專利名稱：采用丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行的基因免疫的制作方法
采用丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行的基因免疫本申請(qǐng)是1999年1月28日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?9802481. 3 (PCT/US 99/01823)， 名為"采用丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行的基因免疫"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及重組核酸分子和包含例如與基因免疫方案中抗丙型肝炎病毒 的疫苗組分同樣有用的藥物組合物；涉及誘導(dǎo)抗丙型肝炎病毒感染的免疫應(yīng) 答的方法；并涉及治療患有丙型肝炎感染的病人的方法。發(fā)明背景丙型肝炎病毒(HCV)，由輸血獲得的非甲非乙型肝炎的主要病原體，在 美國(guó)每年引起了大約150， OOO起的急性病毒性肝炎的新病例。(Choo，等，科 學(xué)，1989， 244， 359-362.)在西方國(guó)家，有0. 6%至2.0%的流行率，而在世界的 一些不發(fā)達(dá)地區(qū)要高達(dá)15%。 (Heintges，等，H印athology， 1997， 26, 521-526.)大約一半的此類感染會(huì)演變成和肝硬化以及/或肝癌相關(guān)的慢性感 染。(Alter,等，科學(xué)，1992， 258， 135-140;和alter,等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜 志，1992， 327， 1899-1905).此外，抗丙型肝炎病毒抗體的流行顯示，丙型肝炎 病毒的感染是肝細(xì)胞癌發(fā)展的 一 種獨(dú)立的危險(xiǎn)因素(Colombo, 等，Lancet, 1989， ii, 1006-1008; Saito，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1990， 87， 6547-6549; Simonetti,等，An. Int. Med. , 1992， 116, 97—102 ;和 Tsukuma，等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，1993， 328， 1797-1801).丙型肝炎病毒是一種具有衣殼的正鏈RNA病毒，長(zhǎng)度大約為9， 500核苷 酸，最近被分類為黃病毒屬的一個(gè)獨(dú)立種。(Heinz, Arch. Virol. (S叩pl.)， 1992， 4, 163-171.)不同的分離物顯示出相當(dāng)多的核酸序列多樣性，導(dǎo)致將 HCV的基因組進(jìn)一步分成八個(gè)基因型。(Simmonds,等，J. Gen. Virol. ， 1993,74， 2391-2399.)在所有的基因型中，病毒基因組都包含一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框(0RF),編碼一條由3010到3033個(gè)氨基酸組成的，大約330Kd的多聚蛋白前 體。(Choo,等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991， 88， 2451-2455 ; Inchauspe， 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991， 88， 10292-10296; Kato，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1990， 87， 9524-9528 ; 0kamoto，等，病毒遺傳學(xué)雜 志，1991, 72, 2697 - 704;禾口 Takamizawa ,等，J. Gen. Virol. ， 1991， 65, 1105-1113.)通過(guò)該多聚蛋白前體的蛋白水解加工產(chǎn)生了核心蛋白(C)，衣殼蛋白(El， E2)和非結(jié)構(gòu)(NS2 — NS5)蛋白，從而產(chǎn)生出各種HCV多肽。(Bartenschlager， 等，病毒遺傳學(xué)雜志，1993， 67， 3835 — 3844; Grakoui，等，病毒遺傳學(xué)雜 志雜志，1993， 67， 2832 —2843;及Selby，等，病毒遺傳學(xué)雜志，1993， 74， 1103—1113)。這種蛋白水解是聯(lián)合采用細(xì)胞蛋白酶和病毒編碼的蛋白酶進(jìn) 行催化反應(yīng)的。NS3基因編碼一種絲氨酸蛋白酶，此酶能在幾種功能部位切 斷轉(zhuǎn)錄后的病毒多聚蛋白前體，還可以作為蛋白解旋酶起作用。NS5區(qū)域編 碼此病毒的脂A依賴的脂A聚合酶。除了轉(zhuǎn)錄區(qū)域外，HCV基因組還包含一個(gè)5'非翻譯區(qū)域(5'UTR)和一個(gè) 3'非翻譯區(qū)域(3'UTR)。該324至341的5'非翻譯區(qū)域核酸序列代表了迄今 為止報(bào)道過(guò)的所有HCV分離物中最保守的核酸序列。(Han，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1991, 88， 1711-1715;禾口 Bukh，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1992, 89,4942-4946).該5，非翻譯區(qū)域被假定包含了 HCV RNA復(fù)制和/ 或翻譯的重要調(diào)控元件。該5'非翻譯區(qū)域還包含了數(shù)個(gè)小的開(kāi)放閱讀框 (0RF)，但現(xiàn)今尚未有證據(jù)提示這些開(kāi)放閱讀框被真實(shí)翻譯。在HCV感染期間涉及肝損傷和病毒清除的細(xì)胞免疫機(jī)制只是部分的被說(shuō) 明。在嘗試檢測(cè)慢性HCV感染病人中肝浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的潛在致病作用時(shí)， Koziel等檢驗(yàn)了細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)這些細(xì)胞的反應(yīng)，并證明HLA I 類限制性的CD8 +細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答針對(duì)HCV多肽的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)區(qū)域。 (Koziel，等，病毒學(xué)雜志 1993, 67， 7522-7532;和Koziel，等，免疫學(xué)雜 志，1992， 149, 3339-3344).其他研究者也注意到在外周血單核細(xì)胞群體中存 在細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞，它能識(shí)別慢性HCV感染時(shí)的病毒核心上的和其它病毒 相關(guān)蛋白上的表位。(Kita,等，Heatol. ， 1993， 18， 1039-1044;和Cerny， 等，Intl. Symp. virol Hepatitis Liver Dis. ， 1993， 83 (abstr. ). ) Botarelli， 等，(Botarelli，等，Gastroenterol. ， 1993， 104, 580-587)禾口 Ferrari,等，(Ferrari, Hepatol. ， 1994， 19， 286-295)發(fā)現(xiàn)了針對(duì)慢性HCV感染病人體內(nèi) 得到的HCV的不同區(qū)域的幾種重組蛋白的HLA II類限制性的CD4 + T細(xì)胞介導(dǎo) 的增殖反應(yīng)。在有效HCV感染中，體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答已顯示是多克隆、多特異性的。 很可能在持續(xù)HCV感染中產(chǎn)生的宿主免疫應(yīng)答，部分的引了肝細(xì)胞損傷。然 而，這些免疫應(yīng)答不足夠廣泛或強(qiáng)大，以在慢性HCV感染的病人體內(nèi)促進(jìn)病 毒清除和保護(hù)性免疫力。(Chisari， J.Clin. Invest., 1997， 99， 1472-1477.) 最近顯示，那些從急性HCV感染中恢復(fù)的病人能產(chǎn)生很強(qiáng)的對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白多 肽CD4 + T細(xì)胞增殖反應(yīng)。(Missale，等，J.Clin. Invest. ， 1996， 98， 706-714; 和Di印older，等，Lancet, 1995， 346, 1006-1007.)更重要的是，HCV特異性 CTL活性的產(chǎn)生是和慢性肝炎個(gè)體體內(nèi)病毒復(fù)制的控制相聯(lián)系的。 (Rehermann,等，J.Clin.Invest. ，996，98， 1432-1440;和 Nelson,等， J, Immunol. ， 1997， 158,1473-1481.)然而，非結(jié)構(gòu)蛋白NS3， NS4和NS5是否有足夠的免疫原性能夠在體內(nèi)產(chǎn) 生廣泛的、強(qiáng)有力的CTL應(yīng)答尚不知道?，F(xiàn)今還沒(méi)有通用的、高效的對(duì)慢性HCV感染的治療方法。HCV疫苗策略 的開(kāi)發(fā)是復(fù)雜的，不僅是由于HCV分離物的顯著的異質(zhì)性，還由于在一個(gè)病 毒分離物中混合了異源基因組。(Martell，等，J. Virol. ， 1992， 66， 3225.)此 外，病毒包含了一個(gè)高度可變的衣殼區(qū)。有效的治療僅限于干擾素。 (Carithers， et al， H印atology， 1997， 26, 83S-88S.)事實(shí)上，用這種制劑治 療的病人大約8—10%有反應(yīng)，并有HCV從肝部的擴(kuò)散。然而，近來(lái)的研究 顯示，和那些獲得持續(xù)性HCV感染的病人比較，從急性HCV感染中恢復(fù)的病 人對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)生了充分的CD4 + T細(xì)胞增殖反應(yīng)。(Missale，等， J . Clin. Invest. ， 1996， 98, 706-714;和 Di印older， 等，Lancet, 1995， 346， 1006-1007)直接將DNA注射入動(dòng)物體內(nèi)是免疫接種輸送特異免疫抗原的一種有前途 的方法。(Barry,等，Bio Techniques, 1994， 16， 616-619 ;Davis，等，Hum. Mol. Genet. ， 1993， II, 1847-1851; Tang,等，自然科學(xué)，1992， 356， 152-154 ; Wang, 等 ，J. Virol. ， 1993， 67， 3338-3344; 和 Wolff, 等， 科學(xué) ， 1990， 247， 1465-1468.)該方法已被成功的應(yīng)用于在鼠和雞中產(chǎn)生對(duì)流感病 毒、在鼠和小牛中對(duì)牛皰疹病毒、在鼠中對(duì)狂犬病毒產(chǎn)生保護(hù)性免疫。(Cox,
等， J. Virol. ， 1993， 67， 5664-5667; Fynan， 等，DNA 和 Cell Biol. ， 1993， 12， 785-789;Ulmer等，科學(xué)，1993， 259， 1745-1749;和Xiang等， Virol. ， 1994， 199， 132-140.)在大多數(shù)情況中，強(qiáng)而高度多樣的抗體和細(xì)胞毒 T細(xì)胞應(yīng)答和感染的控制有關(guān)。事實(shí)上，和那些死病毒的疫苗，不僅能引起 抗急性感染的保護(hù)力而且能根除持續(xù)性病毒感染的CTL應(yīng)答的方法比較，不 使用肝臟載體而產(chǎn)生長(zhǎng)而持續(xù)性的記憶性CTL的可能性，使這種方法特別具 有吸引力。(Wolff，等，科學(xué)，1990， 247， 1465-1468;Wolff，等，Hum. Mol. Genet.， 1992， I，363-369; Manthorpe， 等 ，Human GeneTherapy, 1993，4，419-431; Ulmer 等，科學(xué) ，1993，259,1745-1749;Yankauckas，etaal. ,DNA 和 細(xì) 胞 生 物 學(xué)，1993, 12， 777-783;Montgomery， 等，DNA 和細(xì)胞生 物 學(xué)，1993， 12， 777-783;Fynan,等，DNA和細(xì)胞生物學(xué)，1993， 12, 785-789 ; Wang， 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1993, 90， 4156-4160; Wang，等，DNA 和 細(xì) 胞 生 物 學(xué) ，1993, 12， 799-805;Xiang， 等 ， Virol. , 1994， 199， 132-140 ; Davis,等，Hum. Mol. Genet. ， 1993， II， 1847-1851; Donnelly,等，Nat. Med. ， 1995， I， 583-587; Boyer,等，Nat. Med. ， 1997， 3， 526-532;Tascon，等，Nat. Med. ， 1996， 2， 888-892;禾口 Huygen，等，Nat. Med. 1996, 2， 893-898.)。和融合重組蛋白或多肽相比較，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于能 引起強(qiáng)烈的炎癥性的CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒T細(xì)胞活性，推測(cè)是病毒蛋白 在細(xì)胞內(nèi)加工轉(zhuǎn)變成多肽，然后裝載在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的MHC I類分子上，與抗原 遞呈細(xì)胞相互作用而致。相反的是，用融合蛋白免疫接種主要導(dǎo)致由MHC II 類途徑加工的體液免疫應(yīng)答。由于只有有限數(shù)目的表位能刺激宿主的免疫應(yīng) 答，用合成多肽免疫有幾個(gè)缺陷之處。相反的，對(duì)于感興趣的DNA構(gòu)建物編 碼的每個(gè)蛋白，天然存在的B和T細(xì)胞表位都可能是為T細(xì)胞受體識(shí)別而保 留的，因此可能會(huì)產(chǎn)生廣泛的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。(McDonnell,等，N. Engl. J. Med. ， 1996, 334, 42—45.)疫苗接種和免疫接種通常指引入某種無(wú)毒的物質(zhì)，個(gè)體的免疫系統(tǒng)能刺 激針對(duì)該物質(zhì)的免疫應(yīng)答，從而能抵抗病原體的攻擊。免疫系統(tǒng)識(shí)別入侵的 "外來(lái)"組分和物質(zhì)主要靠識(shí)別在個(gè)體內(nèi)正常不存在的蛋白和其它的大分子。 外來(lái)的蛋白是免疫應(yīng)答所針對(duì)的目標(biāo)。PCT專利申請(qǐng)PCT/US90/01348公開(kāi)了 HCV基因組克隆的序列信息，HCV
病毒蛋白的氨基酸序列以及制造和使用包括抗一HCV疫苗等組分的方法，該疫苗中含有HCV蛋白及其產(chǎn)生多肽。美國(guó)專利5， 830， 876， 5， 593， 972， 5， 739， 118和于1994年1月 26日提交的PCT專利申請(qǐng)系列號(hào)PCT/US94/00899，其內(nèi)容全部納入本文以供 參考。每專利都包含了基因免疫方案的細(xì)節(jié)?？笻CV疫苗也包括在各件專利 之中。用于保護(hù)個(gè)體抵抗HCV感染的疫苗的需求仍然存在，保護(hù)個(gè)體抵抗HCV 感染的方法的需求仍然存在。發(fā)明概述本發(fā)明涉及重組核酸序列分子，其包含編碼HCV非結(jié)構(gòu)區(qū)域，如NS3， NS4，或NS5，或它們的組合的核苷酸序列。本發(fā)明涉及包含重組核酸分子的藥物組合物，該重組的核酸分子含有一 段編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列。編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的該核苷酸編碼 序列和人細(xì)胞中的功能性調(diào)節(jié)元件可操作性相連。該藥物組合物還包含有藥 學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑，和任選的促進(jìn)劑(facilitator)，比如丁哌 卡因。該發(fā)明涉及免疫HCV易感個(gè)體的方法，包含向該個(gè)體給藥，藥物組合物 含有編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列的重組核酸分子。該編碼HCV非結(jié)構(gòu) 蛋白的核苷酸編碼序列與人類細(xì)胞中的功能性調(diào)節(jié)元件可操作性相連。該藥 物組合物還包含一種藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑。對(duì)個(gè)體施用一定量的 藥物使之有效誘導(dǎo)抗HCV感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。本發(fā)明涉及治療患有HCV感染個(gè)體的方法，包括相該個(gè)體歌謠，藥物成 分含有編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列的重組核酸分子。該編碼HCV非結(jié) 構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列序列與人細(xì)胞中的功能性調(diào)節(jié)元件可操作性相連。 該藥物組分還包含藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑。給予個(gè)體一定量的藥物 使之有效誘導(dǎo)HCV感染的治療性免疫應(yīng)答。附圖簡(jiǎn)述

圖1A是一示意圖，顯示HCV的單一大開(kāi)放閱讀框，它編碼大約3011 — 3030個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體。該蛋白前體被宿主信號(hào)和病毒蛋白酶切割成
不同的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白，如箭頭所示。圖IB顯示HuH-7細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和 sp2/0細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的非結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的示范性放射自顯影圖。1， 3， 5泳 道是模擬DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用作陰性對(duì)照(Mock); 2， 4和6泳道顯示了特異 條帶，NS3在大約70， NS4在大約30， NS5大約125KD。 7 — 10泳道顯示了分 別轉(zhuǎn)染了含有NS3， NS4，和NS5基因的核酸構(gòu)建物的SP2/0細(xì)胞。7和9泳 道代表由穩(wěn)定表達(dá)HCV—核心蛋白，作為陰性對(duì)照(SP2 — 10)的細(xì)胞得到的細(xì) 胞裂解物，而8和10泳道代表NS3和NS5的特異性表達(dá)。圖2A是一 柱狀圖，顯示一代表性的以DNA為基礎(chǔ)免疫接種引起的對(duì)NS3， NS4和NS5的體液免疫應(yīng)答；血清抗體水平由一 ELISA法測(cè)定(每組n=5). 圖2B是一柱狀圖，顯示一在體外用特異或非特異性重組蛋白刺激3日后測(cè)得 的代表性的t細(xì)胞增殖。圖2c， 2d，和2e為柱狀圖，顯示在體外刺激48小 時(shí)后測(cè)得的代表性的細(xì)胞因子IFN — y， IL一2和IL一4分別在上清液中的分 泌水平。圖3A和3B是柱狀圖，顯示在不同的效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比例下 (100:1,30:1， 10:1，3:1)分別對(duì)NS3禾卩NS5作出的代表性的細(xì)胞毒T細(xì)胞 (CTL)反應(yīng).圖3C是柱狀圖，顯示針對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞譜線的代表性鉻釋放實(shí)驗(yàn)。圖4A是一表格，顯示評(píng)價(jià)CTL活性的腫瘤模型的代表性結(jié)果。圖4B是 一照片，自左自右顯示接種了 l)模擬麗A，并以SP2/NS5-21細(xì)胞攻擊； 2)pApNS5，以SP2/NS5-21細(xì)胞攻擊；3) pApNS5，以SP2-19細(xì)胞攻擊；(穩(wěn)定 表達(dá)HCV核心蛋白)；以及4)用重組NS5蛋白腹膜接種三次，并被SP2/NS5-21 細(xì)胞攻擊的動(dòng)物該發(fā)明的優(yōu)選例描述根據(jù)本發(fā)明，提供了對(duì)HCV感染進(jìn)行預(yù)防性/或治療性免疫，或治療個(gè)體 的方法。重組核酸分子被接種入個(gè)體內(nèi)，該重組核苷酸分子包含編碼HCV非 結(jié)構(gòu)蛋白，如NS3， NS4，或NS5，或它們的組合的核苷酸編碼序列。由該重 組核酸基因構(gòu)建物編碼的蛋白由個(gè)體的細(xì)胞表達(dá)，并作為免疫原性靶子，誘 導(dǎo)針對(duì)它的抗HCV的免疫應(yīng)答。引起的免疫應(yīng)答是廣泛的，除體液免疫應(yīng)答 外，細(xì)胞免疫的兩個(gè)途徑都被激活。該發(fā)明的方法可用來(lái)賦予預(yù)防性和治療 性免疫力。該發(fā)明的方法除用于人類外，亦可用于哺乳動(dòng)物以進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)
研究。因此，該發(fā)明的方法既可用于個(gè)體免疫抵抗HCV攻擊，亦可用于治療HCV感染個(gè)體。本文所用的詞組"HCV非結(jié)構(gòu)蛋白"是指HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3， NS4和 NS5，以及它們的等價(jià)物。等價(jià)蛋白包括保留本文所述的生物活性的NS3， NS4 和NS5肽鏈片段。此外，術(shù)語(yǔ)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白意指相應(yīng)的來(lái)自其它的HCV分 離物，(序列上可能有變化)的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白。該領(lǐng)域一般技術(shù)人員能容 易的鑒定其它HCV分離物的非結(jié)構(gòu)蛋白。需理解的是，當(dāng)編碼相同的氨基酸 時(shí)，密碼子中的核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代 而產(chǎn)生的保守的氨基酸取代時(shí)，核苷酸的變換也是可被接受的。需理解的是， 詞組"HCV非結(jié)構(gòu)蛋白"也包括了融合蛋白，該融合蛋白包括非結(jié)構(gòu)蛋白， 以及它的治療和預(yù)防性的活性片段。本文所用的詞組"基因構(gòu)建物"指包含編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編 碼序列的重組核酸分子，以及起始和終止信號(hào)，它們和包括啟動(dòng)子、聚腺苷 酸化信號(hào)，能指導(dǎo)在疫苗接種個(gè)體細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件可操作性相連。在 某些實(shí)施例中，基因構(gòu)建物更包含有增強(qiáng)子，Kozak序列(GCCGCCATG;SEQID N0:1)，和至少一個(gè)HCV 5'UTR片段。本文所用的詞組"基因疫苗"指包括有一個(gè)基因構(gòu)建物的藥物制劑?；?因疫苗包含有用于刺激對(duì)HCV的預(yù)防性和/或治療性免疫應(yīng)答的藥物制劑。本文所用的詞組"核酸"指DNA，脂A，或由它們形成的嵌合體。根據(jù)本發(fā)明，將基因構(gòu)建物引入個(gè)體細(xì)胞中并在其中表達(dá)，從而產(chǎn)生至 少一種HCV非結(jié)構(gòu)蛋白。更好的是，本發(fā)明的基因構(gòu)建物的調(diào)控元件能指導(dǎo) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，尤其是人類細(xì)胞中的表達(dá)。該調(diào)控元件包括啟動(dòng)子 和聚腺苷酸信號(hào)。此外，其它元件，如增強(qiáng)子和Kozak序列，亦可包含在基 因構(gòu)建物中。當(dāng)被細(xì)胞攝取后，本發(fā)明的基因構(gòu)建物可以在細(xì)胞中作為染色體外功能 性分子存在或整合入細(xì)胞的染色體DNA中。核酸，例如DNA，可以被引入細(xì) 胞，在細(xì)胞中以質(zhì)粒的形式作為獨(dú)立的基因材料存在。另外，可以整合到染 色體中的線狀核酸分子也可導(dǎo)入細(xì)胞。當(dāng)將核酸引入細(xì)胞時(shí)，可加入促進(jìn)核 酸整合到染色體上的試劑。在DNA分子中亦可加入有助于促進(jìn)整合的DNA序 列。此外，RNA也可以接種入細(xì)胞。也可考慮將基因構(gòu)建物以線狀微型染色 體包括著絲粒、端粒和復(fù)制起始點(diǎn)的形式提供。
根據(jù)本發(fā)明，基因構(gòu)建物包含具有編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列的重組核酸分子。在一些優(yōu)選例中，重組核酸分子包括了編碼NS3的核苷 酸編碼序列。在另一些優(yōu)選例中，重組核酸分子包括了編碼包括NS4在內(nèi)的 HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列。在另一些優(yōu)選例中，重組核酸分子包括 了編碼包括NS5在內(nèi)的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列。在另一些優(yōu)選例 中，重組核酸分子包括了編碼包括NS3， NS4，和NS5在內(nèi)的任一HCV非結(jié)構(gòu) 蛋白組合的核苷酸編碼序列。在一些優(yōu)選例中，該重組核酸分子包括了編碼包括HCV NS3， NS4， NS5 蛋白的片段或它們的組合的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列。這些片段包 括，但不限于，含有相應(yīng)非結(jié)構(gòu)蛋白的10， 25， 50， 75， 100， 150, 200， 250， 300， 350， 400， 450， 500， 550， 600， 650， 700， 750， 800， 850， 900， 950，或1000個(gè)氨基酸的片段。此外，這些片段可以包含蛋白羧基端一部分、 胺基端一部分、或它們兩者之間的任一部分。該領(lǐng)域技術(shù)熟練的研究人員可 以容易地制備HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的免疫原性片段、或含有任一組合的非結(jié)構(gòu)蛋 白的免疫原性片段的融合蛋白。因此，可以考慮，使含有編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋 白的核苷酸編碼序列的重組核酸分子含有比整個(gè)HCV非結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物少的序 列，而基本上不改變疫苗效率。還可考慮，在該核苷酸編碼序列中替換至少 一個(gè)或多個(gè)核苷酸而不影響該蛋白的氨基酸序列。此外還可考慮可在整段蛋 白中制造至少一個(gè)或多個(gè)保守性的氨基酸替代，而不實(shí)質(zhì)減弱HCV非結(jié)構(gòu)蛋 白的免疫原性的活力。在本發(fā)明的一些優(yōu)選例中，重組核酸分子包含具有HCV 5'UTR最后9 個(gè)核苷酸，HCV5'UTR最后25個(gè)核苷酸，HCV5'UTR最后50個(gè)核苷酸，HCV 5'UTR最后75個(gè)核苷酸，HCV 5'UTR最后100個(gè)核苷酸，HCV 5'UTR最后 150個(gè)核苷酸，HCV 5' UTR最后200個(gè)核苷酸，HCV 5' UTR最后250個(gè)核苷酸， 以及HCV 5'UTR最后300個(gè)核苷酸的5'UTR片段。在一些優(yōu)選例中，基因 構(gòu)建物含有整個(gè)HCV 5'UTR。在一些優(yōu)選例中，基因構(gòu)建物含有HCV5'UTR 的最3'端的9個(gè)核苷酸。 一個(gè)優(yōu)選例中的整個(gè)HCV 5' UTR是GCCAGCCCCC GATTGGGGGC GACACTCCAC CATAGATCAC TCCCCTGTGA GGAACTACTG TCTTCACGCA GAAAGCGTCT AGCCATGGCG TTAGTATGAG TGTCGTGCAG CCTCCAGGAC CCCCCCTCCC GGGAGAGCCA TAGTGGTCTG CGGAACCGGT GAGTACACCG GAATTGCCAG GACGACCGGG TCCTTTCTTG GATCAACCCG CTCAATGCCT GGAGATTTGG GCGTGCCCCC GCGAGACTGC
TAGCCGAGTA GTGTTGGGTC GCGAAAGGCC TTGTGGTACT GCCTGATAGG GTGCTTGCGA GTGCCCCGGG AGGTCTCGTA GACCGTGCAC C (SEQ ID N0: 2)DNA分子的基因表達(dá)所需的調(diào)控元件包括啟動(dòng)子，初始密碼子，終止 密碼子，聚腺苷酸信號(hào)。此外，基因表達(dá)常需增強(qiáng)子。這些元件需和編碼HCV 非結(jié)構(gòu)蛋白的的序列可操作性連接，還需要在接種的個(gè)體中具操作性。起始 密碼子和終止密碼子通常被視為編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列的一部 分。使用的啟動(dòng)子和聚腺苷酸信號(hào)必須在個(gè)體細(xì)胞中具有功能性。為使蛋白 的生產(chǎn)達(dá)到最大，可選擇給予該構(gòu)建物的細(xì)胞中非常適合基因表達(dá)的調(diào)控元 件。此外，可選擇能在細(xì)胞中最有效轉(zhuǎn)錄的密碼子。在本領(lǐng)域具有一般技能 的研究人員能構(gòu)建在哺乳動(dòng)物，尤其是人類細(xì)胞中具有功能性的DNA構(gòu)建物。用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的啟動(dòng)子的實(shí)例，尤其是生產(chǎn)人類用的基因疫苗的啟動(dòng) 子的實(shí)例，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)的啟動(dòng)子，鼠乳房瘤病毒(MMTV) 的啟動(dòng)子，人類免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV的長(zhǎng)最后重復(fù)序列(LTR) 的啟動(dòng)子，白血病(moloney)病毒，ALV (禽白血病(moloney)病毒)，巨 細(xì)胞病毒(CMV)，如CMV的立即早期啟動(dòng)子，EB病毒(EBV) ， Rous肉瘤病 毒(RSV)，以及來(lái)自人類基因的啟動(dòng)子，如人肌動(dòng)蛋白、人肌球蛋白、人血 色素、人肌酸素以及人金屬硫蛋白的啟動(dòng)子。用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的聚腺苷酸信號(hào)的實(shí)例，尤其是生產(chǎn)人類用的基因疫苗 的聚腺苷酸信號(hào)的實(shí)例，包括但不限于猿猴病毒40 (SV40)和LTR的聚腺 苷酸信號(hào)。具體使用的SV40聚腺苷酸信號(hào)是在pCEPa質(zhì)粒(Invitrogen，San Diego CA)中的SV40聚腺苷酸信號(hào)。除基因表達(dá)所需的調(diào)控元件外，在基因 構(gòu)建物中還可含有其它的元件。這些其它的元件包括增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可從下 列組中選擇但不限于人肌動(dòng)蛋白、人肌球蛋白、人血色素、人肌酸素以及 病毒增強(qiáng)子如CMV， RSV和EBV的增強(qiáng)子?？上蚧驑?gòu)建物提供哺乳動(dòng)物復(fù)制起始點(diǎn)，以使之保持染色體外的狀態(tài)， 從而在細(xì)胞中產(chǎn)生此構(gòu)建物的多個(gè)拷貝。質(zhì)粒pCEP4. pREP4 (San Diego, CA) 包含有EB病毒的復(fù)制起始點(diǎn)和無(wú)需整合，能產(chǎn)生高拷貝游離型復(fù)制的核酸抗 原EBNA—1編碼區(qū)。接種途徑包括，但不限于肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，真皮內(nèi)，皮下，靜脈注射， 動(dòng)脈內(nèi)，眼內(nèi)和口服，以及透皮或采用吸入法或栓劑。優(yōu)選給藥途徑包括肌 內(nèi)，腹膜內(nèi)，真皮內(nèi)和皮下注射。在采用和粘膜免疫力相關(guān)組織中存在的物 質(zhì)免疫接種后，編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的基因構(gòu)建物的輸送能賦予粘膜免疫力。 因此，在一些實(shí)施例中，此基因構(gòu)建物通過(guò)在個(gè)體口腔中的口腔前庭接種來(lái) 輸送。基因構(gòu)建物可通過(guò)包括，但不限于傳統(tǒng)注射，無(wú)針注射設(shè)備，或"顯 微粒子轟擊基因槍，，(microprojectile bombardment gene guns)纟合予。]t匕 外，基因疫苗亦可用多種方法導(dǎo)入從個(gè)體上取出的細(xì)胞中。這些方法包括 比如，體外轉(zhuǎn)染，電穿孔法，顯微注射以及顯微粒子轟擊。在基因構(gòu)建物被 細(xì)胞攝取后，可將細(xì)胞重新植回個(gè)體?？煽紤]，本來(lái)無(wú)免疫原性的細(xì)胞摻入 了基因構(gòu)建物后可以植入個(gè)體，即使被接種的細(xì)胞原來(lái)來(lái)自另一個(gè)個(gè)體。根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選例，基因構(gòu)建物采用無(wú)針注射器接種入個(gè)體。根 據(jù)另一些優(yōu)選例，基因構(gòu)建物同時(shí)用無(wú)針注射器通過(guò)真皮內(nèi)，皮下注射和肌 肉注射來(lái)接種入個(gè)體。無(wú)針注射器是廣為人知并廣泛可得的。該領(lǐng)域的一般 技術(shù)人員能夠按照本文的指導(dǎo)，用無(wú)針注射器來(lái)將基因物質(zhì)傳遞給個(gè)體的細(xì) 胞。無(wú)針注射器非常適合向所有的組織傳遞基因物質(zhì)。它們尤其對(duì)相皮膚和 肌肉細(xì)胞傳遞遺傳物質(zhì)有效。在一些優(yōu)選例中，無(wú)針注射器可以用來(lái)將含有 DNA分子的液體推至個(gè)體的皮膚表面。該液體以足夠的速度推動(dòng)，由于對(duì)皮 膚的沖擊力，液體穿透皮膚表面，滲入到下面的皮膚和肌肉組織。因此，基 因構(gòu)建物同時(shí)被接種入真皮，皮下和肌肉。在一些優(yōu)選例中，為了向器官細(xì) 胞引入核酸分子，無(wú)針注射器可用來(lái)將基因物質(zhì)傳遞給其它器官的組織。根據(jù)本發(fā)明，基因疫苗含有1納克至1000毫克的核酸，宜選是DNA。在 一些優(yōu)選例中，該疫苗含有10納克至大約800毫克的核酸。在一些優(yōu)選例中， 該疫苗含有0. 1至大約500毫克的核酸。在一些優(yōu)選例中，該疫苗含有1至 大約350毫克的核酸。在一些優(yōu)選例中，該疫苗含有25至大約250毫克的核 酸。在一些優(yōu)選例中，該疫苗含有大約IOO毫克的核酸。該領(lǐng)域熟練技術(shù)人 員能容易地配制所需量核酸的疫苗。按照接種模式來(lái)配置本發(fā)明的基因疫苗。該領(lǐng)域中一般技術(shù)人員可以容 易地配制含有基因構(gòu)建物的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物包含有的編碼 NS3， NS4，或NS5，或它們的組合的單一基因構(gòu)建物。另外，本發(fā)明的藥物 組合物包含有編碼NS3， NS4，或NS5，或它們的組合的多個(gè)基因構(gòu)建物。另 外，本發(fā)明的藥物組合物包含有編碼NS3， NS4，或NS5的片段，或它們的組 合的單一或多個(gè)基因構(gòu)建物。此外，本發(fā)明的藥物組合物包含編碼所有或任一NS3， NS4，或NS5蛋白片段的融合蛋白的單一基因構(gòu)建物。在某些例子中， 等滲的配方被采用。通常，等滲添加劑可包括氯化鈉，葡聚糖，甘露糖醇， 山梨醇和乳糖。在某些例子中，可采用等滲溶液例如磷酸緩沖液。穩(wěn)定劑包 括凝膠和白蛋白。在一些優(yōu)選例中，在配方中添加血管收縮劑。本發(fā)明的藥 物制備需是無(wú)菌無(wú)熱源質(zhì)提供的。本發(fā)明的基因構(gòu)建物可以用能提高基因構(gòu)建物的吸收和/或表達(dá)的藥劑 配制或聯(lián)合接種，該藥劑本文稱為促進(jìn)劑(facilitator)，它與基因構(gòu)建物 的攝取和表達(dá)有關(guān)的細(xì)胞，以及當(dāng)在缺少這些藥劑時(shí)接種相同的基因疫苗時(shí) 出現(xiàn)的細(xì)胞有關(guān)。這些藥劑和將它們與基因構(gòu)建物聯(lián)合接種的方案在美國(guó)專 利5， 830， 876， 5， 593， 972， 5， 739， 118和與1994年1月26日PCT專 利申請(qǐng)系列號(hào)PCT/US94/00899中有描述。這類藥劑的例子包括CaP04， DEAE， 葡聚糖，脂質(zhì)，胞外基質(zhì)活性酶；皂角苷；凝集素；雌激素化合物和類固醇 激素；羰化低級(jí)烷，二甲基亞砜(畫(huà)S0);尿素；苯甲酸酯酰替苯胺；脒； 氨基甲酸乙酯和局部麻醉藥家族的鹽酸鹽。此外，基因構(gòu)建物可包裹在脂質(zhì)/ 聚陽(yáng)離子復(fù)合物中或與該復(fù)合物聯(lián)合接種。一種優(yōu)選的促進(jìn)劑(facilitator) 是丁哌卡因。這些組分可以方便的以單位劑量給予，并可用藥學(xué)領(lǐng)域中熟知 的任何方法制備。例如 Remington' s Phamaceutical Sciences (Mack Pub.Co. ，Easton,PA， 1980)，所描述的方法。該文公開(kāi)的內(nèi)容全部納入本文作 參考。在實(shí)施例中，提供了以下的用編碼HCV三種不同非結(jié)構(gòu)蛋白的質(zhì)粒作DNA 疫苗接種，顯示能刺激免疫系統(tǒng)二部分能強(qiáng)烈抗原特異性免疫應(yīng)答。三次免 疫接種后，所有動(dòng)物都產(chǎn)生了可檢測(cè)的抗體反應(yīng)。在這點(diǎn)上，這些非結(jié)構(gòu)蛋 白和以前用結(jié)構(gòu)性HCV核心結(jié)構(gòu)蛋白的研究相比，是好得多的刺激體液免疫 應(yīng)答的抗原。(Tokushige,等，Hepatology， 1996, 24, 14-20 ;和Geissler, 等，J.Immunol.， 1997,158， 1231-1237.)在優(yōu)選例中，對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白的體 液免疫可以用加入能活化抗原遞呈細(xì)胞的化合物來(lái)增強(qiáng)，比如，表達(dá)細(xì)胞因 子的質(zhì)粒，如 IL 一 2禾P GM — CSF 。 ( Geissler，等，J. Immunol., 1997,158,1231- 1237;和Xiang， Immunity, 1995， 2,129-135.)所有的三 種編碼NS3， NS4， NS5的質(zhì)粒都證明了產(chǎn)生了具有優(yōu)勢(shì)THl表型的炎癥性CD4 + 丁細(xì)胞。此外，產(chǎn)生強(qiáng)而特異的008+0^應(yīng)答主要是針對(duì)裂解病毒產(chǎn)生的^3，
NS5。以前已顯示能在動(dòng)物模型系統(tǒng)中誘導(dǎo)抵抗各種病原體的保護(hù)力。 (Tascon，等，Nat. Med. , 1996， 2， 888-892;和Huygen，等，Nat.Med. ， 1996， 2， 893-898.)而且，要確定DNA疫苗產(chǎn)生的CTL應(yīng)答是否能保護(hù)動(dòng)物，防止以編 碼NS5蛋白的cDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同系SP2/0腫瘤細(xì)胞的腫瘤形成。結(jié)果大約 60%的小鼠受到保護(hù)避免了腫瘤形成，表明該免疫接種方式在體內(nèi)產(chǎn)生了高 水平的CTL活性，另外，與用模擬DNA或重組NS5蛋白免疫接種的動(dòng)物相比， 在患腫瘤的那些動(dòng)物中，腫瘤重量顯著下降。這個(gè)模型也證明了在動(dòng)物模型 中評(píng)估抗黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的高水平細(xì)胞免疫應(yīng)答作為衡量抑制腫瘤生長(zhǎng)的 指標(biāo)的能力。本文公開(kāi)的結(jié)果證明，用編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的基因構(gòu)建物來(lái)進(jìn)行DNA 為基礎(chǔ)的免疫接種，如本文所述，可用于患有HCV感染的個(gè)體的治療性處理， 以及可用與抗HCV預(yù)防性疫苗。本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)一步描述，以試圖闡明本發(fā)明。這些實(shí)施 例并不意味，或被解釋成，限制所公開(kāi)述的范圍。實(shí)施例實(shí)施例l:設(shè)計(jì)并構(gòu)建HCV表達(dá)載體將編碼單個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白的基因與采用工程改造后的起始和終止密碼子克 隆入一表達(dá)質(zhì)粒，由CMV啟動(dòng)子和RSV增強(qiáng)子(pAp031)驅(qū)動(dòng)。包括選擇性 標(biāo)記的該表達(dá)載體(pcDNA3)也被用來(lái)產(chǎn)生穩(wěn)定的SP2/0轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。(見(jiàn) 圖1A)。作為病毒基因的來(lái)源，采用命名為pBRTM/HCVl，覆蓋全長(zhǎng)HCV開(kāi)放閱讀 框的質(zhì)?？寺∪氡景l(fā)明的表達(dá)載體中。(Grakoui，等，J. Viol. , 1993， 67,1385-1395)此文公開(kāi)內(nèi)容全部納入本文以供參考。另外，編碼HCV的核 酸序列可從基因文庫(kù)(GenBank)的登錄號(hào)X61596和D16435來(lái)獲得，其公開(kāi) 內(nèi)容全部納入本文。構(gòu)建物pAp031-NS3， pAp031-NS4, pAp031-NS5是在插入 了工程化的起始和終止密碼子以及限制性酶切位點(diǎn)后的PCR克隆，采用以下 弓l物.-對(duì)NS3: 5'- GGTCTAGATT GATGGCGCCC ATCACGGC -3' (Xba I) (SEQ ID NO:3),5'— CACACGCGTT CACGTGACGA CCTCCAGGT —3， (Mlu I)(SEQ ID NO:4)， 對(duì)于NS4:5' GGTCTAGATG AGCACCTGGG TGCTC -3' (Xba I) (SEQ ID N0:5),5'-CCAGGATCCT CAGCATGGAG TGGTACA -3' (B柳Hl) (SEQ ID NO:6),以及對(duì)NS5:5'-TCAGTCTAGA ATGTCCGGCT CCGGCTCCTG GCTAAGGGA -3， (Xba I) (SEQ ID NO:7)，5'- AGCTACGCGT TCACCGGTTG GGGAGGAGGT -3' (Mlu I) (SEQ ID NO:8)。 在使用高精度的PCR系統(tǒng)(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增后，將cDNA片段插入含有RSV增強(qiáng)子元件的質(zhì)粒表達(dá)載體PAp031 中，由CMV啟動(dòng)子(Apollon，Malvern， PA)驅(qū)動(dòng)。使構(gòu)建物在DH5ot細(xì)胞中生長(zhǎng)， 而后質(zhì)粒DNA用2x氯化鈰離心或使用無(wú)內(nèi)切酶的緩沖液系統(tǒng)(Santa Clara，CA)的Qiagen Giga試劑盒純化。非結(jié)構(gòu)基因的插入物的檢驗(yàn)可用標(biāo) 準(zhǔn)方法來(lái)進(jìn)行序列分析。要建立作為CTL試驗(yàn)的靶細(xì)胞的NS3， NS4， NS5的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，將 非結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因片段克隆入帶有新霉素選擇性標(biāo)記的pc面A3和 pcDNA3. I Zeo(-)表達(dá)載體中(Invitrogen, San Diego)。首先，NS3禾P NS5的 Xba I禾卩Mlu I片段被亞克隆至Litmus-38載體(New, England Biolabs, MA) 的Nhe I/Mlu I位點(diǎn)，然后用EcoR I和Sal I切開(kāi)，分別重新連接入pcDNA3 和pcDNA3.工Zeo(-)的EcoR I/Xho I多重克隆位點(diǎn)。含有NS4的Xba I和BamHl 片段被重新連接入Litmus-20 (New, England Biolabs),用Kpn I和EcoR I 再次切開(kāi)，然后重新連入pcDNA3載體。質(zhì)粒被命名為pcDNA3 — NS3， pcDNA3 —NS4禾口 pcDNA3. 1/Zeo (1)-NS5。該領(lǐng)域技術(shù)人員，若有編碼任一HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的DNA順序，就能設(shè)計(jì) 引物來(lái)制備本發(fā)明的任一基因構(gòu)建物。另外，可進(jìn)行核苷酸堿基替代，而不 影響引物的結(jié)合。另外，為了克隆或連接目的，可制備帶有內(nèi)切核酸酶限制 性位點(diǎn)的引物，已為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知道。因此該領(lǐng)域熟練技術(shù)人員 能通過(guò)設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊?，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)制備本發(fā)明的基因構(gòu)建物。將PCR 產(chǎn)物連入一表達(dá)載體中。包含HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列的質(zhì)粒如上所述，將各自含有的 HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列置于CMV啟動(dòng)子和RSV增強(qiáng)子元件的轉(zhuǎn)錄 控制下。實(shí)施例2:體外表達(dá)測(cè)定此質(zhì)粒構(gòu)建物橫跨基因插入物的序列，分別在體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的 HuH-7細(xì)胞中，和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的SP2/0耙細(xì)胞中確認(rèn)蛋白質(zhì)的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)NS3 為70， NS4為30，而NS5為125kD的蛋白條帶在細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)，但未分泌入
培養(yǎng)基°對(duì)HuH-7人肝癌細(xì)胞系，通過(guò)磷酸鈣方式以多種構(gòu)建物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，以評(píng) 估HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)水平。簡(jiǎn)單的說(shuō)，用35硫一甲硫氨酸和半胱氨酸以 代謝法標(biāo)記4小時(shí)后，以改良過(guò)的RIPA緩沖液(0. 15M NaCl， 1%NP_40， 50mM Tris,O. 5。/oDOC和1%SDS)配制細(xì)胞裂解液。細(xì)胞裂解液先用馬血清預(yù)澄清， 然后，通過(guò)與多克隆抗血清WU 110(NS3)， W148/151(NS4)和WU 115(NS5)預(yù)溫 育過(guò)夜使之與瓊脂糖凝膠A 結(jié)合。(Grakoui， 等，J. Virol. ， 1993,67, 1385-1395，全部納入本文以供參考)在用SDS — PAGE 分離蛋白后，將電泳膠晾干，然后放射自顯影。NS5蛋白表達(dá)亦可用蛋白印 跡和用鼠單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光分析來(lái)確定(Biogenesis, Sandown， NH)。 要產(chǎn)生表達(dá)NS3， NS4和NS5的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，用含有感興趣的病毒基因插 入物的pcDNA3質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染同系的BALB/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0。將 在G418選擇下能生長(zhǎng)的細(xì)胞用有限稀釋(0.3細(xì)胞/ L)法克隆，并用上述 的方法篩選。pcD3和pcD3. 1質(zhì)粒分別含有新霉素或葉霉素(Zeomycin)抗性基因， 被用來(lái)克隆HCV非結(jié)構(gòu)基因和產(chǎn)生穩(wěn)定的同系的靶細(xì)胞系。用這些構(gòu)建物瞬 時(shí)轉(zhuǎn)染HuH-7細(xì)胞，并用卩一半乳糖苷酶試驗(yàn)控制轉(zhuǎn)化效率后，在無(wú)甲硫氨酸 和胱氨酸的培養(yǎng)基中饑餓細(xì)胞30分鐘，并用35硫一甲硫氨酸和胱氨酸標(biāo)記4 小時(shí)。用對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白特異性的多克隆兔血清免疫沉淀細(xì)胞裂解物，使之被 瓊脂糖凝膠A珠捕獲，用SDS — PAGE電泳，然后放射自顯影分析。1， 3， 5 泳道是模擬DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，作為陰性對(duì)照(模擬)。2， 4和6顯示了約NS3 70， NS4 30， NS5 125kD的特異性條帶。(7—10泳道)SP2/0細(xì)胞被pcD3 為基礎(chǔ)的含有NS3， NS4和NS5的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染，在抗生素選擇后，將細(xì)胞經(jīng)有 限稀釋(0.3細(xì)胞/孔)法克隆，擴(kuò)增，用放射性標(biāo)記或免疫沉淀對(duì)NS3分析， 或如上所述用蛋白印跡法對(duì)NS5進(jìn)行分析。第7和第9泳道代表作為陰性對(duì) 照(SP2 — 19)的穩(wěn)定表達(dá)HCV —核心蛋白的細(xì)胞中得到的細(xì)胞裂解液，，8 和10泳道為NS3和NS5的特異表達(dá)。這些細(xì)胞被用作體外刺激和作為CTL試 驗(yàn)的耙細(xì)胞。實(shí)施例3:免疫方案雌性BALB/c ( h-2d )小鼠在標(biāo)準(zhǔn)無(wú)病原體條件下在麻省總醫(yī)院(Massachusetts General Hospital)的動(dòng)物設(shè)施中培養(yǎng)。小鼠從Charles River實(shí)驗(yàn)室(Wilmington, MA)獲得，在6至20周齡時(shí)用于體內(nèi)研究。將總 量為lOOpg的質(zhì)粒DNA (以100|il的0. 9%的氯化鈉溶液配制)注射2和3 次，在5個(gè)不同位點(diǎn)上注射入小鼠的股四頭肌。每隔14天，在另一條腿上加 強(qiáng)注射。作為所有免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照，將5jag的配于完全弗氏佐劑(CFA) 的重組NS3， NS4，和NS5非結(jié)構(gòu)蛋白(Mikrogen， Munich)在第0日經(jīng)腹膜 注射入小鼠，并用等量的以0. 05%的SDS配的蛋白在4周和8周后作加強(qiáng)注 射。作為這些實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照，使用空白質(zhì)粒載體和重組的乙型肝炎病毒表 面抗原(HbsAg) (Energix， Smith Kline Beecham， Philadelphia)。 所有小鼠 在最后一次免疫后10日后被處死。實(shí)施例4:體液免疫應(yīng)答的測(cè)定 用已建立的ELISA法測(cè)定每只免疫動(dòng)物血清中的抗NS3， NS4和NS5的 抗體水平。簡(jiǎn)單的說(shuō)，用上述的重組蛋白包裹微量滴定板(Falcon， Microtest IIIM Flexible Assay Plate) ， 4。C過(guò)夜。(0. 5pg/孔)。20。C用胎牛血清封 閉2小時(shí)后，在板中加入l: 50的鼠血清，2(TC培養(yǎng)另一小時(shí)。用含有O. 05% 的Tween-20的磷酸緩沖液(PBS)洗滌4次后，加入l: 2000稀釋度的，用 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠抗體(Amersham， Arlington Heights, IL)。培養(yǎng)1 小時(shí)后，洗滌滴定板，加入底物顯色，在自動(dòng)閱讀機(jī)上讀數(shù)。三次免疫接種后，用ELISA試驗(yàn)在所有免疫動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了針對(duì)所有3種 非結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體反應(yīng)。用模擬DNA (見(jiàn)圖2A)免疫的小鼠中未檢測(cè) 到抗原特異性免疫應(yīng)答。作為陽(yáng)性對(duì)照，小鼠用與完全弗氏佐劑(CFA)結(jié)合 的重組NS3， NS4和NS5非結(jié)構(gòu)蛋白三次腹腔內(nèi)接種后，如預(yù)料的，顯示了強(qiáng) 烈的體液免疫應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示)。圖2A顯示了對(duì)以DNA為基礎(chǔ)的免疫產(chǎn)生的對(duì)NS3， NS4和NS5的體液免 疫應(yīng)答。用ELISA法(每組n=5)測(cè)定血清抗體水平。對(duì)照包括用BSA和模 擬免疫小鼠的血清包裹的孔。作為陽(yáng)性對(duì)照的小鼠用重組蛋白腹膜內(nèi)免疫(數(shù) 據(jù)未顯示)。圖2B顯示在用特異性或非特異性的重組蛋白體外刺激3日后測(cè) 定的T細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞與tf'—胸苷一起培育18小時(shí)然后收集。Acpm用 扣除背景活性(如不加抗原培養(yǎng))的方法測(cè)定。和lpg的重組NS3蛋白培 育的細(xì)胞有毒性，因此未見(jiàn)增殖。用和CFA聯(lián)合的重組蛋白免疫的小鼠有5 到10倍的更強(qiáng)反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例5:淋巴細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子釋放分析用異氟烷(Aerrane， Anaquest，NJ)麻醉小鼠，并收集脾細(xì)胞。用0.83 %的NHX1/0. 17M Tris pH7.4， 25。C培養(yǎng)5分鐘，以除去紅細(xì)胞。脾細(xì)胞洗 滌兩次，用96孔圓底滴定板以每孔5xl()5細(xì)胞，200^1含有10%FBS和2 —巰 基乙醇的完全DMEM(極限必須培養(yǎng)基)(Mediatech， Washington, DC) —式3 份培養(yǎng)。用重組非結(jié)構(gòu)蛋白(NS3， NS4和NS5) (Mikrogen， Munich)在不同濃 度下O，O. 01,0. 1和l|ag/ml)刺激。作為陰性對(duì)照，用重組HCV —核心蛋白或 HbsAg蛋白(Energix)在相同濃度下刺激效應(yīng)細(xì)胞。在刺激3日后，加入3H — 胸苷(lpgCi/孔)。再培養(yǎng)細(xì)胞18小時(shí)，收集后測(cè)定摻入DNA的3H—胸苷。 摻入的放射活性用背景活性修正(Acpm)。為檢測(cè)細(xì)胞因子的釋放，將效應(yīng) 細(xì)胞按上述培養(yǎng)，用商業(yè)試劑盒按照廠商說(shuō)明(Endogen， Boston, MA)測(cè)定 培養(yǎng)上清液中的IL一2， IL一4以及干擾素y水平。為了檢査對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，收集脾細(xì)胞并用重組抗 原或用體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系表達(dá)的抗原再刺激。如用3H—胸苷摻入法所測(cè) 定(見(jiàn)圖2B)的那樣，不同抗原濃度的所有非結(jié)構(gòu)蛋白都誘導(dǎo)了實(shí)質(zhì)性的淋 巴細(xì)胞增殖。用重組蛋白腹膜免疫，作為產(chǎn)生最大刺激的方法，對(duì)所有三種 蛋白產(chǎn)生了強(qiáng)至5到10倍的淋巴細(xì)胞增殖速率(數(shù)據(jù)未顯示)。DNA為基礎(chǔ) 的免疫后測(cè)定的細(xì)胞因子分布圖顯示具有高水平y(tǒng) —干擾素(圖2C)和IL一 2 (圖2D)分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基的Tl應(yīng)答。相反的，在用編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白 的基因進(jìn)行基因免疫后，只檢測(cè)到很少的IL一4產(chǎn)生(圖2E)。圖2C， 2D以及2E顯示了體外刺激48小時(shí)后檢測(cè)到的分泌入培養(yǎng)上清液 中的細(xì)胞因子。編碼NS3， NS4和NS5的DNA構(gòu)建物誘導(dǎo)了 TJ —型的細(xì)胞因 子分布。為了比較，顯示了用重組蛋白(n二4)腹膜免疫小鼠三次的結(jié)果。作 為陰性對(duì)照，用重組HbsAg免疫小鼠。實(shí)施例6:細(xì)胞毒T一淋巴細(xì)胞活性將免疫小鼠脾細(xì)胞以含有10%FCS和2 —巰基乙醇的完全DMEM懸浮 (5x10—5M)并在體外刺激5日后分析細(xì)胞毒活性。以5U/ml的濃度一次加入 重組小鼠IL一2，將反應(yīng)細(xì)胞(4xl07)與2xl(T個(gè)經(jīng)照射的(10， 000rad)同
系的穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)NS3或NS5蛋白(SP2/NS3 — 3， SP2/NS5 — 21)的SP2/0細(xì) 胞共培養(yǎng)。5日后，收集細(xì)胞毒效應(yīng)淋巴細(xì)胞群，用5'Cr標(biāo)記的SP2/NS3 — 3 或SP2/NS5 — 21，在96孔圓底滴定板中進(jìn)行4小時(shí)51Cr釋放試驗(yàn)。親代SP2/0 或表達(dá)HCV核心蛋白的SP2—19被用作裂解液的抗原特異性和背景活性的對(duì) 照。CTL活性試驗(yàn)以效應(yīng)淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞(E: T)分別為100: 1， 30: 1， 10: 1以及3: 1的比例進(jìn)行。用含有雜交瘤上清液GK1.5(抗CD4，大 鼠)；3. 155(抗CD8，大鼠)的抗CD4 +或CD8 +單克隆抗體，在4。C，培育效應(yīng) 細(xì)胞30分鐘，洗滌，然后37。C與補(bǔ)體(l:5稀釋度的低毒性兔補(bǔ)體(Cedarlane Laboratories, Ontario, Cananda)) —起培育，進(jìn)行T細(xì)胞缺損試驗(yàn)。由于CTL應(yīng)答是從感染細(xì)胞中消除病毒，因此用51Cr釋放實(shí)驗(yàn)來(lái)分析免 疫小鼠脾細(xì)胞裂解穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并表達(dá)NS3和NS5蛋白的同系SP2/0小鼠骨髓瘤 靶細(xì)胞的能力。體外刺激5日后，NS3和NS5免疫的小鼠顯示了強(qiáng)而特異性 的細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答，而對(duì)作為靶細(xì)胞特異性對(duì)照的SP2/0或SP2—19 (穩(wěn) 定表達(dá)HCV核心蛋白)只觀察到低活性(表3A和表3B)。為說(shuō)明產(chǎn)生特異 性裂解的細(xì)胞的表型，將脾細(xì)胞和CD8 +或CD4 +反應(yīng)活性的單克隆抗體 (inAbs)在補(bǔ)體存在下共培養(yǎng)，CD8 +細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性見(jiàn)表3C。我們無(wú) 法建立穩(wěn)定表達(dá)NS4蛋白的SP2/0細(xì)胞系，因此對(duì)該HCV非結(jié)構(gòu)蛋白未測(cè)量 CTL活性。圖3顯示了細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)在不同的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的比例(100: 1， 30: 1， 10: 1， 3: 1)的情況下對(duì)NS3 (A)和NS5 (B)的反應(yīng)。脾細(xì)胞 與被照射的穩(wěn)定的NS3和NS5表達(dá)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞在體外共培養(yǎng)5天 (n=5)。然后，進(jìn)行4小時(shí)5'Cr釋放實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的耙細(xì)胞系的CTL 活性。扣除對(duì)SP2/0或SP2—19 (表達(dá)HCV核心蛋白)的背景活性以揭示特 異性裂解值。圖3C顯示了 T細(xì)胞缺損實(shí)驗(yàn)(n=3)，將細(xì)胞與抗CD8 +或CD4 +單克隆抗體一起在冰上培育30分鐘，然后與補(bǔ)體37。C培育30分鐘。對(duì)照 細(xì)胞不和補(bǔ)體以及抗CD8 +或抗CD4+的單克隆抗體一起培育。測(cè)定了作為非 相關(guān)陰性對(duì)照細(xì)胞系，即穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 HCV核心蛋白表達(dá)構(gòu)建物的SP2—19細(xì) 胞的背景活性。實(shí)施例7:體內(nèi)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞活性的評(píng)估CTL實(shí)驗(yàn)極難進(jìn)行，因?yàn)橹钡浆F(xiàn)在也無(wú)人能夠建立用于CTL活性測(cè)定的，
表達(dá)非結(jié)構(gòu)蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系。將小鼠用模擬DNA或pApNS5載體肌肉(i.ra.) 免疫三次。一些動(dòng)物還用重組NS5蛋白或兩者的組合腹膜免疫。重組蛋白(5iig 腹膜內(nèi)注射)作為NS5 — 4 (aa2622-2868)和NS5-12 (aa2007-2268)的大腸桿 菌表達(dá)蛋白(Mikogen， Munich, Germany)，涵蓋了 HCV — NS5a和HCV — NS5b部分 區(qū)域(大約NS5全長(zhǎng)的50%)的混合物提供。用多種質(zhì)粒構(gòu)建物或重組蛋白 最后一次免疫的一周后，洗滌2xl06的穩(wěn)定表達(dá)NS5的同系SP2/0衍生細(xì)胞， 在200^1的PBS中重懸浮，并作右側(cè)皮下接種。SP2/0細(xì)胞表達(dá)HCV NS5 (SP2/NS5 — 21)或HCV核心蛋白SP2/19。在這個(gè)動(dòng)物模型中，在皮下接種 15天后評(píng)價(jià)腫瘤形成，測(cè)定患腫瘤的動(dòng)物數(shù)和腫瘤的重量。
只有40X的用模擬DNA免疫，并用表達(dá)NS5的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系(SP2/NS5 一21)攻擊的小鼠在15日后生成了腫瘤。另外，以腫瘤重量的測(cè)定來(lái)確定腫 瘤的大小，與用模擬麗A或重組NS5蛋白免疫的小鼠，或用同樣的表達(dá)不同 的HCV結(jié)構(gòu)蛋白(HCV核心蛋白)的，作為對(duì)照的同系SP2/0細(xì)胞系免疫的 小鼠比較，腫瘤尺寸要小些(圖4A和4B)。事實(shí)上，90—100%的用模擬DNA 免疫，并用SP2—19細(xì)胞攻擊的小鼠顯示出腫瘤的形成，因此顯示了在該小 型動(dòng)物模型中的CTL活性的特異性。強(qiáng)調(diào)用完全弗氏佐劑配的重組NS5蛋白 來(lái)免疫不能保護(hù)動(dòng)物避免形成腫瘤，這一點(diǎn)很重要。為了評(píng)估DNA為基礎(chǔ)的 免疫和重組蛋白疫苗聯(lián)合的效果，用二者同時(shí)免疫一組動(dòng)物，產(chǎn)生了防御存 在對(duì)腫瘤形成的部分保護(hù)力，但這種方法不如用編碼NS5蛋白的DNA免疫動(dòng) 物三次那樣有效。
圖4A顯示用評(píng)價(jià)CTL活性的一種腫瘤模型獲得的代表性結(jié)果。小鼠用 pApNS5或模擬DNA (lOO)ag)肌肉注射，或用重組NS5蛋白腹膜內(nèi)注射(5pg) 免疫三次。最后一組動(dòng)物接受了聯(lián)合DNA免疫和重組蛋白。用SP2NS5 — 21或 SP2—10細(xì)胞進(jìn)行腫瘤攻擊15日后，長(zhǎng)出腫瘤的小鼠的數(shù)量以及腫瘤的重量 被測(cè)定。圖4B，自左至右，顯示了用模擬DNA免疫，并用SP2/NS5 — 21細(xì)胞 攻擊的動(dòng)物；用pApNS5免疫，并用SP2/NS5 — 21攻擊的動(dòng)物；用pApNS5免 疫，并用SP2—19 (穩(wěn)定表達(dá)HCV核心)攻擊的動(dòng)物；以及用重組NS5蛋白 腹膜內(nèi)注射三次，并用SP2/NS5 —21細(xì)胞攻擊的動(dòng)物。在第一、三和第四組 動(dòng)物的右體側(cè)上有大腫瘤形成，而第二組沒(méi)有，它是用pApNS5免疫，并用穩(wěn) 定表達(dá)NS5的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系攻擊的。
序列表
<110>總醫(yī)院有限公司(THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION)
<120〉采用丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行的基因免疫
〈130> 003095F1
<150> US 60/073， 156 <151〉 1998-01-30
〈160〉 8
<170〉 Patentln version 2.0
<210〉 1
<211> 9
<212〉 腿
<213〉 人工序列
<220〉
<223>人.T.序列的描述合成序列 <400〉 1
gccgccatg 9
<210> 2 <211> 341 <212〉 DNA <213〉 人工序列
〈220〉
<223〉人工序列的描述合成序列
〈400〉 2
gccagcccccgattgggggcgacactccaccatagatcactcccctgtgaggaactactg60
tcttcacgcagaaagcgtctagccatggcgttagtatgagtgtcgtgcagcctccaggac120
cccccctcccgggagagccatagtggtctgcggaaccggtgagtacaccggaattgccag180
gacgaccgggtcctttcttggatcaacccgctcaatgcctggagatttgggcgtgccccc240
gcgagactgctagccgagtagtgttgggtcgcgaaaggccttgtggtactgcctgatagg300
gtgcttgcgagtgccccgggaggtctcgtagaccgtgcacc341
<210〉 3
<211〉 28
<212〉 DNA 〈213〉 人工序列
<220〉
<223>人工序列的描述合成序列
<400〉 3ggtctagatt gatggcgccc atcacggc 28
<210> 4 <211〉 29 <212〉腿 <213〉 人工序列
<220〉
<223〉人工序列的描述合成序列 <400〉 4
cacacgcgtt cacgtgacga cctccaggt 29
<210〉 5
〈211〉 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220〉
〈223〉人工序列的描述合成序列 <400> 5
ggtctagatg agcacctggg tgctc 25
<210〉 6
<211〉 27
<212〉 DNA <213〉 人工序列
<220>
<223〉人工序列的描述合成序列 <400〉 6
ccaggatcct cagcatggag tggtaca 27
<210> 7
<211> 39
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<223〉人T.序列的描述合成序列 <400〉 7
tcagtctaga atgtccggct ccggctcctg gctaaggga 39
<210〉 8 〈211〉 30 <212〉 DNA <213〉 人工序列
<220>
<223〉人工序列的描述合成序列 <400〉 8
agctacgcgt tcaccggttg gggaggaggt
權(quán)利要求
1.一種重組核酸分子，其特征在于，它包含編碼丙型肝炎非結(jié)構(gòu)蛋白NS4的核苷酸序列，其中所述重組核酸不編碼NS2蛋白。
2. 如權(quán)利要求1所述的重組核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列和 人類細(xì)胞中有功能性的調(diào)控元件可操作性相連，所述有功能性的調(diào)控元件選 自啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸序列以及任選的丙型肝炎病毒5'UTR。
3. 如權(quán)利要求2所述的重組核酸分子，其特征在于，所述啟動(dòng)子是巨細(xì) 胞病毒啟動(dòng)子，所述增強(qiáng)子是Rous肉瘤病毒增強(qiáng)子。
4. 一種包含權(quán)利要求1中所述核酸分子的重組宿主細(xì)胞。
5. —種藥物組合物，其特征在于，包含a) 如權(quán)利要求1所述的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列 和人類細(xì)胞中功能性的調(diào)控元件可操作性相連，所述有功能性的調(diào)控元件選 自啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸序列以及任選的丙型肝炎病毒5'UTR;以及b) 藥物接受載體或稀釋劑。
6. 如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述啟動(dòng)子是巨細(xì)胞 病毒啟動(dòng)子，所述增強(qiáng)子是Rous肉瘤病毒增強(qiáng)子。
7. 如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，它還包含促進(jìn)劑。
8. 如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述促進(jìn)劑是丁哌卡因。
9. 權(quán)利要求1所述的重組核酸分子的用途，用于制備在未感染丙型肝炎 病毒的人體中誘導(dǎo)對(duì)丙型肝炎病毒的免疫應(yīng)答的藥物。
10. 如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括細(xì)胞應(yīng)答。
11. 如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括體液應(yīng)答。
12. 如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述重組核酸分子存在于 包含有藥物接受載體或稀釋劑的藥物組合物里。
13. 如權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物還包含促 進(jìn)劑。
14. 如權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于，所述促進(jìn)劑是丁哌卡因。
15. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物的用途，其特征在于，用于制備對(duì)丙型肝炎病毒易感的人免疫的藥物。
16. 如權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于，在給予所述藥物組合物的 部位給予丁哌卡因。
17. 權(quán)利要求1所述的重組核酸分子的用途，其特征在于，用于制備對(duì)丙型肝炎病毒易感的人免疫的藥物。
18. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物的用途，其特征在于，用于制備治療丙型肝炎病毒感染的藥物。
19. 如權(quán)利要求18所述用途，其特征在于，在給予所述藥物組合物的 部位給予所述人丁哌卡因。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種編碼丙型肝炎非結(jié)構(gòu)蛋白的核酸分子(包括具體公開(kāi)的DNA序列)。還公開(kāi)了藥物組合物，它包含編碼NS3、NS4和NS5，或它們組合的核苷酸序列的丙型肝炎非結(jié)構(gòu)蛋白的核酸分子，該核酸分子和人體細(xì)胞內(nèi)功能性的調(diào)控元件可操作性相連。還公開(kāi)了對(duì)丙型肝炎病毒易感或被感染的個(gè)體進(jìn)行免疫的方法，該方法包括施用這些藥物組合物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101126095SQ20071013989
公開(kāi)日2008年2月20日 申請(qǐng)日期1999年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月30日
發(fā)明者J·萬(wàn)德斯, J·恩克 申請(qǐng)人:總醫(yī)院有限公司