)率是育種和 農(nóng)業(yè)研宄中的重要性狀，碳和氮的分離而進(jìn)入發(fā)育種子中的主要存儲(chǔ)產(chǎn)物是重要的過(guò)程。 在模式植物擬南芥（Arabidopsis)中，一種含有AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子WRINKLED1(WRI1 ; At3g54320)控制蔗糖向三?；视偷霓D(zhuǎn)化，并在控制碳和氮流入TAG生物合成和積累中顯 不較強(qiáng)的作用（CernacandBenning, 2004) 〇
[0008] 由于棉花最重要的農(nóng)藝性狀是纖維質(zhì)量和產(chǎn)量，提高對(duì)于棉纖維發(fā)育相關(guān)基因的 認(rèn)識(shí)很重要。棉纖維是單細(xì)胞的種子毛，棉纖維發(fā)育被認(rèn)為是用于研宄細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué) 和功能的很好的模型系統(tǒng)（Seagull，1990)。探討細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化和細(xì)胞骨架相關(guān)基因 的表達(dá)是如何有助于纖維發(fā)育是很重要的。在這個(gè)方向已經(jīng)取得了一些進(jìn)展。細(xì)胞骨架蛋 白GhActin已被證明對(duì)纖維伸長(zhǎng)而不是纖維起始很重要（Lietal.，2005)。纖維優(yōu)先的 肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（GhPFN2)的過(guò)表達(dá)過(guò)早地阻斷細(xì)胞伸長(zhǎng)（Wangetal.，2010)。另一方 面，據(jù)報(bào)道，向下調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白解聚因子基因（actindepolymerizingfactor，ADF)增加纖 維長(zhǎng)度和纖維強(qiáng)度（(Wangetal.，2009)。
[0009] 棉花的基因功能分析的最終目標(biāo)是用它們來(lái)提高棉纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，只 有相對(duì)很少的基因已經(jīng)被成功地用于轉(zhuǎn)化棉花并且提高棉纖維的產(chǎn)量和質(zhì)量。其中不少 來(lái)自碳水化合物的生物合成基因。例如，蔗糖合酶基因（SUS和sps)和纖維素合成酶基因 (acsA和acsB)的轉(zhuǎn)基因過(guò)度表達(dá)改善棉纖維的長(zhǎng)度和強(qiáng)度（Ruanetal.，2003;Jianget al.，2011)。類(lèi)似地，更高的木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶（XTH)活性可促進(jìn)纖維細(xì)胞伸 長(zhǎng)，并且過(guò)表達(dá)的xth基因的轉(zhuǎn)基因棉花增加了成熟的纖維長(zhǎng)度（Leeetal.，2010)。碳水 化合物生物合成基因的過(guò)度表達(dá)可將固定碳（fixedcarbon)分配至碳水化合物，從而提高 棉纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)。值得注意的是，發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子，其可以調(diào)節(jié)在棉花生殖器官內(nèi)的 脂質(zhì)和碳水化合物之間的碳流。擬南芥的研宄已經(jīng)表明，在花椰菜花葉病毒（cauliflower mosaicvirus) 35S啟動(dòng)子的控制下過(guò)表達(dá)擬南芥WRI1cDNA，導(dǎo)致種子含油量增加（Cernac andBenning，2004)。另一方面，剪接突變等位基因wril-1的擬南芥的種子油積累減少。 該突變體中糖酵解降低，使發(fā)育的胚不能有效地將蔗糖轉(zhuǎn)換成三?；视偷纳锖铣汕绑w (CernacandBenning, 2004)〇
[0010] 可用的遺傳資源和棉花基因序列將促進(jìn)棉花主要農(nóng)藝性狀的改良。為此，2007年 發(fā)起了確定完整的棉花基因組序列的公共項(xiàng)目。雖然該項(xiàng)目還正在進(jìn)行，不斷增加的棉花 EST序列集（目前約40萬(wàn)條）被存放在公共數(shù)據(jù)庫(kù)里。盡管有這么龐大數(shù)量的棉花基因序 列可用，只有少數(shù)基因的功能已經(jīng)確定。這主要是因?yàn)槊藁ɑ蚬δ艿拇笠?guī)模分析一直受 制于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因棉花這個(gè)費(fèi)力又耗時(shí)的過(guò)程。此外，許多棉花品種難以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。因 此，迫切需要開(kāi)發(fā)以基因組規(guī)模進(jìn)行棉花基因的不依賴于物種的快速功能分析的方法。
[0011] 病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-inducedgenesilencing,VIGS)提供了有吸引力 的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的替代，因?yàn)樗鼰o(wú)需植物轉(zhuǎn)化而允許基因功能的研宄（Ruizetal.，1998; Burch-Smithetal.，2004)。候選基因的部分片段被插入到病毒載體內(nèi)，產(chǎn)生重組病毒。用 該重組病毒感染植物，導(dǎo)致產(chǎn)生病毒相關(guān)的小干擾RNA(siRNA) (Baulcombe，2004)，它可介 導(dǎo)相關(guān)的內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄物的降解，從而導(dǎo)致被接種植物中候選基因表達(dá)的沉默（Brigneti etal.，2004 ;Burch-Smithetal.，2004)。內(nèi)源性基因表達(dá)的沉默效果一般可在病毒接種 1-2周后進(jìn)行檢測(cè)。VIGS已成為使用最廣泛的、的確很重要的反向遺傳學(xué)的工具之一，尤其 是對(duì)非模式植物而言。
[0012] 人們需要識(shí)別參與生物合成途徑的基因，其調(diào)節(jié)可導(dǎo)致棉纖維長(zhǎng)度的增加。也需 要開(kāi)發(fā)用于增加棉纖維長(zhǎng)度的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)，更具體地涉及棉花WRINKLED1樣（WRIL)基因。更具 體地，本發(fā)明涉及棉花基因WRIL，其產(chǎn)物作為參與調(diào)節(jié)脂肪酸生物合成的基因的轉(zhuǎn)錄因子。 本發(fā)明還涉及提高棉花的棉纖維長(zhǎng)度的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些方法包括調(diào)節(jié)宿主 棉花細(xì)胞中參與脂肪酸生物合成的酶的活性水平和/或培養(yǎng)該宿主棉花細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，這些方法涉及操縱轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)編碼參與脂肪酸生物合成的 酶的基因。
[0014] 在第一方面，本發(fā)明提供了分離的核酸，其編碼GhWRIL蛋白，其包含如SEQID NO:2所示的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含如SEQIDNO: 1所示的核苷酸 序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含如SEQIDNO: 1的第25-1338位核苷酸所示的核 苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含如SEQIDNO: 1的第25-1341位核苷酸所 示的核苷酸序列。在另外的實(shí)施方案中，該核酸還包含植物可操作啟動(dòng)子（plantoperable promoter)，其可操作地連接到該核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子是種子特異性啟動(dòng)子。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，種子特異性啟動(dòng)子是棉花種子特異性啟動(dòng)子。
[0015] 在第二方面，本發(fā)明提供了分離的核酸，其編碼GrWRIL蛋白，其包含如SEQID N0:4所示的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸包含如SEQIDN0:3所示的核苷酸序 列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸包含如SEQIDNO: 3的第32-1345位核苷酸所示的核苷 酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含如SEQIDN0:3的第32-1348位核苷酸所示 的核苷酸序列。在另外的實(shí)施方案中，該核酸還包含可操作地連接到該核酸的植物可操作 啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子是種子特異性啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該種子 特異性啟動(dòng)子是棉花種子特異性啟動(dòng)子。
[0016] 在第三方面，本發(fā)明提供了構(gòu)建體或載體，其包含如本文所述的分離的核酸。在一 個(gè)實(shí)施方案中，該構(gòu)建體或載體是表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該構(gòu)建體 或載體還包含可選擇的標(biāo)記。在另一實(shí)施方案中，該構(gòu)建體或載體包括不含Cre-lox重組 標(biāo)記的系統(tǒng)。
[0017] 在第四方面，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物，其包含本文描述的核酸或載體。在一個(gè)實(shí) 施方案中，該轉(zhuǎn)基因植物是棉花植物。
[0018] 在第五方面，本發(fā)明提供了用于棉花WRIL基因的下調(diào)。在一個(gè)實(shí)施例中，棉 花WRIL基因的下調(diào)涉及使用RNA干擾（RNAi)，其中包括微小RNA(microRNA)和發(fā)夾 RNA(hairpinRNA)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，棉花WRIL基因的下調(diào)涉及使用病毒誘導(dǎo)的基因 沉默（VIGS)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供下調(diào)GhWRIL基因的核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提 供下調(diào)GrWRIL基因的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸還包含植物可操作啟動(dòng)子，其可操 作地連接到該核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是種子特異性啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，種子特異性啟動(dòng)子是棉籽啟動(dòng)子。根據(jù)該方面，本發(fā)明還提供了包含如本文所述的分離 核酸的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體是表達(dá)載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該載體還包含 選擇標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該載體包括不含Cre-lox重組標(biāo)記的系統(tǒng)。根據(jù)該方面， 本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因植物或感染植物，其包含本文所述的核酸或載體。在一個(gè)實(shí)施方案 中，該轉(zhuǎn)基因或受感染的植物是棉花植物。
[0019] 在第六方面，本發(fā)明提供了增加棉花的棉纖維長(zhǎng)