專利名稱：一種關(guān)節(jié)軟骨原性微載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微載體，尤其涉及一種關(guān)節(jié)軟骨原性微載體的制備方法及由該方法制備得到的產(chǎn)品，屬于生物醫(yī)學(xué)組織工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
組織工程技術(shù)是一種應(yīng)用生物技術(shù)在體外制備與人體相同的組織，用于修復(fù)人體病變或缺損組織，又稱再生醫(yī)學(xué)。
軟骨缺損的修復(fù)主要依賴工程軟骨組織。構(gòu)建軟骨組織工程的一個重要條件是軟骨細胞在體外的大量擴增，采用生物反應(yīng)器及微載體技術(shù)培養(yǎng)軟骨細胞為高效擴增軟骨細胞的一條途徑。目前市售的微載體不但價格高昂，而且在使用時需要把軟骨細胞從微載體上消化下來，勢必存在部分軟骨細胞的損傷或流失。另外，也存在細胞-微載體不能完全分離，微載體也被植入患者機體體內(nèi)等可能，不但影響再生的工程化軟骨的質(zhì)量，同時也可能對患者機體產(chǎn)生危害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種既能大量擴增軟骨細胞同時又能作為細胞支架的關(guān)節(jié)軟骨原性微載體。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實現(xiàn)的一種關(guān)節(jié)軟骨原性微載體，由以下方法制備而成1)、將新鮮關(guān)節(jié)軟骨凍干，用粉碎機將之粉碎，過篩，得直徑為150-200μm的顆粒備用；2)、向顆粒中加入10倍體積的0.25％胰蛋白酶，37℃持續(xù)振蕩24-48h后用蒸餾水洗3次，用1％Triton X-100在4℃溫度下持續(xù)振蕩48-72h，然后用蒸餾水沖洗48h；
3)、1000rpm，離心10min，取沉淀，將沉淀與蒸餾水按1∶3體積混合后，置入冷凍干燥機內(nèi)凍干處理12小時，經(jīng)25kGy鈷60輻照滅菌再用10倍體積的0.25％胰蛋白酶消化15min，攪拌，再粉碎成顆粒狀，蒸餾水洗3次，即得。
上述制備方法中，上述制備方法中，所用的關(guān)節(jié)軟骨可為人、豬、羊或牛的關(guān)節(jié)軟骨。步驟2)中優(yōu)選為向顆粒中加入0.25％胰蛋白酶后37℃持續(xù)振蕩48h；加入1％Triton X-100后在4℃溫度下優(yōu)選持續(xù)振蕩72h。
本發(fā)明關(guān)節(jié)軟骨原性微載體具有下述優(yōu)點1、本發(fā)明關(guān)節(jié)軟骨原性微載體在制備過程中用胰酶敲除了軟骨蛋白聚糖，使關(guān)節(jié)軟骨源性微載體呈絨球狀或毛刷狀(見圖1)，極大增加了表面接觸面積，軟骨細胞能夠更好的黏附其上，生長狀態(tài)好。
2、本發(fā)明微載體由軟骨基質(zhì)構(gòu)成，細胞在其上擴增后不須洗脫細胞，可直接植入體內(nèi)，避免了因洗脫細胞而造成的損失。
3、在制備過程中用Triton X-100脫去了細胞成分，剔除了抗原性。如再植入體內(nèi)，不被機體排斥。
4、制備成本低，方法簡便易行，所用試劑價廉、易得。
本發(fā)明微載體使用方法將微載體根據(jù)需要與軟骨細胞和培養(yǎng)基，按下述比例放入細胞培養(yǎng)液中250萬骨髓基質(zhì)干細胞∶50mg本發(fā)明微載體∶10ml培養(yǎng)基(DMEM見后)，再加入軟骨細胞，置于旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)器(生物反應(yīng)器)中培養(yǎng)。
其中，軟骨細胞培養(yǎng)基由高糖型DMEM、HEPES、L-脯氨酸、維生素C和NEAA配制而成，具體配制過程如下取1L裝粉末狀高糖型DMEM培養(yǎng)基1袋，倒入潔凈三角燒瓶中，加入HEPES 2.97g、L-脯氨酸0.046g，維生素C 0.05g，NEAA 10ml，加三蒸水950ml溶解，用NaHCO3調(diào)整pH值到7.2，再加三蒸水到1000ml，用Zeiss不銹鋼濾器過濾除菌(雙層濾膜同上)，密閉分裝到250ml瓶中，瓶口用火棉膠帽封口。4℃冰箱儲存待用。


圖1為本發(fā)明關(guān)節(jié)軟骨源性微載體的外形圖。
圖2為用本發(fā)明微載體擴增軟骨細胞8小時后的結(jié)果。
圖3為用本發(fā)明微載體擴增軟骨細胞30小時后的結(jié)果。
以下通過實施例來進一步描述本發(fā)明的有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式1、取豬新鮮關(guān)節(jié)軟骨1kg，凍干，用粉碎機將之粉碎，過篩，得直徑為200μm的顆粒備用；2、將顆粒中加入10倍體積的0.25％胰蛋白酶，37℃持續(xù)蕩48h后用蒸餾水洗3次，用1％Triton X-100在4℃溫度下持續(xù)振蕩72h，然后用蒸餾水沖洗48h；3、1000rpm，離心10min，取沉淀，將沉淀與蒸餾水按1∶3體積混合后，置入冷凍干燥機內(nèi)凍干處理12小時，經(jīng)25kGy鈷60輻照滅菌再用10倍體積的0.25％胰蛋白酶消化15min，攪拌，再粉碎成顆粒狀，蒸餾水洗3次，即得。
1、取牛新鮮關(guān)節(jié)軟骨4kg，凍干，用粉碎機將之粉碎，過篩，得直徑為150μm的顆粒備用；2、將顆粒中加入10倍體積的0.25％胰蛋白酶(購于Sigma公司)，37℃持續(xù)振蕩48h后用蒸餾水洗3次，用1％Triton X-100在4℃溫度下持續(xù)振蕩72h，然后用蒸餾水沖洗48h；3、1000rpm，離心10min，取沉淀，將沉淀與蒸餾水按1∶3體積混合后，置入冷凍干燥機內(nèi)凍干處理12小時，經(jīng)25kGy鈷60輻照滅菌再用10倍體積的0.25％胰蛋白酶(購于Sigma公司)消化15min，攪拌，再粉碎成顆粒狀，蒸餾水洗3次，即得。
1、取人新鮮關(guān)節(jié)軟骨0.5kg，凍干，用粉碎機將之粉碎，過篩，得直徑為180μm的顆粒備用；2、將顆粒中加入10倍體積的0.25％胰蛋白酶(購于Sigma公司)，37℃持續(xù)振蕩48h后用蒸餾水洗3次，用1％Triton X-100在4℃溫度下持續(xù)振蕩72h，然后用蒸餾水沖洗48h；3、1000rpm，離心10min，取沉淀，將沉淀與蒸餾水按1∶3體積混合后，置入冷凍干燥機內(nèi)凍干處理12小時，經(jīng)25kGy鈷60輻照滅菌再用0.25％胰蛋白酶消化15min，攪拌，再粉碎成顆粒狀，蒸餾水洗3次，即得。本發(fā)明微載體擴增軟骨細胞效果試驗一、試驗材料1、供試樣品本發(fā)明實施例1所制備的微載體。
2、培養(yǎng)基1)DMEM配方(單位g/L)精氨酸(L-Arginine-HCl)0.084、胱氨酸(L-Cystine-2HCl)0.0626、谷氨酰胺(L-Glutamine)0.584、甘氨酸(Glycine)0.03、組氨酸(L-Histidine-HCl-H2O)0.042、異亮氨酸(L-Isolucine)0.105、亮氨酸(L-Lucine)0.105、賴氨酸(L-Lycine-HCl)0.146、蛋氨酸(L-Methionine)0.03、苯丙氨酸(L-Phenylalanine)0.066、絲氨酸(L-Serine)0.042、蘇氨酸(L-Threonine)0.095、色氨酸(L-Tryptophan)0.016、酪氨酸二鈉(L-Tyrosine-2Na-2H2O)0.10376、纈氨酸(L-Valine)0.094、氯化膽堿(Choline Chloride)0.004、葉酸0.004、肌醇0.0072、尼克酰胺0.004、D-泛酸0.004、吡哆醇(Pyridoxal-HCl)0.004、核黃素0.0004、硫胺素(Thiamine-HCl)0.004、氯化鈣0.2、硝酸鐵(Ferric Nitrate-9H2O)0.0001、硫酸鎂0.09767、氯化鉀0.4、氯化鈉6.4、磷酸鈉0.109、葡萄糖4.5、酚紅(Phenol Red-Na)0.0159。
2)F-12配方(單位g/L)丙氨酸0.009、精氨酸0.211、天門冬氨酸0.013、天冬酰氨0.015、半胱氨酸0.035、谷氨酸0.0147、谷氨酰氨0.146、甘氨酸0.0751、組氨酸0.0209、異亮氨酸0.0039、亮氨酸0.013、賴氨酸0.0365、蛋氨酸0.0045、苯丙氨酸0.0049、脯氨酸0.0345、絲氨酸0.0105、蘇氨酸0.0119、色氨酸0.002、酪氨酸二鈉0.0077、纈氨酸0.0117、氯化鈣0.0441、氯化鉀0.224、磷酸二氫鈉0.142、氯化鈉7.1、生物素0.0000073、氯化膽堿0.0139、肌醇0.018、尼克酰胺0.000004、D-泛酸0.00048、吡哆醛0.000006、硫胺素0.00034、核黃素0.00004、維生素B-12 0.00136、葉酸0.000132、D-葡萄糖1.802、酚紅0.0013、丙酮酸鈉0.110、次黃嘌呤0.0041、胸苷0.00073、碳酸氫鈉1.176。
二、試驗方法及結(jié)果取人關(guān)節(jié)軟骨，用膠元酶消化，體外培養(yǎng)至第6代，置入含有本發(fā)明微載體的培養(yǎng)液(DMEM/F-12，加10％牛血清白蛋白，其中，DMEM∶F-12＝1∶1)中繼續(xù)培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞黏附逐漸增多，培養(yǎng)30小時后，細胞布滿于微載體上(見圖2和圖3)。
試驗結(jié)果說明，本發(fā)明微載體具有良好的擴增軟骨細胞的效果。
權(quán)利要求
1.一種制備關(guān)節(jié)軟骨原性微載體的方法，包括以下步驟1)、將新鮮關(guān)節(jié)軟骨凍干后粉碎，過篩，得直徑為150-200μm的顆粒備用；2)、向顆粒中加入10倍體積的0.25％胰蛋白酶，37℃持續(xù)振蕩24-48h后用蒸餾水洗3次，用1％Triton X-100在4℃溫度下持續(xù)振蕩48-72h，然后用蒸餾水沖洗48h；3)、1000rpm，離心10min，取沉淀，將沉淀與蒸餾水按1∶3體積混合后，置入冷凍干燥機內(nèi)凍干處理12小時經(jīng)25kGy鈷60輻照滅菌后加入10倍體積的0.25％胰蛋白酶消化15min，攪拌，再粉碎成顆粒狀，蒸餾水洗3次，即得。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的關(guān)節(jié)軟骨為人、豬、牛或羊的關(guān)節(jié)軟骨。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟2)中向顆粒中加入0.25％胰蛋白酶后37℃持續(xù)振蕩48h。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟2)中向顆粒中加入1％Triton X-100后在4℃溫度下持續(xù)振蕩72h。
5.一種關(guān)節(jié)軟骨原性微載體，其特征是由權(quán)利要求1～4任一所述方法制備得到的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的關(guān)節(jié)軟骨原性微載體，該微載體通過以下方法制備而成1)將新鮮關(guān)節(jié)軟骨凍干后粉碎，過篩，收集過篩后的顆粒備用；2)向顆粒中加入胰蛋白酶，37℃持續(xù)振蕩24－48 h后用蒸餾水洗3次，接著用Triton X－100在4℃下持續(xù)振蕩48－72h，然后用蒸餾水沖洗48h；3)離心取沉淀，將沉淀與蒸餾水按1∶3體積混合后，凍干處理12小時，經(jīng)25kGy鈷60輻照滅菌再用胰蛋白酶消化，攪拌，再粉碎成顆粒狀，蒸餾水洗3次，即得。本發(fā)明微載體呈絨球狀或毛刷狀，具有較大的比表面積，軟骨細胞能夠更好的黏附其上，軟骨細胞在其上迅速繁殖、擴增后可直接植入體內(nèi)能有效促進軟骨再生，避免了因洗脫細胞而造成軟骨細胞的損失。
文檔編號A61L27/36GK1868424SQ20051007300
公開日2006年11月29日 申請日期2005年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月27日
發(fā)明者盧世璧, 張建黨, 袁玫, 黃靖香, 孫明學(xué) 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院