專利名稱：紅色紅曲霉(Monascus rubber)Mr-99菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)保健品領(lǐng)域，涉及一株液體發(fā)酵高產(chǎn)胞外多糖紅色紅曲霉 Mr-99菌株、用途和多糖制備方法。
背景技術(shù)：
真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的由10個以上單糖以糖苷鍵連接而成的高分子多聚物，具有能夠控制細(xì)胞分裂分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長衰老，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能的一類活性多糖。自1970年日本千原羽田從香菇中分離出一種抗腫瘤的多糖后， 科學(xué)界掀起了食用真菌多糖研究的熱潮，目前己在國內(nèi)臨床應(yīng)用的真菌多糖主要有香菇多糖、云芝多糖、云芝糖肽、靈芝肽多糖、猴頭菌多糖、銀耳多糖等。紅曲霉是一類十分重要的藥用真菌，系中藥紅曲的基原菌，是我國重要的微生物資源，在我國已有上千年的使用歷史，被廣泛用于食品發(fā)酵劑，食品著色劑和中藥配伍的生產(chǎn)。紅曲霉屬腐生真菌，通常出現(xiàn)在乳酸自然發(fā)酵的基質(zhì)中，大曲、制曲作坊、釀酒液等都適于其繁殖，紅曲霉最適生長PH 3.5 5.0，可耐pH 2. 5，尤其嗜乳酸；適宜生長溫度范圍為 42°C，能耐10 %的乙醇。由于紅曲霉在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生多種具有生理活性的代謝產(chǎn)物如紅曲色素、Monacolin類物質(zhì)、Y-氨基丁酸以及多種酶類等，近年來，國內(nèi)外關(guān)于紅曲霉制劑及其代謝產(chǎn)物的研究成為熱點。多糖類物質(zhì)是紅曲霉所含有的重要化學(xué)成分之一，相關(guān)研究表明紅曲多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和提高免疫力等多種生物學(xué)功能，目前國內(nèi)對紅曲多糖的發(fā)酵生產(chǎn)工藝研究較少，尚處于探索階段，國內(nèi)已有文獻(xiàn)報道的產(chǎn)胞外多糖紅曲霉菌株的產(chǎn)量均處于較低水平，達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
針對市場上紅曲多糖需求日益增長，而目前高產(chǎn)紅曲多糖菌株缺乏、發(fā)酵生產(chǎn)工藝不完善等問題。本發(fā)明的目的是提供一株紅色紅曲霉Ofoaascm r^/Mer) Mr-99菌株。 本發(fā)明的另外一個目的是提供采用上述的紅色紅曲霉(ifoaascm rubber) Mr-99菌株制備紅曲胞外多糖的方法。為了實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
紅色紅曲霉(ifoaasc^s rubber) Mr-99菌株，該菌株已于2011年3月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :M2011053。該菌株從自然發(fā)酵紅曲米中篩選到一株紅曲霉Mr-99菌株，該菌株具有高產(chǎn)紅曲胞外多糖的特點，可用于紅曲胞外多糖工業(yè)化生產(chǎn)菌株。該菌株在CYA培養(yǎng)基上25 °C培養(yǎng)后7 d，菌落直徑23 mm 25 mm，表面質(zhì)地叢轉(zhuǎn)毛狀，邊緣流蘇狀；菌落初期為白色絨毛狀，5 d后中心菌絲開始變紅色，培養(yǎng)25 d后菌落的色澤為粉紅色，直徑達(dá)到60 mm (附圖1、圖2)。顯微鏡觀察菌絲光滑、有隔膜、含油滴、直徑3 μπι-7 μ m，分枝狀，含有色素顆粒；分生孢子球形或倒梨形，具有平截基部，單生或成鏈，直徑6 μπι 8 μ m;閉囊殼呈橢球形，透明或紅色，內(nèi)充滿密集排列的子囊孢子，子囊孢子卵形或者球形，大小為6 μ m 7X4.5 μ m，淡紅色(附圖3、圖4)。生理生化實驗表明，該菌株的適宜生長溫度范圍為觀°C 36 °C，最適pH范圍為 4. 0 5. 0，不能水解明膠，生長速度快，不產(chǎn)生桔霉素、抗高溫等生物學(xué)特性。能夠很好的利用各種有機(jī)碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、番薯粉等，其中最適生長碳源為麥芽糖；在氮源利用方面，可以利用可利用硝酸鈉、氯化銨、硝酸銨等無機(jī)氮源和牛肉膏、酵母粉、蛋白胨等多種有機(jī)氮源，但在有機(jī)氮源中較無機(jī)氮源中生長的好，而且在以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基中生長最好。ITS基因序列分析結(jié)果表明，與紅色紅曲霉(Mwa1SCM r油力er)的相似度最高達(dá) 99%。根據(jù)李鐘慶和郭芳紅曲菌分種檢索表、ITS基因序列Blast比對結(jié)果和傅立葉變換紅外光譜掃描圖譜，將菌株Mr-99為鑒定紅色紅曲霉(ifoaasc^s rubber)。為了實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案 一種高產(chǎn)紅曲胞外多糖的生產(chǎn)方法，該方法包括以下的步驟
1)取所述的紅色紅曲霉Mr-99菌株保存菌種，在無菌條件下，用接種針挑少許菌種，轉(zhuǎn)接于含PDA的培養(yǎng)平板上，活化培養(yǎng)；以同樣方式接入活化好的菌種到PDA培養(yǎng)平板上，培養(yǎng)制得一級種子；
2)在查氏合成培養(yǎng)液，接入一級種子菌餅，搖床培養(yǎng)制得二級發(fā)酵種子；
3)接種二級發(fā)酵種子，發(fā)酵時間為70 IOOh；
4)發(fā)酵培養(yǎng)完畢，過濾發(fā)酵液，濾液離心，去除沉淀，取上清；
5)離心后的上清液中用乙醇沉淀法提取胞外多糖。作為優(yōu)選，上述步驟3)中有機(jī)碳源選用乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉和番薯粉中的一種或多種，氮源選用無機(jī)氮源和有機(jī)氮源中的一種或多種。作為最優(yōu)選，上述的有機(jī)碳源選用麥芽糖。作為再優(yōu)選，上述的無機(jī)氮源選用硝酸鈉、氯化銨、硝酸銨中的一種或多種，有機(jī)氮源選用牛肉膏、酵母粉、蛋白胨中的一種或多種。作為優(yōu)選，上述步驟3)中接種量為6% 10% (V/V)，發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)數(shù)150 250 r/ min，溫度30 35 "C,通氣量80 150 L/h,罐壓0. 1 0. 5MPa。作為優(yōu)選，上述步驟5)中向上清液中加入無水乙醇后置于2 8°C溫度下靜止過夜，然后于10000 15000rpm離心5 20 min，沉淀用乙醇和丙酮反復(fù)沖洗，最后于10000 15000離心5 20 min取沉淀烘干，即為胞外多糖。作為再優(yōu)選，上述的無水乙醇與上清液的體積比為2:1 6 :1。紅色紅曲霉(ifo/K^cm iT/Mer)Mr-99菌株篩選自自然發(fā)酵的紅曲米，可用于發(fā)酵生產(chǎn)紅曲胞外多糖。該菌株在葡萄糖60 g/L，蛋白胨20 g/L,K2HPO4 10 g/L，MgSO4 ·7Η20， 1.1 g/L, KCl 0.5 g/L, FeSO4 ·7Η20 0.01 g/L，pH 6. 5 的發(fā)酵培養(yǎng)基上，在搖床轉(zhuǎn)速 200 r/ min，溫度32 °C的發(fā)酵條件下，培養(yǎng)96 h ；發(fā)酵液用乙醇沉淀法提取，經(jīng)苯酚-硫酸比色法 (Dubois et al., 1956)檢測胞外多糖產(chǎn)量最高可達(dá)18. 6 g/L。紅曲霉的應(yīng)用至今已有上千年的歷史，在民間紅曲霉廣泛作為粗藥和用于制醋、釀酒等，在食品生產(chǎn)中已獲得了長期使用，實踐證明，紅曲霉多數(shù)種都是比較安全的，被FDA認(rèn)為是GRAS(generally recognized as safe)級食品添加劑。因此此法生產(chǎn)的紅曲胞外多糖不存在安全上的隱患，能達(dá)到食品安全級。


圖1為紅色紅曲霉(Monascus rubber) Mr-99菌株在CYA上培養(yǎng)7天菌落正面照片。圖2為紅色紅曲霉(Monascus rubber ) Mr-99菌株在CYA上培養(yǎng)7天菌落背面照片。圖3為紅色紅曲霉(Monascus rubber) Mr-99菌株的菌絲顯微特征。圖4為紅色紅曲霉(Monascus rubber) Mr-99菌株的閉囊殼顯微特征。圖5為紅色紅曲霉(Monascus rubber) Mr-99菌株的紅外光譜掃描圖譜。圖6為紅色紅曲霉(I ruber) Mr-99菌株制備的紅曲胞外多糖。生物材料保藏說明
紅色紅曲霉(ifoaasc^s rubber) Mr-99菌株，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保藏時間2011年3月2 日，保藏號為 CCTCC NO :M2011053o
具體實施例方式下面對本發(fā)明具體實施方式
做一個詳細(xì)的說明。實施例1紅色紅曲霉Mr-99菌株的分離、純化和篩選 1. 1培養(yǎng)基
(1)PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，水1000 mL, pH自然；
(2)查氏合成培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基):葡萄糖30g,NaNO3 3 g，酵母提取物1 g，K2HP04 1 g, KCl 0. 5 g, MgSO4. 7H20 0. 5 g, FeSO4 · 7H20 0. 01 g，水 1000 mL, pH 5. 0 ；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)液葡萄糖50 g，蛋白胨 20 g，KH2PO4 8 g，MgSO4. 7H20 0. 5 g，KCl 0. 5 g，去離子水 1000 mL, pH 6. 0 ；
(4)CYA培養(yǎng)基(參照李鐘慶等，2004，鑒定用)蔗糖30.0 g，NaNO3 3 g，酵母提取物 5.0 g, K2HPO4 1 g, KCl 0.5 g, MgSO4 7H20 0. 05 g, FeSO4 7H20 0. 01 g，瓊脂 18 g，水 1000 mL, pH 6· O。分離、純化和篩選
紅色紅曲霉Mr-99菌株分離自自然發(fā)酵的紅曲米。將紅曲米0.5 g用研缽研磨成粉狀，取少量均勻的灑入PDA培養(yǎng)基表面，30 °C培養(yǎng)48 h，待白色絨毛狀菌絲長出后，挑取少許菌絲轉(zhuǎn)接于另一 PDA培養(yǎng)平板上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)1 W后重復(fù)上述分離純化操作，經(jīng)三次純化后即可得到得性狀均一的紅曲霉菌株。將篩選獲得的紅曲霉菌株保存于PDA試管斜面培養(yǎng)基上并置于4 °C冰箱中，編號備用。菌種使用之前需先活化，250 mL三角瓶裝入50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)液，接入5塊直徑為1 cm菌餅，32 °C搖床(200 r/min)培養(yǎng)96 h，發(fā)酵液用乙醇沉淀法提取紅曲胞外多糖，經(jīng)苯酚-硫酸比色法檢測篩選獲一株高產(chǎn)胞外多糖紅色紅曲霉 Mr-99菌株，胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)15 g/L 18 g/L。實施例2發(fā)酵法生產(chǎn)和制備胞外多糖的工藝流程
取紅色紅曲霉Mr-99菌株保存菌種，在無菌條件下(無菌室或超凈工作臺)，用接種針挑少許菌種，轉(zhuǎn)接于含PDA的培養(yǎng)平板上，30 ！活化培養(yǎng)108 h。以同樣方式接入活化好的菌種到PDA培養(yǎng)平板上，在30 °C培養(yǎng)120 h，即為一級種子。250 mL三角瓶裝入50 mL查氏合成培養(yǎng)液，接入5塊直徑為Icm Mr-99菌株一級種子菌餅，32 °C搖床(200 r/min)培養(yǎng) 96 h，即為二級發(fā)酵種子。根據(jù)發(fā)酵規(guī)模大小，如3. 7 L發(fā)酵罐裝2. 5L發(fā)酵培養(yǎng)液，接種量 8 % (V/V)，轉(zhuǎn)數(shù)200 r/min，溫度32 °C，通氣量100 L/h，罐壓0. 3 MPa，發(fā)酵時間為96 h。 發(fā)酵培養(yǎng)完畢，用四層紗布過濾發(fā)酵液，濾液用12000 rpm離心20 min，去除沉淀，取上清。向上述離心后的上清液中緩慢加入無水乙醇，邊加入乙醇邊震蕩混勻，直至無水乙醇與上清液的體積比為4:1，放入4°C冰箱靜止過夜，然后于12000 rpm離心10 min，沉淀用乙醇和丙酮反復(fù)沖洗(4次)，最后于12000 rpm離心10 min取沉淀烘干，即為胞外多糖 (附圖4)。本發(fā)明中的紅色紅曲霉Mr-99菌株選育于自然發(fā)酵的紅曲米，采用深層液體發(fā)酵方法，發(fā)酵產(chǎn)物與普通紅曲發(fā)酵產(chǎn)物相比，普通紅曲液體發(fā)酵產(chǎn)物胞外紅曲多糖含量很低， 經(jīng)苯酚-硫酸比色法(Dubois et al.，1956)檢測為0. 5 3. 5 g/L，按上述方法用Mr-99 紅曲霉菌株發(fā)酵發(fā)酵液中紅曲胞外多糖含量可達(dá)15 g/L 18 g/L。綜上所述，經(jīng)過紅色紅曲霉Mr-99菌株發(fā)酵，可以產(chǎn)生含量較高紅曲胞外多糖發(fā)酵液，可用于紅曲霉保健制品的制備。
權(quán)利要求
1.紅色紅曲霉(monascus rubber)Mr~99菌株，該菌株已于2011年3月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :M2011053。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅色紅曲霉(monascus rubber)Wr-99菌株用于紅曲胞外多糖的生產(chǎn)。
3.一種高產(chǎn)紅曲胞外多糖的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)取權(quán)利要求1所述的紅色紅曲霉Mr-99菌株保存菌種，在無菌條件下，用接種針挑少許菌種，轉(zhuǎn)接于含PDA的培養(yǎng)平板上，活化培養(yǎng)；以同樣方式接入活化好的菌種到PDA培養(yǎng)平板上，培養(yǎng)制得一級種子；2)在查氏合成培養(yǎng)液，接入一級種子菌餅，搖床培養(yǎng)制得二級發(fā)酵種子；3)接種二級發(fā)酵種子，發(fā)酵時間為70 1OOh；4)發(fā)酵培養(yǎng)完畢，過濾發(fā)酵液，濾液離心，去除沉淀，取上清；5)離心后的上清液中用乙醇沉淀法提取胞外多糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高產(chǎn)紅曲胞外多糖的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟3)中有機(jī)碳源選用乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉和番薯粉中的一種或多種，氮源選用無機(jī)氮源和有機(jī)氮源中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高產(chǎn)紅曲胞外多糖的生產(chǎn)方法，其特征在于有機(jī)碳源選用麥芽糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高產(chǎn)紅曲胞外多糖的生產(chǎn)方法，其特征在于無機(jī)氮源選用硝酸鈉、氯化銨、硝酸銨中的一種或多種，有機(jī)氮源選用牛肉膏、酵母粉、蛋白胨中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種高產(chǎn)紅曲胞外多糖的生產(chǎn)方法，其特征在于有機(jī)氮源選用酵母粉。
8.根據(jù)權(quán)利要求3 7任意一項權(quán)利要求所述的一種高產(chǎn)紅曲胞外多糖的生產(chǎn)方法， 其特征在于步驟3)中接種量為6% 10%(V/V)，發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)數(shù)150 250 r/min，溫度30 35 "C，通氣量 80 150 L/h,罐壓 0. 1 0. 5MPa。
9.根據(jù)權(quán)利要求3 7任意一項權(quán)利要求所述的一種高產(chǎn)紅曲胞外多糖的生產(chǎn)方法， 其特征在于步驟5)中向上清液中加入無水乙醇后置于2 8°C溫度下靜止過夜，然后于 10000 15000rpm離心5 20 min，沉淀用乙醇和丙酮反復(fù)沖洗，最后于10000 15000 離心5 20 min取沉淀烘干，即為胞外多糖。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種高產(chǎn)紅曲胞外多糖的生產(chǎn)方法，其特征在于無水乙醇與上清液的體積比為2:1 6 :1。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)保健品領(lǐng)域，涉及一株液體發(fā)酵高產(chǎn)胞外多糖紅色紅曲霉Mr-99菌株、用途和多糖制備方法。紅色紅曲霉(Monascusrubber)Mr-99菌株，該菌株已于2011年3月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC No.M2011053。該菌株具有胞外多糖產(chǎn)量高、生長速度快、抗高溫等多種優(yōu)良特性。通過液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化后，胞外多糖產(chǎn)量最高可達(dá)18.6g/L。
文檔編號C12P19/04GK102277303SQ20111022574
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月8日
發(fā)明者劉偉芬, 曹麗凌, 汪鵬榮, 蔣冬花 申請人:浙江師范大學(xué)