一種超聲輔助酶法制備野生河蚌肉蛋白源抗氧化肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種河蚌抗氧化肽及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]自Harman提出自由基理論以來(lái)，人們對(duì)機(jī)體氧化產(chǎn)生的自由基與衰老和疾病之間的關(guān)系越來(lái)越重視?？寡趸瘎┮搽S之被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)中，但目前大部分使用的是人工合成的抗氧化劑，這些抗氧化劑在使用時(shí)存在很多的安全隱患，甚至于長(zhǎng)期服用會(huì)在機(jī)體內(nèi)積累毒素并有致癌的危險(xiǎn)等。近些年，介于氨基酸和蛋白質(zhì)間的肽類物質(zhì)逐漸被研宄者們開(kāi)發(fā)，人們發(fā)現(xiàn)其具有更好的抗氧化活性，而且無(wú)毒性或者低毒性，且肽類物質(zhì)本身就具有豐富的營(yíng)養(yǎng)特性，是優(yōu)異的抗氧化劑。
[0003]隨著國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)生物資源的開(kāi)發(fā)利用，關(guān)于水產(chǎn)蛋白制備抗氧化肽的研宄也逐漸展開(kāi)，如白蝦頭、沙丁魚、扇貝、合浦珠母貝、黃緣盒龜?shù)龋绣潮砻?，水產(chǎn)蛋白制備的抗氧化肽具有良好的抗氧化活性及其他功能特性，是制備抗氧化肽的理想原料。
[0004]我國(guó)野生河蚌分布廣泛，尤其是吉林省松花江流域資源極其豐富，價(jià)格低廉，2013?2014年僅為0.5?0.7元/kg。蚌肉因烹煮后肉質(zhì)粗韌而食用口感不佳，但蚌肉中含豐富蛋白質(zhì)且蚌肉中氨基酸種類齊全，必需氨基酸占氨基酸總量的44.43%，高于WHO/FAO模式的推薦值，此外，蚌肉還含有豐富的多糖、不飽和脂肪酸及礦質(zhì)元素，是一種質(zhì)優(yōu)、價(jià)廉的可用資源。而目前對(duì)蚌肉精深加工的研宄較少、加工利用率較低，產(chǎn)品形式單一。
[0005]超聲波輔助酶解法是近些年發(fā)展起來(lái)的一種新的酶解方式。一般來(lái)說(shuō)，頻率超過(guò)20kHz的聲波都屬于超聲波，其具有頻率大、波長(zhǎng)小、穿透力強(qiáng)等特點(diǎn)。當(dāng)傳播介質(zhì)為液體時(shí)，超聲波會(huì)在液體內(nèi)產(chǎn)生空化作用，使得液體局部產(chǎn)生可達(dá)幾萬(wàn)個(gè)大氣壓的作用力，使蛋白質(zhì)降解或者改變其構(gòu)象，促使其親水基團(tuán)更多地暴露出來(lái)，從而提高蛋白質(zhì)在水中的溶解度，有利于酶和底物蛋白質(zhì)結(jié)合，最終提高酶解效率。與此同時(shí)，使用超聲波技術(shù)無(wú)化學(xué)殘留、安全、簡(jiǎn)單，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種超聲輔助酶法制備野生河蚌肉蛋白源抗氧化肽的方法。以本發(fā)明所提供的輔助酶解工藝，可提高酶解過(guò)程中生物活性肽的釋放量，增強(qiáng)所得河蚌抗氧化肽的抗氧化活性，為野生河蚌資源的開(kāi)發(fā)和工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
[0007]本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，
[0008]一種超聲輔助酶法制備野生河蚌肉蛋白源抗氧化肽的方法，包括如下步驟:
[0009](I)野生鮮活河蚌，剝殼去內(nèi)臟，河蚌肉經(jīng)絞肉機(jī)絞碎后過(guò)膠體磨得河蚌肉勻漿；
[0010](2)河蚌肉勻漿中加入蒸餾水調(diào)節(jié)底物蛋白濃度，調(diào)節(jié)體系pH值，加入中性蛋白酶，超聲輔助酶解；
[0011](3)經(jīng)超聲輔助酶解的體系于恒溫水浴振蕩器中繼續(xù)酶解并維持pH值穩(wěn)定，滅酶，冷卻到室溫，得到酶解液；
[0012](4)將酶解液離心，上清液經(jīng)超濾，冷凍干燥得到河蚌抗氧化肽。
[0013]本發(fā)明所述步驟(2)中底物蛋白濃度為6%，調(diào)節(jié)混合體系pH值所用的溶液為
1.0moI/L的鹽酸溶液，pH值調(diào)節(jié)至5.90?6.10，中性蛋白酶的加入量為4141U/g(U為蛋白酶活力單位，g為底物蛋白質(zhì)量單位)，超聲波功率為140?160W，溫度為35?45°C，超聲時(shí)間為25?35min ；
[0014]本發(fā)明所述步驟(3)中水浴溫度為48?52°C，酶解時(shí)間為2.8?3.2h，維持反應(yīng)體系pH值穩(wěn)定所用的溶液為1.0moI/L的氫氧化鈉溶液，體系pH值為5.90?6.10，滅酶水浴溫度為100°C，時(shí)間為10?15min ；
[0015]本發(fā)明所述步驟(4)中酶解液離心轉(zhuǎn)速為10000r/min，時(shí)間為10?15min，所得上清液采用正切流動(dòng)過(guò)濾系統(tǒng)超濾，濾膜分子量大小為3000Da，超濾參數(shù)為:溫度為15?35°C、操作壓力為0.12?0.18MPa，將小分子抗氧化肽溶液冷凍干燥，干燥條件為:干燥溫度為-80?-90°C，真空度為5?15Pa。
[0016]其中，所述步驟⑵中所加中性蛋白酶為本發(fā)明經(jīng)過(guò)前期大量的研宄所篩選出的酶解效果好且性價(jià)比高的食品級(jí)工業(yè)用酶，本發(fā)明所用中性蛋白酶購(gòu)買于諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司，測(cè)其酶活力為43.8萬(wàn)U/mL。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn):
[0018](I)野生河蚌資源豐富，產(chǎn)量大，蛋白質(zhì)含量高，是制備抗氧化活性肽優(yōu)質(zhì)的原料來(lái)源，且價(jià)格十分低廉，來(lái)源穩(wěn)定；
[0019](2)采用超聲波輔助酶解法制備河蚌抗氧化肽，能耗小、效率高且無(wú)化學(xué)殘留、安全、簡(jiǎn)單，既提高了生物活性肽的回收率，又增強(qiáng)了其抗氧化效果，且通過(guò)超濾技術(shù)，可得到分子量小于3000Da的抗氧化肽，lmg/mL的反應(yīng)體系還原力(A700)為0.263，DPPH自由基清除率為80.4% ；
[0020](3)制備河蚌抗氧化肽實(shí)施的過(guò)程中所需的酶解、超聲波、離心、超濾、冷凍干燥等設(shè)備技術(shù)成熟度高、可行性強(qiáng)，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；
[0021](4)本發(fā)明以野生河蚌肉為原料，制備河蚌抗氧化肽。為河蚌肉活性肽作為功能性食品、藥品及化妝品輔料和功能因子提供理論基礎(chǔ)，對(duì)拓寬河蚌精深加工途徑、實(shí)現(xiàn)野生河蚌肉高值化利用，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和良好的經(jīng)濟(jì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0023]一種超聲輔助酶法制備野生河蚌肉蛋白源抗氧化肽的方法，制備流程如下:野生河蚌一預(yù)處理一超聲波輔助酶解處理一滅酶一離心一超濾一冷凍干燥一抗氧化肽。
[0024]以下為具體實(shí)施步驟:
[0025](I)原料預(yù)處理:取鮮活野生河蚌，剝殼，去除內(nèi)臟及其他雜物，用絞肉機(jī)將河蚌肉絞碎，通過(guò)膠體磨兩次，將碎肉磨成勻漿；
[0026](2)超聲處理:取一定量的蚌肉勻漿，通過(guò)添加蒸餾水調(diào)節(jié)底物蛋白濃度為6%，用1.0moI/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為6.0，按4141U/g的添加量向體系中添加中性蛋白酶，混勻，將混合物置于超聲功率為150W、超聲溫度為40°C的超聲波儀器中超聲輔助酶解處理30mino
[0027](3)酶解:將經(jīng)超聲波處理的混合物移至50°C的水浴振蕩器中繼續(xù)酶解3h，并通過(guò)添加1.0moI/L的氫氧化鈉溶液維持反應(yīng)體系pH值穩(wěn)定，體系pH值為6.0 ；
[0028](4)滅酶:酶解反應(yīng)結(jié)束后，將混合物移至100°C沸水浴中滅酶lOmin，冰水浴冷卻，得酶解液；
[0029](5)離心:將酶解液在10000r/min的條件下離心lOmin，取上清液；
[0030](6)超濾:將上清液通過(guò)截留分子量為3000Da的正切流動(dòng)過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行超濾處理，處理溫度為25°C，操作壓力為0.15MPa，收集分子量小于3000Da的部分。
[0031](7)冷凍干燥:將超濾得到的超濾液在-18 °C條件下預(yù)凍后，在溫度為-80?_90°C、真空度為5?15Pa的條件下冷凍干燥12h。
[0032](8)抗氧化肽:經(jīng)冷凍干燥后即得河蚌肉抗氧化肽，產(chǎn)品呈淡黃色且略帶腥味，lmg/mL時(shí)，還原力(A700)為0.263，DPPH自由基清除率為80.4% ο
[0033]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，對(duì)發(fā)明而言僅僅是說(shuō)明性的，并非對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思和范圍進(jìn)行限定。本領(lǐng)域中專業(yè)技術(shù)人員理解，在不脫離本發(fā)明思想的前提下可對(duì)其技術(shù)方案作出各種改變和修改，但都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種超聲輔助酶法制備野生河蚌肉蛋白源抗氧化肽的方法，其特征在于:步驟如下 (1)野生鮮活河蚌，剝殼、去內(nèi)臟，河蚌肉經(jīng)絞肉機(jī)絞碎后過(guò)膠體磨得河蚌肉勻漿； (2)河蚌肉勻漿中加入蒸餾水調(diào)節(jié)底物蛋白濃度，調(diào)節(jié)體系pH值，加入中性蛋白酶，超聲輔助酶解； (3)經(jīng)超聲輔助酶解的體系于恒溫水浴振蕩器中繼續(xù)酶解并調(diào)節(jié)pH值穩(wěn)定，滅酶，冷卻到室溫，得到酶解液； (4)將酶解液離心，上清液超濾，冷凍干燥得到河蚌抗氧化肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲輔助酶法制備野生河蚌肉蛋白源抗氧化肽的方法，其特征在于:步驟(2)中所述的底物蛋白濃度為6%，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值所用的溶液為1.0mol/L的鹽酸溶液，反應(yīng)體系pH值調(diào)節(jié)至5.90?6.10，中性蛋白酶的加入量為4141U/g(U為蛋白酶活力單位，g為底物蛋白質(zhì)量單位)，超聲波功率為140?160W，溫度為35?45°C，超聲時(shí)間為25?35min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲輔助酶法制備野生河蚌肉蛋白源抗氧化肽的方法，其特征在于:步驟(3)中所述的水浴溫度為48?52°C，時(shí)間為2.8?3.2h，調(diào)節(jié)體系pH值穩(wěn)定所用的溶液為1.0moI/L的氫氧化鈉溶液，反應(yīng)體系pH值為5.90?6.10，滅酶時(shí)所用水浴溫度為100°C，時(shí)間為10?15min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲輔助酶法制備野生河蚌肉蛋白源抗氧化肽的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的酶解液離心采用的轉(zhuǎn)速為10000r/min，時(shí)間為10?15min，離心所得上清液超濾所采用的超濾膜孔徑為3000Da，超濾溫度為15?35 °C、操作壓力為0.12?0.18MPa，收集小于3000Da的抗氧化肽溶液冷凍干燥，干燥條件為:干燥溫度為-80?_90°C，真空度為5?15Pa。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種超聲輔助酶法制備野生河蚌肉蛋白源抗氧化肽的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，其主要步驟是：將鮮活野生河蚌剝殼取肉，河蚌肉絞碎勻漿，添加中性蛋白酶，在底物蛋白濃度為6％，pH值為6.0，超聲功率為150W，40℃條件下超聲處理30min，然后將反應(yīng)體系在50℃，pH值為6.0的條件下繼續(xù)酶解3h，滅酶，離心，酶解液經(jīng)過(guò)超濾進(jìn)行純化并通過(guò)冷凍干燥制備抗氧化肽。以上述工藝制得的抗氧化肽呈淡黃色、略帶腥味，具有較高的抗氧化活性，1mg/mL的反應(yīng)體系還原力(A700)為0.263，DPPH自由基清除率為80.4％，是優(yōu)異的抗氧化劑。
【IPC分類】C07K1-34, C12P21-06
【公開(kāi)號(hào)】CN104673868
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510119313
【發(fā)明人】董周永, 徐兆剛, 李明月, 徐敏, 關(guān)天竺, 周亞軍, 任輝
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年3月18日